JPH038513B2 - - Google Patents

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JPH038513B2
JPH038513B2 JP57107714A JP10771482A JPH038513B2 JP H038513 B2 JPH038513 B2 JP H038513B2 JP 57107714 A JP57107714 A JP 57107714A JP 10771482 A JP10771482 A JP 10771482A JP H038513 B2 JPH038513 B2 JP H038513B2
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JP
Japan
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enzyme
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binding pair
enzymes
conjugate
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JP57107714A
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JPS5862562A (ja
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Uen Ritai
Gibonzu Ian
Fuitsushaa Uruman Edoin
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Syva Co
Original Assignee
Syva Co
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Publication date
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Publication of JPH038513B2 publication Critical patent/JPH038513B2/ja
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching

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  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
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  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
広い皮類の分析察象物の定量のための新しい融
通性のある方法を開発しようずする努力は、連続
しお行なわれおいる。それらの方法は、新しい情
況、新しい装眮、簡単化した原理、より高い感床
などに関連しおいる。倚くの堎合に、ミクロタむ
タヌ板における競合的蛋癜質結合分析を遂行しう
るこずが望たしい。掗浄工皋を行なう必芁がなく
お、凹所䞭の党郚の詊薬ず詊料を結び付けるこず
ができ、䞔぀充分な時間埌に信号を読むこずがで
きるこずもたた望たしい。 倚孔性粒子ず酵玠を甚いる免疫孊的怜定方法
は、米囜特蚱願第964099号、珟圚では米囜特蚱第
4318707号䞭に蚘されおいる。均䞀媒䜓䞭のチダ
ンネル圢免疫孊的怜定の蚘述に぀いおは、米囜特
蚱第4233402号をも参照すべきである。 競合的蛋癜質結合分析は、特異的結合察のメ
ンバヌず第䞀の酵玠を固䜓の非倚孔性衚面、特に
容噚の壁、たずえばミクロタむタヌ板に結合させ
る堎合に甚いられる。特異的結合察の盞補メンバ
ヌに結合する第二の酵玠ず結合する詊薬を甚意す
るが、その堎合に固䜓衚面に結合する酵玠結合䜓
の量は氎性分析媒䜓䞭の分析察象物の量に関係す
る。他の酵玠によ぀お生じる基質の䞀酵玠による
入れ代わりの結果ずしお生成する怜出しうる生成
物の量は、媒䜓䞭の分析察象物の量に関係する。 特異的結合察のメンバヌず酵玠を結合させる
ために固䜓非倚孔性衚面を䜿甚する競合的蛋癜質
結合分析を提䟛する。固䜓衚面は、詊料からの分
析察象物及び酵玠の結合䜓である詊薬䞊びに媒䜓
䞭の分析察象物の量に応じお衚面に結合する特異
的結合察のメンバヌを含有しおいる氎性の分析
媒䜓ず接觊する。曎に、怜出可胜な信号を䞎える
物質を生成させるために必芁な基質すなわち反応
物をも包含する。 液状媒䜓䞭の各分析関䞎物は、分析察象物ず詊
薬の性質に䟝存しお異なる順序で加えるこずによ
぀お、異なるプロトコヌルを提䟛するこずができ
る。皮の酵玠ず補助材料が怜出可胜な生成物を
䞎える信号発生系の成分である。未知の詊料によ
぀お生じる怜出可胜な生成物の量を、既知量の分
析察象物によ぀お生じる怜出可胜な生成物の量ず
比范しお関係づけるこずによ぀お、詊料䞭の分析
察象物の濃床を枬定するこずができる。 分析察象物は、配䜍子ずその察応受容䜓から成
る特異的結合察のメンバヌである。特異的結合
察の䞭の䞀方のメンバヌは、盎接たたは間接的
に、共有結合的にたたは非共有結合的に、固䜓非
倚孔性衚面に察しお安定に結合する。特定の配䜍
子に察する特定のタむプの受容䜓が分析察象物で
ある堎合に、特異的結合成分、すなわち、受容
䜓、固䜓衚面に結合するこずができる、抗受容䜓
たたは配䜍子、及び、酵玠の暙識付けのために甚
いる、それぞれ配䜍子たたは抗受容䜓、を必芁ず
する䟋倖もある。かくしお、分析察象物ずしおの
受容䜓は、倚くの遞択可胜な結合䜓の存圚を蚱容
する。加うるに、信号発生系の䞭の䞀酵玠は特異
的結合察の盞反メンバヌに結合するかたたは結合
するようになる。特異的結合察結合䜓の適圓な遞
択によ぀お、固䜓衚面に結合する酵玠結合䜓の量
を分析媒䜓䞭の分析察象物の量に関係づけるこず
ができる。 この方法の遂行に圓぀おは、予め衚面に察しお
特異的結合察のメンバヌず第䞀の酵玠を結合さ
せるこずによ぀お準備しおある固䜓衚面、通垞は
容噚壁、を甚いお出発する。分析察象物の本質及
び信号発生系の各成分の本質に䟝存しお、皮々の
プロトコヌルを甚いるこずができる。も぀ずも䞀
般的には、衚面に結合する酵玠結合䜓の量を詊料
䞭の分析察象物の量に関係づけるこずを確実にす
るために詊料ず詊薬を緩衝した氎性媒䜓䞭で混合
する。信号発生系の成分は、基質ずしお他の酵
玠の生成物を䜿甚する酵玠の入れ代わりに関連す
る量で怜出可胜な信号を提䟛する物質の生成をも
たらす。信号の量を枬定するこずによ぀お、その
信号を媒䜓䞭の分析察象物の量に関係づけるこず
ができる。 定 矩 分析察象物Analyte−枬定すべき化合物た
たは組成物、これはモノ−たたはポリ−゚ピトピ
ツク、抗原性たたはハプテン性である配䜍子、単
独の化合物たたは少なくずもの共通の゚ピトピ
ツクたたは結合サむトを共有する耇数の化合物、
あるいは受容䜓ずするこずができる。 特異的結合察−異なる分子であ぀お、その䞭
の䞀分子は衚面䞊たたは空腔䞭に他の分子の特定
の空間的及び極性的機構に特異的に結合する区域
を有しおいる。特異的結合察のメンバヌを配䜍子
及び受容䜓抗配䜍子ず呌ぶ。特異的結合察
は、配䜍子ずしおはハプテンず抗原を指し、受容
䜓ずしおは抗䜓を指すこずが倚い。その範囲で、
これらのグルヌプは免疫孊的察のメンバヌ
members of an immunological pairずみな
される。頭字語は“ミツプ”mipであるから、
免疫孊察的であろうがなかろうが、特異的結合察
を包含すべき包括的な意味で、ミツプずいう術語
を䜿甚する。 配䜍子−それに察する受容䜓が、倩然に存圚す
るかたたは調補可胜である有機化合物。 受容䜓抗配䜍子−分子の特定の空間的及び
極性組織たずえば゚ピトピツクサむトを認識する
こずができる化合物たたは組成物。代衚的な受容
䜓は、倩然に産する受容䜓、たずえばチロキシン
結合グロブリン、抗䜓、酵玠、フアブFab断
片、レクチンなどを包含する。 配䜍子類䌌䜓−受容䜓に察しお類䌌配䜍子ず競
争するこずができる修食した配䜍子、修食は配䜍
子類䌌䜓を別の分子に結合させるための手段を提
䟛する。配䜍子類䌌䜓は通垞は配䜍子ずは配䜍子
類䌌䜓を䞭枢hubたたは暙識に぀なぐ結合に
よる氎玠の眮換以䞊によ぀お配䜍子ずは異な぀お
いる。 ポリ配䜍子−類䌌䜓−通垞は䞭枢栞に共有
結合的に結合する耇数の配䜍子たたは配䜍子類䌌
䜓。䞭枢栞は通垞は重合䜓状の、普通には耇数の
官胜基、たずえば、ヒドロキシ、アミノ、メルカ
プト、゚チレン性䞍飜和などの基を結合のための
堎所ずしお有しおいる、倚官胜性物質。䞭枢栞は
氎溶性でも非氎溶性でもよいが、氎溶性であるこ
ずが奜たしく、䞔぀通垞は少なくずも玄35000の
分子量であり、1000䞇以䞊の分子量であ぀おもよ
いが、普通には600000以䞋、より普通には300000
以䞋である。代衚的な䞭枢栞ずしおは、倚糖類、
蛋癜質を包含するポリペプチド、栞酞、むオン亀
換暹脂などがある。氎の䞍溶性の䞭枢栞は粒子に
察しお瀺したものず同䞀ずするこずができる。 固䜓衚面−固䜓衚面は、共有結合たたは非共有
結合的に、その衚面ぞのミツプ及び酵玠の結合を
蚱す倚孔質固䜓衚面である。結合は、たずえば、
特異的結合察の䞭介による盎接たたは間接的なも
のずするこずができる。固䜓衚面は、分析の必芁
成分の衚面ぞの結合を助けるため、たたは衚面ぞ
の成分の非特異的結合を抑制するために、被芆し
おあ぀おも被芆しおいなくおもよい。倚くの堎合
に、固䜓衚面は、容噚の壁たたは容噚䞭の翌板で
あり、固䜓非倚孔性粒子もたた、それ自䜓で、あ
るいは容噚壁ず組み合わせお、䜿甚するこずがで
きる。粒子は100nm乃至玄mmの範囲の倧きさず
するこずができるが、通垞は玄10Όを超えるこず
はない。 信号発生系−信号発生系は、その基瀎ずしお䞀
方の生成物が他方の基質であるずいう関係をも぀
酵玠を有しおいる。それ故、酵玠がきわめお
近䌌しおいるずきは、系列䞭の第䞀の酵玠の生成
物の系列䞭の第二の酵玠によるより倧きな入れ代
わりが予想される。それ故、信号発生系の郚分ず
しお、少なくずも化合物が存圚し、その化合物
を第䞀の酵玠によ぀お倉性するこずによ぀お生じ
る生成物は、第二の酵玠による倉性によ぀お、盎
接的たたは間接的に、怜出可胜な信号を提䟛する
第二の生成物を䞎えるこずができる。しかしなが
ら、信号発生系䞭には、酵玠的觊媒反応のためた
たは第二の酵玠の生成物ず䜜甚しおたたは反応し
お怜出可胜な信号を䞎えるために必芁な倚くの他
の成分を含有しおいおもよい。倚くの堎合に、信
号は通垞は玫倖たたは可芖の範囲の電磁攟射線の
吞収たたは発光であるが、電気化孊的倉化、熱的
倉化、濁床的な倉化などもたた、応甚するこずが
できる。 ミツプ−酵玠−結合䜓−信号発生系の成分であ
る酵玠の䞭の䞀方ず結合する結合䜓配䜍子ある
いは受容䜓。ミツプは分析察象物たたはその盞補
察メンバヌであ぀おも、そうでなくおもよい。結
合䜓は配䜍子−酵玠−結合䜓たたは受容䜓−酵玠
−結合䜓を指すこずが適切である。 方 法 本発明の分折は、䞀般には最適分析感床に近
い、適床はΩの氎性の区域䞭で、分折成分たたは
生成物の分離なしに、遂行する。分析察象物の定
量のための分折区域は、通垞は緩衝した、適圓な
氎性媒䜓、事前の凊理を斜しおあ぀おもよい未知
詊料、ミツプず酵玠を結合せしめる固䜓衚面、ミ
ツプ−酵玠−結合䜓、怜出可胜な信号を発生する
ための信号発生系に察しお必芁な残りのすべおの
材料、䞊びに必芁に応じミツプたたはミツプ類䌌
䜓を䜿甚するこずによ぀お調補する。 未知詊料䞭の分析察象物の存圚は、固䜓衚面ず
分析媒䜓䞭の党溶液の間のミツプ−酵玠−結合䜓
の分配に圱響する。 分析の遂行においおは、通垞は氎性の媒䜓を䜿
甚する。アルコヌル、゚ヌテルなどを包含する、
通垞は〜、さらに通垞は〜の炭玠原子の
酵玠含有有機溶剀を含むその他の極性溶剀をも含
有させるこずができる。通垞はこれらの共溶剀は
箄40重量未満、さらに普通には玄20重量未満
の量で存圚させる。 媒䜓に察するΩは通垞は玄〜11の範囲、さら
に普通には玄〜10の範囲、奜たしくは玄6.5〜
9.5の範囲ずする。Ωは受容䜓による特異的な結
合の有意な氎準を保぀ず共に信号発生効率を最適
化するように遞ぶ。堎合によ぀おは、考慮すべき
これらの芁件の間で歩み寄りを行なう。望たしい
Ωを達成し䞔぀定量の間のΩを維持するために、
皮々の緩衝剀を䜿甚するこずができる。代衚的な
緩衝剀は、ホり酞塩、リン酞塩、炭酞塩、トリ
ス、バルビタヌルなどを包含する。䜿甚する特定
の緩衝剀は本発明に察しお重倧なこずではない
が、個々の分折に察しお特定の緩衝剀が他のもの
よりも奜適なこずがある。 分析の遂行に察しおは通垞は適床な枩床を䜿甚
し、䞔぀通垞は、特に速床の枬定に察しおは、枬
定時間䞭で䞀定の枩床を䜿甚する。枬定のための
枩床は、䞀般には玄10〜15℃、さらに普通には玄
15〜40℃の範囲である。 分析するこずができる分析察象物の濃床は䞀般
に玄10-4〜10-8M、さらに通垞は玄10-6〜10-18M
の範囲で倉えるこずができる。分析が定性、半定
量的たたは定量的の䜕れであるかずいうこず、特
定の怜出方法及び察象ずする分析物の濃床ずいう
ような考慮すべき条件によ぀お、他の詊料の濃床
を決定する。 分析媒䜓䞭の各詊薬の濃床は䞀般に、分析察象
物に぀いお関䞎する濃床範囲によ぀お決定される
けれども、各詊薬の最終濃床は通垞は、関䞎する
範囲にわた぀お分析の感床を最適化するように、
経隓的に決定する。分析察象物に察しお盞補的な
特異的結合察のメンバヌの党結合サむトは、分析
察象物の結合サむトに基づいお関䞎する最䜎濃床
の玄0.1倍よりも少ないこずはなく、通垞は関䞎
する最倧濃床の玄0.1〜100倍、さらに普通には玄
0.3〜10倍である。ここでいう濃床は、可胜な濃
床、すなわち、飜和における濃床を意味し、特異
的結合察のメンバヌを結合に察しお同様に利甚し
埗ないこずもある実際の濃床である必芁はない。 詊薬の本質、及びプロトコヌルに䟝存しお、
個々の詊薬の濃床を広く倉えるこずができる。た
ずえば、分析察象物が抗原であり、䞔぀固䜓衚面
に結合したミツプずミツプ−酵玠−結合䜓が䜕れ
も抗原に察する受容䜓である堎合には、抗原の党
量ず比范しお衚面䞊に著るしく倧過剰のミツプを
有するこずができる。普通は、固䜓衚面に結合し
た酵玠の生成物の寿呜がきわめお短かいかあるい
は党溶液䞭の生成物の濃床をきわめお䜎い氎準に
保぀ために党溶液䞭で捕捉剀を甚いる堎合を陀け
ば、倧過剰のミツプ−酵玠−結合䜓を存圚せしめ
るこずはない。 各成分の添加の順序は、平衡方匏たたは速床方
匏の䜕れを甚いるかずいうこず、及び䜿甚するミ
ツプの本性に䟝存しお、倉えるこずができる。 倚くの受容䜓においおは、ミツプの䌚合は分析
䞭の間䞭ほずんど非可逆であるから、通垞は、結
合䜓のミツプに察しお補完的なミツプ衚面に結合
させる堎合に、ミツプ−酵玠−結合䜓を詊料より
も前に固䜓衚面に加えるこずは避ける。分析察象
物が倚䟡であり䞔぀衚面䞊のミツプずミツプ−酵
玠−結合察のミツプが同䞀である堎合には、その
限りではない。これは分析察象物䞊の異なるサむ
トに指向する単䞀分枝系抗䜓を䜿甚する堎合にも
圓おはたる。分析察象物の本性及び速床たたは平
衡枬定の䜕れを行なうかにかかわりなく、党成分
を同時に加えるこずもできる。 掗浄段階は避けるこずが通垞は望たしいけれど
も、堎合によ぀おは詊料を固䜓衚面に加え、枩眮
し䞔぀掗浄しお、信号発生系を劚害するおそれの
ある内因性の物質を陀くこずが奜たしい。 分析には以䞊の枩眮工皋を包含させるこずが
できる。たずえば、抗原分析物を衚面ず共に、あ
るいは、ミツプ−酵玠−結合䜓ず共に、他の成分
を加える前に、枩眮するこずが望たしいこずがあ
る。枩眮期間を眮くかどうかずいうこず及びその
枩眮時間の長さは、枬定の方匏速床たたは平
衡及び盞補ミツプの結合の速床に倧きく䟝存す
る。通垞は、枩眮工皋は玄0.5分乃至24時間、さ
らに普通には玄分乃至時間の範囲である。枩
眮枩床は䞀般に玄〜50℃、さらに普通には玄15
〜37℃の範囲である。 詊薬を混合したのち、信号を枬定する。回以
䞊の読みが行なわれるが、所定の時間間隔にわた
る信号氎準の差を甚いるこずが倚い。枬定の方法
は、吞光たたは発光の䜕れかの電磁攟射線、特に
玫倖及び可芖光、比色、電気化孊的、比濁的など
の芳枬ずするこずができる。信号は玫倖たたは可
芖領域、特に玄250〜750nm、通垞は玄350〜
650nmの電磁攟射線ずしお読むこずが望たしい。 信号を芳枬する枩床は䞀般に玄10〜50℃、さら
に普通には玄15〜40℃である。 既知量の分析察象物を含有する暙準分析媒䜓を
調補する。次いで暙準分析媒䜓に察する芳枬信号
を、信号ず濃床を関係させるようにプロツトす
る。暙準曲線を確立すれば、信号を分析察象物の
濃床ず盎接に関係づけるこずができる。 信号を枬定するための時間は、速床たたは平衡
方匏の䜕れを甚いるか、必芁ずする感床、信号発
生系の本質などによ぀お異なる。速床方匏に察し
おは、読みの間の時間は䞀般に玄秒乃至時
間、通垞は玄10秒乃至時間の間で異なる。平衡
方匏に察しおは、定垞状態に達したのち、単独の
読みで十分であるか、たたは適宜の間隔における
回の読みで十分である。 配䜍子は、モノ−たたはポリ゚ピトピツクのも
のずするこずができる。゚ピトピツクずは、他の
分子が特異的に結合する分子䞊の特異的サむトを
意味する。倚くの堎合に、配䜍子がモノ−たたは
ポリ゚ピトピツクの䜕れであるかは、分析をどの
ように遂行するかには圱響しない。分析察象物が
配䜍子である堎合には、衚面に結合したミツプは
配䜍子たたは受容䜓、通垞は受容䜓ずするこずが
できる。ミツプ−酵玠−結合䜓は配䜍子たたは受
容䜓の䜕れかを有するこずができる。しかしなが
ら、衚面に結合したミツプ及びミツプ−酵玠−結
合䜓が共に受容䜓である堎合には、配䜍子はポリ
゚ピトピツクであるかたたは远加の詊薬ずしおポ
リ配䜍子類䌌䜓を䜿甚するこずによ぀おポリ
゚ピトピツクにしなければならない。すなわち、
配䜍子が衚面に結合したミツプに結合しお衚面ぞ
のミツプ−酵玠−結合䜓の結合のための配䜍子゚
ピトピツクサむトを提䟛するずいうサンドむツチ
方法を甚いる。 受容䜓が分析察象物である堎合には、衚面に結
合したミツプずミツプ−酵玠−結合䜓は同䞀たた
は異なるミツプを有するこずができ、䜆しここで
配䜍子が䞡結合䜓䞭に含たれる堎合には受容䜓は
倚䟡であるこずを条件ずする。 分析察象物、衚面に結合したミツプ及びミツプ
−酵玠−結合䜓がすべお同䞀タむプのミツプであ
るかたたは同䞀タむプのミツプを含有しおいる堎
合には、単分枝系抗䜓が含たれるのでない限り
は、同族メンバヌを添加しなければならず䞔぀、
それが受容䜓である堎合には、抗䜓たたはその他
の倚䟡受容䜓の䜕れかずしお、あるいはそれが配
䜍子の堎合には、ポリハプテンポリ配䜍子類
䌌䜓ずしお、ポリ゚ピトピツク圢態で提䟛し
なければならない。 ミツプ−酵玠−結合䜓は分析察象物に察しお盞
補的である必芁はない。倚くの堎合に、配䜍子に
察しお盞補的である受容䜓に耇数の酵玠が結合す
るために、ミツプ−酵玠−結合䜓が受容䜓を認識
するこずが望たしい。 材 料 分析においお䜿甚する成分は、分析察象物を含
有する詊料、ミツプず信号発生系を結合させるべ
き固䜓衚面、信号発生系の残りのメンバヌ、及び
適切なものずしお、ミツプである。䜜甚物の調補
においお䜿甚するものは固䜓衚面ずミツプであ
る。 分析察象物 本発明の配䜍子分析察象物は、モノ゚ピトピツ
クたたはポリ゚ピトピツクである。ポリ゚ピトピ
ツク配䜍子分析察象物は通垞はポリアミノ酞、
たずえばポリペプチド及び蛋癜質、倚糖類、栞
酞、䞊びにそれらの混合物である。このような混
合物たたは集合物は、现菌、ビヌルス、染色䜓、
遺䌝子、ミトコンドリア、现胞栞、现胞膜などを
包含する。 倚くの堎合に、本発明においお䜿甚するポリ゚
ピトピツク配䜍子分析察象物は、少なくずも玄
5000、さらに普通には少なくずも10000の分子量
を有しおいる。ポリアミノ酞領域においお
は、興味あるポリアミノ酞は䞀般に玄5000〜
5000000の分子量、さらに普通には玄20000〜
1000000の分子量であり興味あるホルモンにお
いおは、分子量は通垞は玄5000〜60000にわた぀
おいる。 広い皮類の配䜍子が米囜特蚱第4193983号に蚘
されおおり、その説明は参考のためにここに線入
する。たた、配䜍子類䌌䜓の説明もたた、この文
献䞭に認めるこずができ、その蚘述もたた参考の
ためにここに線入する。 信号発生系 信号発生系は少なくずも次の成分を有しおい
る第䞀及び第二の酵玠これらの酵玠は第䞀の
酵玠の生成物が第二の酵玠の基質であるこずによ
぀お関連しおいる及び䞡酵玠の基質。酵玠觊媒
反応の䞀方たたは䞡方のために、あるいは第二の
酵玠の生成物ず䜜甚たたは反応させお怜出可胜な
信号を䞎えるために、远加の成分を必芁ずするこ
ずもある。 信号発生系は、倚くの堎合に、光を吞収する発
色団のような、電磁攟射線の枬定をもたらす生成
物、あるいは、たずえば螢光䜓たたは化孊ルミネ
センス䜓のような、発光をもたらす生成物を提䟛
する。 酵玠の遞択においおは、酵玠の入れ代わりの速
床に察する粒子の圱響のほか、他の考慮すべき条
件もたた酵玠の遞択に圱響する。これらの条件
は、酵玠の安定性、高い入れ代わり速床の必芁
床、物理的環境の倉化に察する速床の感床、基質
たたは生成物、奜たしくは生成物、の本性、酵玠
の入手し易さ、酵玠の性質に察する酵玠の結合の
圱響、詊料溶液䞭で遭偶する可胜性のある物質の
酵玠掻性に察する圱響、酵玠の分子量などを包含
する。 前蚘の特蚱文献䞭には酵玠に぀いおの広範な説
明があり、その説明もたた参考のために本明现曞
䞭に線入する。 皮々の酵玠の組合わせを䜿甚するこずができ
る。連の組合わせにおいおは、NADたたは
NADPあるいはそれらの還元生成物を枬定すべ
き胜力を甚いる。これらの組合わせにおいおは、
NADに䟝存する酞化還元酵玠を、酞化還元酵玠
に察する基質を提䟛する酵玠ず共に䜿甚する。枬
定する生成物を生じさせるために、広い皮類の酵
玠及び反応を甚いるこずができるが、酵玠の倚く
は炭氎化物代謝の䞀郚である。盞圓な数のこれら
の酵玠がリン酞゚ステルの生成ず倉換に関係す
る。関係する可胜性のあるその他の反応ずしおは
リアヌれによる炭玠−炭玠結合の開裂、ケト−ア
ルデヒド倉換を䌎なう異性化及び脱カルボキシル
化である。 特に興味のあるものは糖を包含する組合わせで
あ぀お、その堎合に第䞀段階においお転移酵玠、
加氎分解酵玠、リアヌれたたはむ゜メラヌれは、
特にリン酞゚ステルを䌎な぀お、酞化還元酵玠に
䟝存するNADの基質を䞎える。特に有甚な
ものは酞化還元酵玠反応における酵玠基質ずしお
〜炭玠原子を有する単糖類モノリン酞であ
る。 䞋衚は、酞化還元酵玠に察する前駆物質が生成
し䞔぀NAP䟝存酵玠の反応の経過ののちにNAD
たたはNADPのその還元圢態ぞあるいは還元圢
態からの倉換が続く堎合の倚数の実䟋を瀺す。各
䟋においお䞡酵玠は信号発生系の郚分である。
【衚】 デヒドロゲナヌれ

【衚】 ドロゲナヌれ
その他の酵玠の組合わせは過酞化氎玠の生成を
包含するが、その堎合に化孊ルミネセンス材料、
たずえばルミノヌル、を䌎なう過酞化氎玠のペル
オキシダヌれによる觊媒反応が光を生じさせる。
ルミノヌルのほかに、その他の−ゞヒドロ
−−フタルアゞンゞオン類を甚いるこずも
できる。これらは−アミノ−−トリ
メトキシ−及びゞメチルアミノ〔ca〕ベンズ類
䌌䜓を包含する。その他の化合物は、芪化合物に
察する䞀般名ずしおロフむンを有する。
−トリプニルむミダゟヌル類であり、䞔぀パ
ラ−ゞメチルアミノ及び−メトキシ眮換した化合
物もたた有甚である。化孊ルミネセンス化合物を
光の盎接源ずするこずができ、たたは、たずえば
10−ゞブロモアントラセンのような受容䜓ず
反応させお、それを発光させるこずもできる。あ
りいはたた、過酞化氎玠ず共に酵玠的な觊媒反応
を受けお怜出可胜な着色圢態を䞎える、皮々な染
料前駆物質を甚いるこずもできる。 䞋衚は䞡酵玠を信号発生系の成分ずしおいる、
倚くのこれらの反応を瀺す。
【衚】 以䞋の系列の反応は、氎を包含する反応、通
垞は加氎分解酵玠を包含する反応に基づくもの
であるけれども、シンテタヌれをも䜿甚するこず
ができる。
【衚】 以䞋の系列の組合わせは、受容䜓たたは䟛䞎䜓
から電子を䟛䞎たたは受容するこずができ、その
結果ずしお受容䜓たたは䟛䞎䜓の吞収スペクトル
に実質的な倉化が存圚する酵玠に察する第䞀段階
における基質の調補を包含する。倚くの堎合に、
第二の酵玠は酞化還元酵玠、特にデヒドロゲナヌ
れ及びオキシダヌれである。この系列においお䞡
酵玠は信号発生系の成分である。
【衚】
【衚】 本発明においおは、それ故、第䞀の酵玠反応が
第二の酵玠反応に察する基質を提䟛するように働
らく。第二の酵玠反応は、盎接に、たたは付加的
な反応によ぀お、特に300nm以䞊、奜たしくは
350nm以䞊、さらに奜たしくは400nm以䞊の光の
吞収350nmを超え、奜たしくは400nmを超え、
さらに奜たしくは450nmを超える波長の光を発す
る螢光あるいは化孊ルミネセンスによ぀お、分
光光床的に枬定するこずができる化合物の生成を
結果する。光の吞収の枬定のためには、消光率は
䞊蚘の波長を超える吞収に察しお103mol-1より
も倧きく、奜たしくは104よりも倧きくなければ
ならない。 前蚘のように、分析察象物の量に関係しお衚面
に結合するミツプの各盞補察に察しお衚面に結合
する耇数のミツプ−酵玠−結合䜓を有するこずに
よ぀お、怜出可胜な信号を著るしく増倧させるこ
ずができる。かくしお、宿䞻からのたずえば抗
䜓のような受容䜓及び第二の宿䞻からの酵玠に結
合する抗受容䜓を有するこずによ぀お、衚面ぞの
受容䜓の結合は、かかる受容䜓に結合する耇数の
抗受容䜓−酵玠−結合䜓をもたらす。これは、
抱合䜓の酵玠が衚面に結合た酵玠により生じる生
成物の䞻芁郚分を捕捉するこずを可胜ずしお、党
媒䜓䞭で生じる怜出可胜な信号発生生成物の量を
最䜎にするずいう効果を有する。 バツクグラりンドを䜎䞋させる別の方法は、党
媒䜓䞭に捕捉剀を存圚せしめるこずである。たず
えば、第䞀の酵玠の生成物が過酞化氎玠であるず
きは、党媒䜓䞭に過酞化氎玠を分解するカタラヌ
れたたはその他の反応物を䜿甚するこずができ
る。党媒䜓䞭に捕捉剀を存圚せしめるこずによ぀
お、䞡酵玠の党䜓的な入れ代わり速床の倚少の䜎
䞋があるけれども、バツクグラりンド信号ず比范
しおの、分析察象物の量に関係する信号発生生成
物の生成の比率の実質的な増倧が予想される。 各酵玠系ず共に、捕捉剀ぞの異なるアプロヌチ
を甚いるこずができる。衚面ぞのミツプ−酵玠−
結合䜓の結合の効果は、ミツプ−酵玠−結合䜓が
溶液本䜓䞭にある堎合よりも、少なくずも倍、
さらに普通には10倍、より奜たしくは100倍の速
床差を提䟛するこずが望たしい。 固䜓衚面 倩然たたは合成の、有機あるいは無機材料を包
含するこずができる、広く異なる固䜓衚面を䜿甚
するこずができる。特に興味あるものは、たずえ
ばポリスチレン、ポリ゚チレン、ポリプロピレン
などのような、合成重合䜓、特に付加重合䜓、通
垞は炭化氎玠重合䜓である。 固䜓衚面は、共有結合たたは非共有結合のどち
らかで、ミツプず酵玠を結合するこずができる
か、あるいは官胜化たたは適圓な材料による被芆
によ぀お、それが可胜であるこずが必芁である。
䞍掻性な固䜓衚面を、共有結合的に蛋癜質を結合
するこずができるように倉性するためには、広く
異なる官胜基を甚いるこずができる。官胜基ずし
おは掻性ハロゲン化物、゚ポキシド、非オキ゜−
カルボニル化合物、メルカプタンなどが含たれ
る。ミツプず酵玠の衚面ぞの抱合の特定方匏は、
それぞれが分析に察しお必芁な性質を維持する限
りは、本発明にず぀お限定的ではない。 別法ずしお、固䜓衚面をポリアミノ酞、た
ずえばポリリシン、で被芆しお、そのポリアミ
ノ酞を、固䜓衚面ずポリヘプチド配䜍子たたは
受容䜓及び酵玠の間の䞭間的結合剀ずしお、働ら
かせるこずもできる。 拡散の速床は、所望の感床を取埗するために必
芁な時間を望たしくない皋床に増倧させるおそれ
があるから、そのような情況では、ミツプ−酵玠
−結合䜓が衚面に出合うたでの平均経路長を短か
くするために、固䜓衚面の衚面積を著るしく増倧
させるこずが望たしい。固䜓衚面積の党溶液容量
に察する比を決定するには、衚面に結合させなけ
ればならない酵玠の量に察する固䜓衚面積の増倧
の圱響、及びこの酵玠が生産する生成物の党媒䜓
䞭に逞出する量の䞡方を考慮しなければならな
い。増倧した衚面積を䞎えるために、固䜓衚面ず
しお、通路ずしお働らく倧きな穎を有する翌、粒
子などを甚いるこずができる。通垞は容噚の壁の
みを甚いるこずが望たしい。 補助材料 本発明の分析においおは、皮々の補助的な材料
を甚いるこずができる。特に、信号発生系の郚分
ずしお、酵玠基質、補足因子及び抑制因子を䜿甚
しおもよい。加うるに、緩衝剀、安定剀、界面掻
性剀、特に非むオン掻性剀のような、その他の材
料を含有させるこずもできる。 キツト 䟿宜䞊の問題ずしお、各詊薬をキツトずしお提
䟛するこずができるが、その堎合に各詊薬は興味
の範囲にある分析の感床を実質的に最適化するた
めの所定の比率で存圚せしめる。通垞は、詊薬を
粉末、特に凍結也燥した粉末ずしお甚意し、その
際、詊薬の本性ずプロトコヌルによ぀お必芁ずす
るような最䜎数の個々の配合物を䜿甚するこずに
より、䜿甚者による別々の枬定ず添加の数をでき
るだけ少なくする。その䞊に、容噚、特にミクロ
タむタヌ板を甚意しお、ミツプず酵玠を噚壁に結
合させる。結合䜓の酵玠が系列䞭の第二の酵玠で
ある堎合にミツプ−酵玠−結合䜓ず共に、䞡酵玠
に察しお必芁な基質ず捕足因子を含有せしめるこ
ずができる。前蚘のような各皮の補助材料をも含
有せしめるこずができる。 実斜䟋 以䞋の実斜䟋は䟋蚌のために瀺すものであ぀
お、限定のためのものではない。 癟分率及び郚数は、液䜓の混合物に察する容量
のほかは、特に他のこずわりがない限りは、重量
による。枩床は、他のこずわりがない限りは、摂
氏である。 ミクロタむタヌ板リンブロヌ板、フロヌ研究
所の凹所を、200Όのポリリシン溶液
mgmlで〜時間被芆した。結合しないポリ
リシンを、0.1M酞性リン酞ナトリりム
0.2MNaClΩ7.0を甚いる回の掗浄によ぀お陀
去した。次いで凹所を、グルコヌス オキシダヌ
れmgmlず人のIgG10Όmlの50ÎŒ
の混合物で、16時間被芆した。未結合の蛋癜質を
0.2M NaCl牛の血枅アルブミンmgml
及びツむヌン200.02を含有する0.1M酞性リ
ン酞ナトリりムで回掗浄した。板をこの掗浄緩
衝液200Ό凹所ず共に枩眮した。時間
埌に、板の凹所を空にしお暗所で振ずうした。 チダンネル圢の反応に察しおは、20Όの掗浄
緩衝液を凹所に入れた。非チダンネル圢反応に察
しおは20Όの人のIgGmgmlを入れた。チ
ダンネル圢ずは生成物がミクロタむタヌ板に結合
した酵玠GO及びHRPから由来するこずを
意味するのに察しお、非チダンネル圢ずは酵玠
GOのみがミクロタむタヌ板に結合し、他の
酵玠HRPは溶液䞭に遊離しおいるこずを意
味する。チダンネル圢の免疫孊的怜定に察しお
は、䞀連の垌釈床における20Όの人のIgGを加
えた。次いで30Ό䞭で玄30ngの掻性HRPに垌釈
した矊抗人IgG−ワサビ ペルオキシダヌれ−結
合䜓を各凹所に加えた。板を振ずう䞋に時間枩
眮した。次いで溶液に、ワサビペルオキシダヌれ
に察しおモル的に玄600倍過剰である100mgのカラ
タヌれを含有する0.15mlの基質12.5nMの
2′−アゞノ−ゞ−−゚チルベンゟチアゟリン
−−スルホン酞〔ABTS〕及び120mMのグル
コヌスを加えた。最終容量は0.2mlであ぀た。
時間埌に、ミクロタむタヌ板リヌダヌフロヌ
研究所䞊で、414nmにおける吞光床を読んだ。 䞋衚はその結果を瀺すが、これらの倀は詊料
の平均倀である。HIgGng凹所 吞光床 0 0.457 0.1 0.351 1 0.374 10 0.168 100 0.08 1000 0.07 10000 0.02 非倚孔性ビヌズの䜿甚を実蚌するために、以䞋
の実隓を行な぀た。玄0.94Όの倧きさのポリス
チレン ビヌズコンバスプアズコバレント
テクノロゞヌ瀟を、ビヌズの0.5分散物10ÎŒ
䞭で〜4ngの掻性グルコヌス オキシダヌれ
ず200〜400ngのhIgGがビヌズに結合する条件䞋
に、グルコヌス オキシダヌれ及び人のIgGず混
合した。 チダンネル圢の反応に察しおは、10Όの緩衝
剀を加え、䞀方、非チダンネル圢の反応に察しお
は、10ΌのHIgG20Όを加えた。次いでこ
の混合物に30Όの結合䜓100の垌釈、玄
15ngの掻性HRPを含有を加え䞔぀分析媒䜓を
箄2.5時間枩眮した。チダンネル圢の反応におい
おは、ビヌズが凝集しお凹所の底に沈殿し、かく
しお溶液は透明ずな぀た。非チダンネル圢の反応
においおは、溶液は濁぀たたたであ぀た。次いで
この混合物に、凹所圓り玄35Όの量で䞔぀カ
タラヌれのHRPに察する400のモル比を䞎え
るために十分なカタラヌれず共に、前蚘の基質溶
液を加えた。 䞋衚はその結果を瀺す。
【衚】 䞊蚘の結果は、玄100分においお最良のチダン
ネル圢信号の非チダンネル圢信号に察する比が埗
られるこずを瀺しおいる。 䞊蚘のデヌタは本発明が固䜓衚面䞊で分析を遂
行するための簡単䞔぀迅速な方法を提䟛するこず
を実蚌する。驚くべきこずに、酵玠が衚面䞊に
あるチダンネル圢の反応ず酵玠が衚面䞊にあり
他の酵玠が溶液䞭に分散しおいる非チダンネル圢
反応の間には明確な盞違を認めるこずができる。
衚面䞊の酵玠の生成物がミツプ−酵玠−結合䜓の
酵玠に察する基質ずしお働らく堎合に、衚面䞊の
酵玠の生成物を分解する捕捉剀を党溶液䞭に存圚
させるこずによ぀お、感床が増倧する。ミツプ−
酵玠−結合䜓は、存圚する分析察象物の量に関連
しお、衚面ず党溶液の間に分配される。この分析
は、物理的な分離工皋たたは詊料の添加埌の噚壁
の掗浄の䜕れをも必芁ずしない方法を提䟛するず
いう点で、特に有甚である。この方法は分析媒䜓
䞭の詊料の量の枬定のために党溶液からのミツプ
−酵玠−結合䜓の陀去を必芁ずするこずもない。 本発明を䟋蚌のために倚少詳现に説明し䞔぀理
解を明瞭ずするために実斜䟋を瀺したが、特蚱請
求の範囲内においお、いく぀かの倉曎及び修食を
行なうこずができるずいうこずは明癜であろう。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  配䜍子ずその受容䜓から成る特異的結合察の
    メンバヌである分析察象物の詊料䞭における存
    圚を枬定するための分析方法であ぀お、該方法
    は (a) 連続的な氎性媒䜓 (b) 該媒䜓ず接觊しおおり䞔぀特異的結合察のメ
    ンバヌず第䞀の酵玠が結合されおいる非倚孔性
    固䜓衚面 (c) 枬定しうる信号を発生するこずができる信号
    発生系、䜆し該信号の匷床は該媒䜓䞭の該分析
    察象物の濃床によ぀お圱響を受け䞔぀該信号発
    生系は少なくずも第二の酵玠ず該第䞀及び第二
    の酵玠の䞭の䞀぀に察する基質を包含しおい
    る (d) 該第二の酵玠は特異的結合察のメンバヌ−酵
    玠−結合䜓を䞎えるように特異的結合察のメン
    バヌに結合せしめられおいる、ここで固䜓衚面
    に結合した特異的結合察のメンバヌ−酵玠−結
    合䜓の量は該氎性媒䜓䞭の分析察象物の量に関
    連しおいる ここで、䞊蚘぀の酵玠は䞀方の生産物が他方
    の基質であるずいう関係を有しおいる を採甚し、そしお該方法は 該特異的結合察のメンバヌず該第䞀の酵玠を結
    合せしめた該固䜓衚面を、 (a)該詊料(b)該特異的結合察のメンバヌ−酵玠
    −結合䜓(c)該分析察象物、特異的結合察のメン
    バヌ−酵玠−結合䜓及び衚面に結合した特異的結
    合察のメンバヌが同䞀である堎合、該特異的結合
    察の盞補的メンバヌ、および (e) 該䞡酵玠の少なくずも䞀぀に察する基質及び
    該信号発生系の残䜙のメンバヌ、 を含有しおなる氎性の分析媒䜓 ず組合せ、 䜆し分析察象物が第䞀の受容䜓であるずき
    は、該固䜓衚面に結合せしめた該特異的結合察
    の該メンバヌは配䜍子たたは該第䞀の受容䜓の
    ための受容䜓ずするこずができ䞔぀該酵玠結合
    䜓の該メンバヌはそれぞれ該第䞀の受容䜓のた
    めの受容䜓たたは配䜍子ずするこずができ䞔
    ぀ 該氎性の分析媒䜓䞭の該信号の匷床を、既知
    量の分析察象物を含有する分析媒䜓ず比范しお
    枬定する、 こずから成る分析方法。  該固䜓衚面は容噚壁である特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の方法。  該固䜓衚面は非倚孔性粒子である特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の方法。  媒䜓に察するΩは玄〜10の範囲にある特蚱
    請求の範囲第たたは項蚘茉の方法。  該酵玠の䞀぀は加氎分解酵玠である特蚱請求
    の範囲第たたは項蚘茉の方法。  該酵玠の䞀぀は酞化環元酵玠である特蚱請求
    の範囲第たたは項蚘茉の方法。  該酞化還元酵玠はオキシダヌれである特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の方法。  配䜍子及びその受容䜓から成る特異的結合察
    のメンバヌの詊料䞭における存圚を枬定するた
    めの分析方法であ぀お、該方法は (1) 箄6.5〜9.5の範囲のΩにおける氎性の緩衝連
    続盞から成る媒䜓、及び該特異的結合察の䞭の
    䞀぀ず第䞀の酵玠ずを結合せしめお結合担䜓を
    䞎える担䜓ずしおの固䜓非倚孔性盞、䞊びに (2) 枬定しうる信号を発生するこずができ䞔぀特
    異性結合察のメンバヌ−酵玠−結合䜓を䞎える
    ために特異的結合察のメンバヌに結合せしめる
    第二の酵玠ずを有する信号発生系 を䜿甚し、ここで該第䞀及び第二の酵玠は該信号
    発生系を芏定し䞔぀第䞀及び第二の酵玠は䞀方の
    生産物が他方の基質であるこずによ぀お関連を有
    しおおり、ここで該枬定しうる信号は該担䜓ず該
    氎性の媒䜓の間の該特異的結合察のメンバヌ−酵
    玠−結合䜓の分配に関係しお倉化し、該分配は該
    媒䜓䞭の分析察象物の量に関係しおおり、 該方法は 該特異的結合察のメンバヌ及び該第䞀の酵玠を
    結合せしめた該担䜓を、 (a)該詊料(b)該特異的結合察のメンバヌ−酵玠
    −結合䜓(c)該分析察象物、担䜓及び特異的結合
    察のメンバヌ−酵玠−結合䜓が特異的結合察の同
    䞀のメンバヌを有する堎合には、該特異的結合察
    の盞補メンバヌ䞊びに(d)基質及び該信号発生系の
    付加的メンバヌから成る氎性媒䜓ず組み合わせ、
    䜆し、その際、特異的結合察のメンバヌ−酵玠−
    結合䜓は、該氎性媒䜓ず該担䜓の間で、該詊料䞭
    の分析察象物の量に䟝存する量で分配され䞔぀ 該分析媒䜓䞭の該信号の匷床を、既知量の分析
    察象物を含有する分析媒䜓ず比范しお枬定する、
    こずから成る特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  いずれの酵玠も酞化還元酵玠である特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の方法。  該酵玠の䞭の䞀぀は過酞化氎玠を生産する
    ものである特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  該氎性媒䜓䞭に、酵玠過酞化氎玠捕捉剀を
    含有せしめる特蚱請求の範囲第項蚘茉の方
    法。  該酵玠の䞭の䞀぀はグルコヌスオキシダヌ
    れであり䞔぀該酵玠の他方はワサビペルオキシダ
    ヌれである特蚱請求の範囲第たたは項蚘
    茉の方法。  耇数の凹所を有するミクロラむタヌ板、䜆
    し該凹所の壁には第䞀の酵玠ず特異的結合察のメ
    ンバヌが結合しおいる第二の酵玠を有する特異
    的結合察のメンバヌ−酵玠−結合䜓、䜆し該぀
    の酵玠は該酵玠の䞀方の生産物が該酵玠の他方の
    基質であるこずによ぀お関連しおいる及び該
    の酵玠に察する少なくずも぀の基質の組み合わ
    せ から成るキツト。  ぀の酵玠は酞化還元酵玠である特蚱請求
    の範囲第項蚘茉のキツト。  該酞化還元酵玠の䞭の䞀方はグルコヌスオ
    キシダヌれであり䞔぀該酞化還元酵玠の䞭の他方
    はワサビペルオキシダヌれである特蚱請求の範囲
    第項蚘茉のキツト。  該基質はワサビペルオキシダヌれを觊媒ず
    する反応によ぀お酞化せしめられた染料を包含す
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉のキツト。
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