JPS5862562A - 非多孔性表面上での均一系分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 広い種類の分析対象物の定量のための新しい融通性のあ
る方法を開発しようと丁！努力は、連続して行なわれて
いる。それらの方法は、新しい１＃況、新しい装置、簡
単化した原理、より−い感Ｉｆなどに関連している。多
くの場合に、ミクロタイター板Ｃおける競合的蛋白質結
合分析を遂行しうることが望ましい。洗浄工程を行なう
必要がなくて、凹所中の全部の試薬と試料を結び付ける
ことができ、且つ充分な時間後に信号を読むことができ
ることもまた望ましい。

多孔性粒子と２１＋＃！素を用いる免疫学的検定方法は
、米国特許願第９６４．０９９号、現在では米国特許第
　　　　　号中に記されている。均−媒体中のｔヤンネ
ル形免疫学的検定の記述については、米国特許第４．２
３　＆　４０２号をも参照すべきである。

競合的蛋白質結合分析は、特異的結合対の１メンバーと
第一の酵素を固体の非多孔性表面１．持に容器の壁、九
とえばミクロタイター板に結合させる場合に用いられる
。！４的結合対の相補メンバーに抱合する第二の酵素と
結合する試薬を用意するが、その場合に固体表口＃Ｃ績
合する＃素抱合体の量は水性分析媒体中の分析対象−の
蓋ｔｒ−関係する。他の酵素によって生じる基質の−ｌ
ｖ＊ｔＣよる入れ代わりの結束として生成する検出しつ
る生成物のｍ祉、媒体中の分析対象物の′１１：に関係
する。

特異的結合対の１メンバーと酵素を結合させるために固
体非多孔性表面を使用する競合的蛋白質結合分析を提１
共する。固体表面Ｌ、試料からの分析対象物及び酵素の
抱合体である試薬並びに媒体中の分析対象中の社に一応
じて＆面ｔＣ結合する特異的結合対の１メンバーを含有
している水性の分析媒体と接触する。更に、検出ＩＪＴ
１ｉヒな４ｇ号を与える物質を生成させるために必要な
基質すなわち反応考をも包才する。

液状・媒体中の各分析ＩＡ与＜９１１は、分析対象物と
試薬の性質に依存してＡｒｚる順序で加えることによっ
て、異なるプロトコールを提供することができる。２５
ｇの酵素と補助材料が検出ｏＴ能な生成４勿を与える信
号発生系の成分である。未知の試料によって生じる検出
可能な生成りの量を、既知量の分析対象＠によって生じ
る検出可能な生ｂｙｔ′、４ＩＪの閂と比較して関係づ
けることによって、／：、材中の分ｖｔ対象物の濃度を
定量することができる。

分析対象物は、配位子とその対応受６体から成る特異的
結合対の１メンバーである。特異的結合対の中の一方の
メンバーは、直接または間接的Ｖこ、共有結合的にまえ
は非共有結合的軒、固体非多孔性表面に対して安定に結
合する。特定の配位子に対する特定のタイプの受容体が
分析対象物である場合に、３特異的結合成分、すなわち
、受容体、固体表面に結合することができる、抗受ｄ体
または配位子、及び、酵素の標黛付けのためｔこ用いる
、それぞれ配位子または抗受容体、を必要とする列外も
ある。かくして、分析対象物としての受浮体は、多くの
Ａ択ｏ７　能な抱合体の存在を許容する。

加うるに、信号発生系の中の一酵素は特異的結合で、固
体表面ｔこ結合する酵素抱合体の量を分析媒体中の分析
対象物の韻″に関係づけることができる。

この方法の遂行に当っては、予め表面ＶＣ対して特異結
合き対の１メンバーと第一の酵素を結合させることによ
って準備しである固体表面、通常はｄ器１、を、Ｈいて
出発する。分析対＃！吻の不貞及び信号発生系の？！ｒ
成分の本貞に依存して、遣々のプロトコールを用いると
とができる。もつとも一般的には、＆１田に結合する酵
単抱合本の１を試料中の分析対象物の門に１３１１Ａづ
けることを確実にするために試→と試薬を緩倒した水性
媒体中で一合する。１１号発生糸の１成分献基゛むして
池の酵素の生産吻を１史ＩＩＴる酵素の入れ代わりにＩ
−遷する量で検出可能な信号を提供する物質の生成をも
たらす。信号の量を測定することによって、その信号を
媒体中の分析対象物の量に関係づけることができる。

定　　義 分析対象物（ムｎａｌｙｔ・）−測定すべき化合物また
社組成物、これ祉モノ−またはポリ−エビトビツク、抗
原性ま九はへブテン性である配位子、単独の化合物また
社少なくとも１の共通エビトビツクまたは結合ナイトを
共有する複数の化合物、あるいは受容体とすることがで
きる。

特異的結合対−異なる２分子であって、その中の一分子
は表面上または空腔中に他の分子の特定の空間的及び極
性的機構に特異的に結合する区域を有している。特異的
結合対のメンバーを配位子及び受容体（抗配位子）と呼
ぶ。特異的結合対は、配位子としてａへブテンと抗原を
指し、受容体としては抗体を指すことが多い。その範囲
で、これらのグループは免疫学的対のメンバー（ｍ＠ｍ
ｂｅｒｓｏｆ　ａｎ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐ
ａｉｒ）とみなされる。

頭字語は・ミップ°（ｍｉｐ）であるから、免疫学射的
であろうがなかろうが、特異的結合対を包含すべき包括
的な意味で、ミップという一語を使用する。

配位子−それに対する受容体が、天然に存在するかまた
は調製０１′能である有機化合物。

受容体（抗配位子）−分子の特定の空間的及び極性組織
たとえばエビトビツクサイトを＆！處することができる
化合物または組成物。代表的な受容体は、天然に産する
受容体、たとえばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵
素、ファプ（Ｆｅｂ）断片、レクチンなどを包含する。

配位子類似体−受容体に対して類似配位子と競争するこ
とができる修飾した配位子、修飾は配位子類似体を別の
分子＃Ｃ結合させるための手段を提供する。配位子類似
体は通常は配位子とは配位子類似体を中枢（ｈｕｂ）ま
たは標識につなぐ結合による水素の置換以上によって配
位子とは異なっている。

ポリ（配位子−類似体）−通常は中枢核に共有結合的に
結合する複数の配位子または配位子類似体。中枢核は通
常は重合体状の、普通には複数の官能基、たとえば、ヒ
ドロキシ、アミノ、メルカプト、エチレン性不飽和など
の基を結合のための場所として有している、多官能性物
質。中枢核は水８注でも非水溶性でもよいが、水溶性で
あることが好ましく、且つ通常は少なくとも約５５，０
００の分子量であり、１０００万以上の分子量であって
もよいが、普通には６００，０００以下、より普通には
３０へ０００以下である。代表的な中枢核としては、多
糖類、蛋白質を包含するボリペブｔド、核酸、イオン交
換樹脂などがある。水に不耐性の中枢核は粒子に対して
示したものと同一とすることができる。

固体表面一固体表面は、共有結合または非共有結合的に
、その表面へのミップ及び酵素の結合を許丁多孔實固体
＆面である。結合は、たとえば、特異的結合対の中介に
よる直接または間接的なものとすることができる。固体
表面は、分析の必要成分の表面への結合を助けるため、
または表面への成分の非特異的結合を抑制するために、
ｔ＆覆してあっても被検してなくてもよい。多くの場合
に、固体表面は、′ｄａの壁または容器中の翼板であり
、固体非多孔ＩＩＳ子もまた、それ自体で、あるいは容
器壁と組み合わせて、蘭用することができる。

粒子は１１００ｎ乃至約１　ｍｍの（範囲の大きさとす
ることができるが、通常は約１０μを超えることはない
。

信号発生系−信号発生系は、その基礎として一方の生成
物が他方の基質であるという関係をもつ２酵素を有して
いる。それ故、２酵素がきわめて近似しているときは、
系列中の第一の＃素の生成物の系列中の第二の酵素によ
るより大きな入れ代わりが予想される。それ故、信号発
生系の部分として、少なくとも１化合物が存在し、その
化合物を第一の酵素によって変性することによって生じ
る生成物は、第二の酵素による変性によって、直接的ま
たは間接的に、検出可能な信号を提供する第二の生成物
を与えることができる。しかしながら、信号発生系中に
は、酵素的触媒反応のためまたは第二の酵素の生成物と
作用してまたは反応して検出可能な信号を与えるために
必要な多くの他の成分を含有していてもよい。多くの場
合に、信号は通常は紫外または可視の範囲の電磁放射線
の吸収ま九は発光であるが、電気化学的変化、熱的変化
、濁ｊ髪的な変化などもまた、応用することができる。

ミツブー＃素−抱合体−信号発生系の成分である２酵素
の中の一方と抱合する抱合体配位子あるいは受答体。ミ
ップは分析対象物またはその相補対メンバーであっても
、そうでなくてもよい。

抱合体は配位子−酵素−抱合体または受容体、−酵素−
抱合体を指すことが適切である。

方　　法 本発明の分析は、一般には最適分析感＋−１ｔ′に近い
、適度なｐ　）Ｉの水性の区域中で、分析成分または生
成物の分離なしに、遂行する。分析対象物の定蓋のだめ
の分１１「区賊は、通常は緩闘した、適当な水性媒体、
小＋ｉｉｌの処理を施してあってもよい未知試料、ミッ
ブと酵素を結合せしめる固体表面、ミソブー酵素−抱合
庫、検出ＯＴ能な１４号を発生するための信号発生系に
対して必要な残りのすべての材料、並びに必要に応じミ
ップまたはミツプ類似本を使用することによってａ４製
する。

未知試料中の分析対象物の存在は、固体表向と分析媒体
中の全溶液の間のミツブー＃素−抱合体の分配に影響す
る。

分析の遂行においては、通常は水性の媒体を使用する。

アルコール、エーテルなどを包含する、通常は１〜６、
さらに通常は１〜４の炭素原子のｆＩＮ素含有有機溶剤
を含むその他の極性溶剤をも含有させることができる。

通常はこれらの共溶剤は約４０重量襲未満、さらに普通
には約２０１ｔ％未満の量で存在させる。

媒体に対するｐＨは通常は約４〜１１の範囲、さらに普
通には約５〜１０の範囲、好ましくは約６５〜９５０笥
囲とする。ｐＨは受容体による特異的な結合の有意な水
準を保つと共に信号発生効率を最適化するように選ぶ。

場合によっては、考慮すべきこれらの要件の間で歩み寄
りを行なう。

望ましいｐ　Ｈを４成し巨７定量の間のｐＨを維持する
ために、櫨々の緩−剤を使用することができる。代ｆｉ
的な緩衝剤は、ホウ酸塩、リンｃｆＲ塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビツールなどを包含する。使用する特定の緩衝
剤は本発明に付して重大なことではないが、礒々の分析
に対して特定の一貞削が他のものよりも好適なことがあ
る。

分析のａ行に対しては通常は適度なＭｌｆを使用し、且
つ通常は、ｅｔｃ速度の測定に対しては、測定時間中で
一定の温度を使用する。測定のための温度は、一般には
約１０〜１５℃、さら＃Ｃｆｌ！ｌＫ−は約１５〜４０
゛Ｃの範囲である。

分析することができる分析対象づのａｌには一般［約１
０”−’　〜１０−’　Ｍ、　サラＣａｇｅ１’＋　１
０−＠−１０−゛Ｍ１囲で変えるこ“とができる。分析
が定性、半定−°的または定蓋的の何れであるかという
こと、特定の検出方法及び対象とする分析物の濃度とい
うような考慮すべき条件によって、他の試薬の機度を決
定する。

分析媒体中の各試薬の濃度は一般に、分析対象物につい
て関与する濃度範囲によって決定さににれるけれども、
各試薬の最終濃度は通常は、関与する範囲にわたって分
析の感イを最適化するように、経験的に決定する。分析
対象物に対して相補的な特異的結合対のメンバーの全結
合サイトは、分析対象物の結合サイトに基づいて関与す
る最低濃１ｙの約０．１倍よりも少ないことはなく、通
常は関与する最大濃度の約ｃＬ１〜１００倍、さらに普
通には約α３〜１０倍である。ここでいう濃度は、可能
な濃度、すなわち、飽和における濃度を意味し、特異的
結合対のメン）パーを結合に対して同様に利用し得ない
こともある実際の濃度である必要はない。

試薬の本質、及びプロトコールに依存して、個々の試薬
の濃度を広く変えることができる。たとえば、分析対象
物が抗原であり、且つ固体表面に結合したミップとミツ
ブー＃索−抱合体が何れも抗原に対する受容体である場
合には、抗原の金蓋と比較して表面上に著るしく大過剰
のミップを有することができる。普通は、固体表ｉｌｌ
　ｋこ結合したＮ素の生成物の寿命がきわめＣ短かいか
あるいは全溶液中の生成物の濃度をきわめて低い本革ケ
こ保つためｔこ全浴液中で捕捉剤を用いる場合を除けば
、大過−ｊのミツブーｆｌ素−抱合体を存在せしめるこ
とはない。

各成分の請願の順序は、＋衡万式または速Ｉ髪方式の何
れを用いるかということ、及び使用するミップの本性に
依存して、変えることができる。

多くの受容体にｇいては、ミップの会合は分析の間中は
とんど非可逆であるから、通常は、抱合体のミップに対
して補完的なミッブを表面１こ結合させる場合に、ミツ
ブー酵素−抱合体を試料よりも＃１＃ｃ固体表面に加え
ることは避ける。分析対象物が多価であり且つ表面上の
ミップとミツブーＦｌｆ素−抱合対のミッブが同一であ
る場合には、その限りではない。これは分析対象物上の
異なるサイトに指向する琳−分岐系抗体を１史用する場
合１こも当てはまる。分析対象物の本性及び速度または
平衡測定の何れを行なうかにかかわりなく、全成分を同
時に加えることもできる。

洗浄段階は避けることが通常は１ましいけれども、場合
によっては試料を固体表面に加え、装置し且つ洗浄して
、信号発生系を妨害するおそれのある内因性の物質を除
くことが好ましい。

分析には１以上の温置工根を包含させることができる。

たとえば、抗原分析物を表面と共に、あるいは、ミツブ
ーＷＩ素−抱合体と共ｔこ、他の成分を加える前−こ、
温置することが１ましいことがある。１置期間を置くか
どうかというこζ及びその温置時間の反さは、測定の方
式（速度またＦｉ＋貧）及び相補ミツブの結合の速度に
大きく依存する。

通常は、偏置工程は約ａ５分乃至２４時間、さら奢こ普
通には約５分乃至１時間の範囲である。温直温１ｆは一
般ｌこ約４〜５０℃、さら−こ仔通には約１５〜３７℃
の範囲である。

試薬を混合したのち、信号を測定する。１回以上の読み
がｒ丁なわれるが、所定の時間間１４にわたる１５号水
準の差を由いることが多い。測定の方法は、吸光または
発九の何れかのＩシ磁放射線、待ｔこ紫外及び町祝尤、
比色、電気化学的、比濁的などの１１１−１と−「るこ
とができる。１６号は紫外または→視領域、侍−ｃ約２
５０〜７５０ｋｍ、通常は約３５０〜６５０　ｎｍの１
磁放射線として読むことが望ましい。

信号を観測する温度は一般に約１０〜５０℃、さらに普
通には約１５〜４０℃である。

既知量の分析対象物を含有する標準分析媒体を調製する
。次いで標準分析媒体に対する一ｍｌｌ信号を、信号と
浸度を関係させるようにプロツトする。

標準曲線を確立すれば、信号を分析対象物の濃度と直接
に関係づけることができる。

信号を測定するための時間は、速度または平１＃方式の
何れを用いるか、必要とする感度、信号発生系の本質な
どによって異なる。速度方式に対しては、読みの間の時
間は一般に約５秒乃至６時間、通常は約１０秒乃至１時
間の間で異なる。平衡方式に対しては、定常状態に達し
たのち、単独の読みで十分であるか、または適宜の１４
隔における２回の読みで十分である。゛、・ 配位子は、モノ−またはポリエビトビツクのものとする
ことができる。エビトビツクとは、他の分子が特異的に
結合する分子上の時！４的サイトを意味する。多くの場
合に、配位子が七ノーまたはポリエピトビツクの何れで
あるかは、分析をどのように遂行するかには影響しない
。分析対象物が配位子である１易合には、表面に結合し
たミツブは配位子または受容体、通常は受容体とするこ
とができる。ミツブー酵素−抱合体は配位子または受容
体の何れかを有することができる。しかしながら、表面
に結合したミツブ及びミツブー１”ｌ素−抱合体が共に
受容体である場合には、配位子はポリエビトビツクであ
るかまたは追加の試薬としてポリ（配位子類似体）を使
用することかこまってポリエビトビツク？こしなければ
ならない。すなわち、配位子が表ＩＩｎに結合したミツ
ブｌこ結合して表面へのミツブー１ｌＳ１！素−抱合体
の結合のための配位子エビトビツクサイトを提供すると
いうサンドイッチ方法を用いる。

受容体が分析対象物である場合には、表面に結合したミ
ツブとミツブー酵素−抱合体祉同一または異なるミツブ
を有することができ、但しことで配位子が両抱合体中に
含まれる場合には受容体は多価であることを条件とする
。

分析対象物、表面に結合したミツブ及びミツブー＃素−
抱合体がすべて同一タイプのミツブであるかまたは同一
タイプのミツブを含有している場合には、単分校系抗体
が含まれるのでない限りは、同族メンバーを添加しなけ
ればならず且つ、それが受容体である場合には、抗体ま
たはその他の多価受容体の何れかとして、あるいはそれ
が配位子の場合には、ポリハプテン（ポリ（配位子類似
体））として・ポリエビトビツク形態で提供しなければ
ならない。

ミツブーＩｌ＃素−抱合本は分析対象物に対して相補的
である必要はない。多くの場合に、配位子に対して相補
的である受容１４：ｃｍ故の＃索が結合するために、ミ
ツブー酵素−抱合体が受容体を認識することが望ましい
。

材　　料 分析ｃｇいて使用する成分は、分析対象物を含有する試
料、ミッブと信号発生系を結合させるべき固体表Ｉｍ、
１ｄ号発生系１の残りのメンバー、及び迩切な窒ものと
して、ミップである。作用物の調＃Ｃおいて１史用する
ものは固体表面とミクプである。

分析対宋物 本発明の配位子分析対象物は、モノエビトビツクまたは
ポリエビトビツクである。ポリエピトビツク配位子分析
対象物は通常はポリ（アミノ酸）、たとえばポリペプチ
ド及び蛋白賞、多糖類、接置、）。

並びにそれらの混合物である。このよりｔ【昆合吻また
は渠合吻は、細菌、ビールス、染色体、遺伝子、ミトコ
ンドリア、細胞核、細胞膜などを包含する。

多くの場合に、本発明において便用するポリエビ［ビッ
ク配位子分析対象物は、少なくとも約４ｏｏｏ、さらに
普通には少なくとも１へ０００の分子量を有している。

ポリ（アミノ酸）領域においては、興味あるポリ（アミ
ノ酸）は一般に約４０００〜ｓ、　ｏ　ｏ　ｏ、　ｏ　
ｏ　ｏの分子量、さらに普通には約２へ０００〜Ｉｏｏ
ｏ、ｏｏｏの分子量であり；興味あるホルモンにおいて
は、分子量は通常は約ｓ、　ｏ　ｏ　ｏ〜６０，０ＯＯ
ＩＣわたっている。

広い種類の配位子が米国特許第４，１９４９８６号に記
されてｇす、その説明は参考のためにここｒｃａ入する
。また、配位子類似体の説明もまた、この文献中に認め
ることができ、その記述もまた参考のためにここに編入
する。

信号発生系 信号発生系は少なくとも次の３成分を有している：第一
及び第二の＃素（これらの＃索は第一の酵素の生成物が
第二の酵素の基質′ｔ′おるととによって関連している
）及び両酵素の基質。酵素触媒反応の一方または両方の
ために、あるいは第二の酵素の生＋ｆｆ１ｍと作用また
は反応させて検出Ｔ能な信号を与えるため１こ、追加の
成分を必要とすることもある。

信号発生糸は、多くの場合に、元を吸収−ｆる発色団の
ような、電磁放射線の測定をもたらず生成物、あるい１
：、たとえば螢＃：、体または化学ルミネセンス体のよ
うな、発光なもたらす生成物を提供−「る。

酵素の選択１０ｇいては、酵素の入れ代わりの速度に対
する粒子の影響のほか、他の考慮すべき条件もまた酵素
の選択に影＊−ｒる。これらの条件は、酵素の安定性、
高い入れ代わり速度の必要度、物理的環境の変化に対す
る速度の感度、基質または生成物、好ましくは生成物、
の本性、酵素の人手し易さ、酵素の性質に対するｍｓの
抱合の影響、試料溶液中で遭遇する町ｌｆ＠性のある物
質の酵素活性に対する影響、酵素の分子量などを包含す
る。

前記の特許文献中には酵素についての広範な説明があり
、その説明もまた参考のために本明細書中に編入する。

檀々のｅｌ素の組合わせを使用することができる。

１連の組合わせに糞いては、ＮＡＤまたはＮＡＤＰある
いはそれらの還元生成物を測定すべき能力を用いる。こ
れらの組合わせにおいては、ＮＡＤに依存する酸化還元
ｅ！ＩＩ素を、酸化還元酵素に対する基質を提供する＃
素と共に使用する。測定する生成物を生じさせるために
、広い種類の＃素及び反応を用いることができるが、酵
素の多くは炭水化物代謝の一部である。相当な数のこれ
らのＭＡかリン酸エステルの生成と変換に関係する。関
係するｕ１能性のあるその他の反応としてはり了−ゼに
よる炭素−炭素結合の開裂、ナト−アルデヒド変換を伴
なう異性化及び脱力ルボヤシル化である。

特に興味あるものけ糖を包含する組合わせであって、そ
の場合に第一４Ｑ　Ｕｓにおいて転移酵素、加水分解酵
素、リアーゼまたはイソメラーゼ幅、特にリン酸エステ
ルを伴なって、酸化賛２じ醇捧に依＋’ｒ’　するＮ　
Ａ　１１　（Ｐ　）の基貿を与える。特に有用なものＦ
ｉ酸化遠フじ酵素反応における酵事基簀と；２て３〜６
炭素原子を有する車軸類モノリン酸である。

Ｆ表は、酸化還元酵素に対するＯｉｊ駆物實が生成し７
且つＮ　Ａ　ｊ）依存酵素の反応の経過ののちにＮＡ１
、またＦｉＮＡＪ）Ｐのその遠冗）Ｗ−・るいね還元ル
給からの変換が続く場合の多数の実ｆｉｌをポす。

五個においでＩＩＩ［Ｉ酵素は４ｇ号晃生系の部分であ
る。

ｚ　　３．ｔｓ　　　　　　　アルカリ性ホス７アター
ぞ ＆５．４．２　　　　　　　ホスホグルコムターゼ１１
１　　　　　　　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ ９　．４１１　　　　　　　　ビルバートデカルボキシ
ラーゼ １α　４ｚ１　　　　　７マラーゼ １１１　　　　　　　　マラート デヒドロゲナーゼ Ｉｔ＆２．１　　　　　　７コニターゼｔｉｔ　　　　
　　　　インシトラードデヒドロゲナーゼ 第　　１　　表（続き） Ｄ−ソルビトール　ホスファート　→　Ｄ−ソルビター
ルＤ−ソルビタール＋ＮＡＤＰ　　→ ａ−ｐ−グＪｚコピラノース十ＮＡＤＰＨａ−グルコー
ス−１−リン酸　→　グルコース−６−リン酸グルコー
ス−６−リン酸十ＮＡＤ　　→６−Ｐ−グルク四ナート
＋ＮＡＤＨ ビルバート　→　アセトアルデヒド アセトアルデヒド十ＮＡＤＨ→ エタノール十ＮＡＤ ７マラード　→　マラート マラート十ＮＡＤ　　→　オキサルアセタートシスーア
コニタート　→　イソシトラートインシトラー）＋ＮＡ
Ｄ　　→ ａ−オキソグルタ、ラード十ＮＡＤＨ その他の酵素の組合わせは過酸化水素の生成を包含する
が、その場合に化学ルミネセンス材料、たとえばルミノ
ール、を伴なう過酸化水素のペルオキシダーゼによる触
媒反応が光を生じさせる。

ルミノールのほかに、その他の２．３−［ヒ）’０１４
−７タルアジンジオン類を用いることもでる。これらは
５−アミノ−４ス８−トリメトキー及びジメチルアミノ
（Ｃ−）ベンズ類似体を含する。その他の化合物は、鋭
化合物に対する般名としてロフィンを有する、２．ａ、
ｓ−＊にジェニルイミダゾール類であり、且つパラージ
メルアミノ及び−メトキシ置換した化合物もまた用であ
る。化学ルミネセンス化合物を光の直接とすることがで
き、または、たとえば８１〇−ブロモアントラセンのよ
うな受容体と反応させそれを発光させることもできる。

あるいはまた過酸化水素と共に酵素的な接触反応を受け
て検可能な着色形態を与える、種々な染料前躯物貿を用
いることもできる。

下表線画酵素を信号発生糸の成分としている、多くのこ
れらの反応を示す。

酵素区分　　　　　　酵　　　素 ｔ　１１３　　　　　　グルコースオキシダーゼ１１ｔ
１　　　　　ペルオキシダーゼ ２、　　ｔｚ３　　　　　　　ウリカーゼ１１ｔ１　　
　　　ペルオキシダーゼ １１１１　　　　　　カタラーゼ オキシダーゼ 第　　　２　　　表 グルコース＋０２→　グルクロナー）＋Ｈ２０！Ｈ２Ｏ
３＋ルミノール　→　生成物＋ｈν尿酸塩＋０２　　→
　アラントイン＋Ｈ，０゜す２ｏ、＋ｏ−ジアニシジン
　→　染料Ｄ−アラニン＋０２→　ピルバート＋Ｈ冨０
２Ｈ，Ｏ，＋Ｆｅ（ＣＮ）、−＊　　Ｆｅ（ＣＮ）＠キ
サンチン＋０鵞→　尿酸＋Ｈ，０゜ Ｈρ２＋ピロガロール　→　ヒドロキシギノン以下の系
列の反応は、水を包含する２反応、通？Ｊは加水分解酵
素を包含する２反ルｈ・に〃−づくものであるけれども
、シンテターゼをも使用することかできる。

以下の系列の組合わせは、受容体または供与体から亀子
を供午または受容することｂｌでき、そσ）結果として
受容体またれ供与体σ）吸収スペクトルに実質的な変化
が存在する酵素に対するＥ作一段階における。Ｍ［の調
製を包含する。多くσ）場合に、＋Ａｉ二の酵素は削・
化遣元酵素、特にデヒドロゲナーゼ及びオキシダーゼで
ある。この系列（ニオ５し）て１向ｒＩＹ素は（ｉｉ号
発牛糸σ）成分である。

本発明においては、それ故、第一の酵素反応が第二の酵
素反応に対する基質を！Ｍ謳するようにｗｊＩら〈。第
二の酵素反応は、直接に、また祉付加的な反応によって
、特に３００ｎｍ以上、好ましくは５５０ｎｍ以上、さ
らに好ましくは４００ｎｍ以上の光の吸収：３５０ｎｍ
を超え、好ましくけ４００ｎｍを超え、さらに好ましく
は４５０ｎｍを超える波長の光を発する螢光；あるいけ
化学ルミネセンスによって、分光光度的に測定すること
ができる化合物の生成を結果する。光の吸収の測定のた
めには、消光率は上記の波長を越える吸収に対して１０
”ｍｏｌ−豫（！ＩＩ−”よりも大きく、好ましくは１
０６　よりも大きくなければならない。

前記のように、分析対象物の量に関係して放間に結合す
るミックの各相補対に・対して表面に結合する１ｗ数の
ミツブー１１素−抱合体を有することによって、検出可
能な信号を著るしく増大させることができる。かくして
、１捕虫からのたとえば抗体のような受答体及び第二の
宿主からの酵素に抱合する抗受容体を有することによっ
て、表向への受容体の結合は、かかる受容体に結合する
接散の抗（受容体）−酵素−抱合体をもたらす。こり、
Ｉｄ。

抱合体の酵素が表＋ｇ］に結合した酵素により生じる生
成物の主斐部分を捕捉することをμ■能として、全媒体
中で生じる検出ｇＴｆ＃：な信号発生生成物の量を最低
にするという効果を有する。

バンクグラウンドを低下させる別の方法は、全媒体中に
捕捉剤を存在せしめることである。たとえば、第一の解
束の生成物が過耐化水素であるときは、全媒体中に過酸
化水素を分解するカタラーゼまたはその他の反応物を使
用することができる。

全媒体中に捕捉剤を存在せしめることによって、−σ酵
素の全体的な入れ代わり速度の多少の低下かあるけｔど
も、バックグラウンド信号と比較しての１分析対象物の
−に関係１′る信号発生生成物の生成の比率の実質的な
増大が予想される。

各酵素系と共に、捕捉剤への異なるアブリーチを用いる
ことができる。表１ｆｌｌへのミツブー酵素−抱合体の
結合の効果ＢＩ　ミツブー＃＃素−抱合体が溶液本体中
にある場合よりも、少なくとも２倍、さらに普通には１
０倍、より好ましくは１００倍の速度差を提供すること
が望ましい。

固体放間 天然または合成の、有機あるいり無機材料を包含するこ
とかできる、広く異なる固体表面を使用することができ
る。特に興味あるものは、たとえばポリ７チレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレンなどのような、合成重合体、
特に付加１合体、通′帛′ｈ炭化水素鳳合体である。

ｂ！＋Ｉ体衣凹は、共有結合または非共有結合のどちら
かで、ミックと＃素を結合することかできるか、あるい
龜′１能化または適当な材料による被筒によって、それ
がｕｌ　Ｑ’ｅであることが必要である。不活１１な固
体表器を、共有結合的に蛋白質を結合することができる
ように変性するためには、広く異なる官能基を用いるこ
とができる。官能基とし−Ｃは活性ハロゲン化静ノ、エ
ポキシド、非オキソ−カルボニル化合物、メルカプタン
などが含まれる。ミッ１と酵素の表向への抱合の特定方
式は、そｆ＋それが分析に対し２て必要な性質を維持す
る限りは、本発明にとって限定的ではない。

別法として、ｌｔ’ｊ体表１１１１をポリ（アミノ酸）
、ｌ（とえばポリリシン、で装置して、そのポリ（アミ
ノＩ！１１）を、固体放間とポリへプチド配位子または
り容体及び酪案のＩｌｌの中■１重結合剤として、−ら
かせることもできる。

拡散の速度ｒＪ、所望の感度を取得するために必要な時
間を望ましくない程ル゛に増大させるおそれがあるから
、そのような情況では、ミツブー酵素−抱合体が表器に
出合うまでの平均経路長を短かくするために、肉体表面
の表面種を着るしく増大させることが望ましい。固体表
面種の全＃液容緻に対する比を決定するには、放間に結
合させなければならない酵素の墓に対する固体表面積、
の増大の影暢、及びこの酵素が生産する生成物の全媒体
中に逸出する敏の両方を考慮しなければならない。

増大した放間槓を与えるために、肉体表面として、通路
として働らく大きな穴を有する腕、粒子などを用いるこ
とができる。通常は容器の壁のみを用いることが望まし
い。

補助材料 本発明の分析においては、板々の補助的な材料や８い６
．よヵ５．６゜！、、′九〇□や。。

とじて、酵累基買、補足因子及び抑制因子を使用しても
よい。加うるに、緩働剤、安定剤、界面活性剤、特に非
イオン活性剤のような、その他の材料を含有させること
もできる。

キット 便宜上の問題として、各試薬をキットとして提供するこ
とができるが、その場合に各試薬は興味本性とプロトフ
ールによって必要とするような最低数の個々の配合物を
使用することにより、使用者による別々の測定と添加の
麺をできるだけ少なくする。その土に、容器、特にミク
ロタイター板を用慧して、ミップと酵素を器壁に結合さ
せる。

抱合体の酵素が系列中の第二の酵素である場合にミツブ
ー酵素−抱合体と共に、崗酵素に対して必′：１゜ 要な基質と補足因子を含有せしめることができる。

前記のような谷柚の補助材料をも含有せしめるにとかで
きる。

実施例 以下の実施例は例証のために示すものであって、限定の
ためのものてはない。

百分率及び部数は、液体の混合物に対する容置のほかは
、特に他のことわりがない限り社、重鎖による。温度祉
、他のことわりかない限りは、摂氏である。

ミクロタイター板（リンプ四−板、フロー研究所）の凹
所を、２００声ノのポリリシン溶液（１雫／ｓｇ）で１
〜２時間被覆した。結合しないポリリシンを、（ＬＩＭ
ｇ性リン酸ナトリウム０２Ｍ、ＮａＣ１，ｐＨ７，０を
用いる２回の洗浄によって除去した。休いて凹所を、グ
ルコース　オキシダーゼ（１１ｖ／ｗｔ）と人のｘｇａ
（１ｏｐｌ／−）の５０声ノの混合物で、１６時間被曹
した。未結合の蛋白質をα２Ｍ　　Ｎａ（ｊ、牛の血清
アルブミン（１〜／ｍ）及びツイーン２０（００２％）
を含有する［１．１Ｍ％性リンすナトリウムで２１１Ｊ
Ｉ沈浄した。

板をこの洗浄緩袖液（２００μ７／ｌ！ｌ！Ｊ所）と共
に湯飲した。２時［細俊に、板の凹所を空にして暗所で
振とうした。

チャンネルＪβの反応に対しては、２０ｐｌの洗浄緩衝
液を凹所に入れた。非チャンネル形反応に対しては２０
μ）の人のＩｇＧ（１〜／、ｇ）を入れた。チャンネル
形υとは生成物がミクロタイター板に結合した２酊索（
ＧＯ及びＨＲＰ　）から由来することを慈味するのに対
して、非チャンネル朕とは１酵［（００）のみがミクロ
タイター板に結合し、他の酵素（４１！（Ｐ　）は濱液
中に遊離していることを意味するっチャンネル形の免疫
学的検定に対しては、一連の希釈ルにおける２　０　、
ａ　ｌの人のＩｇＧを加えた。次いで３０μｌ中で約５
ＯｎＨの活性ＨＲＰに重訳した羊抗人１ｇ０−ワサビ　
ペルオキシダーゼ−抱合体を各！！Ｊａｒに加えた。板
を珈とう下に３時間装置した。次いで溶液に、ワサビペ
ルオキシダーゼに対してモル的に約６００倍過剰である
１ｏｏ１ｍ９のカタラーゼを含有する０、１５−の基質
（１２，５ｍＭの２．２′−アジノージ−（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ８）及び１
２０ｍＭのグルコース）を加えた。

最終容量はα２−であったっ３詩間後に、ミクロタイタ
ー板リーダー（フロー研究所）上で、４１４ｎｍにおけ
る吸光度を読んだ。

下表はその結果を示すか、これらの値は２試料の平均値
である。

８　　　　　　　　０．４５７ ０．１　　　　　　　　（１３５１ １０，３７４ １０’　　０．１６８ １００　　　　　　　　０．０８ ｔ０００　　　　　　　　　α０７ ＨＬＯＯＯａ０２ 非多孔性ビーズの使用を実証するために、以下の実験を
行なった。約０９４μｍの大きさのポリスチレン　ビー
ズ（コンパスフエアズ、コバレント　テクノロジー社）
を、ビーズの０５％分１ｋｔ１１０μｚ　中で６〜４ｎ
ｇの活性グルコース　オキシダーゼと２００〜４００ｎ
ｇのｈｒｇｏ　　がビーズに結合する采ｔ″ト下に、グ
ルコース　オキシダーゼ及び人のＩｇＯと混１合した。

チャンネル形のノｘ　ｈ６に対してｔｒ、ｒ、１ｏμノ
の緩個液を加え、一方、Ｊトチャンネルノしの反応に対
し−Ｃは、１０ｐｌのｎＩｇａ（２ｏｐｇ）を加えた。

次いでこのα合物に３０μｌの抱合体（１：１００の希
釈、約１５ｎｇの活性ＨＲＰを含有・）を加え且つ分わ
１′鯨体を約２５時１１１１　ｍ　ｉｋ　Ｌだ。チャン
ネル形の反１＋ｃにおビ１ては、ビーズが凝集して凹ｆ
ａｔの底に沈殿し、かくして溶液れ透明となった。

非チャンネル形の反応においては、溶液扛濁ったままで
あった。次いでこの混合物に、１凹所当り約３５μＩの
縁で且２カタラーゼのＨＲＰに対する４００：１のモル
比を与えるために十分なカタラーゼと共に、前記の基質
溶液を加えた。

下表れその結果を示す。

２９’　　　　　　　　　７．５ １００’　　　　　　　　１α４ １２０’　　　　　　　　　９．５ １６６１　　　　　　　６．７ おりる吸光度 上記の結果は、約１００分において最良のチャンネル形
信号の非チャンネル庇信号に対する比が得られることを
示している。

上記のデータは本発明が１体表面上で分析を遂行するた
めのｈ？Ｉｉ且つ迅速な方法を提供することを央ｊトす
る。ｋ〈べきことに、２酢素が表面上にあるチャンネル
形の反応と１酵素が表面上にあり他のＭ索が溶液中に分
散している非チャンネルｊｂ反応の而にれ明確な相違を
詔めることができる。

表面上の酵素の生成物がミツブー酵素−抱合体の１ｉ７
素に対する基質として慟らく場合に、表面上の酵素の生
成物を分解する捕捉剤を全溶液中に存在させることによ
って、／１度が増大する。ミツブー曲素−抱合体）」、
存在する分析対象物の−に関連して、表面と全浴欣の間
に分配される。この分析な」、物理的な分離工程または
試料の添加後の器壁の洗浄の何れをも必要としない方法
を提供するという点で、特に有用である０この方法は分
析賑体中の試料のｉの画定のために蛍溶液からのミツ７
゛−酵素−抱合体の除去を必要とすることもない。

本発明を例証のために多少詳細に説明し且つ坤解を明鞍
とするために実施例を示したが、特許請求の範囲内にお
いて、いくつかの変更及び修飾を行なうことができると
いうことは明白であろう。

３８３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　配位子及びその同族受容体から成る特異的結合対（
   ミック）の１メンバーである分析対象物の、試料中にお
   りる９在を測定するだめの分析方法にして、該方法は： （ａ）　　連続的な水性媒体： （ｂ）　　該媒体と接触しており且つミックと第一の酵
   素が抱合せしめである固体の非多孔性表１；（Ｃ）　　
   ？１ｌｆｌ定しうる信号を発生することができる信号発
   生系、但し該信号の強度は該媒体中の該分析対象物の濃
   度によって影響を受は且つ該信号発生糸は少なくとも第
   二の酵素と該第−及び第二の酵素の中の一つに対する基
   質を包含している；（ｄ）　　該第二の酵素はミツブー
   酵素−抱合体を与えるようにミックに抱合せしめられて
   いる、ここで固体表面に結合したミツブー酵素−抱合体
   の量は該水性媒体中の分析対象物の祉に関連している：
   ここで、上記２つの酵素は一方の生産物が他方の基質で
   あるという関係を有している；を採用し、そして該方法
   は： 該ミックと該第−の酵素を抱合せしめる該固体表向を、
   （ａ）該試料；（ｂ）該ミツブー酵素−抱合体；（Ｃ）
   該特異的結合対の同族メンバー、但し、該分析対象物、
   ミツブー酵素−抱合体及び表向に結合したミックが同一
   ミックである場合、から成る水性の分析媒体、および （−）　　該両酵素の中の少なくとも一つに対する基質
   及び該信号発生系の残余のメンバー とを組合せ、 但し分析対象物が第一の、受容体であるときは、該固体
   表向に抱合せしめる数対の該メンバーは同族配位子また
   は該第−の受容体のための受容体とすることができ且つ
   該酵素抱合体の該メンバーはそれぞれ該第−の受容体の
   だめの受容体または同族配位子とすることができ；且っ 該水性の分析媒体中の該信号の強度を、既知量の分析対
   象物を含有する分析媒体と比較して測定する、 ことから成る、該分析方法。 ２、該固体表向は容器壁である、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 五　該固体表面は非多孔性粒子である、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４、媒体に対するｐＨは約５〜１ｏの範囲にある、特許
   ｊｉｆｆ求の範囲第１．２または３項記載の方法。 ５、　該酵素の一つは加水・分解酵素である、特許請求
   の範囲第１．２また＃−ｉ５項記載の一方法。 ６　該酵素の４酸化還元酵素である、特許請求の範囲第
   １．２または３項記載の方法。 ｌ　該酸化還元酵素はオキシダーゼである、特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ａ　配位子及びその同族受容体から成る特異的結合対（
   ミック）の１メンバーの、試料中における存在を測定す
   るための分析方法にして、該方法は＝（１）　　約６５
   〜９５の範囲のＰＨにおける水性の緩衡連続相から成る
   媒体、及び抱合せしめた担体を与えるために該特異的結
   合ｉへの中の一つと第一の酵素とを抱合せしめるべき、
   担体としての固体非多孔性相、Ｖ並びに （２）　　測定しうる信号を発生することができ且つミ
   ツブー酵素−抱合体を与えるためにミックに抱合せしめ
   る第二の酵素とを有する信号発生系を使用し、ここ中適
   当な基質及び補足因子を備えた該第−及び第二の酵素は
   該信号発生系を規定し且つ第−及び第二の酵素は一方の
   生産物が他方のＭｌであることによって関連を有してお
   り、ここで該測定しうる信号Ｆｉ該担体と該水性の媒体
   の間の該ミツクー酵素−抱合体の分配に関係して変化し
   、該分配は該媒体中の分析対象物の看に関係しており、 該方法け： 該ミック及び該第−の酵素を抱合せしめる該担体を（−
   ）該試料ニー）該ミツブー酵素−抱合体：（Ｃ）該分析
   対象物、担体及びミツ１−＃素−抱合体が同一のミック
   を有する場合に、該特異的結合ハの同族メンバー、並び
   に（ｄ）基質及び該信号発生糸の付加的メンバーから成
   る水性媒体と組み合わせ、但し、その際、該ミツブー酵
   素−抱合体は、該水性の媒体と該担体の間で、該試料中
   の分析対象物の−に依存する置で分配される：且っ 該分析媒体中の該信号の強度を、既知量の分析対象物を
   含有する分析媒体と比較して測定する、ことから成る該
   分析方法。 ９　いずれの酵素も酸化還元酵素である、特許請求の範
   囲第８項記幀の方法。 １（Ｌ　　＠酵素の中の一つは過酸化水素を生産するも
   のである、特許請求の範囲′＃ＩＩｔ項記載の方法。 １ｔ　該水性媒体中に、酵素過酸化水素捕捉剤を含有せ
   しめる、特許請求の範囲第１０項記戦の方法。 １２、ｇｌ［酵素の中の一つはグルコースオキシダ−セ
   であり且つ該ＩＷ！素の他方はワサビペルオキシダーゼ
   である、特許請求の範囲＠１ｏまたは１１項記載の方法
   。 １五　複数の凹所を有するミクロタイター板、但し該凹
   所の壁＜１１第一のＩ’ｌｌ素とミックが結合し酵素の
   他方の基質であることによって関連してぃ亭 る；及び該２つ酵素に対する少なくとも１つの基質の組
   み合わせから成る、特許請求の範囲第１項記戦の方法に
   おいて使用するためのキット。 １４、２つの酵素は酸化還元酵素である、特許請求の範
   囲第１３項記載のキット。 １５、該酸化還元酵素の中の一方はグルコースオキシダ
   ーゼであり且つ該酸化還元酵素の中の他方はワサビペル
   オキシダーゼである、特Ｉｌｆ請求の範囲第１４項記載
   のキット。 １＆　該基質はワサビペルオキシダーゼｘｌ触媒とする
   反応ｔこよって酸化せしめられた染料を特徴する特許請
   求の範囲第１５項記載のキット。