JPS6337348B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、化学誘発螢光免疫分析法に関する。 大きな有機化合物の空間かつ極性構造（エピト
ープ部位）に特異的に結合する能力は、競合的蛋
白質結合分析と呼ばれる広い範囲の分析技術の基
礎となる。これらの技術は検出可能な信号を出す
被分析物を標識化することを利用している。特異
結合性対の相反的な１構成員への標識化された被
分析物との結合により、相反的な１構成員に結合
した標識化された被分析物と標識化されていない
被分析物との間に差異をもたらすことができる。
そのサンプル中の被分析物と相反的結合性１対の
構成員のための標識化被分析物との間の分析媒体
中で競争をもたらすことによつて、その媒体中の
被分析物の量を決定できる。 放射性原子、安定な遊離基、酵素および螢光を
含む広範囲な標識化が使用されて来た。その系は
Murphy、Ｊ、Clin.Endocr.27、973（1967）およ
びUSP3690834；381787及び3996345に記載され
ている。 現在行なわれている多くの系の感度および正確
性にもかかわらず、現在行なわれている系よりも
１つ又はそれ以上の利点をもつ新しい系を提供す
ることがまだ望まれている。その利点は、高めら
れた感度、その被分析物を含む媒体中に普通に存
在する物質からの妨害の減少、操作の容易性、装
置の簡略化等である。 Mossbach及びMattiason、Acta Chem.
Scand.24、2093（1970）；BBA253 253（1971）は
第１の酵素の生成物が第２の酵素の基質である２
つ又はそれ以上の酵素と支持体を結合させる時速
度の増加を教示している。類似の内容はSrere et
al、BNAS70、２、534（1973）、Hervagault、et
al、Eur.J.Biochem.51、19（1975）及びBouin et
al、BBA.438、23（1976）に報告されている。使
用された各種の酵素の組合せは、ヘキソキナゼと
グルコース−６−ホスフエイト・デヒドロゲナー
ゼ；マレート・デヒドロゲナーゼとサイトレート
シンセナーゼ及びピルベート・デヒドロゲナー
ゼ；キサンチンオキシダーゼとウリカーセ及びグ
ルコースオキシターゼとカタラーゼである。２つ
の報告書において、例えばAdv.Enzymol、34、
444（1971）及びJ.Theo.Biol.32、243（1971）にお
いてKatichalski et alはチヤンネリングの現象
を示している。又Bryce et al、Biochem.J.153
571（1976）を参照すること。 本発明により特異結合性対の１構成員である被
分析物を決定するための方法が提供される。この
方法は２つの手段を有している。すなわち本質的
に単一物をしばしば含む第１の手段（第１の化学
系）は、信号調整体と呼ばれ、溶液中の化合物の
濃度を化学的に変える。第２の手段（第２の化学
系）は信号生成手段である化学系であり、信号の
性質又は量は付近の信号調整体の濃度によつて影
響を受ける。その信号生成手段は１つ以上の成分
を有し、その信号調整体および信号生成成分は信
号生成手段の一員を構成する。 第１の手段、すなわち濃度変性手段は特異結合
性対の１構成員に結合している。第１の手段は、
普通、本質的に単一物でありうる。すなわち、１
種の主要成分、例えば触媒を有する。主要成分が
結合されており、一般に第１の手段と呼ぶ。第２
の手段（信号生成手段）の１成分も特異結合性対
の１構成員に結合しており、その１員は濃度変性
手段が結合している分子と同じかまたは異なる分
子であつても良い。第１及び第２の手段の成分に
結合している特異結合性対の１構成易の適当な選
択によつて、その媒体中の被分析物の量は、その
２つの手段が溶液中に位置している平均的な接近
距離に影響を与える。すなわち特異結合性対の相
反的な１構成員間で複合体が形成されるだろう。
その複合体中に存在する２つ又はそれ以上の１員
が２つの手段の構成員に結合している場合、平均
して、その溶液中の２つの手段の接近が非常に高
められる。従つて、第１の手段（濃度変性手段）
は第２の手段の位置の或る限定された環境におけ
る信号調整体の濃度に影響を与えることができ
る。その信号生成手段によつて生じた信号がその
信号調整体の濃度偏在によつて影響されるので、
その複合体中に生じた信号の強さ又は量はその溶
液全体に生じた信号の強さ又は量とは異なるだろ
う。分析媒体中に存在する被分析物の量は、その
２つの手段を限定されたミクロ環境において包囲
する程度に影響を与え、その結果被分析物の量の
変化が信号の強さの変化になつて表われる。既知
量の被分析物を有する標準物を使用することによ
つて、信号−濃度の関係を明らかにでき、そこで
被分析物の濃度を量的に決定できる。以下の詳細
な記載で明らかになるが「ミクロ環境」とは、溝
（チヤンネル）に集中された特異結合性対の多数
の構成品の集合体または会合体であり、溶液本体
との連絡が制限されている環境である。 本発明により特異結合性対の構成員である有機
被分析物の定量を行なうための化学分析用方法が
提供される。該特異結合性対はリガンドとリガン
ド受容体とからなり、ここに、リガンド受容体は
該リガンドの少なくとも１つの極性かつ空間的組
織（エピトープ部位）を識別するようなものであ
る。リガンドおよびリガンド受容体が部分的に閉
鎖されたミクロ環境内にあるか、または溶液中を
自由に移動するかによつて検出可能な信号が大き
く変化を受ける場合には、リガンドとリガンド受
容体が特異的に結合して接近状態になる性質を、
ミクロ環境を作り出すのに利用する。 該系は、３つの必須のあるいは主要な要素ある
いは試薬系を有している。第１の要素は第２の要
素の濃度に影響を与えるように作用する。第１の
要素は、反応性の種であつて、溶液中の或る化合
物と反応して、第３の要素と相互反応する化合物
を生成する。第３の要素は１つより多い構成員を
有する信号生成系であり、この信号は、系の１員
として作用する第２の要素の局部的濃度の相違に
従つて変化する。第２の要素の濃度が溶液のミク
ロ環境以外の部分の濃度に対して変化しているミ
クロ環境中において、第１の要素と第３の要素と
を共存させ得る限り、溶液中につくり出されるミ
クロ環境の数と性質とに応じて、種々の異なる結
果を得ることができる。第１の要素（反応性の要
素）と第３の要素の１成分（信号生成性組成物）
とを結合させて特異結合性１対の構成員とするこ
とにより、結合の生じるときに、複数個の第１お
よび第３要素が合体されて実質的に固定された空
間的関係をもたらす。相互の距離を近接させるた
めの結合体の結合の起る程度は、溶液中に被分析
物の量に応じて相違する。したがつて、観察され
る信号は、分析媒質中における被分析物の量の関
数になる。 本発明の方法は、第１の要素、すなわち反応性
の種と、これと関わり合う第３の要素すなわち、
第２の要素によつて信号を生成する組成物との相
互の関わり合いをもつ。前記の第２の要素は小さ
な化合物であることが多く、有機、無機いずれで
もよい。信号の強度または量は第３の要素の周囲
の第２の要素の濃度によつて影響を受ける。 溶液中における拡散法の性質により、制限され
たミクロ環境における３つの要素の局部濃度が大
きければ大きいほど、それだけ余計に第１の要素
（反応性要素）は、第３の要素（信号生成性組成
物）の周囲における第２の要素の濃度を高めるこ
とができる。したがつて、ミクロ環境において第
１の要素と第３の要素との距離を近接させる手段
を提供することにより、すなわち本発明において
は特異結合性１対の構成員の存在により、第１の
要素と第３の要素との相互作用が大いに高められ
る。観察される信号は次に、制限されたミクロ環
境における複数個の第１および第３要素の距離と
関わりをもつ。さらに、複数個の第１および第３
要素相互間の空気的関係が被分析物の濃度により
影響を受け得るものと仮定すれば、該被分析物の
分析を発展させることができる。特異結合性１対
の構成員に置きかわるかまたはそれらと結合する
ことにより被分析物が特異結合性１対の結合に加
わると、第１および第３要素の平均空間距離に影
響を与え、したがつて第２の要素によるそれらの
結合の程度に影響を与える。 少なくとも実質的に分析の感度を高められるよ
うに構成要素の相対的量を予め決定できる場合に
は、種々の結合体が、提供できる。さらに、他の
補助的物質を該結合体に含ませて、測定誤差を避
け、製造を簡易化することもできる。 以下、本書の全体を通して使用される特定の用
語について定義し、説明する。 “被分析物”とはモノーまたはポリエピトープ
性、抗原性若しくはハプテン性のリガンド、少な
くとも１個の共通のエピトープ部位を共有する単
一若しくは複数の化合物又は受容体である様な測
定すべき化合物または組成物のことである。 “リガンド”とはそれに対する受容体が天然に
存在するか、または製造されうる化合物のことで
ある。 “リガンド類似体”とは受容体に対して同類の
リガンドと競いあうことのできる変性リガンドの
ことであり、該変性によつて単一分子中で多数の
リガンド類似体と結合する手段またはリガンド上
の部位に標識を向けさせる手段を供給する手段が
もたらされる。リガンド類似体はリガンド類似体
をハブ（hub）または標識に結びつける結合に関
する水素の置換以上にリガンドとは異なる。 “ポリ（リガンド類似体）とは通常、ハブ核に
共有結合によつて一緒に結合した多数のリガンド
類似体のことである。ハブ核は多官能性物質であ
り、通常、高分子物質であり、また、通常、例え
ば結合部位として水酸基、アミノ基、メルカプト
基、エチレン基等の様な多数の官能基を有する。
ハブ核は水溶性あるいは水不溶性のいずれであつ
てもよいが、水溶性であることが好ましい。ま
た、ハブ核は通常少なくとも約30000の分子量を
有する。しかし、1000万以上の分子量を有するこ
ともできる。ハブ核としては例えば多糖類、ポリ
ペプチド（蛋白質を含む）、核酸、アニオン交換
樹脂等を含む。水不溶性ハブ核はまた、例えばガ
ラスあるいはプラスチツク製の容器壁、ガラスビ
ーズ、付加重合体および縮合重合体、セフアデツ
クス（Sephadex）およびアガロース（Agarose）
ビーズ等であることもできる。 “標識”とは検出可能信号の生成に直接または
間接的に関与し、かつリガンド、リガンド類似体
または受容体に直接または間接的に結合される化
合物のことである。 二種の異なる機能を満たす当該系には次の二種
の異なつた標識がある。 (i) 反応体標識 反応体標識は結合能力のある化合物であり、
好ましくは、溶液中の化合物（信号調整体）を
破壊することによつて、または溶液中の前駆体
から該化合物（信号調整体）を生成させること
によつて該化合物（信号調整体）の濃度に影響
を及ぼす触媒である。通常、信号調整体は前駆
体から生成される。従つて、該信号調整体の初
期濃度はゼロかまたは極めて低い値である。 (ii) 信号生成標識 信号生成標識は信号生成系を構成する一成分
である。即ち、信号生成系は少なくとも、信号
生成標識と信号調整体の二成分を有する。信号
生成標識は結合可能な化合物であり、該化合物
は信号調整体および必要に応じて補助試薬と一
緒に作用し、信号を生成する。測定される信号
は信号調整体の濃度に関連する。信号調整体の
濃度は反応体標識によつて影響される。信号調
整体は通常、直接または間接的に信号を供給す
る。該信号は都合よくは通常紫外領域または可
視領域における電磁線の吸収または放射であ
る。しかし、また、電気化学的または熱的変
化、混濁変化等であつてもよい。 “信号調整体”とは反応体標識との相互作用に
よつて生成され、信号生成系を構成する一成分で
ある化合物または化合物の励起状態のことであ
る。信号生成系によつて生成された信号は信号調
整体の濃度の関数である。信号調整体はエネルギ
ーを伝達することによつて信号生成系の一成分
（通常は信号生成標識）と化学的にまたは電子的
に反応させ得る。 “受容体”とは分子の特定空間かつ極性機構、
（即ちエピトープ部品）を認識できる化合物また
は組成物のことである。受容体としては例えば天
然受容体類、抗体類、酵素類、フアブ（Fab）小
片、レクチン類等がある。いずれの特定リガンド
についても、受容体は抗リガンドを指称される。
受容体（抗リガンド）およびその相反リガンドは
特異結合性対を形成する。 “ポリ受容体”とは、受容体結合部位を実質的
な割合で維持させている、他の受容体、結合基ま
たはハブ核によつて共有結合または非共有結合で
互いに結合した多数の受容体のことである。 “標識リガンド”とは、共有結合した標識を少
なくとも１つ有し、かつ、エピトープ性部位を少
なくとも１つ保持するリガンド、またはリガンド
を少なくとも１個結合した標識（ここで、該リガ
ンドは少なくとも１箇所、エピトープ性部位を保
持している）のことである。特に、ハプテン性リ
ガンドおよび細小標識（分子量2000未満）の場
合、多数の標識および多数のリガンドが存在しえ
る。該標識およびリガンドは多官能化された水溶
性または水不溶性のハブ核に共有結合している。
ハブ核については既に説明した。この様な組成物
をポリ（リガンド類似体）−ポリ標識と指称する。
望ましくは、受容体が複合体中のリガンドに結合
する場合、標識の官能性をさほど妨害しない。 標識リガンドのカテゴリーに含まれるものとし
ては分子レベルのミクロ環境を自然にもたらす巨
大分子結合体がある。これらの巨大分子物質は極
めてはつきりとした溝または表面くぼみを有す
る。この様な溝または表面くぼみは容量を規定す
るのに役立てることができるが、その規定された
（部分的に囲まれた）容量への接近に制限される。
この様な巨大分子組成物の例としてはゼオライ
ト、多孔質ガラス、架橋結合ポリアクリルアミ
ド、セフアロース等がある。リガンドおよび標識
の双方とも該巨大分子ハブ核に結合できる。この
様なタイプのハブ核は多孔質ハブと指称される。 “反応体標識結合体”とは特異結合性１対の１
員に直接または間接的に共有結合した反応体標識
のことであり、該結合体中には１つまたは多数の
反応体標識および／または特異結合性１対構成員
が存在する。 “信号生成標識結合体”とは特異結合性１対の
１員に直接または間接的に共有結合した信号生成
系の成分のことであり、該結合体中には１つまた
は多数の該成分および／または特異結合性構成員
が存在する。 “反応体標識−信号生成標識結合体”とは特異
結合性対の一構成員である同じ分子に直接または
間接的に反応体標識および信号生成標識の両者が
共有結合によつて結合したもののことであり、該
結合体中には１つまたは多数の各標識および／ま
たは特異結合性対構成員が存在する。ある場合に
は、反応体標識および信号生成標識は互いに同一
物であることができる。細小リガンド（分子量が
1000以下）の場合、ハブ核を伴う。一方、大リガ
ンドの場合、ハブ核を伴うことも伴わないことも
できる。通常、標識のうちの１つは触媒（通常は
酵素）であり、特に反応体標識は触媒である。 “標識受容体”とは共有結合した標識を少なく
とも１個有し、かつ、少なくとも１個の結合部位
を有する受容体であるか、または結合した受容体
を少なくとも１個有する標識（ここで、該受容体
は結合部位を少なくとも１箇所保持している。）
のことである。互に結合した、特にハブ核によつ
て結合した多数の受容体および／または標識が存
在できる。この様な組成物をポリ受容体−ポリ標
識と指称する。望ましくは、リガンドが複合体中
の受容体に結合している場合、標識の官能性はさ
ほど妨害を受けない。 標識リガンドの場合と同じ様に、標識受容体を
含む巨大分子結合体を使用できる。（前記を参照
されたい。） “複合体”とは特異結合性対の相対構成員の
各々のうちの少なくとも１つ（通常は該構成員の
うちの１構成員の少なくとも２つとその相反構成
員のうちの少なくとも１つ）が互いに非共有結合
または会合したものであり、斯くして溶液の主要
本体と区別しえる少なくとも部分的に囲まれた領
域を形成するミクロ環境を生成する。特異結合性
１対の構成員が互いに結合することによつて該ミ
クロ環境中に反応体標識と信号生成標識とが互い
に立体的な超接近をおこす。ミクロ環境は溝に集
中された特異結合性対の多数の構成員の集合体ま
たは会合体であり、溶液本体との連絡は制限され
る。即ち、小分子はその拡散が該複合体の範囲内
に限定される。互いに結合し、溶液本体との連絡
が制限された複数の細隙を有する容量を形成す
る、変動寸法および形状の構成単位の数は予想で
きる。 該複合体は該標識の信号調整体の局部濃度環境
を形成する。この局部濃度は、溶液全体のそれよ
りも高く、その結果、複合体が存在しない溶液と
比較して、生成する検出可能な信号の量の増大が
もたらされる。 以下、効力検定方法を説明する。 主題の効力検定は通常、最適効力検定感度に近
い中程度のPH値で、普通は検定成分または生成物
を分離することなく水性帯域中で行なわれる。被
分析物の測定のための効力検定帯域は通常緩衝化
された適当な水溶液、事前処理を受けた未知試
料、反応体標識結合体、信号生成標識結合体、信
号調整体前駆体および検出可能信号を発生させる
ための反応体標識および信号生成標識に必要な他
の全ての物質ならびに、必要に応じて特異結合性
１対またはその類似体の構成員を使用することに
よつて生成される。 未知試料中に抗リガンドまたはリガンドが存在
すると前記二種の標識が平均して立体近接する度
合に悪影響する。望ましくは、該標識結合体の少
なくとも一方は結合部位が多価のものでなければ
ならない。あるいは、該リガンドまたは結合体は
多数の結合部位を有する形状のもの、例えばポリ
（リガンド類似体）でなければならない。斯くし
て、多数の反応体標識および信号生成標識が信号
調整先駆体を含有する多量の溶液を囲む集合を形
成する場合、比較的大きなミクロ環境が形成され
る。そして、この部の溶液は溶液の残部との連絡
が制限される。 信号調整体を生成する信号調整体先駆体と反応
体標識との反応は検出可能信号を高める最大効果
を有する。次いで、該信号調整体は信号生成系中
に沈殿し、検出可能信号を生成する。しかし、信
号調整体が存在しない場合、検出可能信号は測定
されない。信号調整体および信号生成系の別の構
成成分との間における衝突またはエネルギー転移
のいずれかによる相互作用の確度は複合体のミク
ロ環境中で大きくなるので、検出可能信号の向上
は溶液全体と比較して測定される。 従つて、二種の異なつた多数の標識が極めて接
近している様なミクロ環境の数が大きくなればな
るほど、溶液の残部と比較してミクロ環境中の信
号調整体の濃度が増大した結果、信号の向上はま
すます高くなる。 分析の実施においては通常、水性媒体を用い
る。他の極性溶媒も用いることができ、普通
C_1〜6、更に普通にはC_1〜4の酸素化有機溶媒、例え
ばアルコール、エーテル等が用いられる。普通に
はこれら補溶媒は約40重量％未満、更に普通には
約20重量未満で存在する。 媒体のPHは普通約４〜11の、更に普通には約５
〜10の、好ましくは約6.5〜9.5の範囲内にある。
PHは、受容体による特異的結合を有意レベルに維
持し、かつ信号生成効率を最適化する様に選択す
る。場合によつては、これら２つの要求点の間で
妥協を図る様々な緩衝剤を使つて所望PHを達成
し、測定中そのPHを維持できる。緩衝剤の例はホ
ウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビター
ル等である。いずれの緩衝剤を用いるかは本発明
にとり重要ではないが、個々の分析においては１
つの緩衝剤が他より好ましいことがある。 分析実施には中温度が通常用いられ、分析中は
普通恒温を用いる。温度は一般に約10〜50℃、更
に普通には約15〜40℃である。 被分析物の濃度は一般に約10^-4〜10^-15M、更
に普通には約10^-6〜10^-13Mである。分析が質的
なものか、半定量的か定量的か、個々の検出技
術、対象被分析物の濃度等の観点から他試薬の濃
度が通常決定される。 種々の試薬の濃度は一般的には被分析物の対象
濃度範囲によつて決定されるけれども、各々の試
薬の最終濃度は、通常、対象濃度範囲にわたる分
析の感度を最適化するように実験的に決定され
る。被分析物に相反する特異結合性１対の１員の
合計結合部位数は、被分析物の結合部位数基準の
最小対象濃度の約0.1倍より少なくなく、そして
被分析物の結合部位数基準の最大対象濃度の約
1000倍より多くなく、普通には最大対象濃度の約
0.1〜100倍、さらに一般的には最大対象濃度の約
0.3〜10倍である。ポリエプトープ性リガンド受
容体である被分析物については、標識付きリガン
ドと受容体被分析物との当量比は、一般的には、
対象範囲内の受容体被分析物の最小濃度の約0.01
倍より小さくなくかつ受容体被分析物の最大濃度
の約100倍より大きくない。受容体被分析物の分
析においては、追加の（別の）受容体を含ませる
ことができる。リガンド被分析物については、標
識付きのリガンドを用いる場合、当量基準の標識
付きリガンドの濃度範囲は、一般的には最小対象
濃度の約10^-4倍より小さくなく、さらに一般的に
は最小対象濃度の10^-2倍より小さくなく、そして
最大対象濃度の100倍より大きくなく普通は最大
対象濃度の10倍より大きくない。 信号調整体前駆体の濃度の広範囲に変えること
ができ、ある最小レベル以上であることは要件で
なく、一般的には約１ないし10^-8M、普通は約
10^-2ないし10^-6Mの範囲である。 種々の試薬の添加順序は、個々の標識、標識を
結合する化合物、結合体の種類、被分析物の種類
ならびに被分析物および試薬の相対濃度の要因に
より広く変わりうる。また、測定に平衡法または
速度法のいずれを用いるかによつても、添加の順
序が影響を受ける。 添加順序を定めるにあたつては、ある種の基本
的な考慮がなされる。分析から観察される信号は
多数のミクロ環境の形成に基づくものであり、被
分析物の量がミクロ環境の数および性質に影響を
与える場合には、かかるミクロ環境は空間的に極
めて近接して多数の２種の標識、すなわち反応体
標識および信号生成標識を有するのが望ましい。
従つて、被分析物はミクロ環境の形成に参加しう
るべきである。被分析物がミクロ環境の形成に影
響を与えるという要件は、通常、添加の順序によ
つて左右される。 多くの受容体について、結合速度が解離速度を
はるかに越えるので、リガンドおよび受容体試薬
を合わせた後に被分析物を添加するのを避けるの
が普通である。例えば、抗原被分析物について、
反応体標識が抗原に結合されそして信号発生標識
が受容体に結合される場合、被分析物の添加前に
二つの結合体を合わせないのが普通であろう。被
分析物に受容体結合体を添加し、次いで抗原結合
体を添加するか、又は、抗原結合体および抗原被
分析物を一緒に合わせ、次いで受容体結合体を添
加するのが適当であろう。 被分析物の種類にかかわらず、すべての試薬を
同時に添加することができ、また速度法または平
衡法のいずれの測定も行いうる。モノエピトープ
性リガンドが含まれる場合、複数のリガンドエピ
トープ性部位を有する種（化学種）が存在すべき
である。化学種は、ポリ（リガンド類似体）、ま
たはポリ（リガンド類似体）−標識、またはポリ
（リガンド類似体）−ポリ標識のいずれであつても
よい。標識が、酵素のように大きな分子である場
合、多数のリガンド類似体が標識に結合されう
る。標識が小さな有機分子、例えば受けたエネル
ギーを再放出するようなエネルギー収容体、であ
る場合、リガンド類似体および標識の両者は、ハ
ブ核に結合されることになる。リガンドおよび標
識の寸法にかかわらず、両者はハブ核に結合され
うる。 試薬には、同一または異なるリガンド分子に結
合した両標識、あるいは同一または異なる受容体
分子に結合した両標識、あるいはリガンドに結合
した一方の標識および受容体に結合した他方の標
識、を与えることができる。さらには、リガンド
が被分析物であり、そして標識がリガンドに結合
されている場合には、抗リガンドまたはポリ（リ
ガンド類似体）をも添加する。分析媒体中にポリ
（リガンド類似体）および抗体を含ませることに
より、小標識を有するモノエピトープ性リガンド
分析を行うことができる。さらに好ましくは、ポ
リ（リガンド類似体）−ポリ標識またはポリ（リ
ガンド類似体）−標識と受容体標識結合体とを使
用する。モノエピトープ性被分析物は、その場
合、受容体結合体に添加し、次いでリガンド標識
結合体を添加することができる。 ポリエピトープ性リガンド被分析物について
は、その被分析物によつて結び合わされる二つの
受容体を好適に使用しうる。別法としては、リガ
ンド被分析物とリガンド標識結合体との間で受容
体標識結合体を取り合うように競合させてもよ
い。従つてその被分析物を、両結合体のうちの一
方に添加し、次いで他方の結合体を添加するか、
あるいは三者を同時に添加することができる。 受容体被分析物についても同様な考慮を行う。
普通、二つの標識結合体を使用するか、またはリ
ガンド標識結合体と受容体標識結合体とを組合せ
て使用する。二つの標識を受容体に結合させる場
合、ポリ（リガンド類似体）または抗原を分析媒
体中に含める。好適には、二つの標識付きリガン
ドを合せて、受容体用の単一試薬とする。標識付
き受容体を用いる場合には、すべての受容体を同
時に分析媒体へ添加する。 モノエピトープ性リガンドおよびポリエピトー
プ性リガンドの両者について、それらが標識付き
であつても標識付きでなくても〔モノエピトープ
性リガンドはポリ（リガンド類似体）と組合せ
て〕、ポリ受容体を用いて、接近状態にされうる
標識の数を増加させることができる。ポリ受容体
については、反応体標識および信号生成標識をリ
ガンドの異なつた分子に結合させてよく、あるい
は両標識を特異結合性１対の相反構成員に結合さ
せてもよい。 信号調整体前駆体は、普通、その他の試薬の添
加完了前に信号調整体の濃度に著しい変化が生じ
ないように分析媒体に添加される。従つて信号調
整体前駆体は、被分析物およびその他の試薬の添
加前、添加と同時、または添加後に、分析媒体に
添加されうる。信号調整体前駆体は、反応体標識
と同時に、あるいは被分析物とその他のすべての
試薬を合わせた後に、添加するのが好適である。
この場合にも、被分析物およびその他の試薬の分
析媒体への添加完結前に信号調整体前駆体を添加
することによる信号調整体濃度への影響、ならび
に測定様式についての実際的考慮が主要である。 分析媒体の調製には、一またはそれ以上のイン
キユベーシヨン工程を用いうる。例えば、抗原被
分析物を受容体標識結合体でインキユベートする
のが望ましいことがある。あるいは、抗原被分析
物を受容体標識結合体でインキユベートし、次い
で抗原標識結合体を添加して第２のインキユベー
シヨンを行なうのが好ましいことがある。インキ
ユベーシヨン期間を設けるかその期間を如何にす
るかは、測定法（すなわち速度法または平衡法）
ならびにリガンドに対する受容体の結合速度によ
つて可成り左右される。普通、インキユベーシヨ
ン工程は約0.5分から16時間にわたり、さらに一
般的には約0.5分から１時間にわたり変化しうる。
インキユベーシヨン温度は一般的には約４℃〜50
℃、さらに一般的には約15℃〜37℃の範囲であ
る。 試薬を混合した後に、信号を測定する。測定方
法は、電磁線、殊に紫外線および可視光線（吸光
または発光）の観測、重量法、容量法、電気化学
法等である。望ましくは、信号は紫外域または可
視域殊に約250〜750nｍの電磁線として測定す
る。 信号を観測する温度は一般的には約10〜50℃、
さらに一般的には約15〜40℃の範囲である。 いくつかの標準分析媒体をいくつかの既知量の
被分析物で調製する。次いでそれらの標準分析媒
体で観測した信号をグラフにして濃度と信号とを
相関させる。一旦標準曲線が設定されれば、ある
信号は、被分析物の濃度と直接に関係付けること
ができる。 材 料 本分析で用いられる成分は被分析物（リガンド
と受容体との両方）、リガンド類似体、ハブ核、
反応体標識、信号生成標識、信号調整体前駆体、
そして、適宜、リガンド又は受容体である。 被分析物 本発明のリガンド（被分析物）はモノエピトー
プ性がポリエピトープ性であることを特徴とす
る。ポリエピトープ性リガンド（被分析物）は通
常はポリ（アミノ酸）即ちポリペプチドと蛋白、
多糖類、核酸及びこれらの結合体である。かかる
結合体は細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミト
コンドリア、核、細胞膜等である。 大部分の場合、本発明で用いられるポリエピト
ープ性リガンド（被分析物）は少くとも約5000
の、更に普通には少くとも約10000の分子量を待
つ。ポリ（アミノ酸）のカテゴリーにおいては、
対象ポリ（アミノ酸）は一般に約5000〜5000000
の、更に普通には約20000〜1000000の分子量を持
ち、対象ホルモンの場合に分子量は普通約5000〜
60000である。 様々な蛋白質を類似構造特徴を持つ蛋白、特有
の生物学的機能を持つ蛋白、特定微生物（特に病
原菌）に関連した蛋白の族として考えることがで
きる。 以下は、構造により区分された蛋白群である。 プロタミン ヒスタミン アルブミン グロブリン 硬蛋白 隣蛋白 ムコ蛋白 色素蛋白 リポ蛋白 核蛋白 糖蛋白 末分類蛋白、例えばソマトトロピン、プロラクチ
ン、インシユリン、ペプシン 人血奨中に見い出される多数の蛋白は臨床的に
重要であり、例えば以下のものである。 プレアルブミン アルブミン α₁−リポ蛋白 α₁−酸糖蛋白 α₁−抗トリプシン α₁−糖蛋白 トランスコルチン ４，6S−ポストアルブミン トリプトフアンに乏しいα₁−糖蛋白 α_1x−糖蛋白 チロキシン結合性グロブリン α−トリブシン間阻止剤（Inter−α−trypsin−
inhibitor） Gc−グロブリン （Gc1−１） （Gc2−１） （Gc2−２） ハプトグロピン （Hp1−１） （Hp2−１） （Hp2−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α₂−リポ蛋白 ミオグロビン Ｃ−反応性蛋白 α₂−マクログロブリン α₂−HS−糖蛋白 Z_o−α₂−糖蛋白 α₂−ノイラミノ−糖蛋白 エリスロ蛋白 β−リポ蛋白 トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノーゲン プラスミノーゲン β₂−糖蛋白 β₂−糖蛋白 免疫グロブリンＧ（IgG）又はγG−グロブリン 分子式： γ₂κ₂又はγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ（IgA）又はγA−グロブリン 分子式： （α₂κ₂）ⁿ又は（α₂λ₂）ⁿ 免疫グロブリンＭ（IgM）又はγM−グロブリン 分子式： （μ₂κ₂）⁵又は（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ（IgD）又はγD−グロブリン
（γD） 分子式： （δ₂κ₂）又は（δ₂λ₂） 免疫グロブリンＥ（IgE）又はγE−グロブリン
（γE） 分子式： （ε₂κ₂）又は（ε₂λ₂） 遊離κ、γ光鎖 補足因子： C′1 C′1q C′1r C′1s C′2 C′3 β₁A α₂D C′4 C′5 C′6 C′7 C′8 C′9 重要な凝血因子は次の通りである。 凝血因子 国際名称 名 称 フイブリノーゲン プロトロンピン ａ トロンビン 組織トロンボプラスチン と プロンアクセレリン、促進グロブリン プロコンバーチン 抗血友病グロブリン（AHG）、クリスマ
ス因子、 血奨トロンボプラスチン成分（PTC） スチユアルトープラウアー因子 XI 血奨トロンボプラスチン前駆体（PTA） XII ハーゲマン因子 フイブリン安定化因子 重要な蛋白ホルモンは下記のものである。 ペプチドと蛋白ホルモン 上皮小体ホルモン（パラトロモン） チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリスロポイエチン メラノトロピン （黒血球刺激ホルモン；インテルメジン） ソマトトロピン （生長ホルモン） コルチコトロピン （副腎皮質刺激ホルモン） チロトロピン 小胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン （間質細胞刺激ホルモン） 黄体腫乳腺親和性ホルモン （ルテオトロピン、プロラクチン） ゴナドトロピン （絨毛膜ゴナドトロピン） 組識ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシン、 ブラジギニン 人胎盤ラクトゲン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バソプレシン 解放因子（RF） CRF、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RIF、MIF 他の対象高分子物質はムコ多糖類と多糖類であ
る。 微生物から誘導される抗原性多糖類の例は次の
通りである。

【表】

【表】 分析される微生物はそのままでも溶解しても粉
砕しても或はその他の方法で破砕してもよく、生
じた組成物或は例えば抽出による部分を分析す
る。対象微生物は下記のものである。 コリネバクテリア ジフテリア菌 肺炎球菌 肺炎双菌球 連鎖球菌 化濃連鎖球菌 str.サリバラス（salivarus） ブドウ球菌 黄色ブドウ球菌 白色ブドウ球菌 ナイセリア菌 髄膜炎菌 淋 菌 腸内菌 大腸菌 アイロゲネス菌 肺炎桿菌大腸菌 腸チフス菌 豚コレラ菌 ネズミチフス菌サルモネラ菌 赤痢菌 シラゲ シユミツツイ （Shigella schmitzii） シラゲ アラビノタルダ （Shigellaarabinotarda） フレキシナー菌 ボイド菌 ゾンネ菌赤痢菌 他の腸内菌 尋常変形菌 奇形変形菌 モルガン変形菌変形菌 緑膿菌 アルカリ大便菌 コレラ菌 ヘモフイラス・ボーデテラ群 インフルエンザ菌、軟下疳菌 H.ヘモフイラス（hemophilus） H.エジプチカス（aegypticus） パラインフルエンザ菌 ボーデテラ ペルツシス（Bordetella pertussis） パスツレラ菌 ペスト菌 野兎病菌 ブルセラ菌 マルタ熱菌 牛流産菌 豚流産菌 好気性胞子形成性桿菌 炭疽菌 枯草菌 巨大菌 セレウス菌 嫌気性胞子形成性桿菌 ボツリヌス菌 破傷風菌 ウエルチ菌 ノービ菌 セプチツクス菌 ヒストリチクス菌 第３型ロデラ菌 Cl.ビフエルメンタンス（bifermentans） スポロゲネス菌 ミコバクテリア 人型結核菌 牛型 〃 鳥型 〃 癩 菌 パラ結核性腸炎菌 放線菌（カビ状細菌） 牛放線菌（Actinomyces israelii、
Actinomycesbovis） A.ネスルンジ（naeslundii） ノカルジア アステロイデス（N.asteroides） ノカルジア プランリエンシス（N.brasiliensis） スピロヘータ 梅毒トレポネーマ 小スピリルム フランベジア・トレポネーマ ヘーヴアリル熱病
原菌 ピンタ・トレポネーマ オーベルマイエル回帰熱スピロヘータ 黄疽出血病レプトスピラ 犬レプトスピラ ミコプラズマ ミコプラズマ プノイモニー（Mycoplasma
pneumoniae） 他の病原菌 単球症リステリア 豚丹毒菌 ヘーヴアリル熱病原菌 鼠径肉芽腫菌 バチルス形バルトネラ リケツチア（細菌様寄生虫） 発疹熱リケツチア（R.prowazekii、R.mooseri） 斑点熱リケツチア コノリリケツチア 北クノースランド壁蝨性チフスリケツチア（R.
australis） R.シビリカス（sibiricus） リケツチア痘瘡 恙虫リケツチア Ｑ熱トケツチア 塹壕熱病原菌 クラミジア（分類不可能の寄生細菌／ウイルス） クラミジア剤（命名は不確定） 真 菌 酵母症病原菌 北アメリカ分芽菌病原菌 ヒストプラズマ病原菌 コクシジオイデス イミチス ブラジル パラコクシジオイデス 鵞口瘡カンジダ 烟色コウジ菌ケムカビ 傘状ケカビ（アブシデイアコリンビフエラ） リゾプス オリザエ（R.oryzae） リゾプス アリズス（R.arrhizus） リゾプス ニグリカンス（R.nigricans）藻菌 スポロトリコーシス病原菌 フオンセケア ペドロゾイ（F.pedorsoi） フエンセケア コンパクタ（F.compacta） フオンセケア デルマチチジス（F.
dermatitidis） クラドスポリウム カリオニ（C.carrionii） 色素分芽菌症病原菌 為巣性コウジ菌 マズラ足放線菌 マズラ グリセ（Madurella grisea） 糸状菌腫病原菌 フイアロスフオラ ジエンセルメイ
（Phialosphora jeanselmei） 石膏状小胞子菌 毛瘡白癬菌 ケラチマイセス アジエロイ（Keratinomyces
ajelloi） 犬小胞子菌 猩紅色白癬菌 オーズアン小胞子菌 ウイルス アデノウイルス ヘルペスウイルス 単純疱疹ウイルス 水痘ウイルス 帯状疱疹ウイルス ウイルスＢ 巨大細胞ウイルス（Cytomegalo virus） 痘疹ウイルス 痘瘡（小痘瘡）ウイルス 種瘡ウイルス 牛痘疹ウイルス 変態痘ウイルス 伝染性軟属腫ウイルス ピコルウイルス ポリオウイルス コツクスサツキーウイルス エコーウイルス リノウイルス 粘液ウイルス インフルエンザ（Ａ、Ｂ、Ｃ）ウイルス パラインフルエンザ（１−４）ウイルス おたふくかぜウイルス 牛疫ウイルス 犬ジステンバーウイルス レスピレイトリーシンシシアル（Respiratory
Syncytial）ウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス イースタン エクイン ユーセフアリチス
（Eastern Equine Eucephalitis）ウイルス ウエスタン エクイン ユーセフアリチス
（Western Equine Eucephalitis）ウイルス シンドビス（Sindbis）ウイルス チクグンヤ（Chikugunya）ウイルス セムリキ森林ウイルス マヨラウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリホルニア脳炎ウイルス コロラド真壁蝨熱ウイルス 黄熱ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス レオウイルス１−３型 肝炎ウイルス 肝炎Ａウイルス 肝炎Ｂウイルス 腫瘍ウイルス ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルス グロス（Gross）ウイルス マロネイ（Maloney）白血病ウイルス アレルゲン モノエピトープ性リガンド（被分析物）は一般
に約100〜2000の、更に普通には125〜1000の分子
量を持つ。対象被分析物は薬物、代謝産物、農
薬、汚染物質等である。対象薬物にはアルカロイ
ドが包含される。アルカロイドはモルフインアル
カロイド（モルフイン、コデイン、ヘロイン、デ
キストロメトルフアン、それらの誘導体と代謝産
物を含む）；コカインアルカロイド（コカイン、
ベンゾイルエクゴニン、それらの誘導体と代謝産
物を含む）：エルゴツトアルカロイド（リゼルグ
酸のジエチルアミドを含む）；ステロイドアルカ
ロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリン
アルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キノ
リンアルカロイド（キニン、キニジンを含む）；
ジテルペンアルカロイド、それらの誘導体と代謝
産物である。 次の薬物群はステロイドであり、これにはエス
トロゲン、ゲストロゲン、アンドロゲン、アンド
レノコルチカルステロイド、胆汁酸、強心性のグ
リコシドとアグリコン、ジゴキシンとジゴキシゲ
ニン、サポニンとサポゲニン、それらの誘導体と
代謝産物が含まれる。ジエチルスチルベストロー
ル等の偽ステロイド物質も含まれる。 次の薬物群は、５〜６員環ラクタムであり、こ
れにはバルビツール酸塩、例えばフエノバルビタ
ールとセコバルビタール、ジフエニルヒダントイ
ン、プリミドン、エトスクシミド及びそれらの代
謝産物が含まれる。 次の薬物群は、アミノアルキルベンゼン（アル
キル部分はC_2〜3）であり、これにはアンフエタミ
ン、カテコールアミン、エフエドリン、Ｌ−ドー
パ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリン、そ
れらの代謝産物と誘導体が含まれる。 次の薬物群はベンゾ複素環式化合物であり、オ
キサゼパム、クロロプロマジン、テグレトール、
イミプラミン、それらの誘導体と代謝産物が含ま
れ、その複素環はアゼピン、ジアゼピン、フエノ
チアジンである。 次の薬物群はプリンであり、テオフイリン、カ
フエイン、それらの代謝産物と誘導体が含まれ
る。 次の薬物群は麻から誘導されるものであり、カ
ンナビノール、テトラヒドロカンナビノールを含
む。 次の薬物群はＶ、Ａ、Ｂ、例えばB₁₂、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｋ、葉酸、チアミンの様なビタミンであ
る。 次の薬物群はプロスタグランジンであり、ヒド
ロキシル化、不飽和の程度と部位が異る。 次の薬物群は抗生物質であり、ペニシリン、ク
ロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサ
イクリン、テラマイシン、それらの代謝産物と誘
導体が合まれる。 次の薬物群はヌクレオシドとヌクレオチドであ
り、適当な糖、ホスフエート置換基を有する
ATP、NAD、FMN、アデノシン、カノシン、
チミジン、シチジンである。 次の薬物群はその他の薬物であり、メサドン、
メプロバメート、セロトニン、メペリジン、アミ
トリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、
プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、
プロパノール、グリセオフルビン、バルプロ酸
（valproic acid）ブチロフエノン、抗ヒスタミ
ン、コリン抑制薬、例えばアトロピン、それらの
代謝産物及び誘導体が含まれる。 次の化合物群はアミノ酸と小ペプチドであり、
ポリヨードチロニン、例えばチロキシン、トリヨ
ードチロニン、オキシトシン、ACTH、アンギ
オテンシン、メト−、ロイ−エンケフアリン、そ
れらの代謝産物と誘導体が含まれる。 病的状態に関係ある代謝産物はスペルミン、ガ
ラクトース、フエニル焦性ブドウ酸、ポルフイリ
ン１型である。 次の薬物群はアミノグリコシド類、例えばゲン
タミシン、カナミシン、トブラマイシン、アミカ
シンである。 対象農薬には多ハロゲン化ビフエニル、リン酸
エステル、チオホスフエート、カルバメート、多
ハロゲン化スルフエンアミド、それらの代謝産物
と誘導体が含まれる。 受容体（被分析物）の分子量は一般に10000〜
２×10⁶、更に普通には10000〜10¹⁶である。免疫
グロブリンIgA、IgG、IgE、IgMの分子量は一
般に約160000〜約10⁶である。酸素の分子量は通
常約10000〜600000である。天然受容体は様々で
あり、分子量は一般に少くとも約25000であり、
10⁶ないしそれ以上と高くてもよく、アビジン、
チロキシン結合性グロブリン、チロキシン結合性
プレアルブミン、トランスコルチン等の物質が含
まれる。 リガンド類似体 リガンド類似体は、水素または官能基を、水酸
基、アミノ、アリール、チオ、オレフイン等のよ
うな活性官能基を持つ他の分子に対して共有結合
を形成するための官能基を持つ結合または結合基
によつて置換されていることによりリガンドと異
なる。ここで、得られる化合物は、その化合物が
結合される分子による水素の置換以上のものによ
つてリガンドと異なる。結合基は炭素、酸素、硫
黄、窒素および原子番号17−35のハロゲンである
水素以外の原子を１−20個通常持つている。包含
される官能基はカルボニル、オキソおよび非オキ
ソ活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、エチレン
（特に活性化エチレン）、アミノ等である。異原子
の数は普通約０−６、より普通には約１−６、好
ましくは約１−４である。結合基の説明は米国特
許3817837に見られ、この説明は本明細書に含ま
れる。 結合基としてはジアゾ基、芳香族基が含まれる
が、ほとんど脂肪族基である。一般に、結合基は
約１−10、より普通には約１−６個の原子を鎖中
に持つ二価の鎖である。通常、酸素は炭素および
水素に結合し、好ましくは炭素にのみ結合するオ
キソまたはオキシとして存在する。一方、窒素は
炭素にのみ結合するアミノとしてまたはアミドと
して存在し、硫黄は酸素と同様である。 結合基および結合される分子間の共有結合を形
成する通常の官能基はアルキルアミン、アミド、
アミジン、チオアミド、ウレア、チオウレア、グ
アニジンおよびジアゾである。 ポリペプチドと結合する具体的適用が見出され
ている結合基は、ジイミドとの結合に使用できる
カルボン酸、またはその炭酸モノエステルとの混
合酸無水物、または活性カルボン酸エステル、例
えばＮ−ヒドロキシサクシンイミドまたはｐ−ニ
トロフエニルを含む基である。還元性アミノ化条
件、例えば水素化ホウ素の存在においてアルキル
アミンを作るように、アルデヒドを用いてイミン
を形成できる。使用できる他の非オキソカルボニ
ル基としてはイソシアネートおよびイソチオシア
ネートがある。更に、活性ハロゲン化基、特にブ
ロムアセチル基が使用できる。 ほとんどの場合、リガンドが結合基を結合する
ための部位として使用できる１以上の官能基を持
つている。特に、水酸基、アミノおよびアリール
基、特に活性アリール基が使用される。また、ア
ルボキシメチルのような結合基に結合させるため
の部位として、オキシ官能基と水酸基とからオキ
シムを形成できる。 リガンド中およびリガンドが結合する化合物中
に存在する官能基、所望の結合基の性質および鎖
長等に依り、結合基の選択は広範囲に変わるであ
ろう。 ハブ核 ハブ核は通常可溶性である。ハブ核は、リガン
ド類似体および／または標識が共有的に結合でき
る多数の官能基と持つかまたは官能化されてその
ような能力が与えられ得る基を持たなければなら
ない。 可溶性ハブ核はポリ（アミノ酸）、多糖類、核
酸、水溶性付加ポリマー（例えばポリビニルアル
コール）、等からほとんど構成されている。具体
的な物質としてはアルブミン、グロブリン、ゼラ
チン、変性セルロール、デキストラン、澱粉、カ
ルボキシメチルセルロース、寒天、ポリリジン、
等があるが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。 ハブ核は一般に約30000以上、より普通には約
50000の分子量であるが、数百万の分子量を持つ
ものでも良い。通常、平均で10⁷分子量のハブ分
子当り、より普通には10⁶分子量当り、更に最も
普通には10⁵分子量当りそれぞれ１以上のリガン
ド、１以上の受容体および適切な場合には１以上
の標識が存在する。しかしながら、分子量1500当
り平均で約１以上存在することは普通は無い。 ハブ核に結合した標識に対するリガンドの比は
２種の分子の性質、リガンドがモノまたはポリエ
ピトープ性であるか、標識が小さい分子が、大き
い分子か、検定に要求される感度等に依つて広く
変化する。一般に、数比はリガンド対標識の比が
約0.01〜100対１、好ましくは約0.05〜20対１で
ある。 反応体標識 単一の事象のみ起こりうる反応体標識を使用で
きるが、好ましくは、各反応体標識は多くの事象
の起こるものがよい。反応体標識は溶液中で化合
物と反応して信号発生標識と相互作用を起すこと
ができる化合物を生産または破壊し、それによつ
て変調信号を発生する。 第１のタイプ標識は触媒標識であり、これは酵
素および非酵素触媒の両者を含む。信号の発生を
含むことのできる生成物を生産する各種の酵素を
使用できる。認識されている第１のタイプの酵素
オキシドリダクターゼ（酸化還元酵素）である。
IUB分類におけるこれら酵素は第１群である。こ
の群のうち特に興味深いのは１・１・１および
１・６の酵素群であり、ここにはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドまたはそのリン酸エステ
ル（NADおよびNADP）が含まれる。これら酵
素は還元形の補酵素NADHおよびNADPHを生
成するために使用できる。逆も同じである。具体
的な酵素としてはアルコールデハイドロゲナー
ゼ、グリセロールデハイドロゲナーゼ、ラクテー
トデハイドロゲナーゼ、マレートデハイドロゲナ
ーゼ、グルコース−６−ホスフオートハイドロゲ
ナーゼ、マンニトール−１−ホスフエートハイド
ロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフエ
ートデハイドロゲナーゼおよびイソシトレートデ
ハイドロゲナーゼのようなデハイドロゲナーゼ
（脱水素酵素）がある。 オキシドリダクターゼ群における酵素の他のグ
ループは過酸化水素を生産または分解するもので
ある。これらの酵素は１・11・１のグループであ
り、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、アミノ酸オ
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクト
ースオキシダーゼ、ユリカーゼ、ポリフエノール
オキシダーゼ、アスコルペートオキシダーゼなど
である。興味ある他のオキシドリダクターゼ酵素
はジアホラーゼである。 興味ある他のグループの酵素はトランスフエラ
ーゼ（転移酵素）であり、IUB分類の第２群、特
に細分類２・７である。ここでホスフエートはア
ルコールに転化される、第２・７・１群、例えば
ヘキソキナーゼである。 他の興味ある酵素群はIUB分類の第３群である
ハイドロラーゼ（加水分解酵素）である。特に興
味深いものは第３・２・１群のグリコシドハイド
ロラーゼ（グリコシダーゼ）および第３・１・３
群のホスフアターゼである。特にアルフアアミラ
ーゼ、セルラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ア
ミログルコシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、
酸性ホスフアターゼおよび塩基性ホスフアターゼ
が興味がある。 興味ある酵素の別の２つの群としては第４群の
リアーゼおよび第５群のインメラーゼ（異性化酵
素）、特に細分類５・３および５・４でこの群に
はホスフオグルコースイソメラーゼ、トリオース
ホスフエトインメラーゼおよびホスフオグルコー
スミユターゼのような酵素が含まれる。 上記種々の酵素の作用の仕方を説明するために
次に例が与えられる。第１番目の例はオキシドリ
ダグターゼ、特にNADをNADHに還元する酵素
に関する。これらの酵素は大部分のハイドロゲナ
ーゼに関するもので、ここで水酸基はオキソ基に
移行する。次いでNADHは、多数の酵素または
補酵素触媒と結合して検出し得る生成物を生産す
る信号調整体になる。例えば信号発生標識はジア
ホラーゼでで良く、２，６−ジクロロフエノール
インドフエノール、メチレンブルーまたはカリウ
ムフエリシアニドのような合成基質と反応するこ
とができる。NADHはフラボ蛋白と共に使用す
ることができ、この蛋白はクルコースオキシダー
ゼアミノ酸オキシダーゼおよびジヒドロオロテー
トデハイドロゲナーゼのような酵素をである。こ
こでフラビン蛋白およびNADHと酸素との生成
物、すなわち過酸化水素を検出できる。下記を参
照されたい。 別法として、フエナジンメトスルフエートまた
はメルドラブルーのような非酵素触媒をテトラゾ
リウム塩のような染料と共に使用して信号を発生
することもできる。 更に、別の方法として、過酸化水素を生産する
オキシドリダクターゼを使用することもできる。
このような酵素はグルコースオキシダーゼ、エト
クロームリダクターゼ、ユリカーゼ等である。こ
れら酵素はパーオキシターゼのような過酸化水素
と反応する酵素と結合し、ここで過酸化水素は信
号調整体として作用する。過酸化水素＋パーオキ
シダーゼ＋螢光体物質（例えばルミノール）は化
学螢光反応を起すために使用できる。 ２つの別々の段階において２個の置換基の加水
分解的除去を必要とする化合物を使用することに
よりハイドロラーゼを効果的に使用できる。 例えば、１−ウンベリフエリル−β−ガラクト
シド−６−ホスフエートは螢光信号を得るために
ウンベリフエロンに転化されなければならない。
反応体標識として塩基性ホスフアターゼを、信号
調整体として１−ウンベリフエニル−β−ガラク
トシドを、信号生成標識としてβ−ガラクトシダ
ーゼを使用することにより、複合体中における２
つの標識の近似に依存する検知可能な信号螢光を
得ることができる。検知可能な信号を与えるウン
ベリフエロンの形成に両酵素は必須である。 あるいは、ヒドロラーゼは、次に行なわれる酵
素反応または非酵素反応において使用してもよい
生成体を生成させることもある。例えば、補酵素
はその活性を抑制するために反応性としてもよ
く、その反応性はヒドロラーゼ酵素によつて取り
出し可能とし、これにより遊離補酵素は信号生成
酵素との相互反応によつて検出可能な信号を生成
させ得る。 さらに、イソメラーゼを、特に炭水化物類と共
に使用し、ホスヘートを１の位置から別の位置に
転位させてアルドース類およびケトース類を異性
化することによつて、続いて行なわれる酵素反応
の基質を生成させ得る。 別の場合には、螢光または化学発光のいずれか
あるいは両者による発光に対して抑制剤あるいは
消光剤として作用する適宜組成物を溶液中に加え
る。例えば、いくつかの螢光体は過酸化物によつ
て抑制される。過酸化物と反応する過酸化物用ジ
スムターゼを使用することによつて、過酸化物の
局部濃度は減少し、これにより信号生成酵素の領
域における消光度を低下させる。 さらに例示すれば、螢光を消光するために、例
えば反応性部分の１部を置換することによつて、
非螢光物質から螢光物質を得ることができる。ウ
ンベリフエロンの例はすでに述べたが、本例の場
合、置換基は水酸基に結合するが、その除去には
唯１個の酵素を必要とする。次いで適宜酵素が上
記置換基を除去することになる。このようにして
得たウンベリフエロンは光照射によつて活性化さ
れ、信号生成標識は、その場合、螢光消光剤とし
て作用し、双極子−双極子相互反応によつて励起
ウンベリフエロンからエネルギーを受け取り、長
波長の光を再び放出することになる。 非酵素触媒作用を利用することも可能ではある
が、一般には反応体標識としては使用されていな
い。しかし、それを利用する場合の適当な触媒と
してはフエナジンメンスルフエート、メルドラ・
ブルー、FMN、メチレン・ブルー、パイロ・シ
アニン、ウルステル・ブルーおよび１，２−ナフ
トキノンがある。例えば、反応体標識としてのメ
ルドラ・ブルーはNADHによるFMNから
FMNH₂への還元反応に触媒作用を示す。この
FMNH₂は次いで信号生成標識としてのバクテリ
アルシフエラーゼと反応して化学発光による発光
を示す。 別の場合には、反応体標識が溶解した化合物と
反応して発光性化合物を生成する。例えば、ビス
ー（ジニトロフエニル）オキサレートが溶解した
化合物と都合よく結合され、過酸化水素および塩
基との反応によつてジオキシエタンジオン
（dioxyethanedione）を生成する。ジオキシタン
ジオンは、受容体分子の近傍にいない限り、光を
放出することなく分解する。上記受容体分子はそ
の分解によつて放出されたエネルギーによつて電
子励起され、化学発光として発光するのである。
ジオキシタンジオンは十分長い半減期を有するた
め消光剤に移行でき、したがつて消光剤がジニト
ロフエニルオキサレートの数オングストロームの
範囲内に存在することを必要としない。 特に興味があるのは、酵素含有反応性部分をよ
り高度の酸化状態にまで酸化させることによつ
て、例えばアルコールをケトンに、あるいはアル
デヒドをカルボン酸に酸化させることによつて基
質と反応する酵素反応体標識、あるいは加水分
解、ホスホリレーシヨンまたは異性体によつて分
子間または分子内においてホスフエート基を転位
させる酵素反応体標識である。 信号生成標識 反応体標識に関する説明からも明らかなよう
に、信号生成標識は、その化学組成、反応性およ
び信号調整体との相互反応の性質に関して、広範
囲にわたり変化する。反応体標識と同じように、
信号生成標識には単一の事象よりも多くの事象を
起こすことのできるものが望ましい。触媒反応、
エネルギー転移、光の吸収および放出、電気化学
的活性等の結果として、多くの事象が起こりう
る。 触媒反応の場合、その触媒は酵素あるいは非酵
素のものであつてもよい。酵素による信号生成標
識は、反応体標識、特にそれ自身も酵素である反
応体標識に結合する。このように、反応体標識の
生成体は信号生成標識の基質として作用し得る。
例えば、NADHから生成したNADあるいは
NADから生成したNADHあるいはホスフエート
類似体を信号生成標識によつて使用して基質と反
応させて、光の吸収あるいは放出のいずれであつ
てもよい信号を生成させる。そのような酵素の例
としては、ジアフオラーゼ、脱水素酵素、フラビ
ンプロテイン、キユープロプロテイン、ヘメ
（hemes）および同等物がある。別の群の酵素と
してはペルオキシダーゼのような過酸化水素と反
応する種類のものがある。ペルオキシダーゼはル
ミノールおよび過酸化水素と反応して化学発光を
生成させ得る。 ヒドロラーゼの使用については反応体標識に関
連してすでに説明した。ヒドロラーゼは、望まし
い吸収あるいは放出特性を有する化合物を放出す
るために第二の反応性部分を除去できる。 あるいは、そのような信号生成標識は非酵素触
媒であつてもよく、多くの触媒についてはすでに
説明した。これらの触媒は次いで反応体標識の生
成体と溶液中の化合物との間の反応に対し触媒作
用を示す。例えば、メルドラ・ブルーはNADH
とテトラゾリウム塩との反応に対し触媒作用を示
すものとして使用され得る。 さらに説明すれば、染料のようなエネルギー受
容体化合物を使用してもよく、その場合、反応体
標識の生成体は、基底状態あるいは励起状態に生
成された螢光体あるいは受容体化合物を励起でき
る高エネルギー中間体のいずれかである。エネル
ギーはエネルギー受容体または消光剤に転移され
長波長の光を放出し、これがモニターできる。 結局、信号生成標識は過酸化物のような化合物
によつて消光される螢光体であつてもよい。螢光
体の存在下に過酸化物の濃度を低下させることに
よつて、増強した螢光が観察される。 特に重要なのは、オキシドリダクターゼ酵素で
あつて、またNADの付いた酵素である。NADH
の濃度を増加あるいは低下させることは、検出可
能信号として特に有用である。信号生成薬剤とし
てのNADHは、吸収あるいは螢光発光によつて
分光光度計を使つて測定できる。 信号調整体 信号調整体は信号生成系において信号調整体の
相互反応によつて得られる信号の調整剤として作
用する。ほとんどの場合、この信号調整体は観察
される信号を生成させることはない。例外的に
は、信号調整体が反応体標識の生成体であつて、
信号生成標識の生成体と反応して観察し得る信号
を生成させることがある。例えば、互いに急速に
反応するNADHとメルドラ・ブルーのような２
種の化合物を利用する場合である。メルドラ・ブ
ルーの単一部分を反応性とし、さらに適宜酵素を
反応体標識および信号生成標識として使用しメル
ドラ・ブルーの反応性部分を除去してNADから
NADHを生成させることによつて、前記の２種
の反応体が生成される。テトラゾリウム塩の存在
下ではフオルマサンの生成によつてNADHとメ
ルドラ・ブルーとの反応を追跡できる。 信号調整体には広範囲にわたる化合物があり、
補酵素、螢光体、触媒、化学発光体、還元剤、酸
化剤、抑制剤、および同等物などの化合物が包含
される。すなわち、化学的手段で濃度が調節され
また化学的又は電子的に別の化合物と反応して直
接的にあるいは間接的に検出可能な信号を与える
ほとんどすべての化合物が包含される。 それ自体であるいは適当な反応性化（例えば酵
素によつて除去される基による置換）によつて信
号調整体前駆体、信号調整体あるいは信号生成標
識として作用する多くの化合物−発色団および螢
光体があり、それらの化合物あるいはその生成体
は、化学反応によつて電子的に励起されて発光す
るかあるいはエネルギー（化学発光エネルギー）
を転移させるか、あるいは照射または励起分子か
らエネルギーを受け取つて、吸収エネルギーより
も長波長の光を放出する能力を有する。 エネルギーが転移する場合、エネルギー供与体
からエネルギー受容体への高効率のエネルギー伝
達が行なわれるのが望ましい。好ましくは、この
エネルギー供与体は、350Åより長い、好ましく
は400Åより長い波長の光を吸収する化学発光体
または発色団である。好ましくは、エネルギー受
容体としての発色団は、400Å以上で10⁴以上、好
ましくは450Å以上で10⁴以上、より好ましくは
400Å以上で10⁵以上の消光係数を有する。 発色団の使用および検出可能な信号としての発
光について説明するために以下に例を示す。
HRPはアセトンおよび過酸化水素と反応して三
重線アセトン（信号調整体）を与え、これが９，
10−ジブロモアントラセン（信号生成標識）に移
行し、そしてそれが三重線アセトンからエネルギ
ーを受け取り螢光を発する。 反応体標識と反応して励起状態の反応剤を生成
させ、これがエネルギーを伝達させて溶液中の発
色団を励起させる化学発光剤も与えられる。励起
された発色団（信号調整体）は次いでエネルギー
受容体（信号生全標識）に移行し、これが衝突あ
るいは双極子−双極子結合によるエネルギー伝達
を受け入れ、次に螢光を発して検出可能な信号を
生成させる。 例示的に示せば、螢光体であつて使用可能な各
種の発色団としては以下の化合物およびそれらの
同族体がある。 螢光体の最初の同族体はキサンテン染料であつ
て、３，６−ジヒドロキシ−９−フエニルキサン
トヒドロールから導かれたフルオレセイン類を含
む。ローダミン類およびフルオレイン類は９−０
−カルボキシフエニル基を有しそして９−０−カ
ルボキシフエニルキサントヒドロールの誘導体で
ある。 フエニル基上に結合部位として使用できる置換
基を有するこれら化合物は市販されている。例え
ば、アミノ、イソチオシアネート置換フルオレセ
イン化合物を入手できる。 螢光性である他染料は３−フエニル−７−イソ
シアナトクマリン、アクリジン、例えば９−イン
チオシアナトアクリジンとアクリジンオレンジ；
Ｎ−〔ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フエニル〕
マレインイミド；ベンゾオキサジアゾール、例え
ば４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾールと７−（ｐ−メトキシベンジ
ルアミノ）−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，
３−ジアゾール；スチルベン、例えば４−ジメチ
ルアミノ−4′−イソチオシアナトスチルベンと４
−ジメチルアミノ−4′−マレインイミドスチルベ
ン；Ｎ，N′−ジオクタデシルオキサカルボシア
ニン ｐ−トルエンスルホネート；ピレン、例え
ば８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスル
ホン酸と１−ピレン酪酸；メロシアニン、例えば
メロシアニン540、ローズベンガル、２，４−ジ
フエニル−３（2H）−フラノン；ジアニン；アン
チアキノン；ポルフイリン；トリアリールメタ
ン；及び螢光を発することのできる他の容易に入
手できる染料である。これら染料は活性結合機能
を有するか、かかる機能を容易に導入できる。 染料の吸収、発光特性は、溶解して遊離状態に
ある状態から蛋白即ちリガンドに結合するとかわ
ることがあることも銘記されたい。それゆえ、染
料の様々な波長域と特性に言及する時は、用いら
れている染料をさし、結合しておらず任意溶媒中
で特性化される染料はさしていない。螢光体又は
化学発光体と受容体又は消光体との重複領域で
は、受容体が高転移確率を持つことが望ましい。 化学発光源は反応体標識でよく、或は、反応体
標識又は信号調整体と反応する試薬を含んでもよ
く、又、まれに信号生成標識であることがある。
化学発光源は、化学反応により電子的に励起さ
れ、ついで、検出可能信号として役立つか、或
は、エネルギーを受容体を供与し、この受容体が
検出可能信号として光を発するか、供与体として
第２の受容体に作用し、この第２受容体が検出可
能信号としての光を発する光を発することができ
る化合物を含む。 化学発光源は単一成分でも複数成分でもよく、
普通は２又は３の成分を有する。熱不安定性であ
り、分解して化学発光する特定ジオキセタンの様
な単一分子を存在させることも可能だが、多数の
理由によりこれら分子の使用は実質的でない。そ
れゆえ、大部分の場合、化学発光源は少くとも２
成分とし、本明細書の記載の大部分はこの場合を
対象とする。 便宜上、化学発光源を２つのカテゴリー：酵素
触媒の仲介を含まないものと酵素触媒を含むもの
にわける。 酵素触媒を含まない化学発光源の場合には、受
容体がリガンドに結合するのを阻止したり、測定
中許容できない速度で受容体、リガンドを分解し
たりしない条件下で化学発光するもののみを採用
できる。非水性溶媒と、PH11より高い強塩基条件
に依存する普通の化学発光源は役立たないが、プ
ロトンが変性し、有意な解離が生ずる前に変調発
光が実質上完了する場合には、急速注入ないし流
入技術等の技術を採用できる。塩基注入後に測定
可能のせん光が観察される。 様々な化合物群が様々な条件下で化学発光する
ことが発見された。１つの化合物群は２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオンである。最も
ポピユラーな化合物はルミノールであり、これは
５−アミノ化合物である。この族の他構成員は５
−アミノ、６，７，８−トリメトキシ類似体とジ
メチルアミノ〔ca〕ベンズ類似体等である。こ
れら化合物はアルカリ水素過酸化物又は次亜塩素
酸カルシウムと塩基とで発光させることができ
る。第２の化合物群は２，４，５−トリフエニル
イミダゾールであり、ロフインが親生成物の一般
名である。化学発性体の類似体はｐ−ジメチルア
ミノ、−メトキシ置換体等である。 次の化合物群は酵素触媒下で化学発光する化学
発光体である。主として２つの酵素被触媒化学発
光体群がある。第１群はアルカル水素ペルオキシ
ドとの結合で化学発光する化合物である。過酸化
水素及び化学発光体と組み合せてペルオキシダー
ゼ、例えば西洋わさびペルオキシダーゼを用いる
ことにより化学発光を達成できる。例は２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類である。 第２の化学発光触媒源はルシフエリン類とその
類似体及びルシフエラーゼ類に基づく。特に重要
なのは細菌ルシフエラーゼである。 次の化学発光性化合物群はインドレン−３−イ
ルヒドロペルオキシド、その前駆体及び誘導体で
ある。 次の化合物群はビス−９，9′−ビアクリジニウ
ム塩であり、その例はルシゲニン（Lucigenin）、
Ｎ，N′−ジメチル−９，9′−ビアクリジニウムジ
ナイトレートである。これら化合物はアルカリ水
素ペルオキシドとの結合で化学発光する。 次の化合物群は９位が置換されているアクリジ
ニウム塩である。個々の置換基はカルボン酸エス
テル、特にアリールエステル、アシル置換基、特
にベンゾイル、シアノである。アルカリ水素ペル
オキシドを用いて化学発光を誘発する。 次の化合物群は様々なアシルペルオキシエステ
ルとヒドロペルオキシドであり、９，10−ジフエ
ニルアントラセンの様な化合物との結合でその場
で形成できる。 別の化学発光源はヒドロペルオキシド、例え
ば、金属錯体、特にポルフイリンとフタロシアニ
ン（金属は鉄、亜鉛）、と結合したテトラリンヒ
ドロペルオキシドである。 好ましい系は、11ないしそれ未満、好ましくは
10ないしそれ未満のPHの化学発光源からの発光量
効率を満足なものとするものであり、免疫学的１
対の１員に結合できる触媒に依存する。 標識および信号変調剤として採用し得る種々の
組成物が存在することを考慮すると、各種の物質
の化学的および／または物理的性質に関して適用
できる単純な定義は存在しない。しかしながら、
ある種の組合せが好ましいことは言える。下記の
表はすべてを列挙し尽くすつもりのものではない
が、好ましい組合せの一般的な範疇を示すものと
言つてよいであろう。第一の範疇には、少なくと
も１つの酵素の使用が含まれる。 これらの組合せは、反応体標識としてのオキシ
ドリダクターゼ酵素、補酵素たとえばNADまた
は誘導体（還元体および／または燐酸塩）、およ
び第１の酵素により生成する補酵素の形をとる信
号生成標識としての第２の酵素を含んでいる。 第２の系は、信号変調剤としての過酸化水素を
生じる反応体標識としてのオキシドリダクターゼ
酵素と、同じくオキシドリダクターゼ特にパーオ
キシダーゼであり、過酸化水素および補助的基材
たとえば染料前駆体または化学的発光性化合物た
とえばルミノールのような光を生じる化合物と反
応する第２の酵素とを採用する。 第３の例は、補酵素たとえばNADと反応して
NADH（信号変調剤として作用する）を生じ、次
いで触媒反応により染料と反応する（この場合の
触媒は酵素系のものではなく、信号生成性標識で
ある。）オキシドリダクターゼ酵素の採用である。 第４の例は、両標識がヒドロラーゼ酵素であ
り、螢光剤または化学発光剤が酵素によつて個々
に除去される置換基によつて２置換されている場
合である。モノ置換化合物は信号調整剤である。
他の組成物も容易に推測することができる。 下記の表は本発明において使用できる各種の組
成物の例示である。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 結合体 該結合体−反応体標識および／または信号生成
標識（特異結合対の構成員に結合している）から
なる−は、該特異結合対の構成員への、標識の共
有または非共有結合（通常は共有結合）を含むこ
とができる。各種の共有結合基について、既に、
リガンド類似体との関連において論じた。 ２つの分子、一方は小さく（1000m.w.）一
方は大きい（1000、通常は5000m.w.）が結
合されるべきとき、小さいほうの分子は、通常、
大きいほうの分子中に本来存在する官能基と反応
することのできる官能基を有している。しかしな
がら、２つの大きな分子が含まれている場合に
は、特に同じ活性官能基を有するものたとえば蛋
白質、２官能性結合基またはカルボキシ賦活性化
合物、たとえばカルボジイミドなどが採用され
る。あるいは、各々の化合物が、相互に反応する
異なつた官能基たとえばマレイミドとメルカプト
によつて官能性を与えられていてもよい。 これら分子は、公知の合成技術によつて一緒に
することができる。 リガンドが小さい分子（1000m.w.）である
場合、大きな分子（5000m.w.）に結合してい
るリガンドの数は、平均して、標識１つにつき少
なくとも１リガンドであり、かつ標識の分子量
1500当り、通常は2500当り、約１リガンドより多
くはない。結合されるべき分子、すなわちリガン
ドおよび標識または受容体と標識との両分子が共
に大きい場合は、一般に、平均して、結合体の各
構成員が少なくとも１つ存在し、かつ該構成員の
１つまたは各員が10あるいはそれ以上存在するこ
ともある。 次の考慮は、特殊な場合すなわち反応体標識お
よび信号発生標識が同一である（普通、酵素であ
る）場合である。この場合は、特殊な信号調整体
前駆体を必要とする。かかる前駆体は、標識によ
り開裂された官能度によつて接合された繰返し単
位を有するオリゴマー（普通少なくとも２個、さ
らに一般的には２個の単位を有する）でモノ置換
されているか、あるいはその信号調整体が中間レ
ベルの置換度である場合には、標識で開裂された
官能度による異なる部位に結合された複数（普通
は少なくとも２個、さらに一般的には２個）の置
換基を有する。その例は、二糖類もしくは多糖
類、二燐酸塩もしくはポリ燐酸塩、ジ（アミノ
酸）もしくはポリ（アミノ酸）等である。 信号調整体前駆体は、従つて、検出可能信号を
得るように少なくとも２個の結合手が開裂される
ように置換されていなければならず、またそれら
すべての結合手は同一の酵素によつて開裂されう
るように置換されているべきである。速度の増加
はミクロ環境における酵素標識および信号調整体
の局部的な高濃度、ならびにミクロ環境からの信
号調整体の拡散離れの制限によるものである。 特に興味ある標識は、糖類、例えばガラクトシ
ダーゼ、と適切に糖類で置換した信号調整体前駆
体とを組合せたものである。次の実施例は説明の
ためで限定のためではない。 すべての温度は℃であり、“部”および“パー
セント”は重量によるが、液体混合物に関すると
きは容量による。次の略号が用いられた。
HRP：ホースラデイシユ パーオキシダーゼ、
GO：グラクトースオキシダーゼ、FDNB：フル
オロジニトロベンゼン、hIgG：人間のγ−グロ
ブリン。 実施例 １ HRPのヤギ抗hIgGへの結合 用いた処理手段はNakaneおよびKawaoki、J.
Histochem and Cytochem22、1084（1974）によ
つた。 新たに調製したリン酸緩衝液（0.3M、PH8.1）
２mlにHRP12.3mlおよびFDNB0.25mlを添加、溶
解し、混合物を１時間放置した。約１mlを取出し
た後、0.04M過ヨー素酸塩1.2mlを残りの１mlに
加え混合物を室温で約0.5時間撹拌した。次いで
混合物にエチレングリコール1.2mlを添加した。
混合物を緩衝液に対し透析した。透析袋中の残留
物にヤギ抗hIgG（マイルス、ラボラトリース）
600mlを加え、混合物を室温で３時間撹拌した。
混合物に水素化硼素ナトリウム９mgを加え、得ら
れる反応混合物を撹拌しながら４℃で一晩放置し
た。次いで反応混合物をPBSに対し透析し、引
き続き溶離剤としてPBS（PH7.2）を用いセフアデ
ツクスG200カラムでクロマトグラフした。カラ
ムから溶離した画分はそれぞれHRPおよびIgG
の比の特徴である403nｍおよび276nｍでの吸収
によりモニターした、所望の生成物は初期画分に
溶離していた。 実施例 ２ GOのhIgGへの結合 主炭酸ソーダ緩衝液（0.3M、PH8.1）１mlに
hIgG2mgおよびGO6mgを加えてから0.04M過ヨー
素酸ソーダ１mlを加えた。室温で１時間後、混合
物を10mlに稀釈してからダイアフロ ウルトラフ
イルターで１mlに濃縮した。混合物に水素化硼素
ナトリウム３mlを加え一晩放置後、PBS（PH７）
10mlを加えた。ダイアフロ ウルトラフイルター
で１mlに濃縮後、混合物を0.3×45cmセフアデツ
クスG200カラムでクロマトグラフした。溶離剤
としてPBS緩衝液（PH7.2）を用い画分を280nｍ
で吸収を監視してUVスペクトロフオトメーター
でモニターした。 この発明を示すために、次の実験を行つた。濃
度の異なる複数のチユーブを調製した。次の表は
反応媒体の組成を示している。

【表】 すべてのチユーブは全容量が25mlであつた。材
料は表示の順序で添加し、Ｇ／Ｌ溶液の添加前に
室温で34分混合物を培養した。読みは非同時的に
ベツクマンβ−メートで多数の異なる時間で行
い、観察された結果は次表に示した。

【表】 上記の結果は、反応体標識（グルコースオキシ
ダーゼ）により作られる過酸化物が信号調整体と
して信号生成標識（ホースラデイシユパーオキシ
ダーゼ）およびルミノールと作用して化学螢光信
号を作る場合に、HRP−抗hIgGがhIgGに結合し
てコムプレツクスを形成することを示している。
HRP−抗hIgGとhIgG−GO結合体との適当な比
を与えることで遊離のhIgGの不存在下では、観
察される信号を明瞭にすることができる。媒質へ
のhIgGの添加により、信号は消失した。 上記で用いた比は最適比ではないと考えられる
が、得られた結果は添加したhIgGの量を減少さ
せると観察される信号は増大することを確信させ
る。このことは特に約45分で明らかになりその後
はそのまま残つている。チユーブ６の30分の読み
はある程度不明確であるが、これは説明できな
い。それにもかかわらず、読みの差はhIgGの濃
度200倍の変化にわたつて極めて劇的であつた。 この発明はリガンドの決定において多くの利点
を与える。信号リガンドは多くの測定可能事項に
影響するので、この方法は高い感度を与える。第
２に、分析法は２種類の物質を近接して一緒する
ことであるから、特定の結合対のメンバー以外と
結合した標識は特に干渉しない。これらの外来標
識は溶液中で遊離しておりかつ特定の結合対の結
合で作られる微少環境に顕著には関与しない。し
たがつて、リガンドまたは抗リガンドが比較的不
純な形態で得られるとき、標識の適当な選択によ
りリガンドまたは抗リガンドの不純物組成に標識
したとき背景効果を減殺できる。 この発明の方法は、試料源の内因性干渉を避け
ることのできる広範な組合せを用いられ非常に融
通性がある。さらに、シンチレーシヨンカウンタ
ーのような高感度カウンターを用いられるので、
レートムード（rate mode）の採用により分析を
比較的短時に実施できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サンプル中の被分析物の存在量の測定方法に
   おいて、 該被分析物がリガンドと抗リガンドとからなる
   特異結合性対の１構成員であり、検出可能の信号
   の量は分析媒体中の被分析物の量の関数であり、
   該検出可能信号は３主要試薬： (A) 反応体標識結合体−前記特異結合性対の１構
   成員に結合した反応性有機化合物からなり、信
   号調整体前駆体と相互作用して信号調整体を生
   成する： (B) 信号生成標識結合体−前記特異結合性対の１
   構成員に結合した検出可能信号生成系の一成分
   である化合物からなり、ここで生成信号量は前
   記信号調整体の局部濃度によつて影響される、
   但し、前記信号生成標識と前記反応体標識とは
   前記特異結合性対の同一分子構成員に結合し
   て、反応体標識−信号生成標識結合体である信
   号試薬を生成してもよく： (C) 信号調整体前駆体−前記反応体標識と相互作
   用する未結合化合物であり、該信号調整体前駆
   体の電子励起状態である信号調整体を、または
   前記反応体標識との反応生成物である信号調整
   体をもたらす、但し、前記反応体標識と前記信
   号生成標識とが同一酵素のとき、前記信号調整
   体前駆体は、前記酵素によつて開裂可能な複数
   の置換基を有し、前記信号調整体は、該置換基
   による置換量が中間レベルにある： を使用することにより生成され、 ここで前記分析媒体中の前記反応体標識と前記
   信号生成標識との平均空間距離は該媒体中の被分
   析物の濃度の影響をうけ、前記リガンド又はリガ
   ンド類似体の抗リガンドとの結合により該反応体
   標識結合体と該信号生成標識結合体又は複数の反
   応体標識−信号生成標識結合体を一体にすると該
   反応体標識と該信号生成性標識がミクロ環境に導
   かれて、該全体の分析媒体中の信号調整体の濃度
   と異なる信号調整体の局部濃度が作り出される；
   方法において、 水性分析媒体中で (A) 該サンプル； (B) 該反応体標識結合体； (C) 該信号生成標識結合体； （但し、該反応体標識結合体と該信号生成標
   識結合体の両者は反応体標識−信号生成標識結
   合体で代用してもよい） (D) 該信号調整体前駆体 （但し、該反応体標識と該信号生成標識が共
   に同一の酵素である時には、該酵素により共有
   結合が開裂される少なくとも２つの置換基を持
   つ該信号調整体前駆体を用いる） (E) 該反応体標識と該信号生成標識の反応に必要
   な補助試薬； (F) ポリ（リガンド類似体） （該リガンドがモノエピトープ性であり、単
   一標識および単一リガンドからなる結合体を該
   結合体の１つとして用いる時） を併わせ、 生じた検出可能信号を、既知量の被分析物を含
   む分析媒体からの検出可能信号と比較して測定す
   ることからなる方法。 ２ 該媒体のPHが約４〜11の範囲内にあり、該媒
   体の温度が約10〜50℃の範囲内にある、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３ 該反応体標識結合体が該反応体標識として酵
   素を有する、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 該酵素がオキシドレダクターゼである、特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 該オキシドレダクターゼがNAD依存デヒド
   ロゲナーゼである、特許請求の範囲第４項記載の
   方法。 ６ 該酵素がヒドロラーゼである、特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ７ 該ヒドロラーゼがホスフアターゼである、特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 該ヒドロラーゼがグリコシダーゼである、特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ９ 該酵素がイソメラーゼである、特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 １０ 該信号生成標識が酵素である、特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 １１ 該酵素がオキシドレダクターゼである、特
   許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 該オキシドレダクターゼがペルオキシダー
   ゼである、特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 該オキシドレダクターゼがNAD依存デヒ
   ドロゲナーゼである、特許請求の範囲第１１項記
   載の方法。 １４ 該酵素がヒドロラーゼである、特許請求の
   範囲第１０項記載の方法。 １５ 該ヒドロラーゼがグリコシダーゼである、
   特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６ 該信号生成性標識が螢光体である、特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 １７ 該信号生成標識が非酵素系触媒である、特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 １８ 該被分析物が抗原である、特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 １９ 該抗原がグロブリンである、特許請求の範
   囲第１８項記載の方法。 ２０ 該抗原がホルモンである、特許請求の範囲
   第１８項記載の方法。 ２１ 該抗原がウイルス蛋白である、特許請求の
   範囲第１８項記載の方法。 ２２ 該被分析物がハプテンである、特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ２３ 該ハプテンがステロイドである、特許請求
   の範囲第２２項記載の方法。 ２４ 該ハプテンがアルカロイドである、特許請
   求の範囲第２２項記載の方法。 ２５ 該ハプテンが合成薬である、特許請求の範
   囲第２２項記載の方法。 ２６ サンプル中のリガンドの存在量の測定方法
   において、 該リガンドがリガンドと抗リガンドとからなる
   特異結合性対の１構成員であり、ここで検出可能
   の信号の量は分析媒体中の被分析物の量の関数で
   あり、該検出可能信号は３主試薬； (A) 反応体標識結合体−該特異結合性対の１構成
   員に結合した第１酵素からなる（該酵素は信号
   調整体前駆体と反応して信号調整体を生成す
   る）； (B) 信号生成標識結合体（これは第２の酵素から
   なり、検出可能信号生成系の成分であり、該第
   ２酵素は該特異結合性対の１構成員に結合して
   おり、生成信号量は該信号調整体の局部濃度の
   影響をうける）； (C) 信号調整体前駆体（これは該第１酵素と反応
   して該信号調整体を生成し、この調整体が該第
   ２酵素の生成物又は第２酵素と反応して該検出
   可能信号を生成する）； を使用することにより生成され、 ここで該分析媒体中の該反応体標識結合体と該
   信号生成結合体との空間距離は該媒体中のリガン
   ドの濃度の影響をうけ、該リガンド又はリガンド
   類似体と抗リガンドとの結合により該反応体標識
   結合体と該信号生成標識結合体とをあわせると該
   反応体標識と該信号生成標識がミクロ環境内で空
   間的に近接して、該分析媒体中の信号調整体濃度
   と異る信号調整体局部濃度が作り出される； 方法において、 水性分析媒体中で (A) 該サンプル； (B) 該反応体標識結合体； (C) 該信号生成標識結合体； (D) 該信号調整体前駆体： (E) 該第１、第２の酵素の反応に必要な補助試
   薬； (F) ポリ（リガンド類似体） （該リガンドがモノエピトープ性であり、単
   一標識および単一リガンドからなる結合体を該
   結合体の１つとして用いる時）； を併わせ、 生じた検出可能信号を、既知量の被分析物を含
   む分析媒体からの検出可能信号との比較により測
   定することからなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ２７ 該分析媒体のPHが約４〜11の範囲内にあ
   り、該分析媒体の温度が約10〜50℃の範囲内にあ
   る、特許請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８ 該第１、第２の酵素がオキシドレダクター
   ゼである、特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９ 該第１酵素が過酸化水素を生成し、該第２
   酵素がペルオキシダーゼである、特許請求の範囲
   第２８項記載の方法。 ３０ 該第１酵素がグルコースオキシダーゼであ
   り、該検出可能信号がペルオキシダーゼ、過酸化
   水素、化学発光体の反応により生成される、特許
   請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１ 該リガンドが抗原である、特許請求の範囲
   第３０項記載の方法。 ３２ 該抗原がグロブリンである、特許請求の範
   囲第３１項記載の方法。 ３３ 該抗原がホルモンである、特許請求の範囲
   第３１項記載の方法。 ３４ 該第１酵素がヒドロラーゼである、特許請
   求の範囲第２７項記載の方法。 ３５ 該第２酵素がヒドロラーゼである、特許請
   求の範囲第２７項記載の方法。 ３６ 該第１酵素がイソメラーゼである、特許請
   求の範囲第２７項記載の方法。 ３７ 該特異結合性対の構成員が該反応体標識結
   合体当たり少なくとも一つであり、信号生成標識
   結合体がポリエピトープ性リガンド又はリガンド
   類似体であり、該水性分析媒体中でポリ受容体を
   あわせる工程を有する、特許請求の範囲第１又は
   ２６項記載の方法。