JPS6337347B2 - - Google Patents

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JPS6337347B2
JPS6337347B2 JP54041546A JP4154679A JPS6337347B2 JP S6337347 B2 JPS6337347 B2 JP S6337347B2 JP 54041546 A JP54041546 A JP 54041546A JP 4154679 A JP4154679 A JP 4154679A JP S6337347 B2 JPS6337347 B2 JP S6337347B2
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JP
Japan
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ligand
analyte
chemiluminescent
quencher
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JP54041546A
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Toomasu Matsujio Edowaado
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Syva Co
Original Assignee
Syva Co
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Publication date
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Publication of JPS6337347B2 publication Critical patent/JPS6337347B2/ja
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は免疫学的分析法に関し、詳細には螢光
を利用した免疫学的分析法とこの方法で使用され
るキツトに関する。 容易かつ正確に決定できる物質の種類と決定方
法の両者に関して臨床診断分野は近年幅広く発展
している。一技術では、別の分子でできた特殊の
空間、極性有機体に特異結合できる有機受容体を
使用している。大部分の場合、これら化合物は抗
体であり、対象化合物又は組成物と、類似構造を
持つ他化合物とを区別できる。被標識化リガンド
に受容体を結合させることにより、受容体に結合
している被標識化リガンドと未結合の被標識化リ
ガンドとを区別できる。 受容体により結合されることにより観察される
効果は標識に依存する。場合によつては、抗体の
結合によつては結合被標識化リガンドと未結合被
標識化リガンドとが分子量で示差されるのであ
る。他の場合では受容体の存在が標識から得られ
る信号の性質に影響し、信号が、被標識化リガン
ドに結合した受容体の量に伴つて変化することが
ある。第２の変法では受容体を被標識化し、リガ
ンドは被標識化しない。極めて接近する時に相互
作用する２つの異なる標識で受容体を被標識化す
る場合には、リガンドの存在量が、受容体上の標
識が相互作用する程度に影響する。 分析法の開発には多数の問題点がある。１つの
問題点は、被分析物の濃度の変化に対する信号反
応である。第２の問題点は、分析を実施できる容
易性である。第３の問題点は、サンプル相互の妨
害の差である。試薬の製造、精製の容易性、装置
の入手性、自動化の容易性、リガンドとの相互作
用が追加の問題点であるが、有用な分析法の開発
における様々な懸念を全て研究し尽したものでは
ない。 それゆえ、広範囲の様々なリガンドに適用で
き、或は、他方法を容易には適用できない特定の
場合に使用できる新規かつ正確な技術の必要性が
依然存在する。 アメリカ特許3709868号発明は放射免疫分析法
の一例である。アメリカ特許3960834号発明はス
ピン免疫分析法の一例である。アメリカ特許
3654090号とドイツ特許公開2223385号の発明は酵
素免疫分析法の一例である。関連論文はLudwig
BrandとJames R.Gohlkeによる論文、Annual
Review of Biochemistry 41、843〜868
（1972）、StryerのScience、162、526（1968）であ
る。SmithによりFEBS Letters77、25（1977）に
は螢光免疫分析法が記載されており、そこではチ
ロキシンを螢光体に結合して螢光体を消光させて
おり、この消光は抗体をチロキシンに結合させる
と生じない。Ullman等のJ.Biol.Chem.251、4172
（1976）も参照されたい。 化学発光についての優れた考察はMcCapraの
Quarterly Reviews20、485（1966）に見い出すこ
とができる。 被分析物としてリガンドとこのリガンドの受容
体とからなる免疫学的１対の１員を対象とする競
合蛋白結合分析法が提供される。この分析法は、
化学発光源が比較的長距離で消光剤へのエネルギ
ー移動により消光される程度に影響する被分析媒
体中の被分析物の存在を基礎とする。化学発光源
（化学発光源が複数の成分を必要とする場合には
化学発光源の１成分）を免疫学的１対の１員と結
合し、消光剤を免疫学的１対の残りの１員と結合
することにより、被分析媒体中に入れられる時に
被分析媒体中に存在する被分析物の量に依存して
様々な程度に発光する試薬を製造できる。 詳細には、化学発光源又はその成分と消光剤と
をリガンドがその受容体に結合させて得られた試
薬を、緩和温度にあり、水性であり、通常緩衝さ
れている媒体に入れ、発光量を測定できる。既知
量の被分析物を含む分析媒体との比較により、発
光量と分析媒体中の被分析物の量との間に量的関
係を確立できる。 そのまま使用できるが、容易に希釈して分析の
感度と成果を実質上最適化する濃度にできる様に
前もつて測定された量で試薬を含むキツトを提供
できる。 本発明により、化学発光を用いて、分析媒体中
の被分析物の量に関連した信号を提供する。被分
析物はリガンドと受容体からなる免疫学的１対の
１員である。化学発光源又は化学発光源の１成分
（該源が２以上の成分からなる場合）を免疫学的
１対の１員と、消光剤を残りの１員と結合すれ
ば、被分析物の存在が、被結合化学発光源の消光
距離内にある消光剤の量に影響する。この化学発
光源試薬と消光剤試薬（２つの標識が異なる分子
上にある場合）及び、必要ならば追加の免疫学的
対の構成員とを分析媒体中で被分析物とあわせ、
化学発光に必要な補助試薬を含め、分析媒体から
の発光量を一定波長で測定することにより、既知
量の被分析物を含む分析媒体との関係からサンプ
ル中の被分析物の量を決定できる。 この方法は、染料が励起状態の化学発光体から
一定距離内にある時には衝突、放射なしに化学発
光体がそのエネルギーを消光剤に伝達することが
あるという観察に基づく。ついで消光剤は化学発
光体より高波長で放射するか無放射減衰によりエ
ネルギーを失う。化学発光源の一員と受容体とを
リガンドが受容体に結合させ、２つの結合体が一
緒になる時には化学発光源の消光距離内の消光剤
の量が分析媒体中に存在する被分析物の量の影響
を受ける様にする。分析媒体から発せられる光の
性質と量はそれゆえ、分析媒体中に存在する被分
析物の関数である。既知量の被分析物を用いて分
析を行うことにより、分析媒体中の被分析物の量
と、１ないしそれ以上の波長で分析媒体から発せ
られる放射量との間に量的関係を確立できる。 本明細書で使用される用語の定義は次の通りで
ある。 被分析物 測定すべき化学物か組成物であり、これは、モ
ノ−又はポリエピトープ性で、抗原性がハプテン
性であり、単一か、少くとも１つの共通のエピト
ープ性部位を共有する複数の化合物であるリガン
ドか、受容体である。 リガンド それに対する受容体が天然に存在するか製造で
きる化合物。 リガンド類似物 受容体に対して類似リガンドと競合できる被修
飾リガンドであり、該修飾により標識かハブ核に
結合する手段を備える。 ポリ（リガンド類似物） 通常ハブ核に共有結合されて、受容体に対して
類似リガンドと競合できる複数のエピトープ性部
位を持つ化合物を提供する複数のリガンド類似
物。 標 識 化学発光源の１成分が消光剤染料であり、消光
剤染料が化学光源からエネルギーを吸収する高遷
移確率を持つ場合には発光性相反１対を形成す
る。 (a) 化学発光体標識 それ自体、或は他化合物との組合せにより電
子励起状態の分子を生成する化合物をいう。該
分子は発光により低エネルギー状態に減衰で
き、全過程で化合物の１ないしそれ以上で化学
変化が起きる。 (b) 消光剤 化学発光体分子から短いが衝突しない距離
（普通約100Å未満）内にある時にエネルギー
（これは他の場合には化学性発光として発せら
れるものである）を受け取ることにより化学発
光を阻止できる分子。事実、消光剤は消光する
ためには化学発光体に最も近接している必要は
ない。 標識−結合体 標識（化学発光源構成化合物か消光剤のいづれ
か）を結合手即ち結合鎖により免疫学的１対の１
員に結合したものである（両者を同一分子に結合
したものではない）。この結合体は少くとも１つ
の標識を持ち、又、免疫学的１対の１員に結合し
た複数の標識或は、標識又は複数のリガンドと標
識に結合した複数のかかる構成員即ちポリ（リガ
ンド類似体）−ポリ標識を有してもよい。特に、
酵素が標識として用いられる化学発光源の成分で
ある場合には複数のリガンド類似体を酵素に結合
してポリ（リガンド類似体）−標識を形成できる。 受容体 分子の特殊の空間的かつ極性の組織即ちエピト
ープ性部位を認識できる化合物又は組成物。例示
すると天然受容体、抗体、酵素、レクチン、Fab
フラグメント等である。受容体の受容体部位は１
価でも多価でもよく、普通多価、例えば抗体であ
る。いかなる特定のリガンドに対しても受容体は
“抗リガンド”と呼ばれる。受容体（抗リガンド）
及びその相反リガンドが免疫学的１対を形成す
る。 ポリ（リガンド類似体）−標識 複数のリガンド類似体と１個ないし複数の標識
が一緒に結合してリガンド類似体と標識とが並置
されており、従つて、受容体がリガンド類似体に
結合している時には被標識化受容体上の標識が相
互標識の消光距離内にある組成物。酵素が化学発
光源の１部であり、かつリガンドがハプテン性で
ある場合には複数のリガンド類似体を酵素に結合
してもよい。別法として、複数のリガンド類似体
と１ないしそれ以上の標識とを水溶性多官能性ハ
ブ核に結合できる。 分析法 本発明の分析法は水性で通常均質なゾーン（通
常は緩和なPH値にあるが必ずしもその必要はな
く、一般には最適分析感度に近いPH値にある）内
で実施される。被分析物測定のための分析ゾーン
は、適当な被分析液（普通緩衝されている）中で
未知サンプル（前処理してあつてもよい）、化学
発光体では標識化された試薬、消光剤で標識化さ
れた試薬〔ポリ（リガンド類似体）−ポリ標識を
含む〕を用いることにより調製される。 分析媒体中に所定量の抗リガンドと共に抗リガ
ンド又はリガンドが存在すれば、化学発光剤の消
光距離内にくる消光剤の程度が制御される。 消光剤、化学発光体（試薬）の調製には４つの
基本的変型がある。４つの変型は次の通りであ
る。 (1) 化学発光体をリガンドに結合して化学発光体
被標識化リガンドとし、消光剤を受容体に結合
して消光剤被標識化抗リガンドとする。 (2) 消光剤をリガンドに結合して消光剤被標識化
リガンドとし、化学発光体を受容体に結合して
化学発光体結合抗リガンドとする。 (3) 化学発光体を受容体に結合して化学発光体被
標識化抗リガンドとし、消光剤を受容体に結合
して消光剤被標識化抗リガンドとする。 (4) 化学発光体をリガンドに結合して化学発光体
被標識化リガンドとし、消光剤をリガンドに結
合して消光剤被標識化リガンドとする。 最初の２つの組合せを用いると、試薬が結合す
ると消光剤は化学発光体の消光距離内にある。被
分析物（リガンドであれ抗リガンドであれ）の存
在が、化学発光体の消光距離内の消光剤分子の数
を減らすことにより化学発光体と消光剤との間の
エネルギー伝達量を減らすのに役立つ。第３の組
合せにおいてはポリエピトープ性リガンド（ポリ
（リガンド類似物）を含む〕を被分析物としての
抗リガンドかモノエピトープ性リガンドのために
加えねばならない。リガンドがポリエピトープ性
である場合にはポリエピトープ性リガンドの濃度
の上昇につれて消光が強まつて最大消光となり、
ついで、ポリエピトープ性リガンド濃度の低下に
伴つて弱まる。かくて２相反応が得られ、従つ
て、不連続の結果を得るためにはその結果が曲線
のいづれの例にあるかを知らねばならない。対照
的に、ポリ（リガンド類似体）を用いた場合に
は、モノエピトープ性リガンドの存在が消光を減
じるのに役立つ、受容体が被分析物ならば、受容
体濃度の増加も消光を減じるのに役立つ。 化学発光体と消光剤を共にリガンドに結合する
場合には、リガンドが多価抗リガンドのいずれか
の分析を達成できる。リガンドの分析を行う場合
には２つの標識−結合体を、化学発光体と消光剤
とを相互の消光距離内にもたらす抗リガンドと共
に用いる。リガンドの添加により、消光距離内の
化学発光体と標識との量が減少する。抗リガンド
の測定には２つの標識−結合体を用いる。抗リガ
ンドの量が増加すると化学発光が減少して最少に
なり、ついで、抗リガンド濃度の上昇につれて上
昇する。２相曲線のいづれの側か不確実ならば１
ないしそれ以上のサンプル希釈物の分析によりそ
の濃度が示される。消光とは、化学発光体から消
光剤へのエネルギー伝達をさす。この伝達の結果
により、その他の場合には化学発光体により発せ
られたであろう単一波長の又は波長域の光が消光
剤に伝達されて螢光し、被吸収エネルギーより高
波長の光が発せられる。化学発光体の発光の量的
効率、化学発光体から消光剤へのエネルギー伝達
の効率、消光剤の発光の量的効率、モニターされ
る波長域に依存して、消光による光の量を多少に
関らず観察できる。それゆえ、消光という場合に
は、信号の減少が観察される必要はない。事実、
消光剤により発せられる光を観察すれば、消光の
強化に従つて信号も大きくなる。 分子量が約125〜2000の小さなハプテンでは特
別の場合が存在する。これらハプテンの場合には
化学発光が相当に減少し、即ち、受容体（特に抗
体である場合）に結合した消光剤がなくても消光
する。信号の減少は消光剤が受容体に結合してい
る時ほどに大きくないが、充分な減少が達成され
て許容される分析が行われる。消光剤なしで受容
体を使う場合を除けば分析は化学発光体により発
せられる光を読むことにより同一方法で達成され
る。 分析の実施においては通常、水性媒体を用い
る。他の極性溶媒も用いることができ、普通
C1〜6、更に普通にはC1〜4の酸素化有機溶媒、例え
ばアルコール、エーテル等が用いられる。普通に
はこれら補溶媒は約40重量％未満、更に普通には
約20重量未満で存在する。 媒体のPHは普通約５〜12の、更に普通には約７
〜10の範囲内にあり、又、酸素を化学発光源の１
部として用いる時は７〜９の範囲内にある。様々
な緩衝剤を使つて所望PHを達成し、測定量そのPH
を維持できる。緩衝剤の例はホウ酸塩、リン酸
塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等である。い
づれの緩衝剤を用いるかは本発明にとり重要では
ないが、個々の分析においては１つの緩衝剤が他
より好ましいことがある。 分析実施には緩和温度が通常用いられ、分析中
は普通恒温を用いる。温度は通常約10〜50℃、更
に普通には約15〜40℃である。 被分析物の濃度は一般に約10-4〜10-15M、更
に普通には約10-6〜10-13Mである。前述の別法
では対象濃度域は約10-3〜10-14ｇ／mlが一般で
ある。 対象被分析物の濃度域に加えて、分析が量に関
するものか半量的なものか質に関するものか、用
いられる装置、試薬特性等の観点から通常、試薬
の濃度が決まる。被分析物の濃度により他試薬の
濃度域が決まるのではあるが、通常は分析感度を
最適化するために各試薬濃度は経験で定める。受
容体の結合定数と結合プロフイルとは例えば抗体
により採血毎に変わるので、別々の試薬に対して
は各々新しいバツチの抗体の濃度比を別々にする
必要がある。 通常、モノ−、ポリエピトープ性リガンドが被
分析物である場合には、結合部位に基く抗リガン
ドの濃度は結合部位に基く対象最小濃度にほぼ等
しく、結合部位に基く対象最大濃度の約50倍以下
であり、結合部位に基く対象最大濃度の普通約１
〜10倍、更に普通には約１〜３倍である。 ポリエピトープ性リガンド受容体が被分析物で
ある場合には被標識化リガンド又はリガンドの受
容体被分析物に対する均等比は結合比に基づいて
対象最小濃度の約0.01倍から対象最大濃度の約
100倍以下の範囲内にあるのが一般的である。被
標識化リガンド又はリガンドと組み合せられて用
いられる被標識化受容体は一般に、結合部位に基
づいてリガンド又は被標識化リガンドの濃度の約
0.01〜100倍で存在する。 ポリエピトープ性リガンドが被分析物であり、
被標識化リガンドを用いる場合には被標識化リガ
ンドの濃度は対象最小濃度の一般に約10-4倍以
上、更に普通には約10-12倍以上であり、普通に
は、対象最小濃度にほぼ等しい濃度から、ほぼ対
象最大濃度を越えない範囲内にある。被標織化受
容体の比は一般に、結合部位に基づいて被標識化
リガンド濃度の約0.1倍以上であり、結合部位に
基いて被標識化リガンドの濃度の約100倍以下で
ある。 モノエピトープ性リガンド、モノエピトープ性
リガンド受容体が被分析物であり、被標識化リガ
ンド〔ポリ（リガンド類似体）−標識を含む〕を
用いる時には、結合部位に基く被標識化リガンド
の濃度は普通には対象最小濃度の10-4倍以上、更
に普通には対象最小濃度の10-2倍以上であり、普
通には、ほぼ対象最小濃度から対象最大濃度の範
囲内にある。ポリ（リガンド類似体）を被標識化
抗リガンドと共に用いる時にはポリ（リガンド類
似体）の濃度は被標識化リガンドに対して示した
と同一の範囲内にあり、抗リガンドの濃度は前に
示した。 様々な試薬の添加順位は、平衡即ち速度測定が
含まれるか否か、試薬の性質、リガンドと抗リガ
ンドとの間に平衡が達成される速度、化学発光源
の性質に依存して幅広く変えることができる。化
学発光源が複数の成分を有する（成分の１つが標
識）場合には化学発光源の他成分の添加により化
学発光をいつでも開始できる。化学発光源が１よ
り多い成分を有する場合には被標識化試薬と未知
物とを同時にあわせ、ついで化学発光源の他成分
を添加する。別法として、被分析物を被標識化抗
リガンドとあわせ、被標識化リガンドを添加し、
ついで化学発光源の残りの成分を加える。添加の
間にインキユベーシヨンしてもよい。化学発光源
が単一成分である場合は通常、被標識化受容体を
被分析物とあわせ、ついで適宜被標識化リガンド
を添加する。 用いる方法、平衡か非平衡であるか、抗リガン
ドがリガンド、被標識化リガンドに結合する速
度、リガンド、被標識化リガンド、被標識化抗リ
ガンドの相対濃度に依存して１以上のインキユベ
ーシヨン工程を含めることができる。通常、添加
間隔は２〜３秒から多数時間であり、普通16時間
を越えることはなく、更に普通には６時間を越え
ることはない。普通、インキユベーシヨン時間は
約0.5分〜１時間、更に普通には約0.15分〜30分
である。最終結果は実質上同一の方法で処理され
た標準液を用いて得られる結果に依存するので、
様々な濃度の被分析物を用いて有意な再現可能な
識別を得られる限り、同一方法であるならば個々
の方法と時間とは重要でない。 分析処方、用いられる装置、被分析物の濃度に
依存して被分析容量は約１mlと小量でよく、更に
普通には約25mlであり、普通は５mlを越えず、更
に普通には２mlを越えない。 分析方法は分析媒体から発せられる光の量の計
数に依存する。シンチレーシヨン計数計、光電池
等の、単一波長又は波長域で光を測定できる様々
な装置を使用できる。 材 料 本発明の分析における主成分（これらは全ての
場合に用いてもよいし用いなくてもよい）は；被
標識化リガンド〔ポリ（リガンド類似体）−標
識〕；被標識化抗リガンド；リガンド；抗リガン
ド；及び、化学発光源に必要とされる別の成分で
ある。 被分析物 本発明のリガンド（被分析物）はモノエピトー
プ性かポリエピトープ性であることを特徴とす
る。ポリエピトープ性リガンド（被分析物）は通
常はポリ（アミノ酸）即ちポリペプチドと蛋白、
多糖類、核酸及びこれらの結合体である。かかる
結合体は細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミト
コンドリア、核、細胞膜等である。 大部分の場合、本発明で用いられるポリエピト
ープ性リガンド（被分析物）は少くとも約5000
の、更に普通には少くとも約10000の分子量を持
つ。ポリ（アミノ酸）のカテゴリーにおいては、
対象ポリ（アミノ酸）は一般に約5000〜5000000
の、更に普通には約20000〜1000000の分子量を持
ち、対象ホルモンの場合に分子量は普通約5000〜
60000である。 様々な蛋白質を類似構造特徴を持つ蛋白、特有
の生物学的機能を持つ蛋白、特定微生物（特に病
原菌）に関連した蛋白の族として考えることがで
きる。 以下は、構造により区分された蛋白群である。 プロタミン ヒストン アルブミン、 グロブリン 硬蛋白 隣蛋白 ムコ蛋白 色素蛋白 リポ蛋白 核蛋白 糖蛋白 未分類蛋白、例えばソマトトロピン、プロラク
チン、インシユリン、ペプシン 人血漿中に見い出される多数の蛋白は臨床的に
重要であり、例えば以下のものである。 プレアルブミン アルブミン α1−リポ蛋白 α1−酸糖蛋白 α1−抗トリプシン α1−糖蛋白 トランスコルチン 4.6S−ポストアルブミン トリプトフアンに乏しいα1−糖蛋白 α1x−糖蛋白 チロキシン結合性グロブリン α−トリプシン間阻止剤（Inter−α−
trypsin−inhibitor） Gc−グロブリン （Gc １−１） （Gc ２−１） （Gc ２−２） ハプトグロビン （Hp １−１） （Hp ２−１） （Hp ２−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α2−リポ蛋白 α2−マクログロブリン α2−HS−糖蛋白 Zn−α2−糖蛋白 α2−ノイラミノ−糖蛋白 エリスロ蛋白 β−リポ蛋白 トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノーゲン プラスミノーゲン β2−糖蛋白 β2−糖蛋白 免疫グロブリンＧ（IgG）又はγG−グロブリン 分子式： γ2K2又はγ2λ2 免疫グロブリンＡ（IgA）又はγA−グロブリン 分子式： （α2K2）n又は（α2λ2）n 免疫グロブリンＭ（IgM）又はγM−グロブリン 分子式： （μ2K2）5又は（μ2λ2）5 免疫グロブリンＤ（IgD）又はγD−グロブリン
（γD） 分子式： （δ2K2）又は（δ2λ2） 免疫グロブリンＥ（IgE）又はγE−グロブリン
（γE） 分子式： （ε2K2）又は（ε3λ2） 遊離Ｋ、γ光鎖 補足因子： C′1 C′1q C′1r C′1s C′2 C′3 β1A α2D C′4 C′5 C′6 C′7 C′8 C′9 重要な凝血因子は次の通りである。 凝血因子 国際名称 名 称 フイブリノーゲン プロトビン ａ トロンビン 組織トロンボプラスチン と プロアクセレリン、促進グロブリン プロコンバーチン 抗血友病グロブリン（AHG）、クリスマス因
子、 血漿トロンボプラスチン成分（PTC） スチユアルトープラウアー因子 XI 血漿トロンボプラスチン前駆体（PTA） XII ハーゲマン因子 フイブリン安定化因子 重要な蛋白ホルモンは下記のものである。 ペプチドと蛋白ホルモン 上皮小体ホルモン（パラトロモン） チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリスロポイエチン メラノトロピン （黒血球刺激ホルモン；インテルメジン） ソマトトロピン （生長ホルモン） コルチコトロピン （副腎皮質刺激ホルモン） チロトロピン 小胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン （間質細胞刺激ホルモン） 黄体腫乳腺親和性ホルモン （ルテオトロピン、プロラクチン） ゴナドトロピン （絨毛膜ゴナドトロピン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシン、 ブラジキニン 人胎盤ラクトゲン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バソプレシン 解放因子（RF） CRF、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RF、PIF、MIF 他の対象高分子物質はムコ多糖類と多糖類であ
る。 微生物から誘導される抗原性多糖類の例は次の
通りである。
【表】
【表】 分析される微生物はそのままでも溶解しても粉
砕しても或はその他の方法で破砕してもよく、生
じた組成物或は例えば抽出による部分を分析す
る。対象微生物は下記のものである。 コリネバクテリア ジフテリア菌 肺炎球菌 肺炎双菌球 連鎖球菌 化膿連鎖球菌 Str.サリバラス（Salivarus） ブドウ球菌 黄色ブドウ球菌 白色ブドウ球菌 ナイセリア菌 髄膜炎菌 淋 菌 腸内菌 大腸菌 アイロゲネス菌 肺炎桿菌大腸菌 腸チフス 豚コレラ菌 ネズミチフス菌サルモネラ菌 赤痢菌 シゲラシユミツツイ （shigella schmitzii） シゲラアラビノタルダ （Shigella arabinotarda） フレキシナー菌 ボイド菌 ゾンネ菌赤痢菌 他の腸内菌 尋常変形菌 奇怪変形菌 モルガン変形菌変形菌 緑膿菌 アルカリ大便菌 コレラ菌 ヘモフイラス−ボーデテラ群 インフルエンザ菌、軟下疳菌 H.ヘモフイラス（hemophilus） H.エジプチカス（aegypticus） パラインフルエンザ菌 ボーデテラペルツシス （Bordetella pertussis） パスツレラ菌 ペスト菌 野兎病菌 ブルセラ菌 マルタ熱菌 牛流産菌 豚流産菌 好気性胞子形成桿菌 炭疳菌 枯草菌 巨大菌 セレウス菌 嫌気性胞子形成性桿菌 ボツリヌス菌 破傷風菌 ウエルチ菌 ノービ菌 セプチツクス菌 ヒストリチクス菌 第３型ロデラ菌 Cl.ビフエニルメタンス（bifermentans） スポロゲネス菌 ミコバクテリア 人型結核菌 牛型 〃 鳥型 〃 癩菌 パラ結核性腸炎菌 放線菌（カビ状細菌） 牛放線菌（Actinomyces israelii、
Actinomyces bovis） A.ネスルンジ（naeslundii） ノカルジアアステロイデス（N.asteroides） ノカルジアブラシリエンシス（N.brasiliensis） スピロヘータ 梅毒トレポネーマ 小スピリルム フランベジア・トレポネーマ ヘーヴアリル熱
病原菌 ピンタ・トレポネーマ オーベルマイエル回帰熱スピロヘータ 黄疽出血病レプトスピラ 犬レプトスピラ ミコプラズマ ミコプラズマプノイモニー（Mycoplasma
pneumoniae） 他の病原菌 単球症リンテリア 豚丹毒菌 ヘーヴアリル熱病原菌 鼠径肉芽腫菌 バチルス形バルトネラ リケツチア（細菌様寄生虫） 発疹熱リケツチア（R.prowazekii、（R.
mooseri） 斑点熱リケツチア コノリリケツチア 北クノーンスランド壁 性チフスリケツチア
（R.australis） R.シビリカス（Sibiricus） リケツチア痘瘡 恙虫リケツチア Ｑ熱リケツチア 塹壕熱病原菌 クラミジア（分類不可能の寄生細菌／ウイルス） クラミジア剤（命名は不確実） 真 菌 酵母症病原菌 北アメリカ分芽菌病原菌 ヒストプラズマ病原菌 コクシジオイデスイミチス ブラジルパラコクシジオデス 鵞口瘡カンジダ 烟色コウジ菌ケムカビ 傘状ケカビ（アブシデイアコリンビフエラ） リゾプスオリザエ（R.oryzae） リゾプスアリズス（R.arrhizus） リゾプスニグカンス（R.nigricans）藻菌 フオンセケアペドロゾイ（F.pedrosoi） フオンセケアコンパクタ（F.compacta） フオンセケアデルマチチジス（F.
dermatitidis） クラドスポリウムカリオニ（C.carrionii） 色素分芽菌症原菌 為巣性コウジ菌 マズラ足放線菌 マズラグリセ（Madurella grisea） 糸状菌腫病原菌 フイアロスフオラジエンセルメイ
（Phialosphora jeanselmei） 石膏状小胞子菌 毛瘡白癬菌 ケラチノマイセスアジエロイ
（Keratinomyces ajelloi） 犬小胞子菌 猩紅白癬菌 オーズアン小胞子菌 ウイルス アデノウイルス ヘルペスウイルス 単純疱疹ウイルス 水痘ウイルス 帯状疱疹ウイルス ウイルスＢ 巨大細胞ウイルス（Cytomegalo virus） 痘疹ウイルス 痘疹（小痘瘡）ウイルス 種瘡ウイルス 牛痘瘡ウイルス 変態痘ウイルス 伝染性軟属種腫ウイルス ピコルスウイルス ポリオウイルス コツクスサツキ−ウイルス エコーウイルス リノウイルス 粘液ウイルス インフルエンザ（Ａ、Ｂ、Ｃ）ウイルス パラインフルエンザ（１−４）ウイルス おたふくかぜウイルス 牛疫ウイルス 犬ジステンバーウイルス レスピレイトリーシンシシアル（Respiratory
Syncytial）ウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス イースタンエクインユーセフアリチス
（Eatern Equine Eucephalitis）ウイルス ウエスタンエクインユーセフアリチス
（Wastern Equine Eucephalitis）ウイルス シンドビス（Sindbis）ウイルス チクグンヤ（Chikugunya）ウイルス セムリキ森林ウイルス マヨラウイルス セントルイス脳炎ウイルス カルホルニア脳炎ウイルス コロラド真壁ダニ熱ウイルス 黄熱ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス レオウイルス１〜３型 肝炎ウイルス 肝炎Ａウイルス 肝炎Ｂウイルス 腫瘍ウイルス ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルス グロス（Gross）ウイルス マロネイ（Maloney）白血病ウイルス アレルゲン モノエピトープ性リガンド（被分析物）は一般
に約100〜2000の、更に普通には125〜1000の分子
量を持つ。対象被分析物は薬物、代謝産物、農
薬、汚染物質等である。対象薬物にはアルカロイ
ドが包含される。アルカロイドはモルフインアル
カロイド（モルフイン、コデイン、ヘロイン、デ
トロメトルフアン、それらの誘導体と代謝産物を
含む）；コカインアルカロイド（コカイン、ベン
ゾイルエクゴニン、それらの誘導体と代謝産物を
含む）；エルゴツトアルカロイド（リゼルグ酸の
ジエチルアミドを含む）；ステロイドアルカロイ
ド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリンアル
カロイド；イソキノリンアルカロイド、キノリン
アルカロイド（キニン、キニジンを含む）；ジテ
ルペンアルカロイド、それらの誘導体と代謝産物
である。 次の薬物群はステロイドであり、これにはエス
トロゲン、ゲストロゲン、アンドロゲン、アンド
レノコルチカルステロイド、胆汁酸、強心性のグ
リコシドとアグリコン、ジゴキシンとジゴキシゲ
ニン、サポニンとサポゲニン、それらの誘導体と
代謝産物が含まれる。ジエチルスチルベストロー
ル等の偽ステロイド物質も含まれる。 次の薬物群は、５〜６員環ラクタムであり、こ
れにはバルビツール酸塩、例えばフエノバルビタ
ールとセコバルビタールジフエニルヒダントイン
及びそれらの代謝産物が含まれる。 次の薬物群は、アミノアルキルベンゼン（アル
キル部分はC2〜3）であり、これにはアンフエタミ
ン、カテコールアミン、エフエドリン、Ｌ−ド
パ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリン、そ
れらの代謝産物と誘導体が含まれる。 次の薬物群はベンゾ複素環式化合物であり、オ
キサゼパム、クロロプロマジン、テグレトール、
イミプラミン、それらの誘導体と代謝産物が含ま
れ、その複素環はアゼピン、ジアゼピン、フエノ
チアジンである。 次の薬物群はプリンであり、テオフイリン、カ
フエイン、それらの代謝産物と誘導体が含まれ
る。 次の薬物群は麻から誘導されるものであり、カ
ンナビノール、テトラヒドロカンナビノールを含
む、 次の薬物群はＶ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋの様
なビタミンである。 次の薬物群はプロスタグランジンであり、ヒド
ロキシル化、不飽和の程度と部位が異る。 次の薬物群は抗生物質であり、ペニシリン、ク
ロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサ
イクリン、テラマイシン、それらの代謝産物と誘
導体が含まれる。 次の薬物群はヌクレオシドとヌクレオチドであ
り、適当な糖、ホスフエート置換基を有する
ATP、NAD、FMN、アデノシン、カノシン、
チミジン、シチジンである。 次の薬物群はその他の薬物であり、メサドン、
メプロバメート、セロトニン、メペリジン、アミ
トリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、
プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、
プロパノロール、グリセオフルビン、ブチロフエ
ノン、抗ヒスタミン、コリン抑制薬、例えばアト
ロピン、それらの代謝産物及び誘導体が含まれ
る。 次の化合物群はアミノ酸と小ペプチドであり、
ポリヨードチロミン、例えばチロキシン、トリヨ
ードチロニン、オキシトシン、ACTH、アンギ
オテンシン、ゲンタマイシン、メトー、ロイーエ
ンケフアリン、それらの代謝産物と誘導体が含ま
れる。 病的状態に関係ある代謝産物はスペルミン、ガ
ラクトース、フエニル焦性ブドウ酸、ポルフイリ
ン１型である。 対象農薬には多ハロゲン化ビフエニル、リン酸
エステル、チオホスフエート、カルバメート、多
ハロゲン化スルフエンアミド、それらの代謝産物
と誘導体が含まれる。 受容体（被分析物）の分子量は一般に10000〜
２×106、更に普通には10000〜1016である。免疫
グロブリンIgA、IgG、IgE、IgMの分子量は一
般に約160000〜約166である。酸素の分子量は通
常約10000〜600000である。天然受容体は様々で
あり、分子量は一般に少くとも約25000であり、
106ないしそれ以上と高くてもよく、アビジン、
チロキシン結合性グロブリン、チロキシン結合性
プレアルブミン、トランスコルチン等の物質が含
まれる。 標 識 消光剤 消光剤分子は、化学発光体により発せられる波
長帯の光を吸収する発色団である。好ましくは、
この消光剤は化学発空体の最大発光波長に近い波
長を吸収する。望まれることは、消光剤が化学発
光源に比較的に近く隣接している位置にある時に
は高効率のエネルギー伝達が存在するということ
である。通常、消光剤は約350Åより長波長の、
更に普通には約400Åより長波長の光を吸収する。
消光剤として用いることのできる様々な発色団は
キサンテン染料等であり、３，６−ジヒドロキシ
−９−フエニルキサントヒドロールから誘導され
るフルオレセイン、３，６−ジアミノ−９−フエ
ニルキサントヒドロールから誘導されるローザミ
ン、ローダミン等が該当する。ローダミンとフル
オレセインは９−ｏ−カルボキシフエニル基を有
し、９−ｏ−カルボキシフエニルキサントヒドロ
ールの誘導体である。 フエニル基上に結合部位として使用できる置換
基を有するこれらの化合物は市販されている。例
えば、アミノ、イソチオシアネート置換フルオレ
セイン化合物を入手できる。 消光剤として使用できる他染料は３−フエニル
−７−イソシアナトクマリン、アクリジン、例え
ば９−イソチオシアナトアクリジンとアクリジン
オレンジ；Ｎ−〔ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）
フエニル〕マレインイミド；ベンゾオキサジアゾ
ール、例えば４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２
−オキサ−１，３−ジアゾールと７−（ｐ−メト
キシベンジルアミノ）−４−ニトロベンゾ−２−
オキサ−１，３−ジアゾール；スチルベン、例え
ば４−ジメチルアミノ−4′−イソチオシアナトス
チルベンと４−ジメチルアミノ−4′−マレインイ
ミドスチルベン；Ｎ，N′−ジオクタデシルオキ
サカルボシアニンｐ−トルエンスルホネート；ピ
レン、例えば８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレ
ントリスルホン酸と１−ピレン酪酸；メロシアニ
ン、例えばメロシアニン540、ローズベンガル、
２，４−ジフエニル−３（2H）−フラノン；シア
ニン；アンチアキノン；ポルフイリン；トリアリ
ールメタン；及び、消化できる他の容易に入手で
きる染料である。これら染料は活性結合機能を有
するか、かかる機能を容易に導入できる。 染料の吸収、発光特性は、溶解して遊離状態に
ある状態から蛋白即ちリガンドに結合するとかわ
ることがあることも銘記されたい。それゆえ、染
料の様々な波長域と特性に言及する時は、用いら
れている染料をさし、結合しておらず任意溶媒中
で特性化される染料はさしていない。化学発光体
と消光剤との重複領域では、消光剤が高遷移確率
を持つことが望ましい。 最後に、特定の細菌ルシフエラーゼ、例えばホ
トバクテリウムフイシエリ（Photobacterium
fisheri）生産ルシフエラーゼと通常関連のある
“青螢光蛋白”及び／又は“緑螢光蛋白”も消光
剤として使用できる。 化学発光体 化学発光源は単一成分でも複数成分でもよく、
普通は２又は３の成分を有する。熱不安定性であ
り、分解して化学発光する特定ジオキセダンの様
な単一分子を存在させることも可能だが、多数の
理由によりこれら分子の使用は実用的でない。分
解速度を許容できる程に低くするために充分に低
温で試薬を製造、維持し、ついで試薬を使用直前
に加温することもできる。この技術は放射免疫分
析法と若干類似しているが一般的には不便であ
る。それゆえ、大部分の場合、化学発光源は少く
とも２成分とし、本明細書の記載の大部分はこの
場合を対象とする。 便宜上、化学発光源を２つのカテゴリー：酵素
触媒の仲介を含まないものと酵素触媒を含むもの
にわける。 酵素触媒を含まない化学発光源の場合には、受
容体がリガンドに結合するのを阻止したり、測定
中許容できない速度で受容体、リガンドを分解し
たりしない条件下で化学発光するもののみを採用
できる。非水性溶媒と、PH11より高い強塩基条件
に依存する普通の化学発光源は役立たないが、蛋
白が変性し、有意な解離が生ずる前に変調発光が
実質上完了する場合には、急速注入ないし流入技
術等の技術を採用できる。塩基注入後に測定可能
のせん光が観察される。 様々な化合物群が様々な条件下で化学発光する
ことが発見された。１つの化合物群は２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオンである。最も
ポピユラーな化合物はルミノールであり、これは
５−アミノ化合物である。この族の他構成員は５
−アミノ−６，７，８−トリメトキシ類似体とジ
メチルアミノ〔ca〕ベンズ類似体等である。こ
れら化合物はアルカリ水素過酸化物又は次亜塩素
酸カルシウムと塩基とで発光させることができ
る。第２の化合物群は２，４，５−トリフエニル
イミダゾールであり、ロフインが親生成物の一般
名である。化学発光性の類似体はｐ−ジメチルア
ミノ、−メトキシ置換体等である。 次の化学発光性化合物群はインドレン−３−イ
ルヒドロペルオキシド、その前駆体及び誘導体で
ある。 次の化合物群はビス−９，9′−ビアクリジニウ
ム塩であり、その例はルシゲニン（lucigenin）、
Ｎ，N′−ジメチル−９，9′−ピアクリジニウムジ
ナイトレートである。これら化合物はアルカリ水
素ペルオキシドとの結合で化学発光する。 次の化合物群は９位が置換されているアクリジ
ニウム塩である。個々の置換基はカルボン酸エス
テル、特にアリールエステル、アシル置換基、特
にベンゾイル、シアノである。アルカリ水素ペル
オキシドを用いて化学発光を誘発する。 次の化合物群は様々なアシルペルオキシエステ
ルとヒドロペルオキシドであり、９，10−ジフエ
ニルアントラセンの様な化合物との結合でその場
で形成できる。 別の化学発光源はヒドロペルオキシド、例え
ば、金属錯体、特にポルフイリンとフタロシアニ
ン（金属は鉄、悪鉛）、と結合したテトラリンヒ
ドロペルオキシドである。 好ましい系は、11ないしそれ未満、好ましくは
10ないしそれ未満のPHの化学発光源からの発光量
効率を満足なものとするものであり、免疫学的１
対の１員に結合できる触媒に依存する。系に触媒
が含まれない場合には、発光と共に分解する化合
物は免疫学的１対の１員に結合する。これら条件
で、化学発光性分子の数は結合されるものに限定
される。 次の化合物群は酵素触媒下で化学発光する化学
発光体である。主として２つの酵素被触媒化学発
光群がある。第１群はアルカリ水素ペルオキシド
との結合で化学発光する化合物である。過酸化水
素及び化学発光体と組み合せてペルオキシダー
ゼ、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ即ちカタ
ラーゼ、を用いることにより化学発光を達成でき
る。例は２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオン類である。 第２の化学発光触媒源はルシフエリン類とその
類似体及びルシフエラーゼ類に基づく。 被標識化リガンド リガンドは２つのカテゴリーに分類にできる。
その１つはハプテンであり、分子量は一般に125
〜5000、更に普通には約125〜2000、特に約125〜
1000である。他は抗原であり、分子量は一般に約
2000以上、普通には約5000以上であり、細胞、ウ
イルス、染色体等の一部として存在する時には
10000000を越えることがある。大部分の場合、診
断対象抗原の分子量は一般に約1000000未満、更
に普通には約600000未満、特に約10000〜350000
である。 標識は消光剤（分子量は一般に約125〜1000）
か化学発光源の一成分（分子量が約125〜1000の
小分子か、分子量が約10000〜250000、更に普通
には約10000〜150000の酸素又はヘミンの様な大
分子である）のいずれかである。 リガンドと標識の性質に依存して被標識化リガ
ンドの特性は大いにわかる。考えられる第一の被
標識化リガンドは消光剤−ハプテン試薬である。
両分子は小さいので通常１：１の比であり、２つ
の消光剤−ハプテン部分間には比較的短い結合基
がある。 抗原が含まれる場合には、１個ないしそれ以上
の消光剤が抗原に結合することがある。一般に、
分子量100000当たり少くとも約１個の消光剤分子
が、更に普通には分子量50000当たり少くとも約
１個の消光剤分子が、一般には分子量1000当たり
約１個以下の消光剤分子が、更に普通には分子量
2000当たり約１個以下の消光剤分子が存在する。
分子量が約10000〜300000の抗原の場合には消光
剤分子の数は一般に約２〜30、更に普通には約２
〜20、好ましくは約２〜16である。 結合している化学発光源の成分が小分子（即ち
約125〜1000の分子量を持つもの）である場合に
は、化学発光体−ハプテン試薬中の化学発光体成
分とハプテンの比は通常１：１である。抗原の場
合小さな化学発光成分の数は分子量100000当たり
一般に１以上、普通には１以上、更に普通には分
子量50000当たり１以上、一般に分子量1000当た
り１以下、更に普通には分子量2000当たり１以下
である。 抗原と大（10000を越す）化学発光源成分が含
まれる場合には比は大いに変動し、複数の化学発
光源成分が抗原性リガンドに結合するか、複数の
リガンドが化学発光源成分に結合する。一般に、
抗原対化学発光源成分の比は約0.05〜20、更に普
通には約0.01〜10の範囲内にあり、この場合に化
学発光源と抗原は共に約10000〜300000の分子量
を持つ。 結合基の性質は、結合すべき個々の物質に依存
して大いにわかる。一般に、結合基は結合鎖か、
約20個の原子（Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、特にＣ、Ｏ、Ｎ
であり、ここでＮはＣによつてのみ置換されてい
るか中性であり、この場合にはＣとＨで置換され
ていてもよく、例えばアミドとなる）からなる鎖
である。様々な結合基がアメリカ特許3817837号
公報に記載されている。 ポリ（リガンド類似体）−標識が含まれる場合
にはハブ核を用いることができ、これは通常は水
溶性ポリマーであり、便宜上はポリ（アミノ酸）
又は多糖類である。 普通、ハブ核の分子量は約25000〜600000、更
に普通には約30000〜300000である。リガンド類
似物を結合できる酵素の分子量は一般に約15000
〜300000である。前記と同一の結合基を、標識と
リガンド類似物をハブ核又は酵素に結合するため
に用いることができる。 結合に関与する官能体は通常、アルキルアミ
ン、アミド、アミジン、チオアミド、尿素、チオ
尿素、グアニジンである。その例はジイミドと結
合したカルボン酸、炭酸モノエステルとの混成無
水物、還元体例えば水素化ホウ素物と結合したア
ルデヒド、イミドエステル、活性カルボン酸エス
テル例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド又はｐ
−ニトロフエニル、イソシアネート、ノソチオシ
アネート、活性ハライド等である。 被標識化受容体 受容体は消光剤が化学発光源成分で標識でき
る。標識が分子量が約125〜1000の小分子である
場合には普通、受容体当たり少くとも１個の標識
が、受容体の分子量1500当たり約１未満の、更に
普通には、受容体分子量2500当たり約１以下の標
識が、好ましくは、受容体分子量5000当たり約１
以下の標識が存在する。受容体が抗体である場合
には、標識の数は一般に約２〜20、更に普通には
約２〜12である。標識がマクロ分子（即ち分子量
が約10000〜300000）である場合には一般に約１
〜10個の、更に普通には約１〜６個の標識が存在
する。 受容体への結合方法は前述した。 キツト 本発明の分析方法の実施においては、再生可能
の結果を得るためには、必須試薬を予め定められ
た比で提供して分析感度を最適化することが望ま
しい。リガンドの分析においては必須試薬は被標
識化リガンドであり、ポリ（リガンド類似体）−
標識と被標識化受容体等が該当する。受容体の分
析においてはリガンドを必須試薬としてもよい。
必須試薬を予め定められた割合にすることに加え
て、緩衝剤、安定剤等の補助材料を必須試薬と共
に含めて乾燥粉末又は濃縮物を希釈して直接に被
分析液を形成し、従つて様々な材料を量る必要を
避けることができることにするのが多くの場合に
望ましい。 キツトには、分析感度を対象濃度域に対して実
質上最適化する相対割合で試薬を提供する。更
に、緩衝剤、不活性蛋白、例えばアルブミン、安
定剤、例えばナトリウムアジド等も試薬の１つ又
は両者と共に含めることができる。望ましくは、
試薬は乾燥粉末として、特に被標識化ポリエピト
ープ性リガンド及び受容体と共に提供され、この
場合にこれら材料は凍乾乾燥されていてもよい。 以下の実施例は本発明を例示するために提供す
るものであり、限定するためのものではない。 温度は特記ない限り全て℃単位である。％、部
は、容量によるリガンド混合物以外は、特記ない
限り重量による。 実施例 １ 西洋わさびペルオキシダーゼの人α−グロブリ
ン（hIgG）への結合 用いた方法はナカネ、カワイ著“J.Hist.Cyto.”
22(12)、1084−1091（1974）に記載されている。 １mlの0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液（PH8.1）
中に６mgの西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）
と100μの２，４−ジニトロ−１−フルオロベ
ンゼンの１％水溶液を導入し、１時間インキユベ
ートした。ついで0.01M炭酸ナトリウム（PH9.5）
で２時間、ついで0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.1）で透析した。 上記調整した約1.5mlのHRP物質溶液を１mlの
0.4M適ヨウ素酸ナトリウムに加え、室温で45分
間放置した。ついで25μの0.32Mエチレングリ
コール水溶液を加え、１時間放置し、ついでコロ
ジオンバツク装置内で0.01M炭酸ナトリウム（PH
9.5）で透析した。透析バツク中の残渣を５mgの
hIgGとあわせ、１時間放置した。ついで15mgの
水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で1.25時間
放置し、ついでコロジオンバツグ装置中でPBS
（PH７）により一液透析した。透析バツグ中の残
渣をセフアデツクスＧ−200で0.01M PBS（PH７）
を用いてクロマトグラフイーした。フラクシヨン
を集めた。フラクシヨン７が2.5×10-7MのhIgG
と4.95×10-7MのHRPを含むことが分光光度計に
より発見された。 実施例 ２ フルオレセインの抗（hIgG）への結合 撹拌棒の備わつたバイアル中に５mgの凍乾ウサ
ギ抗（hIgG）（マイルズラボラトリーズ社、ロツ
ト18、コード64−155）を導入し、0.5mlのリン酸
ナトリウム水溶液（PH8.0）に溶解し、水性炭酸
ナトリウム緩衝液でPHを９に調整した。フルオレ
セイン（0.3mg）のDMF（0.3ml）溶液を激しく撹
拌しながら約40秒かけて加え、ついで60分撹拌し
た。ついでセフアデツクス（Ｇ−25）カラムでク
ロマトグラフイーし、フラクシヨンを集めた。
2.4mg／mlの抗（hIgG）を含み、フルオレイン／
抗（hIgG）比が約５：１であるフラクシヨンを
得た。 本発明を実証するために次の分析を室温で実施
した。用いた溶液は1.86mg／mlのHIgG水溶液、
0.023mg／mlのフルオレセイン−抗（hIgG）結合
体（上記で製造）溶液、2.5×10-3MのHRP−
hIgG結合体溶液だつた。更に、各々100μの
10-3Mルミノール水溶液と10-5M過酸化水素水溶
液をも加えた。以表に材料の添加量と、混合中の
様々な時点で計数／0.1分として読みとられた結
果を示す。
【表】 用いた装置はβ−メートシンチレーシヨンカウ
ンタの非暗号型（non−coincidence mode）だ
つた。 上記結果から、分析媒体中の被分析物の量を定
めるための標準曲線を作ることができることは明
白である。試薬を急速に組み合せ、読みを非常に
短時間内に取ることができるという点において本
発明の方法は極めて簡単である。更に、約0.5時
間後に読みは安定するので、読み取る時間の重要
性は低くなる。 本発明の分析方法は、様々な被分析物を量的に
定めるのに便利な手段である。更に、酵素系か非
酵素系の触媒系（媒体中に存在する被分析物の各
分子に対して複数の結果を与える）を用いること
により、本方法では信号の増幅が可能である。更
に、本方法では、散光、蛋白吸収という問題、結
果を妨害する発光はない。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 分析液のサンプル中の被分析物の存在量の測
    定方法において； 該被分析物がリガンドと抗リガンドからなる免
    疫学的１対の１構成員であり； 該リガンドが少なくとも１個のエピトープ性部
    位を有し； 該抗リガンドが該リガンドの該エピトープ性部
    位に特異的に結合でき； 発光性相反１対を標識として用い； 該発光性相反１対が、少なくとも１つの成分を
    有する化学発光源と、該化学発光源により発せら
    れる光を衝突なく消光できる消光剤とからなり； 該標識が該免疫学的１対の構成員に結合して化
    学発光標識結合体と消光剤標識結合体とを形成し
    ており； 該分析液中において、該化学発光源の消光距離
    内に導かれた消光剤の量が核分析液中の被分析物
    の量に関連づけられる； 方法であり、 Ａ 水性媒体中で(i)該サンプル；(ii)該化学発光標
    識結合体；(iii)該消光剤標識結合体；(iv)該化学発
    光源の追加成分；(v)場合により追加の免疫学的
    対の構成員；をあわせて分析液を形成し、 Ｂ 少なくとも１つの波長で該分析液から発せら
    れる光の量を、既知量の被分析物を含む分析液
    から発せられる光の量と比較して測定する； ことからなる方法。 ２ 分析液が約５〜11の範囲内のPH、約10〜50℃
    の範囲内の温度にある、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ３ 該被分析物が約125〜2000の分子量を持つハ
    プテン性リガンドである、特許請求の範囲第２項
    記載の方法。 ４ 該被分析物が少なくとも約2000の分子量を持
    つ抗原である、特許請求の範囲第２項記載の方
    法。 ５ 該被分析物が抗リガンドである、特許請求の
    範囲第２項記載の方法。 ６ 分析液のサンプル中の被分析物の存在量の測
    定方法において、 該被分析物が、分子量約125〜2000のモノエピ
    トープ性リガンドと、抗リガンドからなる免疫学
    的１対の１構成員であり、 該抗リガンドは該リガンドの該エピトープ性部
    位に結合でき； 発光性相反１対を標識として用い； 該発光性相反１対は、少なくとも１つの成分を
    有する化学発光源と、該化学発光源により発せら
    れる光を衝突なく消光できる消光剤である染料と
    からなり； 該標識は該免疫学的１対の構成員に結合して化
    学発光性結合体と消光剤・標識結合体を形成して
    おり； 該標識の少なくとも１つは抗リガンドに結合し
    ており； 該化学発光源の消光距離内に導かれた消光剤の
    量が該分析液中の被分析物の量と関連している；
    方法であり、 Ａ ５〜11の範囲内のPH、10〜50℃の範囲内の温
    度にある水性媒体中で(i)該サンプル；(ii)該化学
    発光性標識結合体；(iii)該消光性標識結合体；(iv)
    該化学発光源の追加成分；(v)場合により追加の
    免疫学的対の構成員；をあわせて分析液を形成
    し、 Ｂ 該分析液から発せられる光の量を既知量の被
    分析物を含む分析液から発せられる光の量との
    比較により少なくとも１つの波長で測定する； ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 該分析物が抗リガンドである、特許請求の範
    囲第６項記載の方法。 ８ 該分析物がモノエピトープ性リガンドであ
    る、特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９ 該化学発光源が少なくとも２つの成分を有
    し、該標識のうちの１つがリガンドに結合し該標
    識のうちの他が抗リガンドに結合する、特許請求
    の範囲第８項記載の方法。 １０ 該リガンドがアルカロイドである、特許請
    求の範囲第９項記載の方法。 １１ 該リガンドがステロイドである、特許請求
    の範囲第９項記載の方法。 １２ 該リガンドが５〜６員環ラクタムである、
    特許請求の範囲第９項記載の方法。 １３ 該リガンドがアミノアルキルベンゼンであ
    り、該アルキルがC2〜3である、特許請求の範囲第
    ９項記載の方法。 １４ 該リガンドがベンゾ複素環化合物である、
    特許請求の範囲第９項記載の方法。 １５ 該リガンドがプリンである、特許請求の範
    囲第９項記載の方法。 １６ 該リガンドがアミノ酸である、特許請求の
    範囲第９項記載の方法。 １７ 該アミノ酸がポリヨードチロニンである、
    特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８ 該化学発光源の該成分の１つが酵素であ
    り、該化学発光標識結合体が該酵素に結合したリ
    ガンドである、特許請求の範囲第９項記載の方
    法。 １９ 該酵素がペルオキシダーゼであり、該化学
    発光源のもう１つの成分がルミノールである、特
    許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０ 分析液のサンプル中の被分析物の存在量の
    測定方法において、該分析物が、少なくとも約
    2000の分子量を持つポリエピトープ性リガンド
    と、抗リガンドとからなる免疫学的１対の１構成
    員であり；該抗リガンドが該リガンドのエピトー
    プ性部位に結合でき；発光性相反１対を標識とし
    て用い；該発光性相反１対が、少なくとも１つの
    成分を有する化学発光源と、該化学発光源により
    発せられる光を消光できる消光剤染料とからな
    り；該標識が該免疫学的１対の構成員に結合して
    化学発光標識結合体と消光剤標識結合体とを形成
    しており；該標識の少なくとも１つは抗リガンド
    に結合しており；該分析液中において該化学発光
    源の消光距離内に導かれた消光剤の量が該分析液
    中の被分析物の量に関連する；方法であり、 Ａ 約５〜11の範囲内のPH、約10〜50℃の範囲内
    の温度の水性媒体中で (i) 該サンプル； (ii) 該化学発光標識結合体； (iii) 該消光剤標識結合体； (iv) 該化学発光源の追加成分； をあわせ、但し、該被分析物が抗リガンドであ
    り、かつ該標識が抗リガンドに結合している時
    にはリガンドを該被分析液に含め； Ｂ 少なくとも１つの波長で、該被分析液から発
    せられる光の量を、既知量の被分析物を含む分
    析液から発せられる光の量との比較により測定
    する； ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２１ 該被分析物が抗リガンドである、特許請求
    の範囲第２０項記載の方法。 ２２ 該被分析物がポリエピトープ性リガンドで
    ある、特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３ 該化学発光源が少なくとも２つの成分を有
    し、該標識のうちの１つがリガンドに結合してお
    り、該標識のうちの他が抗リガンドに結合してい
    る、特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４ 該リガンドがポリペプチドである、特許請
    求の範囲第２３項記載の方法。 ２５ 該ポリペプチドがグロブリンである、特許
    請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６ 該グロブリンが免疫グロブリンである、特
    許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７ 該ポリペプチドがホルモンである、特許請
    求の範囲第２４項記載の方法。 ２８ 該免疫学的対の１構成員に結合した該化学
    発光源の該成分が酵素である、特許請求の範囲第
    ２３項記載の方法。 ２９ 該酵素がペルオキシダーゼであり、ルミノ
    ールが該化学発光源のもう１つの成分である、特
    許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０ 分析液のサンプル中の人グロブリンの存在
    量の測定方法において、試薬として抗（人グロブ
    リン）を用い、標識として発光性反１対を用い；
    該発光性相反１対はペルオキシダーゼとルミノー
    ルからなる化学発光源と、該化学発光源により発
    せられる光を消光できる消光剤染料とからなり；
    該ペルオキシダーゼは人グロブリンに結合して人
    グロブリン−ペルオキシダーゼ結合体を形成し、
    該消光剤染料は抗（人グロブリン）に結合して消
    光剤標識抗（人グロブリン）を形成し；該分析液
    中において、該化学発光源の消光距離内に導かれ
    た消光剤の量が人グロブリン量に関連する；方法
    であり、 Ａ 約７〜10の範囲内のPH、約10〜50℃の範囲内
    の温度の水性媒体中で (i) 該サンプル； (ii) 該ペルオキシダーゼ−人グロブリン結合
    体； (iii) 該消光剤−抗（人グロブリン）結合体； (iv) 該化学発光源の追加成分； をあわせて分析液を形成し； Ｂ 少なくとも１つの波長で、該分析液から発せ
    られる光の量を、既知量の人グロブリンを含む
    分析液から発せられる光の量との比較により測
    定する、 ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３１ 該消光剤染料がフルオレセインである、特
    許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２ 分析液のサンプル中の被分析物の存在量の
    測定方法において、 該被分析物が、分子量約125〜2000のモノエピ
    トープ性リガンドと、抗リガンドからなる免疫学
    的１対の１構成員であり、 該抗リガンドが、該リガンドの該エピトープ性
    部位に結合でき； 少なくとも２つの成分を有する化学発光源の１
    成分である標識を用い； 該標識は該リガンドに結合して化学発光標識結
    合体を形成している； 方法であり、 Ａ ５〜11の範囲内のPH、10〜50℃の範囲内の温
    度にある水性媒体中で(1)該サンプル；(2)該化学
    発光結合体；(3)該化学発光源の追加成分；をあ
    わせて被分析液を形成し、但し、該被分析物が
    リガンドである時には抗リガンドを加え； Ｂ 少なくとも１つの波長で該被分析液からの発
    光量を、既知量の被分析物を含む被分析液から
    の発光量と比較して測定する； ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３３ 分析液のサンプル中の被分析物の存在量の
    測定方法であり、 該被分析物がリガンドと抗リガンドからなる免
    疫学的１対の１構成員であり； 該リガンドが少なくとも１個のエピトープ性部
    位を有し； 該抗リガンドが該リガンドの該エピトープ性部
    位に特異的に結合でき； 発光性相反１対を標識として用い； 該発光性相反１対が、少なくとも１つの成分を
    有する化学発光源と、該化学発光源により発せら
    れる光を衝突なく消光できる消光剤とからなり； 該標識が該免疫学的１対の構成員に結合して化
    学発光標識結合体と消光剤標識結合体とを形成し
    ており； 該化学発光源の消光距離内に導かれた消光剤の
    量が該分析液中の被分析物の量と関連している；
    方法であり、 Ａ 水性媒体中で(i)該サンプル；(ii)該化学発光標
    織結合体；(iii)該消光剤標識結合体；(iv)該化学発
    光源の追加成分；(v)場合により、追加の免疫学
    的対の構成員；をあわせて分析液を形成し、 Ｂ 少なくとも１つの波長で、該分析液から発せ
    られる光の量を、既知量の被分析物を含む分析
    液から発せられる光の量と比較して測定する； ことからなる方法で使用される診断キツトにおい
    て、 その方法を実質上最適化する相対量の該化学発
    光体標識結合体と該消光剤標識結合体からなるキ
    ツト。 ３４ 該化学発光源成分が酵素である、特許請求
    の範囲第３２項記載のキツト。 ３５ 該酵素が該リガンドに結合している、特許
    請求の範囲第３３項記載のキツト。 ３６ 該化学発光源成分と該消光剤染料が共に抗
    リガンドに結合している、特許請求の範囲第３２
    項記載のキツト。
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