JPH04503758A - 表面プラズモン共鳴スペクトロメトリーによるアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 表面プラズモン共鳴スペクトロメトリーによるアッセイ法 本発明は、表面プラズモン共鳴スペクトロメトリー（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓ ｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、　５ＰＲＳ）技術に より酵素アッセイを行う方法ニ関スル。

ＳＰＲ現象は周知であるので詳述しない（たとえば欧州特許出願第３０５１０９ 号明細書参照）。要約すると、光学的に透明な材料、たとえばガラスと金属薄膜 の境界面から反射する単色直線偏光（通常はレーザーから得られる）の強度は金 属の下流側にある材料の屈折率により定まる。従って反射光の強度の変化を測定 することにより、金属の下流面の特定の地点にある材料の屈折率の変化の指標が 得られる。反射光の強度は入射角によっても変化し、反射能はその装置に特徴的 な特定の角度における最小値まで急激に低下する。

通常のアッセイ法において、酵素を用いて基質を分子数の多い観察可能な産生物 に変換する反応を触媒することにより感度を改良しうろことは周知である。本発 明は、より高いかまたは低い屈折率の物質である反応産生物を５ＰＲ３検出面に 析出させることにより、酵素または酵素基質をアッセイするものである。

本発明は、２種以上の反応体間の反応を触媒して反応産生物を産生ずる固定化酵 素または該酵素の基質を保有する固体表面を使用し、該固定化酵素または酵素基 質に、残りの反応体および既存でない場合には酵素を含有する流体媒質を、該固 体表面に反応産生物を析出させる条件下で接触させることよりなるアッセイ法に おいて、 固体表面が電磁線に対して透明な材料のブロックに付与された金属層により与え られ、金属層の表面における反応産生物の析出が表面プラズモン共鳴スペクトロ メトリー（ＳＰＲ３）によりアッセイされることを特徴とする方法を提供する。

被分析体は酵素または酵素基質であってもよい。５ＰＲＳ装置は通常のものでよ い。酵素を金属、たとえば銀層の表面に通常の手段で、たとえば共有結合または 単純な物理的吸着により固定化することができる。ビオチニル化した酵素はスト レプトアビジンが結合している金属表面に固定化することができる。事実、固走 化はＤＮＡ／ＤＮＡまたは抗体／抗原を含めていかなる結合対を伴うものであっ てもよい。たとえば表面結合抗体を用いて抗原を捕捉し、これにより次いで酵素 −抗体結合体を捕捉することができる。あるいは酵素基質を金属層の固体表面に 固定化してもよい。

その酵素の作用により得られる反応産生物が金属表面にまたはそれに極めて近接 して（すなわち数百ナノメーター以下の薄い層内に）固定化されることが必要で ある。反応産生物はその層内に存在する物質より高いかまたは低い屈折率をもつ であろう。適切な酵素の例は下記のものである：ａ）Ｈ，Ｏ，およびジアミノベ ンジジン（ＤＡＢ）を基質とするペルオキシダーゼ。

後者は不溶性産生物に変換される。

ｂ）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈおよびテトラゾリウム塩を特徴とする特定のオキシドレダ クターゼ。後者は不溶性産生物（ホルマザン）に変換される。他の還元体および 色素の組み合わせがある。（参照：アルトマン（Ｆ　Ｐ　Ａｌｔｍａｎｎ）　、 　１９７２．　’Ａｎｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ 　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　５ａｌｔｓ　ｉｎ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｅ ｎ嘯凾hＩｌｅ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　’、コツホ−ライト・ラボラトリーズ発行、コー ンプルツク。

パックス、英国） Ｃ）気体を発生し、その気泡が金属表面に近接して保持される特定のカタラーゼ 酵素が知られている。

ｄ）他の酵素およびそれらの関連基質はアームリッド（＾ａｍｌｉｄ）ら、　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｉｎｄｕｔｒｙ、１９８９年２月２０日、１０６−８ 頁に記載されている。

本方法により行われるアッセイは定性、すなわち単に試料中の被分析体の存否を 検知するもの、または定量のいずれであってもよい。定量的アッセイのためには 、測定は反射能の変化速度および／または特定の時点における絶対反射能からな る。流体媒質と固定化酵素との接触は静的であってもよいが、たとえば金属表面 を横切って流体媒質を流動させることにより動的である方がより好ましい。

１形態においては、アッセイされる被分析体は固定化酵素の基質、すなわち反応 がその酵素により触媒される反応体の１種である。この場合アッセイは単に、被 分析体を含むと思われる試料を酵素が必要とする他の反応体と共に流体媒質中に 導入することにより行われる。

他の形態においては、被分析体はたとえば細菌細胞の電子伝達鎖の一部として存 在する酵素である。生存細菌は反応産生物を析出するのに対し、非生存細菌は析 出しない。

さらに他の形態においては、その産生物が固定化酵素の基質である第２酵素を用 いる。この系は第２酵素の基質に関するアッセイに用いることができ、従ってそ の利用性が大幅に拡大される。第２酵素は流体媒質中に溶解して存在してもよく 、あるいは固体表面に固定化されてもよい。添付の図面を参照する。第１図は本 発明の５形態の反応様式を示す５図（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ ｅ）からなる。各図において、ＳＰＲシステムの一部をなす金属層１０が固体表 面１２を備え、これと接触して流体媒質１４がある。図（ａ）においては、固体 表面１２に付着したペルオキシダーゼ酵素ＰがＨ２Ｏ，の存在下でジアミノベン ジジン（ＤＡＢ）を表面付随の不溶性産生物に変換しつる。従って、この様式は Ｈ，Ｏ！のアッセイに用いることができる。

同様に図（ｂ）においては、オキシドレダクターゼ酵素Ｒがネオテトラゾリウム 色素（ＮＴＺ）を不溶性産生物に還元する反応を触媒する。従ってこの様式は還 元体のアッセイに用いることができる。

図（Ｃ）は、ｉ−ｉ、ｏ、発生酵素、たとえばグルコースオキシダーゼ（Ｏｘ） がペルオキシダーゼにＨ，Ｏ，（これは両反応に共通、すなわち前者の産生物で あり、−かつ後者の基質である）を介して機能的に利用される様式を示す。従っ て図（ｃ）の全反応は下記のとおりとなるニ ゲルコース　十　〇！＋ＤＡＢ−−−−→　グルクロン酸　十〇ＩＯ＋　不溶性 産生物 従ってこの様式はグルコースのアッセイに用いることができる。

図（ｄ）においては、デヒドロゲナーゼ酵素（Ｄｈ）がオキシドレダクターゼ酵 素（Ｒ）にＮＡＤＨ（これは両反応に共通、すなわち前者の産生物であり、かつ 後者の基質である）を介して機能的に連結している。エタノールがデヒドロゲナ ーゼ酵素の基質であり、アセトアルデヒドが産生物である場合、図（ｄ）の全反 応は下記のとおりとなる： エタノール　＋　ＮＴＺ　−−−→　アセトアルデヒド　＋　不溶性産生物従っ てこの様式はエタノールのアッセイに用いることができる。

図（ｅ）は、オキシドレダクターゼ酵素が金属層１０の固体表面工２に固定化さ れた状態で示される意思外は、図（Ｃ）に対応する。これによって、行われる全 反応に変化はない。（ｄ）に関連して、かつデヒドロゲナーゼ酵素を固体表面に 固定化した状態で示して、対応する図を描くことができる。

下記の実施例は本発明を説明するものである。

実施例１ グルツースアッセイ スライドコーティング １０ｍＭリン酸ナトリウム−ｐＨ７，４−を、銀コートしたスライドを横切って ２μｌ／秒でポンプ送りした。これに続いてリン酸緩衝液中の０．　５μＭスト レプトアビジンを２μＩ／秒で送り、０．３ｍｌのリン酸緩衝液で３回洗浄した 。

次いでリン酸緩衝液中の０．２５μＭビオチニル化ホースラディツシュペルオキ シダーゼを２μｌ／秒で、ストレプトアビジンコートしたスライド上で流動させ た。このスライドを０．３ｍｌのリン酸緩衝液により２μｍ／秒で３回洗浄した 。

次いで、下記により調製した種々のグルコース濃度の反応混合物を、ホースラデ ィツシュペルオキシダーゼコートした銀スライドを横切って流動させ、反射能の 経時変化（速度）または反射能の全変化（平衡）を観察した。

グルコースミックス グルコース反応ミックスは１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液−ｐＨ７，４−中に 適宜な濃度（０−２０μＭ）に希釈された１０μｍのグルコースオキシダーゼ（ １０ｍｇ／ｍｌ）、１０μ】のグルコース（原液５０ｍＭ）を含有していた。

この混合物を室温で１０分間インキュベートした。次いで１ｍｌのジアミノベン ジジン溶液（０，５ｍｇ／ｍｌ、リン酸ナトリウム緩衝液−ｐＨ７，２−中）を 添加し、このミックスを前記に従ってコートしたスライド上で流動させた。ゼロ グルコースの対照も実施した。平衡および速度の測定結果（傾斜）を次表に示す 。

グルコース濃度に対する用量応答を観察した。

グルコース濃度　反射能の最終変化 ２、　５　０．０２３ ５　０、　０３６３ １０　０．０４８８ ２０　０．０５９４ １ｍ１の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液−ｐＨ７，４（緩衝液１）を、銀スラ イドを横切って２μｌ／秒でポンプ送りした。次いで緩衝液１中に希釈した０゜ ５μＭストレプトアビジンを２μｌ／秒で上記の銀を横切ってポンプ送りし、続 いて０．３ｍｌの緩衝液１で３回洗浄した。次いで緩衝液１中に１００１Ｍに希 釈したビオチニル化ホースラディツシュペルオキシダーゼ溶液を２μ】７秒で、 銀表面を横切って流動させ、続いて０．３ｍｌの緩衝液１で３回洗浄した。次い で緩衝液１中に希釈されたコレステロールオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、コレ ステロール（０−２０μＭ）、ジアミノベンジジン（０，５ｍｇ／ｍｌ）を含有 するコレステロール反応ミックスを、固定化ペルオキシダーゼを含む銀表面を横 切って２μｍ／秒でポンプ送りし、ＳＰＲ角度（反射能）の変化を観察した。次 表に示すように、コレステロール濃度に伴って反射能の増加速度の変化、および 最終的な反射光の変化が生じた。

コレステ。−ル濃度　反射能の変化 １０μＭ　２４％ ２０μＭ　４５％ （ｅ） 国際調査報告 、７い、１１ユ、Ａ工、。８１．−１ＰＣＴ／困９０１００４３２国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．２種以上の反応体間の反応を触媒して反応産生物を産生する固定化酸素また は該酵素の基質を保有する固体表面を使用し、該固定化酸素または酵素基質に、 残りの反応体および既存でない場合には酵素を含有する流体媒質を、該固体表面 に反応産生物を析出させる条件下で接触させることよりなるアッセイ法において 、固体表面が電磁線に対して透明な材料のブロックに付与された金属層により与 えられ、金属層の表面における反応産生物の析出が表面プラズモン共鳴スペクト ロメトリーによりアッセイされることを特徴とする方法。
2. ２．固体表面が固定化酵素を保有する、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．アッセイすべき反応体を含むアッセイ試料を流体媒質に導入することにより 該反応体がアッセイされる、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．その反応産生物が固定化酵素の基質である第２酵素をも使用し、該方法が第 ２酵素の基質をアッセイするために用いられる、請求の範囲第２項に記載の方法 。
5. ５．第２酵素が流体媒質中に存在する、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．第２酵素が固体表面に固定化される、請求の範囲第４項に記載の方法。