ES2250259T3 - Metodo para detectar sustancias biologicamente activas. - Google Patents

Abstract

Un método para caracterizar la actividad biológica de una muestra, comprendiendo el método: (a) la expresión de una secuencia de ADN en una célula, en la que la secuencia de ADN codifica una proteína o un polipéptido seleccionado del grupo que consta de: (i) una proteína fluorescente verde que tiene un sitio de reconocimiento de proteína quinasa, o (ii) una proteína fluorescente verde en la que uno o más aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados para proporcionar un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconoci miento de un enzima, o (iii) un polipéptido híbrido de proteína fluores cente verde (GFP) o de una GFP modificada y un do minio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima; y (b) la medida de la fluorescencia de dicha GFP en dicha célula en ausencia y presencia de una muestra de ensayo; y (c) la comparación de la fluorescencia de GFP medida en la etapa (b); en el que una diferencia entre la fluorescencia medida en ausencia y presencia de dicha muestra es indicativa de la actividad biológica de dicha muestra de ensayo.

Description

Método para detectar sustancias biológicamente activas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar sustancias biológicamente activas que afectan a procesos intracelulares, y a una construcción de ADN y a una célula para ser utilizadas en el método.

Antecedentes de la invención

Los segundos mensajeros y las proteína quinasas desempeñan papeles fundamentales en las rutas de señalización que controlan la respuesta de las células de mamífero (y probablemente de todas las células eucarióticas) a la mayoría de los estímulos. Aunque tales rutas de señalización han sido sometidas a extensos estudios, un conocimiento detallado sobre, por ejemplo, las características temporales y espaciales exactas de los acontecimientos de señalización es a menudo difícil de obtener debido a la falta de una tecnología adecuada. Hay, sin embargo, una excepción a esta regla: nuestro conocimiento de la función de Ca^{2+} en, por ejemplo, la señalización intracelular ha sido mejorado enormemente debido al desarrollo de la sonda de Ca^{2+} fluorescente FURA-2 que permite estudios en tiempo real del Ca^{2+} en células vivas individuales.

Además, se ha intentando la construcción de sondas para AMPc (Adams y col., Nature 349, 1991, pp. 694-697) y para la actividad de la proteína quinasa dependiente de AMPc (Sala-Newby y Campbell, FEBS 307(2), 1992, pp. 241-244). La sonda para proteína quinasa A tiene, sin embargo, el inconveniente de que está basada en la luciferasa de la luciérnaga y produce por consiguiente muy poca luz para medidas de alta sensibilidad de células individuales. La sonda de AMPc, por otra parte, tiene que ser microinyectada y no es por tanto muy adecuada para el trabajo rutinario en el laboratorio. En conclusión, ambas sondas carecen de algunas de las elegantes propiedades que han tenido como resultado la utilización muy extendida de FURA-2.

Recientemente, se descubrió que la Proteína Fluorescente Verde (GFP) expresada en muchos tipos celulares diferentes, incluyendo células de mamífero, era altamente fluorescente (Chalfie y col., Science 263, 1994, pp. 802-805). WO/07463 describe una célula capaz de expresar GFP y un método para seleccionar células que expresen una proteína de interés y GFP basado en la detección de la fluorescencia de GFP en las células.

Resumen de la invención

La finalidad de la presente invención es proporcionar un método para detectar una sustancia biológicamente activa que afecte a procesos intracelulares basado en la utilización de la Proteína Fluorescente Verde, incluyendo la GFP de tipo salvaje derivada de la medusa Aequorea victoria y modificaciones de la GFP, tales como modificaciones que cambian las propiedades del espectro de fluorescencia de GFP, para la construcción de sondas, preferiblemente sondas de tiempo real para determinar segundos mensajeros y la actividad proteína quinasa.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar la actividad biológica de una muestra, comprendiendo el método:

(a)

la expresión de una secuencia de ADN en una célula, en la que la secuencia de ADN codifica una proteína o un polipéptido seleccionado del grupo que consta de

(i)

una proteína fluorescente verde que tiene un sitio de reconocimiento de proteína quinasa, o

(ii)

una proteína fluorescente verde en la que uno o más aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados para proporcionar un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima, o

(iii)

un polipéptido híbrido de proteína fluorescente verde (GFP) o de una GFP modificada y un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima; y

(b)

la medida de la fluorescencia de dicha GFP en dicha célula en ausencia y presencia de una muestra de ensayo; y

(c)

la comparación de la fluorescencia de GFP medida en la etapa (b);

en el que una diferencia entre la fluorescencia medida en ausencia y presencia de dicha muestra es indicativa de la actividad biológica de dicha muestra de ensayo.

Además, estudios sobre la especificidad de sustrato de las diferentes isoformas de la proteína quinasa A (PKA) utilizando péptidos sintéticos han demostrado que péptidos que contienen los motivos RRXSX o RXKRXXSX (siendo S el aminoácido fosforilado) tienden a ser los mejores sustratos para PKA, y una revisión de Zetterquist, Ö. y col. (en Kemp, B.E. (ed.) Peptide and Protein Phosphorylation (1990), 172-188, CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU.) confirma que la mayoría de los sustratos conocidos de PKA contienen dichos motivos.

Las secuencias de aminoácidos disponibles de GFP no sugieren que la GFP sea un sustrato de PKA, debido a la falta de sitios de reconocimiento que contengan los motivos RRXSX o RXKRXXSX. Es por tanto sorprendente que una proteína fluorescente verde (GFP) nativa o de tipo salvaje derivada de la medusa Aequorea victoria pueda ser fosforilada por la proteína quinasa A y cambien por ello las propiedades del espectro de GFP, teniendo como resultado un incremento sustancial de la fluorescencia.

En el presente contexto, el término "proteína fluorescente verde" tiene la intención de indicar una proteína que, cuando es expresada por una célula, emite fluorescencia (cf. Chalfie y col., Science 263, 1994, pp. 802-805). En lo que sigue a continuación, la GFP en la que uno o más aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados es denominada muy a menudo "GFP modificada".

El término "segundo mensajero" es utilizado para indicar un componente de bajo peso molecular implicado en los acontecimientos tempranos de las rutas de transmisión de señales intracelulares.

El término "dominio de unión de un segundo mensajero" es utilizado para indicar un segmento de una proteína que, en el curso de procesos metabólicos intracelulares, se une al segundo mensajero.

El término "sitio de reconocimiento de un enzima" tiene la intención de indicar una secuencia peptídica modificada covalentemente por un enzima (por ejemplo, fosforilada, glicosilada o cortada); preferiblemente el sitio de reconocimiento de un enzima es un sitio de reconocimiento de una proteína quinasa, lo cual quiere indicar una secuencia peptídica modificada covalentemente por una quinasa, esto es, fosforilada.

Debe hacerse énfasis en que la fosforilación de una proteína en un sitio de reconocimiento de proteína quinasa está a menudo seguida (o acompañada) por la desfosforilación de dicha proteína. Una sonda basada en GFP para medir la actividad de proteína quinasa(s) dada(s) proporcionaría también, por tanto, información sobre la actividad de fosfatasas de proteína relevantes, ya que el parámetro monitorizado es la fosforilación neta de la sonda basada en GFP.

El término "polipéptido híbrido" tiene la intención de indicar un polipéptido que es una fusión de al menos una porción de cada una de dos proteínas, en este caso de al menos una porción de la proteína fluorescente verde y al menos una porción de un dominio de unión de un segundo mensajero o de un sitio de reconocimiento de un enzima.

En el presente contexto, el término "sustancia biológicamente activa" tiene la intención de indicar una sustancia que tiene una función biológica o que ejerce un efecto biológico en el organismo humano o animal. La muestra puede ser una muestra de un material biológico tal como un extracto microbiano, o puede ser una muestra que contenga un compuesto o una mezcla de compuestos preparados mediante síntesis orgánica.

La frase "cualquier cambio de la fluorescencia" indica cualquier cambio de las propiedades de absorción, tales como la longitud de onda y la intensidad, o cualquier cambio de las propiedades del espectro de la luz emitida, tal como un cambio de la longitud de onda, de la duración, la intensidad o la polarización de la fluorescencia.

El(los) mecanismo(s) responsables de un cambio de, por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de una GFP modificada después de la fosforilación, podrían ser varios. Como una posibilidad, la fosforilación de dicha variante de GFP podría cambiar el entorno del cromóforo, debido a la proximidad del grupo fosfato añadido o debido a cambios conformacionales inducidos por la fosforilación. En la misma medida, la unión de por ejemplo un segundo mensajero al dominio de unión de alguna variante de GFP o de alguna proteína de fusión de GFP, podría inducir cambios conformacionales que finalmente cambiaran el entorno del cromóforo y de este modo la fluorescencia. Como apoyo de estas sugerencias, se ha demostrado que sustituciones de aminoácidos distantes del cromóforo (por ejemplo los aminoácidos 167, 202, 203 y 222) pueden cambiar la intensidad de fluorescencia y las características espectrales de GFP (Ehrig y col., FEBS Letters 367, 1995, p. 163; Heim y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 1994, p. 12501).

El desarrollo de sondas luminiscentes de acuerdo con la presente invención permite estudios en tiempo real de segundos mensajeros y de enzimas específicos tales como proteína quinasas en células vivas individuales, haciendo por ello posible estudiar las características temporales y espaciales precisas de estos factores. Además, hace posible la realización de estudios sobre heterogeneidad en poblaciones celulares.

Debido a la potente fluorescencia de GFP, la luminiscencia de las células que expresan las sondas puede ser fácilmente detectada y analiza mediante el empleo de una combinación de microscopía de fluorescencia y análisis de imagen. Además, debe enfatizarse que las sondas descritas son fáciles de introducir en las células, ya que pueden ser expresadas en las células de interés después de la transfección con un vector de expresión adecuado.

Las sondas recombinantes de tiempo real para determinar segundos mensajeros y actividad enzimática, tal como la actividad quinasa, no son sólo útiles en investigación básica sino también en programas de selección encaminados a la identificación de nuevas sustancias biológicamente activas. Muchos programas de selección actualmente utilizados diseñados para encontrar compuestos que afecten a la concentración de AMPc y a la actividad proteína quinasa, están basados en la unión a receptores y/o en la expresión de genes informadores. Las sondas recombinantes descritas en la presente hacen posible, por otra parte, el desarrollo de un tipo totalmente nuevo de ensayos de selección capaces de monitorizar cambios inmediatos y transitorios de la concentración de AMPc y de la actividad proteína quinasa en células vivas intactas.

Cualquier característica nueva o cualquier combinación de características nuevas descrita en la presente se considera esencial para esta invención.

Descripción detallada de la invención

En una realización preferida de la presente invención, el gen que codifica GFP deriva de la medusa Aequorea victoria. La secuencia de este gen está descrita en Prasher y col., Gene 111, 1992, pp. 229-233 (Nº de Acceso del GenBank M62653). El gen puede ser modificado para que codifique una GFP variante en la que uno o más residuos de aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados, para proporcionar un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima. De acuerdo con esta realización, se prefiere insertar una secuencia de ADN que codifique un sitio de reconocimiento de un enzima en el gen que codifica GFP, por ejemplo en una de las posiciones siguientes: entre los aminoácidos 39 y 40, entre los aminoácidos 71 y 72, entre los aminoácidos 79 y 80, entre los aminoácidos 107 y 108, entre los aminoácidos 129 y 130, entre los aminoácidos 164 y 165 o entre los aminoácidos 214 y 215. Los puntos de inserción pueden ser seleccionados sobre la base de la probabilidad superficial (que puede ser calculada utilizando el paquete de programas de ordenador GCG que emplea una fórmula de Emini y col., J. Virol. 55(3), 1985, pp. 836-839). Cuando el enzima es proteína quinasa C, el sitio de reconocimiento insertado contendría preferiblemente el motivo XRXXSXRX, siendo S el aminoácido fosforilado. En las construcciones con éxito de este tipo, la fosforilación de la GFP modificada puede tener como resultado propiedades ópticas de GFP alteradas de manera detectable. Debe señalarse que una deleción extensa puede tener como resultado la pérdida de las propiedades fluorescentes de GFP. Se ha demostrado que puede sacrificarse solamente un residuo del extremo amino y menos de 10 ó 15 del extremo carboxilo antes de que se pierda la fluorescencia, cf. Cubitt y col., TIBS, Vol. 20(11), pp. 448-456, Noviembre de 1995. Por tanto, de acuerdo con esta invención, la modificación del gen de la GFP para que codifique una variante de la GFP en la que se han sustituido, insertado o eliminado uno o más residuos de aminoácido, está limitada a las modificaciones que tengan como resultado una variante de GFP con propiedades de fluorescencia.

El dominio de unión de un segundo mensajero puede ser un receptor de un segundo mensajero. El segundo mensajero puede ser AMP cíclico, fosfato de inositol 3, GMP cíclico, ADP cíclico o diacilglicerol. El dominio de unión es preferiblemente el receptor de AMP cíclico (CRP, por ejemplo según está descrito en Weber y Steitz, J. Mol. Biol. 198, 1987, pp. 311-326; Schroeder y Dobrogosz, J. Bacteriol. 167, 1986, pp. 612-622) o una parte del mismo capaz de unirse a AMP cíclico.

El CRP nativo tiene dos dominios distintos: un dominio de unión a AMPc N-terminal así como una actividad de unión a ADN C-terminal (Weber y Steitz, J. Mol. Biol. 198, 1987, pp. 311-326). Después de la unión del AMPc a la porción N-terminal del CRP, se induce un cambio conformacional en el extremo C que permite la unión del CRP a los promotores de ciertos genes. En las fusiones con éxito del CRP (o de una porción del mismo) a GFP (o a una porción de la misma), los cambios conformacionales del CRP inducidos por AMPc son transmitidos a la GFP, cambiando de este modo las propiedades ópticas de la GFP.

En una realización preferida de la presente invención, el gen o la secuencia de ADNc que codifica una GFP de tipo salvaje deriva de la medusa Aequorea victoria. Una secuencia preferida de este gen está descrita por la Fig. 4a de la presente. La Fig. 4a muestra la secuencia de nucleótidos de una GFP de tipo salvaje (fragmento HindIII-EcoRI) y la Fig. 4b muestra la secuencia de aminoácidos, en la que el codón de inicio ATG corresponde a la posición 8 y el codón de parada TAA corresponde a la posición 722 de la secuencia de nucleótidos de la Fig. 4a. Otra secuencia de un isotipo de este gen está descrita por Prasher y col., Gene 111, 1992, pp. 229-233 (Nº de Acceso del GenBank M62653). Cualquier gen que codifique una proteína fluorescente, tal como la GFP de tipo salvaje, que tenga un sitio de reconocimiento de proteína quinasa, y que derive de cualquier organismo que exprese una proteína fluorescente verde o una proteína fluorescente, fosforescente o luminiscente similar puede ser utilizado en esta invención.

El sitio de reconocimiento del enzima o el sitio de reconocimiento de la proteína quinasa es preferiblemente un sitio de reconocimiento de proteína quinasa Ser/Thr o Tyr, tal como el sitio de reconocimiento de la proteína quinasa C o de la proteína quinasa A (ambos están revisados en, por ejemplo, B.E. Kemp y R.B. Pearson, TIBS 15, Septiembre de 1990, pp. 342-346), o el receptor de insulina o la quinasa Src o una porción de los mismos que contenga un motivo requerido como sustrato para la proteína quinasa, según se sugirió anteriormente. La fosforilación catalizada por la quinasa puede tener como resultado propiedades ópticas de GFP alteradas de manera detectable.

La secuencia de ADN que codifica GFP, el dominio de unión de un segundo mensajero o el sitio de reconocimiento de un enzima pueden ser idóneamente de origen genómico o ADNc, por ejemplo pueden ser obtenidos mediante la preparación de una biblioteca adecuada de ADN genómico o de ADNc y la selección de secuencias de ADN que codifiquen toda o parte de cualquiera de estas proteínas mediante hibridación utilizando sondas oligonucleotídicas sintéticas de acuerdo con técnicas estándar (cf. Sambrook y col., supra).

La construcción de ADN de la invención que codifica la GFP de tipo salvaje, la GFP modificada o el polipéptido híbrido puede ser también preparada sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, por ejemplo el método de las fosforamiditas descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869, o el método descrito por Matthes y col., EMBO Journal 3, 1984, pp. 801-805. De acuerdo con el método de las fosforamiditas, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo en un sintetizador de ADN automático, se purifican, hibridan, ligan y clonan en vectores adecuados. Para la mayor parte de los fines, puede ser práctico preparar una secuencia de ADN más corta, tal como la secuencia de ADN que codifica el sitio de reconocimiento del enzima, sintéticamente, mientras que el ADN que codifica la GFP o el dominio de unión de un segundo mensajero será típicamente aislado mediante el cribado de una biblioteca de ADN.

Además, la construcción de ADN puede ser de origen mixto sintético y genómico, de origen mixto sintético y ADNc o de origen mixto genómico y ADNc, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), correspondiendo los fragmentos a varias partes de la construcción completa de ADN, de acuerdo con técnicas de estándar (cf. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, EE.UU.).

La construcción de ADN puede ser también preparada mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos, por ejemplo según está descrito en US 4.683.202 o en Saiki y col., Science 239, 1988, pp. 487-491. Puede encontrarse una revisión más reciente de los métodos de PCR en PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, EE.UU.

La secuencia de ADN que codifica GFP puede ser también modificada por otros medios tal como mediante mutagénesis química convencional o mediante inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia, ya sea como mutagénesis aleatoria o como mutagénesis dirigida a un sitio. Se espera que tales mutantes presenten propiedades ópticas alteradas o una estabilidad térmica alterada.

La construcción de ADN de la invención puede ser insertada en un vector recombinante que puede ser cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante. La elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que va a ser introducido. Así, el vector puede ser un vector que se replique de manera autónoma, esto es un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando sea introducido en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) cual(les) ha sido integrado.

El vector es preferiblemente un vector de expresión en el que la secuencia de ADN que codifica la GFP de tipo salvaje, la GFP modificada o el polipéptido híbrido esté unida operativamente a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión deriva de ADN plasmídico o vírico, o puede contener elementos de ambos. El término "unidos operativamente" indica que los segmentos están dispuestos de tal manera que funcionan en concierto para sus finalidades deseadas, por ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y continúa a través de la secuencia de ADN que codifica la GFP modificada o el polipéptido híbrido.

El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivar de genes que codifiquen proteínas homólogas o heterólogas para la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica la GFP de tipo salvaje, la GFP modificada o el polipéptido híbrido en células de mamífero son el promotor de SV40 (Subramani y col., Mol. Cell Biol. 1, 1981, pp. 854-864), el promotor de MT-1 (gen de la metalotioneína) (Palmiter y col., Science 222, 1983, 809-814) o el promotor principal tardío de adenovirus 2.

Un ejemplo de un promotor adecuado para ser utilizado en células de insecto es el promotor de la polihedrina (US 4.745.051; Vasuvedan y col., FEBS Lett. 311, 1992, pp. 7-11), el promotor de P10 (J.M. Vlak y col., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis de Autographa californica (EP 397 485), el promotor del gen 1 temprano inmediato de baculovirus (US 5.155.037; US 5.162.222), o el promotor del gen retrasado-temprano 39K de baculovirus (US 5,155.037; US 5.162.222).

Ejemplos de promotores adecuados para ser utilizados en células huésped de levadura incluyen promotores procedentes de genes glicolíticos de levadura (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255, 1980, pp. 12073-12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) o de genes de alcohol deshidrogenasas (Young y col., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender y col., eds.), Plenum Press, New York, 1982), o los promotores de TPI1 (US 4.599.311) o de ADH2-4c (Russell y col., Nature 304, 1983, pp. 652-654).

Ejemplos de promotores adecuados para ser utilizados en células huésped de hongos filamentosos son, por ejemplo, el promotor de ADH3 (McKnight y col., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) o el promotor de tpiA. Ejemplos de otros promotores útiles son los derivados del gen que codifica la TAKA-amilasa de A. oryzae, la aspártico proteinasa de Rhizomucor miehei, la \alpha-amilasa neutra de A. niger, la \alpha-amilasa ácida estable de A. niger, la glucoamilasa (gluA) de A. niger o A. awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. Se prefieren los promotores de TAKA-amilasa y de gluA.

Ejemplos de promotores adecuados para ser utilizados en células huésped bacterianas incluyen el promotor del gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, el promotor del gen de la \alpha-amilasa de Bacillus licheniformis, el promotor del gen de la BAN amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el promotor del gen de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis o el promotor del gen de la xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores P_{R} o P_{L} del fago lambda o los promotores lac, trp o tac de E. coli.

La secuencia de ADN que codifica la GFP de tipo salvaje, la GFP modificada o el polipéptido híbrido de la invención puede ser también, si es necesario, conectada operativamente a un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona de crecimiento humana (Palmiter y col., op. cit.) o (para huéspedes fúngicos) los terminadores de TPI1 (Alber y Kawasaki, op. cit.) o de ADH3 (McKnight y col., op. cit.). El vector puede contener además elementos tales como señales de poliadenilación (por ejemplo de SV40 o de la región Elb de adenovirus 5), secuencias intensificadoras de la transcripción (por ejemplo el intensificador de SV40) y secuencias intensificadoras de la traducción (por ejemplo las que codifican ARNs VA de adenovirus).

El vector recombinante puede contener además una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Un ejemplo de tal secuencia (cuando la célula huésped es una célula de mamífero) es el origen de replicación de SV40.

Cuando la célula huésped es una célula de levadura, secuencias adecuadas que permiten al vector replicarse son los genes de replicación REP 1-3 y el origen de replicación del plásmido de levadura 2 \mu.

El vector puede contener también un marcador seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complemente un defecto de la célula huésped, tal como el gen que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen de TPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130), o uno que confiera resistencia a un fármaco, por ejemplo a ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina o higromicina. Para los hongos filamentosos, los marcadores seleccionables incluyen amdS, pyrG, argB, niaD, sC.

Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican la GFP de tipo salvaje, la GFP modificada o el polipéptido híbrido, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal de secreción, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contengan la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook y col., op. cit.).

La célula huésped en la que se introduce la construcción de ADN o el vector recombinante de la invención puede ser cualquier célula que sea capaz de expresar la presente construcción de ADN e incluye células bacterianas, de levadura, fúngicas y células eucarióticas superiores, tales como células de mamífero.

Ejemplos de células huésped bacterianas que, tras el cultivo, son capaces de expresar la construcción de ADN de la invención son bacterias gram positivas tales como cepas de Bacillus, tales como cepas, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium o B. thuringiensis, o cepas de Streptomyces, tales como S. lividans o S. murinus, o bacterias gram negativas tales como Escherichia coli. La transformación de las bacterias puede ser efectuada mediante transformación de protoplastos o mediante la utilización de células competentes de una manera conocida per se (cf. Sambrook y col., supra).

Ejemplos de líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas celulares HEK293 y HeLa, células primarias, y las líneas celulares COS (por ejemplo, ATCC CRL 1650), BHK (por ejemplo, ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (por ejemplo, ATCC CCU9) o CHO (por ejemplo ATCC CCL 61). Métodos para transfectar células de mamífero y expresar secuencias de ADN introducidas en las células están descritos en, por ejemplo, Kauftnan y Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-621; Southern y Berg, J. Mol. AplRL Genet. 1, 1982, pp. 327-341; Loyter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. US 79, 1982, pp. 422-426; Wigler y col., Cell 14, 1978, p. 725; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 1981, p. 603; Graham y van der Eb, Virology 52, 1973, p. 456; y Neumann y col., EMBO J. 1, 1982, 841-845.

Ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces o especies de Schizosaccharomyces, en particular cepas de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. Métodos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y producir polipéptidos heterólogos a partir de las mismas están descritos en, por ejemplo, US 4.599.311, US 4.931.373, US 4.870.008, 5.037.743 y US 4.845.075. Las células transformadas son seleccionadas por un fenotipo determinado por un marcador seleccionable, normalmente la resistencia a un fármaco o la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente particular, por ejemplo leucina. Un vector preferido para ser utilizado en levaduras es el vector POT1 descrito en US 4.931.373. La secuencia de ADN que codifica la GFP modificada o el polipéptido híbrido puede estar precedida por una secuencia señal y opcionalmente por una secuencia líder, por ejemplo según se describió anteriormente. Ejemplos adicionales de células de levadura adecuadas son cepas de Kluyveromyces, tales como K. lactis, Hansenula, por ejemplo H. polymorpha, o Pichia, por ejemplo P. pastoris (cf. Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465; US 4.882.279).

Ejemplos de otras células fúngicas son células de hongos filamentosos, por ejemplo especies de Aspergillus, especies de Neurospora, especies de Fusarium o especies de Trichoderma, en particular cepas de A. oryzae, A. nidulans o A. niger. La utilización de especies de Aspergillus para la expresión de proteínas está descrita en, por ejemplo, EP 272 277, EP 230 023, EP 184 438. Cuando se utiliza un hongo filamentoso como célula huésped, puede ser transformado convenientemente con la construcción de ADN de la invención mediante la integración de la construcción de ADN en el cromosoma huésped para obtener una célula huésped recombinante. Se considera que esta integración es generalmente una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN sea mantenida de manera estable en la célula. La integración de las construcciones de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo mediante recombinación homóloga o heteróloga.

La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos heterólogos en las mismas puede ser realizada según está descrito en US 4.745.051; US 4.879.236; US 5.155.037; 5.162.222; EP 397.485. La línea de células de insecto utilizada como huésped puede ser idóneamente una línea celular de lepidópteros, tal como células de Spodoptera frugiperda o células de Trichoplusia ni (cf. US 5.077.214). Las condiciones de cultivo pueden ser idóneamente como las descritas en, por ejemplo, WO 89/01029 o WO 89/01028, o en cualquiera de las referencias anteriormente mencionadas.

La célula huésped transformada o transfectada descrita anteriormente es cultivada posteriormente en un medio nutricio adecuado bajo condiciones que permitan la expresión de la presente construcción de ADN, después de lo cual las células pueden ser utilizadas en el método de selección de la invención. Alternativamente, pueden romperse las células, después de lo cual pueden analizarse los extractos celulares y/o los sobrenadantes para determinar fluorescencia. El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células huésped, tal como medio mínimo o complejo conteniendo los suplementos apropiados. Los medios adecuados están disponibles en los proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la American Type Culture Collection).

En el método de la invención, la fluorescencia de las células transformadas o transfectadas con la construcción de ADN de la invención puede ser medida idóneamente en un espectrómetro, en el que pueden determinarse las propiedades espectrales de las células en cultivo líquido como barridos de excitación y emisión lumínica. Alternativamente, tales células cultivadas sobre filtros de nitrocelulosa colocados en placas que contienen medio sólido pueden ser iluminadas con un fuente de luz policromática de barrido y tomarse imágenes con una cámara de color integradora. El color de la luz emitida puede ser determinado posteriormente mediante análisis de imagen utilizando un programa de ordenador especializado.

La invención está ilustrada adicionalmente en los ejemplos siguientes con referencia a las figuras adjuntas, en las cuales

La Fig. 1 muestra un mapa de la construcción del plásmido pUC19-GFP. Los números de los nucleótidos de GFP indicados debajo con una "G" proceden del registro de la secuencia de GFP del GenBank (Nº de Acceso M62653). Las bases en cursiva representan la secuencia de GFP. Los números de los nucleótidos de pUC19 indicados debajo con una "P" proceden del registro de la secuencia de pUC19 del GenBank (Nº de Acceso X02514). Las bases en texto sencillo representan la secuencia de pUC19. Las bases en negrita representan secuencias que no son de GFP ni de pUC19, que han sido insertadas mediante PCR para la introducción de sitios de restricción convenientes.

La Fig. 2 muestra mapas de las cuatro construcciones de fusión GFP-CRP básicas:

A)

GFP de longitud completa en el extremo N fusionada con CRP de longitud completa en el extremo C.

B)

GFP truncada en el extremo N fusionada con CRP de longitud completa en el extremo C.

C)

CRP de longitud completa en el extremo N fusionado con GFP de longitud completa en el extremo C.

D)

CRP truncado en el extremo N fusionado con GFP de longitud completa en el extremo C, correspondiente a la construcción en la que el dominio de unión a ADN de CRP ha sido sustituido por GFP.

Los números de los nucleótidos de GFP indicados debajo con una "G" proceden del registro de la secuencia de GFP del GenBank (Nº de Acceso M62653). Los números de los nucleótidos de CRP indicados debajo con una "C" proceden del registro de la secuencia del CRP del GenBank (Nº de Acceso M13770). Los números de los nucleótidos de pUC19 indicados debajo con una "P" proceden del registro de la secuencia de pUC19 del GenBank (Nº de Acceso X02514).

Ejemplo 1 Clonaje del ADNc que codifica la proteína fluorescente verde

Brevemente, el ARN total aislado de A. victoria mediante un procedimiento estándar (Sambrook y col., Molecular Cloning, 2, eds. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York), 7.19-7.22) fue convertido en ADNc mediante la utilización de la transcriptasa inversa de AMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según está recomendado por el fabricante. El ADNc fue amplificado posteriormente mediante PCR utilizando cebadores de PCR diseñados sobre la base de una secuencia de GFP publicada previamente (Prasher y col., Gene 111, 1992, pp. 229-233; Nº de Acceso del GenBank M62653) junto con la polimerasa ULTma™ (Perkin Elmer, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores fueron: GFP2: TGGAATAAGCTTTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT y GFP-1: AAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCT. Los sitios de endonucleasas de restricción insertados en los cebadores 5' (un sitio de HindIII) y 3' (sitios de EcoRI y BamHI) facilitaban el clonaje del ADNc de GFP amplificado por PCR en un vector pUC19 ligeramente modificado. Los detalles de la construcción son los siguientes: AGGA de Shine-Dalgarno de LacZ, seguido inmediatamente por el sitio de HindIII 5' más una T extra y el codón ATG de la GFP, dando lugar a la secuencia de ADN siguiente en el punto de fusión promotor LacZ-GFP: P_{LacZ}-AGGAAAGCTTTATG-GFP. En el extremo 3' del ADNc de GFP, el par de bases correspondiente al nucleótido 770 de la secuencia publicada de la GFP (Nº de Acceso del GenBank M62653) fue fusionado al sitio de EcoRI del sitio de clonaje múltiple (MCS) de pUC19 a través de una región adaptadora BamHI, EcoRI generada por PCR.

Ejemplo 2 Aislamiento de GFPs mutantes

Se prepara una variante de GFP con propiedades ópticas alteradas y/o estabilidad térmica alterada sometiendo la GFP descrita en el Ejemplo 1 a un ciclo de mutagénesis química seguido por la selección de los mutantes potenciales por propiedades alteradas.

Brevemente, la secuencia de ADN que codifica GFP descrita en el Ejemplo 1 (el fragmento HindIII-EcoRI) es desnaturaliza por calor y sometida a mutágenos químicos esencialmente según está descrito por Myer y col., Science 229, 1985, p. 242. El mutágeno es ácido nitroso o permanganato o ácido fórmico. La población mutada resultante de fragmentos de GFP de hebra sencilla es amplificada por PCR utilizando los cebadores descritos en el Ejemplo 1, o transcrita de manera inversa por la transcriptasa inversa de AMV según se describió en el Ejemplo 1 antes de la amplificación por PCR. Los productos de la PCR son cortados por los enzimas de restricción HindIII y EcoRI y los productos de esta reacción son ligados en el plásmido pUC19 modificado descrito en el Ejemplo 1.

La reacción de ligadura es transformada en una cepa de E. coli y sembrada en placas de agar LB conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina para dar lugar a 500 transformantes por placa aproximadamente. La fluorescencia de la GFP en las células es detectada por excitación de las placas con una fuente de luz a 398 nm o 365 nm. Se realizan réplicas de las colonias sobre placas nuevas o sobre placas en las que se había colocado un filtro de nitrocelulosa antes de la replicación. Cuando se han formado colonias una vez más, son recogidas individualmente y resuspendidas en agua. Las suspensiones celulares son colocadas en un Espectrómetro de Luminiscencia LS50B (Perkin Elmer Ltd., Beaconsfield, Buckinghamshire, Inglaterra) equipado con un soporte para cubetas de temperatura controlada y se determinan las propiedades del espectro (barridos de excitación y emisión lumínica). Alternativamente, placas completas con 500 transformantes aproximadamente son iluminadas con una fuente de luz policromática de barrido (monocromador estable de T.I.L.L. Photonics, Munich, Alemania) y se toman imágenes con una cámara de color RGB integradora (Photonic Science Color Cool View). El color real de la luz emitida fue determinado mediante análisis de imagen utilizando el programa de ordenador Spec R4 (Signal Analytics Corporation, Vienna, VA, EE.UU.)

La sensibilidad al calor de la GFP mutada es analizada caracterizando sus propiedades espectrales, según se describió anteriormente, después de un aumento secuencial de la temperatura desde 20ºC hasta 80ºC.

En otro ciclo de mutagénesis, células de E. coli que contenían el plásmido pUC19 con GFP descrito en el Ejemplo 1, son sometidas a tratamiento con N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina a una concentración de 25 miligramos por litro durante 18 horas, y las células son sembradas y analizadas según se describió anteriormente. Alternativamente, los plásmidos son recuperados primeramente de las células tratadas y transformados en células de E. coli que son sembradas y analizadas según se describió anteriormente.

Ejemplo 3 Construcción de una sonda de AMPc recombinante basada en GFP

La base de la sonda de AMPc recombinante basada en GFP descrita en la presente es la fusión de una porción de la proteína receptora de AMPc (CRP) de E. coli a GFP.

Se decidió preparar cuatro construcciones de fusión GFP-CRP básicas, a partir de las cuales puede generarse una serie completa de construcciones de fusión semialeatorias, algunas de las cuales se espera que tengan la capacidad para inducir cambios conformacionales en GFP cuando se una AMPc a la porción N-terminal de CRP, teniendo como resultado cambios detectables de las propiedades ópticas de GFP.

1. Descripción de las cuatro fusiones GFP-CRP básicas

El plásmido que alberga la fusión GFP-CRP mostrado en la Figura 2 A) fue construido de la forma siguiente: el inserto de CRP del plásmido pHA7 (Aiba y col., Nucl. Acids Res. 10, 1982, pp. 1345-1377) fue amplificado por PCR con los cebadores de PCR CRP1 (CGATACAGATCTAAGCITTATGGTGCTTGGCAAACCGC) y CRP-2 (CG
GAATTCTTAAAAGCTTAGATCTTTACCGTGTGCGGAGATCAG) seguido por digestión con las endonucleasas de restricción BglII y EcoRI. El inserto de GFP del plásmido pUC19-GFP (ver el Ejemplo 1) fue amplificado por PCR utilizando los cebadores de PCR GFP2 (ver el Ejemplo 1) y GFP-4 (GAATCGTAGATCTTTGTATAGTTCATC
CATGCCATG) seguido por digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y BglII. Posteriormente, en una ligadura de tres partes, el fragmento BglII/EcoRI del ADN de CRP amplificado por PCR y el fragmento HindIII/BglII del ADN de GFP amplificado por PCR, fueron ligados con un fragmento del vector HindIII/EcoRI del plásmido pUC19 ligeramente modificado descrito en el Ejemplo 1, seguido por la transformación de E. coli.

El plásmido que alberga la fusión GFP-CRP mostrado en la Figura 2 B) fue construido esencialmente según se describió anteriormente para el plásmido de la Figura 2 A) con una única modificación: Se utilizó el cebador de PCR GFP-3 (GAATCGTAGATCTTTGACTTCAGCACGTGTCTTGTA) en lugar del cebador de PCR GFP-4.

El plásmido que alberga la fusión CRP-GFP mostrado en la Figura 2C) fue producido mediante amplificación por PCR del inserto de CRP del plásmido pHA7 con los cebadores de PCR CRP1 y CRP-2, seguido por digestión con la endonucleasa de restricción HindIII y ligadura en el sitio de HindIII del plásmido pUC19-GFP (ver el Ejemplo 1).

El plásmido que alberga la fusión GFP-CRP mostrado en la Figura 2 D) fue construido esencialmente según se describió anteriormente para el plásmido de la Figura 2 C) con una única modificación: Se utilizó el cebador de PCR GFP-1 (CCAGTTAAGCTTAGATCTTCCGGGTGAGTCATAGCGTCTGG) en lugar del cebador de PCR CRP-2.

2. Generación de fusiones GFP-CRP semialeatorias

Los 4 plásmidos de fusión GFP-CRP básicos descritos anteriormente son digeridos con la endonucleasa de restricción BglII (que abre los plásmidos en los puntos de fusión GFP-CRP), seguido por tratamiento con la exonucleasa de doble hebra Bal31 durante 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, etc., hasta 20 minutos (cf. Sambrook y col., op. cit. en 15.24). Posteriormente, el ADN tratado con Bal31 es incubado con la ADN polimerasa de T4 (cf. Sambrook y col., op. cit. en 15.24) para generar extremos romos, seguido por autoligadura (esencialmente según está descrito por Sambrook y col., op. cit. en 1.68). Finalmente, el ADN plasmídico tratado con Bal31 autoligado es transformado en E. coli.

3a. Selección de las fusiones CRP-GFP por cambios de la fluorescencia inducidos por AMPc

Los transformantes de E. coli que expresan una de las cuatro fusiones CRP-GFP básicas o una de las fusiones GFP-CRP semialeatorias son cultivados durante una noche en 2 ml de medio Luria-Bertani con ampicilina añadida (100 \mug/ml). Las células son posteriormente aglutinadas por centrifugación seguido por resuspensión en 0,5 ml de tampón de lisis (NaCl 100 mM, EDTA 1 mM y Tris 50 mM pH 8,0). Posteriormente, se añaden 25 \mul de Lisozima 10 mg/ml a las células resuspendidas, seguido por incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, agitación vigorosa en vórtex y centrifugación durante 5 minutos a 20.000 x g. Finalmente, se adquieren los espectros de emisión y excitación de los extractos de proteína resultantes (los sobrenadantes) mediante la utilización del Espectrómetro de Luminiscencia LS50B y el paquete de programas de ordenador FL Data Manager (ambos de Perkin Elmer Ltd., Beaconsfield, Buckinghamshire, Inglaterra). Los espectros registrados antes así como después de la adición de AMPc a una concentración final de 0,5 mM, son comparados mediante la utilización del paquete de programas de ordenador Graph Builder (Perkin Elmer). Las fusiones CRP-GFP que presentan cambios de la fluorescencia inducidos por AMPc, son investigadas posteriormente mediante expresión en células de mamífero.

3b. (Protocolo alternativo) Selección de las fusiones CRP-GFP por cambios de la fluorescencia inducidos por AMPc

Los niveles de AMP cíclico en células de E. coli varían según la fuente de carbono proporcionada; ver, por ejemplo, Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1975, pp. 2300-2304 y Botsford y Harman, Microbiological Reviews 56, 1992, pp. 100-122. por ejemplo, las células cultivadas con glucosa contienen un nivel menor de AMPc que las células cultivadas en, por ejemplo, glicerol. Además, el desplazamiento de las células desde una fuente de carbono a otra, o la adición de glucosa a un cultivo crecido en una fuente de carbono diferente de glucosa, cambian el nivel de AMPc de las células. Por lo tanto, el cambio inducido por AMPc de la fluorescencia de las fusiones CRP-GFP puede ser determinado mediante la medición continua de la fluorescencia de las células que expresan las fusiones, después de su transferencia desde un medio que contiene, por ejemplo, glicerol como fuente de carbono a un medio que contiene un 0,2% de glucosa. Las células son analizadas en cultivo líquido en el Espectrómetro de Luminiscencia LS50B o cultivándolas sobre filtros de nitrocelulosa colocados en placas con medio sólido; el filtro es transferido desde placas con un tipo de medio a placas con otro tipo de medio, y se monitoriza continuamente la fluorescencia excitando las placas con una fuente de luz policromática de barrido (monocromador estable de T.I.L.L. Photonics, Munnich, Alemania) y recogiendo imágenes de color con una cámara de color RGB integradora (Photonic Science Color Cool View). El color real de la luz emitida es determinado mediante análisis de imagen utilizando el paquete de programas de ordenador Spec R4 (Signal Analytics Corporation, Vienna, VA, EE.UU.).

Ejemplo 4 Construcción de una sonda recombinante basada en GFP para determinar actividad proteína quinasa Descripción de los sustratos recombinantes de proteína quinasa C (PKC) basados en GFP

Estudios sobre la especificidad de sustrato de las diferentes isoformas de PKC utilizando péptidos sintéticos, han demostrado que los péptidos que contienen el motivo XRXXSXRX (siendo S el aminoácido fosforilado) tienden a ser los mejores sustratos de PKC (según está revisado en Kemp, B.E. y Pearson, R.B., TIBS 15, Septiembre de 1990, pp. 342-346). Además, el sustrato GAP-43 de la PKC neuronal existente en la naturaleza tiene la secuencia de aminoácidos siguiente alrededor del residuo de serina fosforilado (subrayado): AATICIQASFRGHIT (Kosik, K.S. y col., Neuron. 1, 1988, pp. 127-132). Sobre la base de estos datos, nosotros hemos seleccionado el supuesto motivo de reconocimiento de PKC RQASFRS para la inserción en GFP en varias posiciones. Los puntos de inserción fueron seleccionados sobre la base de la probabilidad superficial (calculada utilizando el paquete de programas de ordenador GCG, que emplea una fórmula de Emini y col., J. Virol. 55(3), 1985, pp. 836-839), modificada ligeramente por los valores finales de las cadenas de proteína. Las probabilidades individuales están tomadas de Janin y col., J. Mol. Biol. 125, 1978, pp. 357-386) y/o de la cercanía del cromóforo de GFP. El heptapéptido es insertado en GFP mediante PCR en las posiciones siguientes:

Entre el aminoácido (aa) 39 y el aa 40 (cebadores de PCR PKC-1: GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTC
GGTATGTTGCATCACCTTCACC y PKC1: GATACCAAAGATCTGGAAAACTTACCCTTAAATTT), entre el aa 52 y el aa 53 (cebadores de PCR PKC-2: GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGTTTTCCAGTAGTGCAAA
TAAA y PKC2: GATACCAAAGATCTCTACCTGTTCCATGGCCAACAC), entre el aa 71 y el aa 72 (cebadores de PCR PKC-3: GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGAAAGCATTGAACACCATAAGA y PKC3: GA
TACCAAAGATCTTCAAGATACCCAGATCATATG), entre el aa 79 y el aa 80 (cebadores de PCR PKC-4: GATA
CCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGTTTCATATGATCTGGGTATCT y PKC4: GATACCAAAGATCTCAGCA
TGACTTTTTCAAGAGT), entre el aa 107 y el aa 108 (cebadores de PCR PKC-5: GATACCAAAGATCTGAA
AGAAGCTTGTCGCTTGTAGTTCCCGTCATCTTT y PKC5: GATACCAAAGATCTACACGTGCTGAAGTCAA
GTTT), entre el aa 129 y el aa 130 (cebadores de PCR PKC-6: GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGATCA
ATACCTTTTAACTCGAT y PKC6: GATACCAAAGATCTTTTAAAGAAGATGGAAACATT), entre el aa 164 y el aa 165 (cebadores de PCR PKC-7: GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGGTTAACTTTGATTCCATTCTT y PKC7: GATACCAAAGATCTTTCAAAATTAGACACAACATT) y entre el aa 214 y el aa 215 (cebadores de PCR PKC-8: GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGCTTTTCGTTGGGATCTTTCGA y PKC8: GATACCAAA
GATCTAGAGACCACATGGTCCTTCTT).

Los cebadores de PCR fueron diseñados de la manera siguiente: Cebadores inversos: 5'-GATACCAA AGA TCT GAA AGA AGC TTG TCG-3' + 21 nucleótidos de la hebra antisentido (corriente arriba del segundo aa mencionado) y cebadores directos: 5'-GATACCAA AGA TCT-3' + 21 nucleótidos de la hebra sentido (corriente abajo del primer aa), estando provisto cada cebador de PCR de un único sitio de BglII (que da lugar a los residuos de arginina y serina del heptapéptido). El sitio de PKC es insertado mediante PCR del ADN del plásmido pUC19-GFP (ver el Ejemplo 1) con los 8 cebadores directos y los 8 cebadores inversos correspondientes, seguido por digestión con BglII, autoligadura y transformación de E. coli (cf. Sambrook y col., op. cit.).

2. Selección de los sustratos de PKC recombinante basados en GFP para determinar cambios de la fluorescencia inducidos por fosforilación

Los transformantes de E. coli que expresan uno de los ocho sustratos de PKC recombinantes basados en GFP son cultivados durante una noche en 2 ml de medio Luria-Bertani con ampicilina añadida (100 \mug/ml). Las células son posteriormente aglutinadas por centrifugación, seguido por resuspensión en 0,5 ml de tampón de lisis (NaCl 100 mM, EDTA 1 mM y Tris 50 mM pH 8,0). Posteriormente, se añaden a las células resuspendidas 25 \mul de Lisozima 10 mg/ml, seguido por incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, agitación vigorosa en vórtex y centrifugación durante 5 minutos a 20.000 x g. Finalmente, se adquieren los espectros de emisión y excitación de los extractos de proteína resultantes (los sobrenadantes) mediante la utilización del Espectrómetro de Luminiscencia LS50B y el paquete de programas de ordenados FL Data Manager (Perkin Elmer). Los espectros registrados antes así como después del tratamiento de los extractos con PKC purificada (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, son comparados mediante la utilización del paquete de programas de ordenador Graph Builder (Perkin Elmer). Los sustratos de PKC recombinantes basados en GFP que presentan cambios de la fluorescencia inducidos por fosforilación son investigados posteriormente mediante la expresión en células de mamífero.

Ejemplo 5 Caracterización de las sondas de fusión recombinantes en células de mamífero

Las fusiones CRP-GFP (Ejemplo 3) que presentan cambios de la fluorescencia inducidos por AMPc así como los sustratos de PKC recombinantes basados en GFP que presentan cambios de la fluorescencia inducidos por fosforilación, son investigados posteriormente mediante la expresión en células de mamífero.

Insertos de los plásmidos respectivos son aislados mediante digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI y ligados en los sitios de HindIII y BamHI del MCS del vector pREP4 de mamífero (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.). Posteriormente, células renales de crías de hámster (BHK) son transfectadas con las construcciones plasmídicas resultantes de acuerdo con el protocolo estándar de precipitación de ADN con fosfato de calcio (cf. Sambrook y col., op. cit. en 16.33-16.35). Los transfectantes estables con expresión elevada de las sondas recombinantes son identificados y clonados después de 6-14 días en cultivo mediante la cuantificación de la fluorescencia en un sistema de análisis de imagen, que consta de un microscopio Nikon Diaphot 200 con platina de temperatura controlada, una cámara CCD de barrido lento (T.I.L.L. Photonics), una fuente de luz policromática (T.I.L.L. Photonics) y un paquete de programas de ordenador para el análisis de imagen basado en PC (FUCAL de T.I.L.L. Photonics). Alternativamente, las propiedades de fluorescencia son monitorizadas en un sistema basado en un fotómetro. En este sistema la cámara CCD es sustituida por un fotomultiplicador D104 (PTI, Canadá).

\vskip1.000000\baselineskip

Los clones son cultivados durante un par de días en cámaras con cubreobjetos de vidrio (NUNC, Copenhagen, Dinamarca) antes del análisis de imagen.

La capacidad de los clones para detectar cambios de AMPc es caracterizada mediante la elevación del nivel intracelular de AMPc por desafío de las células con forskolina (0,1-10 \muM) o dibutiril-AMPc (1-100 \muM) y la monitorización del cambio asociado de las propiedades espectrales. De manera similar, los clones que son sensibles a variaciones de la actividad PKC son caracterizados mediante la activación de la PKC de los mismos con PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) (10-1000 nM) o con OAG (1-oleoil-2-acetil-sn-glicerol) (1-100 \muM). Los cambios de las propiedades de la fluorescencia inducidos por el estimulante son monitorizados continuamente utilizando el sistema de análisis de imagen anteriormente mencionado. La combinación del análisis de imagen con fotometría hace posible la caracterización de la respuesta de las sondas recombinantes con una elevada resolución espacial y una elevada resolución temporal.

Ejemplo 6 GFP como sonda recombinante para la determinación de la actividad proteína quinasa Purificación de GFP a partir de células de E. coli que expresan GFP

Células de E. coli conteniendo un plásmido que permite la expresión de GFP fueron cultivadas durante una noche a 24ºC. Las células fueron aglutinadas, se desechó el sobrenadante y la pella fue resuspendida en 1/20 del volumen original de tampón fosfato de Na 100 mM (pH 8,0). Se rompieron las células por sonicación y los desechos celulares fueron aglutinados a 12000 g durante 20 minutos. El sobrenadante fue recuperado, se añadió sulfato de amonio a una concentración final de 1,5 M y la solución resultante fue sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica mediante la aplicación de la misma a una columna de Fenil-Sefarosa CL-4B equilibrada con sulfato de amonio 1,5 M. La columna fue eluida con agua y las fracciones que contenían GFP fueron identificadas por la fluorescencia verde cuando eran iluminadas con luz UV a 365 nm. A las fracciones que contenían GFP se añadió un volumen de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) y éstas fueron sometidas a cromatografía de intercambio aniónico mediante la aplicación de las mismas a una columna de Q-Sefarosa. La columna fue eluida con Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) + NaCl 1,0 M. Las fracciones que contenían GFP fueron identificadas por la fluorescencia verde cuando eran iluminadas con una luz UV a 365 nm. Las fracciones que contenían GFP fueron sometidas a filtración en gel mediante la aplicación de las mismas a una columna de Superosa-12 equilibrada con tampón fosfato de Na 100 mM (pH 8,0). La columna fue eluida con tampón fosfato de Na 100 mM (pH 8,0) y las fracciones que contenían GFP fueron identificadas por la fluorescencia verde cuando eran iluminadas con luz UV a 365 nm. La preparación de GFP resultante era más de un 95% pura según se estimó mediante análisis por HPLC.

Ensayo de fosforilación de GFP in vitro

Para la fosforilación in vitro de GFP, \mug de GFP de tipo salvaje (purificada según se describió anteriormente) en Tris 40 mM, pH 7,4, MgOAc 20 mM y ATP 0,2 mM (todos de Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) fueron incubados durante 1-60 minutos a 37ºC con 0-20 unidades de caseína de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMPc (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y 0-200 \muM de inhibidor de proteína quinasa dependiente de AMPc. Se adquirieron los espectros de emisión (longitud de onda de excitación 395 nm o 470 nm) y excitación (longitud de onda de emisión 508 nm) para todas las muestras utilizando el Espectrómetro de Luminiscencia LS50B y el paquete de programas de ordenador FL Data Manager (Perkin Elmer). Los espectros fueron comparados posteriormente utilizando el paquete de programas de ordenador Graph Builder (Perkin Elmer).

Como puede observarse en la Fig. 3, la intensidad de la fluorescencia de la GFP de tipo salvaje aumenta aproximadamente dos veces cuando es incubada con la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMPc. Además, el inhibidor de la proteína quinasa dependiente de AMPc a 5 \muM inhibe el efecto de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMPc.

La Figura 3 muestra el espectro de emisión de 0,5 \mug de GFP de tipo salvaje (purificada según se describió en el Ejemplo 6) en Tris 40 mM, pH 7,4, MgOAc 20 mM y ATP 0,2 mM (todos de Sigma), incubada durante 5 minutos a 37ºC con 10 unidades de caseína de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMPc (Promega) con o sin 5 \muM del inhibidor de proteína quinasa dependiente de AMPc (PKI). El control (sin PKA) fue incubado 5 minutos a 37ºC sin la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMPc. La longitud de onda de excitación fue de 395 nm. IFR en la figura significa intensidad de fluorescencia relativa.

Ejemplo 7 Caracterización de GFP de tipo salvaje como una sonda para medir actividad PKA en células de mamífero

Las proteínas fluorescentes verdes que presentaban cambios de la fluorescencia inducidos por fosforilación fueron investigadas posteriormente mediante expresión en células de mamífero.

Insertos de los plásmidos respectivos son aislados mediante digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI y ligados en los sitios de HindIII y BamHI del MCS del vector pZEO-SV de mamífero (Invitrogen, San Diego, California, CA). Posteriormente, células renales de crías de hámster (BHK) son transfectadas con las construcciones plasmídicas resultantes según el protocolo estándar de precipitación de ADN con fosfato de calcio (cf. Sambrook y col., op. cit. en 16.33-16.35). Los transfectantes estables con una expresión elevada de las sondas recombinantes son identificados y clonados después de 6-14 días en cultivo mediante la cuantificación de la fluorescencia en un sistema de análisis de imagen, que consta de un microscopio Nikon Diaphot 200 con platina de temperatura controlada, una cámara CCD de barrido lento (T.I.L.L. Photonics), una fuente de luz policromática (T.I.L.L. Photonics) y un paquete de programas de ordenador para análisis de imagen basado en PC (FUCAL de T.I.L.L. Photonics). Alternativamente, las propiedades de la fluorescencia son monitorizadas en un sistema basado en un fotómetro. En este sistema, la cámara CCD es sustituida por un fotomultiplicador D104 (PTI, Canadá).

Los clones son cultivados durante un par de días en cámaras con cubreobjetos de vidrio (NUNC, Copenhagen, Dinamarca) antes del análisis de imagen.

La capacidad de los clones para detectar cambios de la actividad proteína quinasa A es caracterizada mediante la elevación del nivel intracelular de AMPc por desafío de las células con forskolina (0,1-10 \muM) o dibutiril-AMPc (1-100 \muM) y la monitorización del cambio asociado de las propiedades espectrales. Los cambios de las propiedades de la fluorescencia inducidos por el estimulante son monitorizados continuamente utilizando el sistema de análisis de imagen anteriormente mencionado. La combinación del análisis de imagen con fotometría hace posible caracterizar la respuesta de las sondas recombinantes con una elevada resolución espacial y una elevada resolución temporal.

Claims (9)

1. \global\parskip0.970000\baselineskip

   1. Un método para caracterizar la actividad biológica de una muestra, comprendiendo el método:

   (a) la expresión de una secuencia de ADN en una célula, en la que la secuencia de ADN codifica una proteína o un polipéptido seleccionado del grupo que consta de:

   (i)

   una proteína fluorescente verde que tiene un sitio de reconocimiento de proteína quinasa, o

   (ii)

   una proteína fluorescente verde en la que uno o más aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados para proporcionar un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima, o

   (iii)

   un polipéptido híbrido de proteína fluorescente verde (GFP) o de una GFP modificada y un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima; y

   (b) la medida de la fluorescencia de dicha GFP en dicha célula en ausencia y presencia de una muestra de ensayo; y

   (c) la comparación de la fluorescencia de GFP medida en la etapa (b);

   en el que una diferencia entre la fluorescencia medida en ausencia y presencia de dicha muestra es indicativa de la actividad biológica de dicha muestra de ensayo.
2. 2. Un método para caracterizar la actividad biológica de una muestra de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el método:

   (a) la expresión de una secuencia de ADN en una primera población y en una segunda población de células que contienen una secuencia de ADN que codifica:

   (i)

   una proteína fluorescente verde que tiene un sitio de reconocimiento de proteína quinasa, o

   (ii)

   una proteína fluorescente verde en la que uno o más aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados para proporcionar un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima, o

   (iii)

   un polipéptido híbrido de proteína fluorescente verde (GFP) o de una GFP modificada y un dominio de unión de un segundo mensajero o un sitio de reconocimiento de un enzima;

   (b) la medida de la fluorescencia de dicha GFP en dicha primera población en ausencia de dicha muestra y en dicha segunda población en presencia de la muestra; y

   (c) la comparación de la fluorescencia de GFP de dicha primera y dicha segunda población celular;

   en el que una diferencia entre la fluorescencia medida en dicha primera y en dicha segunda población celular es indicativa de la actividad biológica de dicha muestra de ensayo.
3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en el que la célula (o células) es una célula eucariótica.
4. 4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula (o células) es una célula levadura o una célula de mamífero.
5. 5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de unión es un receptor.
6. 6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de unión es un receptor de AMP cíclico o una parte del mismo capaz de unirse a AMP cíclico.
7. 7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sitio de reconocimiento del enzima es un sitio de reconocimiento de proteína quinasa.
8. 8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sitio de reconocimiento de proteína quinasa es seleccionado del grupo que consta de proteína quinasa A, proteína quinasa C, el receptor de insulina y la quinasa Src.
9. 9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el gen que codifica GFP deriva de Aequorea victoria.