JP3535177B2 - 緑色蛍光性タンパクであるｇｆｐの新規な変種 - Google Patents
緑色蛍光性タンパクであるｇｆｐの新規な変種Info
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野〕
本発明は、改善された蛍光特性を有する蛍光性タンパ
クGFPの新規な変種に関する。
クGFPの新規な変種に関する。
クラゲA.ビクトリア（A.victoria）由来の緑色蛍光性
タンパク（GFP）が異種細胞内で発現されたときに蛍光
特性を保持するという発見によって、生物学の研究には
新しいユニークで且つ強力な手段が与えられた（Chalfi
e et al（1994）−Science263:802;Prasher（1995）Tre
nds in Genetics 11:320;WO95/07463）。
タンパク（GFP）が異種細胞内で発現されたときに蛍光
特性を保持するという発見によって、生物学の研究には
新しいユニークで且つ強力な手段が与えられた（Chalfi
e et al（1994）−Science263:802;Prasher（1995）Tre
nds in Genetics 11:320;WO95/07463）。
更に、異なった励起および発光スペクトルがあれば２
以上のプロセスを同時にモニターすることが可能になる
から、GFPの青色蛍光変種（Heim et al.（1994）.Proc.
Natl.Acad.Sci.91:12501）により、蛍光組換えプローブ
を用いて細胞の事象または機能をモニターするといった
応用の可能性が非常に高まっている。
以上のプロセスを同時にモニターすることが可能になる
から、GFPの青色蛍光変種（Heim et al.（1994）.Proc.
Natl.Acad.Sci.91:12501）により、蛍光組換えプローブ
を用いて細胞の事象または機能をモニターするといった
応用の可能性が非常に高まっている。
しかし、ヘイム等（Heim et al.）が記載した青色蛍
光変種Y66H−GFPには、一定の限界がある。即ち、この
青色蛍光は弱く（448nmでの極大発光）、従って検出が
困難であり、またY66H−GFPを発現する細胞の長時間に
渡る励起を必要とする。更に、励起波長はUV範囲（360n
m−390nm）なので、長時間の励起は細胞に対して損傷を
与える。
光変種Y66H−GFPには、一定の限界がある。即ち、この
青色蛍光は弱く（448nmでの極大発光）、従って検出が
困難であり、またY66H−GFPを発現する細胞の長時間に
渡る励起を必要とする。更に、励起波長はUV範囲（360n
m−390nm）なので、長時間の励起は細胞に対して損傷を
与える。
細胞機能を研究する上で、組換え蛍光性タンパクを用
いることの非常に重要な側面は、試験が本来的に非侵襲
的なことである。これは、無傷の生きた細胞内における
細胞事象の検出を可能にする。しかし、現在の蛍光性タ
ンパクを用いる場合の制限は、可視化するために比較的
高い強度の光源を必要とすることである。特に、青色変
種のY66H−GFPを用いる場合、殆どの細胞を損傷するよ
うな強度で励起する必要がある。細胞内の信号伝達シス
テム（例えば原形質ゾル遊離カルシウム）における振動
のような、幾つかの細胞事象は非常に光感受性であるこ
とに言及しておく価値があろう。低発光の更なる結果
は、高レベルの発現しか検出できないことである。この
ような高レベルの発現を得ることは、細胞の転写および
／または翻訳機構にストレスを与える可能性ある。
いることの非常に重要な側面は、試験が本来的に非侵襲
的なことである。これは、無傷の生きた細胞内における
細胞事象の検出を可能にする。しかし、現在の蛍光性タ
ンパクを用いる場合の制限は、可視化するために比較的
高い強度の光源を必要とすることである。特に、青色変
種のY66H−GFPを用いる場合、殆どの細胞を損傷するよ
うな強度で励起する必要がある。細胞内の信号伝達シス
テム（例えば原形質ゾル遊離カルシウム）における振動
のような、幾つかの細胞事象は非常に光感受性であるこ
とに言及しておく価値があろう。低発光の更なる結果
は、高レベルの発現しか検出できないことである。この
ような高レベルの発現を得ることは、細胞の転写および
／または翻訳機構にストレスを与える可能性ある。
アエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）由
来の緑色蛍光性タンパクの励起スペクトルは二つのピー
ク、即ち、396nmの主ピーク（これは細胞を損傷し得るU
V領域にある）と、475nmの副ピーク（これは細胞に対す
る損傷性が極めて低い励起領域にある）とを示す。文献
（Heim et al.（1995）,Nature,Vol.373,p.663−４）
は、野生型GRPよりも長波長での励起および発光（夫々4
90nmおよび510nm）を有し、且つ蛍光団形成が野生型GFP
よりも約４倍速く進行するような、GFPのSer65Thr突然
変異（S65T）を開示している。
来の緑色蛍光性タンパクの励起スペクトルは二つのピー
ク、即ち、396nmの主ピーク（これは細胞を損傷し得るU
V領域にある）と、475nmの副ピーク（これは細胞に対す
る損傷性が極めて低い励起領域にある）とを示す。文献
（Heim et al.（1995）,Nature,Vol.373,p.663−４）
は、野生型GRPよりも長波長での励起および発光（夫々4
90nmおよび510nm）を有し、且つ蛍光団形成が野生型GFP
よりも約４倍速く進行するような、GFPのSer65Thr突然
変異（S65T）を開示している。
生きた細胞内でのGFPまたはその蛍光変種の発現は、
細胞事象の研究のための価値ある道具を提供するもので
あり、哺乳類細胞を含む多くの細胞が、最適および／ま
たは生理学的に適切な増殖を保障するために、略37℃で
インキュベートされることは周知である。異なった生物
または組織を起源とする細胞株は、繊維芽細胞について
の約35℃から、マウスβ細胞についての約38℃〜39℃ま
での範囲に亘る異なった好適温度を有し得る。しかし、
前記細胞を室温よりも高い温度でインキュベートする
と、GFPを発現する細胞からの蛍光信号は弱いか、また
は存在しないことが実験で示されている（Webb,C.D.et
al.,Journal of Bacteriology,Oct.1995,p.5906−5911.
Ogawa H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.92,pp.11
899−11903,December 1995およびLim et al.,J.Bioche
m.118,13−17（1995）を参照されたい）。また、上記の
ヘイム等（1995）が記載した改善された蛍光変種である
S65Tは、通常の培養条件下（37℃）でインキュベートす
ると、非常に低い蛍光を示す（Kaether and Gerdes FEB
S Letters 369（1995）pp.267−271を参照されたい）。
細胞代謝を含む多くの実験は、生理学的に適切な温度、
即ち、約37℃の温度で細胞をインキュベートできる可能
性に依存する。
細胞事象の研究のための価値ある道具を提供するもので
あり、哺乳類細胞を含む多くの細胞が、最適および／ま
たは生理学的に適切な増殖を保障するために、略37℃で
インキュベートされることは周知である。異なった生物
または組織を起源とする細胞株は、繊維芽細胞について
の約35℃から、マウスβ細胞についての約38℃〜39℃ま
での範囲に亘る異なった好適温度を有し得る。しかし、
前記細胞を室温よりも高い温度でインキュベートする
と、GFPを発現する細胞からの蛍光信号は弱いか、また
は存在しないことが実験で示されている（Webb,C.D.et
al.,Journal of Bacteriology,Oct.1995,p.5906−5911.
Ogawa H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.92,pp.11
899−11903,December 1995およびLim et al.,J.Bioche
m.118,13−17（1995）を参照されたい）。また、上記の
ヘイム等（1995）が記載した改善された蛍光変種である
S65Tは、通常の培養条件下（37℃）でインキュベートす
ると、非常に低い蛍光を示す（Kaether and Gerdes FEB
S Letters 369（1995）pp.267−271を参照されたい）。
細胞代謝を含む多くの実験は、生理学的に適切な温度、
即ち、約37℃の温度で細胞をインキュベートできる可能
性に依存する。
本発明の目的は、元のタンパク、即ち、GRP、青色変
種Y66H−GFPおよびS65T−GFPを発現する細胞からの細胞
性蛍光を遥かに超える細胞性蛍光を生じる、F64L−GF
P、F64L−Y66H−GFPおよびF64L−S65T−GFPのような新
規な蛍光性タンパクを提供することである。これは、生
きた細胞での細胞機能の研究において、蛍光性タンパク
の有用性を著しく改善するものである。
種Y66H−GFPおよびS65T−GFPを発現する細胞からの細胞
性蛍光を遥かに超える細胞性蛍光を生じる、F64L−GF
P、F64L−Y66H−GFPおよびF64L−S65T−GFPのような新
規な蛍光性タンパクを提供することである。これは、生
きた細胞での細胞機能の研究において、蛍光性タンパク
の有用性を著しく改善するものである。
本発明の更なる目的は、新規な蛍光性タンパクであっ
て、これらを発現する細胞を30℃以上、好ましくは32℃
〜39℃、より好ましくは35℃〜38℃の温度、最も好まし
くは約37℃の温度でインキュベートしたときに、この細
胞内において高い蛍光を示す蛍光性タンパクを提供する
ことである。
て、これらを発現する細胞を30℃以上、好ましくは32℃
〜39℃、より好ましくは35℃〜38℃の温度、最も好まし
くは約37℃の温度でインキュベートしたときに、この細
胞内において高い蛍光を示す蛍光性タンパクを提供する
ことである。
野生型GFPの蛍光は発色団の存在によるものであり、
該発色団は予想一次アミノ酸配列における位置65〜67の
SYGの環化および酸化、並びにおそらくは他のGFP類縁体
の位置65〜67におけるSHG配列の環化および酸化によっ
て発生することが知られている（Heim et al.（199
4））。我々は、驚くべきことに、SYGまたはSHG発色団
のＳの前の位置１におけるＦアミノ酸残基の変異（好ま
しくは置換）、または予想一次アミノ酸配列における位
置64の場合のTHG発色団のＴの変異によって、励起波長
および発光波長の移動を伴わずに、蛍光強度の実質的な
増大を生じることを見出した。
該発色団は予想一次アミノ酸配列における位置65〜67の
SYGの環化および酸化、並びにおそらくは他のGFP類縁体
の位置65〜67におけるSHG配列の環化および酸化によっ
て発生することが知られている（Heim et al.（199
4））。我々は、驚くべきことに、SYGまたはSHG発色団
のＳの前の位置１におけるＦアミノ酸残基の変異（好ま
しくは置換）、または予想一次アミノ酸配列における位
置64の場合のTHG発色団のＴの変異によって、励起波長
および発光波長の移動を伴わずに、蛍光強度の実質的な
増大を生じることを見出した。
F64L、F64I、F64V、F64A、およびF64Gの置換が好まし
く、F64F置換が最も好ましい。しかし、種々の蛍光性タ
ンパクにおける改善された蛍光特性を与える限り、他の
変異（例えば発色団の直前の欠失、挿入または翻訳後の
修飾）もまた本発明に含まれるものである。広範な欠失
は、GFPの蛍光特性の喪失を生じる可能性があることに
留意すべきである。アミノ末端から１残基のみ、および
カルボキシ末端から10または15残基未満を、蛍光の喪失
を伴わずに犠牲にすることができる（Cubitt et al.TIB
S Vol.20（11）,pp.448−456,November 1995）。
く、F64F置換が最も好ましい。しかし、種々の蛍光性タ
ンパクにおける改善された蛍光特性を与える限り、他の
変異（例えば発色団の直前の欠失、挿入または翻訳後の
修飾）もまた本発明に含まれるものである。広範な欠失
は、GFPの蛍光特性の喪失を生じる可能性があることに
留意すべきである。アミノ末端から１残基のみ、および
カルボキシ末端から10または15残基未満を、蛍光の喪失
を伴わずに犠牲にすることができる（Cubitt et al.TIB
S Vol.20（11）,pp.448−456,November 1995）。
従って、本発明の一つの側面は、本発明の蛍光性タン
パクが細胞内で発現されたときに蛍光強度を増大させる
ように、発色団の上流側の位置１におけるアミノ酸が変
異された、アエクオレア緑色蛍光性タンパク（GFP）ま
たはその何等かの機能的類縁体に関するものである。驚
くべきことに、前記の変異はまた、従来技術のGFP変種
に比較して、30℃以上でインキュベータされた該突然変
異GFPを発現する細胞からの蛍光信号強度の著しい増大
をもたらす。
パクが細胞内で発現されたときに蛍光強度を増大させる
ように、発色団の上流側の位置１におけるアミノ酸が変
異された、アエクオレア緑色蛍光性タンパク（GFP）ま
たはその何等かの機能的類縁体に関するものである。驚
くべきことに、前記の変異はまた、従来技術のGFP変種
に比較して、30℃以上でインキュベータされた該突然変
異GFPを発現する細胞からの蛍光信号強度の著しい増大
をもたらす。
本発明のタンパクには幾つかの利点があるが、その中
には下記の事項が含まれる。
には下記の事項が含まれる。
低エネルギー光源での励起。F64L−Y66H−GFPおよびF
64L−GFPの高い輝度に起因して、それらの発光は低エネ
ルギー光源での励起後にも検出することができる。それ
によって、光誘導性損傷に対して感受性の、細胞内信号
伝達系における振動のような細胞現象を研究することが
可能である。新規な青色および緑色発光蛍光性タンパク
から放出される光の強度は同じなので、同一の光源を用
いてこれらを同時に可視化することが可能である。
64L−GFPの高い輝度に起因して、それらの発光は低エネ
ルギー光源での励起後にも検出することができる。それ
によって、光誘導性損傷に対して感受性の、細胞内信号
伝達系における振動のような細胞現象を研究することが
可能である。新規な青色および緑色発光蛍光性タンパク
から放出される光の強度は同じなので、同一の光源を用
いてこれらを同時に可視化することが可能である。
F64L−Y66H−GFPおよびF64L−GFは、野生型GFPおよび
従来公知のその誘導体よりも遥かに迅速に検出可能レベ
ルに達するので、今や、生きた細胞内での遺伝子発現の
リアルタイムでのレポータが可能である。従って、それ
は生きた細胞における遺伝子発現のリアルタイムでの研
究に更に適している。発色団のより短時間での成熟、よ
り高い発光強度、より安定なタンパクまたはそれらの組
合せに起因して、検出可能な蛍光をより速く得ることが
できる。
従来公知のその誘導体よりも遥かに迅速に検出可能レベ
ルに達するので、今や、生きた細胞内での遺伝子発現の
リアルタイムでのレポータが可能である。従って、それ
は生きた細胞における遺伝子発現のリアルタイムでの研
究に更に適している。発色団のより短時間での成熟、よ
り高い発光強度、より安定なタンパクまたはそれらの組
合せに起因して、検出可能な蛍光をより速く得ることが
できる。
２以上の別々のプロモータの制御下における、新規な
蛍光性タンパク類の同時発現。
蛍光性タンパク類の同時発現。
生きた細胞に何等の損傷を伴うことなく、２以上の遺
伝子の発現を同時にモニターすることができる。
伝子の発現を同時にモニターすることができる。
内部標準として一つのレポータを用い、視認可能なマ
ーカーとして他のレポータを用いた、これら新規タンパ
ク類の同時発現。何故なら、プロモータを例えばF64L−
GFP（またはF64L−Y66H−GFP）に融合させ、蛍光を測定
し、それを構造的に発現されたF64L−Y66H−GFP（また
はF64L−GFP）の蛍光に対して正規化することにより、
遺伝子の調節された発現を定量的にモニターすることが
できるからである。構造的に発現されたF64L−Y66H−GF
P（またはF64L−GFP）は内部標準として働く。
ーカーとして他のレポータを用いた、これら新規タンパ
ク類の同時発現。何故なら、プロモータを例えばF64L−
GFP（またはF64L−Y66H−GFP）に融合させ、蛍光を測定
し、それを構造的に発現されたF64L−Y66H−GFP（また
はF64L−GFP）の蛍光に対して正規化することにより、
遺伝子の調節された発現を定量的にモニターすることが
できるからである。構造的に発現されたF64L−Y66H−GF
P（またはF64L−GFP）は内部標準として働く。
生きた細胞および固定された細胞におけるタンパク質
の標識としての使用。蛍光が強いため、この新規タンパ
ク類は低濃度で存在するタンパクのための適切な標識で
ある。基質を必要とせず、また細胞の可視化によって細
胞が損傷されないから、ダイナミックな分析を行うこと
ができる。
の標識としての使用。蛍光が強いため、この新規タンパ
ク類は低濃度で存在するタンパクのための適切な標識で
ある。基質を必要とせず、また細胞の可視化によって細
胞が損傷されないから、ダイナミックな分析を行うこと
ができる。
細胞小器官の標識としての使用。生きた細胞、例えば
小胞体および細胞骨格内において、２以上の細胞小器官
を標識し、同時に可視化することができる。
小胞体および細胞骨格内において、２以上の細胞小器官
を標識し、同時に可視化することができる。
細胞融合または細胞小器官融合のマーカーとしての使
用。２以上の細胞または細胞小器官を本発明の新規タン
パク、例えばF64L−Y66H−GFPおよびF64L−GFPでそれぞ
れ標識することにより、異核共存体の形成のような融合
をモニターすることができる。
用。２以上の細胞または細胞小器官を本発明の新規タン
パク、例えばF64L−Y66H−GFPおよびF64L−GFPでそれぞ
れ標識することにより、異核共存体の形成のような融合
をモニターすることができる。
本発明の新規タンパクに融合されたタンパクの移動を
可視化できる。問題のタンパクを一つの蛍光性タンパク
（例えばF64L−Y66H−GFP）に融合させ、細胞小器官を
他の蛍光性タンパク（例えばF64L−GFP）でラベルする
ことによって、細胞内タンパクの特定の細胞小器官への
移動を可視化することができる。但し、ここで両者の蛍
光性タンパクは異なった波長の光を放出する。ものとす
る。次いで、特定の細胞小器官内での蛍光性タンパクの
スペクトル変化として、その移動を検出することができ
る。
可視化できる。問題のタンパクを一つの蛍光性タンパク
（例えばF64L−Y66H−GFP）に融合させ、細胞小器官を
他の蛍光性タンパク（例えばF64L−GFP）でラベルする
ことによって、細胞内タンパクの特定の細胞小器官への
移動を可視化することができる。但し、ここで両者の蛍
光性タンパクは異なった波長の光を放出する。ものとす
る。次いで、特定の細胞小器官内での蛍光性タンパクの
スペクトル変化として、その移動を検出することができ
る。
分泌マーカーとしての使用。当該新規タンパクをシグ
ナルペプチドまたは分泌されるべきペプチドに融合させ
ることによって、分泌は、生きた細胞内においてオンラ
インで追跡され得る。そのための前提条件は、検出可能
な数の新規蛍光性タンパク分子の成熟が、分泌よりも迅
速に起きることである。
ナルペプチドまたは分泌されるべきペプチドに融合させ
ることによって、分泌は、生きた細胞内においてオンラ
インで追跡され得る。そのための前提条件は、検出可能
な数の新規蛍光性タンパク分子の成熟が、分泌よりも迅
速に起きることである。
従来技術の蛍光性タンパクGFPまたはY66H−GFPの場合
は、そうではないように思える。
は、そうではないように思える。
トランスジェニック動物における遺伝子レポータまた
はタンパク質の標識としての使用。本発明の新規タンパ
クの強い蛍光に起因して、信号／ノイズ比が顕著に改善
されるから、該タンパクはタンパクおよび遺伝子発現の
ための標識として適している。
はタンパク質の標識としての使用。本発明の新規タンパ
クの強い蛍光に起因して、信号／ノイズ比が顕著に改善
されるから、該タンパクはタンパクおよび遺伝子発現の
ための標識として適している。
細胞または細胞小器官の完全性マーカー。二つの当該
新規タンパク（一方は細胞小器官に向けられ、他方は細
胞質ゾル内で発現される）を同時発現させることによっ
て、細胞質ゾルタンパクの相対的な漏出を計算し、それ
を細胞の完全性の尺度として用いることが可能である。
新規タンパク（一方は細胞小器官に向けられ、他方は細
胞質ゾル内で発現される）を同時発現させることによっ
て、細胞質ゾルタンパクの相対的な漏出を計算し、それ
を細胞の完全性の尺度として用いることが可能である。
細胞形態学的変化のためのマーカーとしての使用。当
該新規タンパク類の細胞内での発現によって、細胞毒剤
またはアポトーシスによって生じる細胞形態学的変化
（例えば水泡、気泡）の容易な検出を可能にする。この
ような形態学的変化は、蛍光プローブを使用せずに、完
全な細胞中で可視化することは困難である。
該新規タンパク類の細胞内での発現によって、細胞毒剤
またはアポトーシスによって生じる細胞形態学的変化
（例えば水泡、気泡）の容易な検出を可能にする。この
ような形態学的変化は、蛍光プローブを使用せずに、完
全な細胞中で可視化することは困難である。
トランスフェクションマーカー、並びにFACS分類と組
み合わせて用いるマーカーとしての使用。当該新規タン
パクの輝度が増大することに起因して、細胞検出および
分類の質を顕著に改善することができる。
み合わせて用いるマーカーとしての使用。当該新規タン
パクの輝度が増大することに起因して、細胞検出および
分類の質を顕著に改善することができる。
当該新規タンパク類の比率リアルタイムでのキナーゼ
プローブ（ratio real−time kinase probe）としての
使用。これは、例えばリン酸化に際してより多くの光を
放出するF64L−GFP（またはF64L−Y66H−GFP）と、リン
酸化に際してより少ない光を放出するF64L−Y66H−GFP
との同時発現による。二つの強度の比率によって、一つ
のプローブだけの場合よりも、キナーゼ活性がより正確
に解明されるであろう。
プローブ（ratio real−time kinase probe）としての
使用。これは、例えばリン酸化に際してより多くの光を
放出するF64L−GFP（またはF64L−Y66H−GFP）と、リン
酸化に際してより少ない光を放出するF64L−Y66H−GFP
との同時発現による。二つの強度の比率によって、一つ
のプローブだけの場合よりも、キナーゼ活性がより正確
に解明されるであろう。
生理学的濃度の近傍で作用するリアルタイムプローブ
としての使用。当該新規なタンパク類は約37℃において
野生型GFPおよび従来の誘導体よりも顕著に輝度が高い
から、可視化のために必要な濃度を下げることができ
る。従って、当該新規タンパク質（例えばF64L−Y66H−
GFPまたはF64L−GFP）の中に組み入れられる酵素の標的
部位は、生きた細胞内における低い濃度で細胞中に存在
させることができる。このことは、（１）研究すべき細
胞内プロセスのプローブによる妨害は、可能な限り少な
くしなければならない；および（２）翻訳および転写の
機構のストレスは最小限にしなければならないという二
つの理由で重要である。
としての使用。当該新規なタンパク類は約37℃において
野生型GFPおよび従来の誘導体よりも顕著に輝度が高い
から、可視化のために必要な濃度を下げることができ
る。従って、当該新規タンパク質（例えばF64L−Y66H−
GFPまたはF64L−GFP）の中に組み入れられる酵素の標的
部位は、生きた細胞内における低い濃度で細胞中に存在
させることができる。このことは、（１）研究すべき細
胞内プロセスのプローブによる妨害は、可能な限り少な
くしなければならない；および（２）翻訳および転写の
機構のストレスは最小限にしなければならないという二
つの理由で重要である。
当該新規タンパク類は、エネルギー移動に基づくリア
ルタイムプローブとして使用することができる。例え
ば、F64L−Y66H−GFPからF64L−GFPへのエネルギーに基
づくプローブ系である。
ルタイムプローブとして使用することができる。例え
ば、F64L−Y66H−GFPからF64L−GFPへのエネルギーに基
づくプローブ系である。
当該新規タンパク類は、真菌のような生物の生きたバ
イオマス／死んだバイオマスをモニターするためのレポ
ータとして使用することができる。F64L−Y66H−GFPま
たはF64L−GFPの真菌中での発現によって、生存してい
るバイオマスはライトアップされるであろう。
イオマス／死んだバイオマスをモニターするためのレポ
ータとして使用することができる。F64L−Y66H−GFPま
たはF64L−GFPの真菌中での発現によって、生存してい
るバイオマスはライトアップされるであろう。
当該新規タンパク類を転写融合および翻訳融合におけ
るマーカーに用いて、トランスポゾンベクター突然変異
を起こすことができる。
るマーカーに用いて、トランスポゾンベクター突然変異
を起こすことができる。
当該新規タンパク類をコードする微生物中で使用すべ
きトランスポゾン。このトランスポゾンは、翻訳融合お
よび転写融合のために構築され得る。プロモータについ
てスクリーニングするために使用される。
きトランスポゾン。このトランスポゾンは、翻訳融合お
よび転写融合のために構築され得る。プロモータについ
てスクリーニングするために使用される。
F64L−Y66H−GFPまたはF64L−GFPのような本発明の新
規タンパク類をコードするトランスポゾンベクターは、
プラスミド類および染色体類の標識するために使用する
ことができる。
規タンパク類をコードするトランスポゾンベクターは、
プラスミド類および染色体類の標識するために使用する
ことができる。
当該新規タンパク類の使用は、２以上のパラメータを
生きた細胞内で追跡できるから、複合プラスミドの転移
の研究を可能にする。このプラスミドはF64L−Y66H−GF
PまたはF64L−GFPによって標識し、ドナー／レシピエン
トの染色体はF64L−Y66H−GFPまたはF64L−GFPによって
標識すればよい。
生きた細胞内で追跡できるから、複合プラスミドの転移
の研究を可能にする。このプラスミドはF64L−Y66H−GF
PまたはF64L−GFPによって標識し、ドナー／レシピエン
トの染色体はF64L−Y66H−GFPまたはF64L−GFPによって
標識すればよい。
当該新規タンパクをバクテリオファージのゲノムに導
入することによる、バクテリア検出用のレポータとして
の使用。
入することによる、バクテリア検出用のレポータとして
の使用。
当該新規タンパク、例えばF64L−Y66H−GFPまたはF64
L−GFPをファージのゲノムに組み込むことによって、診
断用のツールを設計することができる。F64L−Y66H−GF
PまたはF64L−GFPは、このゲノムを生きた宿主の中にト
ランスフェクトした際にのみ発現されるであろう。宿主
特異性はバクテリオファージによって定義される。
L−GFPをファージのゲノムに組み込むことによって、診
断用のツールを設計することができる。F64L−Y66H−GF
PまたはF64L−GFPは、このゲノムを生きた宿主の中にト
ランスフェクトした際にのみ発現されるであろう。宿主
特異性はバクテリオファージによって定義される。
ここに記載した何れかの特徴または特徴の組合せは、
本発明に本質的なものとみなされる。
本発明に本質的なものとみなされる。
本発明の好ましい態様において、新規な蛍光性タンパ
クは、GFPまたは青色変種Y66H−GFPのF64L変異体であ
り、該変異体は増大した蛍光強度を示す。アエクオレア
・ビクトリア由来の緑色GFPをコードする遺伝子の好ま
しい配列は、図２に開示されている。図２は、野生型GF
Pのヌクレオチド配列（Hind3−EcoR1フラグメント）お
よびアミノ酸配列を示しており、ここで開始コドンATG
は該ヌクレオチド配列の位置８に対応しており、停止コ
ドンTAAは位置722に対応している。図２に示すDNA配列
をもった微生物E.coli NN049087は、特許手続きのため
に、ブダペスト条約に従って、ドイツ連邦共和国ブラウ
ンシュバイッヒ（Braunschweig）Ｄ−38124マッシェロ
ーダーベルグ1bのドイツ微生物および細胞培養収集館Gm
bHに寄託番号DSM10260の下に寄託された。この遺伝子の
他のアイソタイプの配列は、文献（Prasher et al.,Gen
e 111,1992,pp.229−233）に開示されている（ジーンバ
ンク受付番号M62653）。加えて、当該新規蛍光性タンパ
クは、他の蛍光性タンパク、例えばウミシイタケ（Rani
lla reniformis）の蛍光性タンパクから誘導してもよ
い。
クは、GFPまたは青色変種Y66H−GFPのF64L変異体であ
り、該変異体は増大した蛍光強度を示す。アエクオレア
・ビクトリア由来の緑色GFPをコードする遺伝子の好ま
しい配列は、図２に開示されている。図２は、野生型GF
Pのヌクレオチド配列（Hind3−EcoR1フラグメント）お
よびアミノ酸配列を示しており、ここで開始コドンATG
は該ヌクレオチド配列の位置８に対応しており、停止コ
ドンTAAは位置722に対応している。図２に示すDNA配列
をもった微生物E.coli NN049087は、特許手続きのため
に、ブダペスト条約に従って、ドイツ連邦共和国ブラウ
ンシュバイッヒ（Braunschweig）Ｄ−38124マッシェロ
ーダーベルグ1bのドイツ微生物および細胞培養収集館Gm
bHに寄託番号DSM10260の下に寄託された。この遺伝子の
他のアイソタイプの配列は、文献（Prasher et al.,Gen
e 111,1992,pp.229−233）に開示されている（ジーンバ
ンク受付番号M62653）。加えて、当該新規蛍光性タンパ
クは、他の蛍光性タンパク、例えばウミシイタケ（Rani
lla reniformis）の蛍光性タンパクから誘導してもよ
い。
ここで、アミノ酸について用いられる略号は、J.Bio
l.Chem.243（1968）,3558に述べられている。
l.Chem.243（1968）,3558に述べられている。
新規な蛍光性タンパクをコードする本発明のDNA構築
物は、確立された標準的方法、例えばビューケージ（Be
aucage）およびカルザーズ（Caruthers）によって記載
されたホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters22（1
981）,1859−1869）、またはマッテス等（Matthes et a
l.）によって記載された方法（EMBO Journal 3（198
4）,801−805により、合成によって製造すればよい。ホ
スホアミダイト法に従えば、オリゴヌクレオチドが例え
ばDNA合成器で合成され、精製され、アニールされ、ラ
イゲートされて、適切なベクターにクローン化される。
物は、確立された標準的方法、例えばビューケージ（Be
aucage）およびカルザーズ（Caruthers）によって記載
されたホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters22（1
981）,1859−1869）、またはマッテス等（Matthes et a
l.）によって記載された方法（EMBO Journal 3（198
4）,801−805により、合成によって製造すればよい。ホ
スホアミダイト法に従えば、オリゴヌクレオチドが例え
ばDNA合成器で合成され、精製され、アニールされ、ラ
イゲートされて、適切なベクターにクローン化される。
DNA構築物はまた、例えば米国特許第4,683,202号また
は文献（Saiki et al.,Science 239（1988）,487−49
1）に記載されたように、特異的プライマーを用いたポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）により製造してもよい。PCR
法のより詳細な総説は、「PCRプロトコール」（PCR Pro
tocols,1990,Academic Press,San Diego,California,US
A）に見られる。
は文献（Saiki et al.,Science 239（1988）,487−49
1）に記載されたように、特異的プライマーを用いたポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）により製造してもよい。PCR
法のより詳細な総説は、「PCRプロトコール」（PCR Pro
tocols,1990,Academic Press,San Diego,California,US
A）に見られる。
本発明のDNA構築物は組換えベクターの中に挿入され
得るが、このベクターは、組換えDNA法の適用に便利な
如何なるベクターであってもよい。ベクターの選択は、
それが導入される宿主細胞に依存する。こうして、ベク
ターは自立的に複製するベクター、即ち、その複製が染
色体の複製に依存しない染色体の外に存在するベクタ
ー、例えばプラスミドであり得る。或いは、該ベクター
は、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組
み込まれて、それが組み込まれた染色体と共に複製され
るものであってもよい。
得るが、このベクターは、組換えDNA法の適用に便利な
如何なるベクターであってもよい。ベクターの選択は、
それが導入される宿主細胞に依存する。こうして、ベク
ターは自立的に複製するベクター、即ち、その複製が染
色体の複製に依存しない染色体の外に存在するベクタ
ー、例えばプラスミドであり得る。或いは、該ベクター
は、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組
み込まれて、それが組み込まれた染色体と共に複製され
るものであってもよい。
好ましくは、上記ベクターは発現ベクターであり、該
ベクターにおいては、本発明の蛍光性タンパクをコード
するDNA配列が、該DNAの転写に必要な追加要素に対して
機能的に連結されている。一般に、発現ベクターはプラ
スミドまたはウイルスDNAから誘導され、または両方の
要素を含んでいてもよい。「機能的に連結された」の用
語は、これらの部分が意図した目的で正しく機能するよ
うに配置されること、例えば、転写がプロモータで開始
して、本発明の蛍光性タンパクをコードするDNA配列の
全体に亘って進行するように配置されることを意味す
る。
ベクターにおいては、本発明の蛍光性タンパクをコード
するDNA配列が、該DNAの転写に必要な追加要素に対して
機能的に連結されている。一般に、発現ベクターはプラ
スミドまたはウイルスDNAから誘導され、または両方の
要素を含んでいてもよい。「機能的に連結された」の用
語は、これらの部分が意図した目的で正しく機能するよ
うに配置されること、例えば、転写がプロモータで開始
して、本発明の蛍光性タンパクをコードするDNA配列の
全体に亘って進行するように配置されることを意味す
る。
プロモータは、選択した宿主細胞における転写活性を
示すDNA配列であってもよく、また該宿主細胞に対して
同種または異種のタンパクをコードする遺伝子（天然の
アエクオレアGFP遺伝子を含む）から誘導されてもよ
い。
示すDNA配列であってもよく、また該宿主細胞に対して
同種または異種のタンパクをコードする遺伝子（天然の
アエクオレアGFP遺伝子を含む）から誘導されてもよ
い。
哺乳類細胞において本発明の蛍光性タンパクをコード
するDNA配列の転写を指令する適切なプロモータの例
は、SV40プロモータ（Subramani et al.,Mol.Cell Bio
l.1（1981）,854−864）、MT−１（メタロチオネイン遺
伝子）プロモータ（Palmiter et al.,Science 222（198
3）,809−814）またはアデノウイルス２主後期プロモー
タである。
するDNA配列の転写を指令する適切なプロモータの例
は、SV40プロモータ（Subramani et al.,Mol.Cell Bio
l.1（1981）,854−864）、MT−１（メタロチオネイン遺
伝子）プロモータ（Palmiter et al.,Science 222（198
3）,809−814）またはアデノウイルス２主後期プロモー
タである。
昆虫細胞で使用するための適切なプロモータの例は、
ポリヘドリンプロモータ（米国特許第4,745,051号;Vasu
vedan et al.,FEBS Lett.311,（1992）７−11）、P10プ
ロモータ（J.M.Vlak et al.,J.Gen.Viroloigy 69,1988,
pp.765−776）、オートグラファ・カリホルニカ・ポリ
ヘドロシス塩基性タンパクプロモータ（Autographa cal
ifornica polyhedrosis virus basic protein promote
r）（EP 397 485）、バキュウロウイルス即時型初期遺
伝子１プロモータ（米国特許第5,155,037号；米国特許
第5,162,222号）、またはバキュウロウイルス39K遅延型
初期遺伝子プロモータ（米国特許第5,155,037号；米国
特許第5,162,222号）である。
ポリヘドリンプロモータ（米国特許第4,745,051号;Vasu
vedan et al.,FEBS Lett.311,（1992）７−11）、P10プ
ロモータ（J.M.Vlak et al.,J.Gen.Viroloigy 69,1988,
pp.765−776）、オートグラファ・カリホルニカ・ポリ
ヘドロシス塩基性タンパクプロモータ（Autographa cal
ifornica polyhedrosis virus basic protein promote
r）（EP 397 485）、バキュウロウイルス即時型初期遺
伝子１プロモータ（米国特許第5,155,037号；米国特許
第5,162,222号）、またはバキュウロウイルス39K遅延型
初期遺伝子プロモータ（米国特許第5,155,037号；米国
特許第5,162,222号）である。
酵母宿主細胞で使用するための適切なプロモータの例
には、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ（Hitzeman e
t al.,J.Biol.Chem.255（1989）,12073−12080;Alber a
nd Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1（1982）,419−434）ま
たはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ（Yo
ung et al.,in Genetic Engineeing of Microorganisms
for Chemicals;Hollaender et al,eds.,Plenum Press,
New York,1982）またはTPI1プロモータ（米国特許第4,5
99,311号）若しくはADH2−4c（Russell et al.,Nature
304（1983）,652−654）プロモータが含まれる。
には、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ（Hitzeman e
t al.,J.Biol.Chem.255（1989）,12073−12080;Alber a
nd Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1（1982）,419−434）ま
たはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ（Yo
ung et al.,in Genetic Engineeing of Microorganisms
for Chemicals;Hollaender et al,eds.,Plenum Press,
New York,1982）またはTPI1プロモータ（米国特許第4,5
99,311号）若しくはADH2−4c（Russell et al.,Nature
304（1983）,652−654）プロモータが含まれる。
糸状菌宿主細胞で使用するための適切なプロモータの
例は、例えば、ADH3プロモータ（McKnight et al.,The
EMBO J.4（1985）,2093−2099）またはtpiAプロモータ
である。他の有用なプロモータの例は、A.オリザエTAKA
アミラーゼ（A.oryzae TAKA amylase）、リゾムコル・
ミエヘイ・アスパラギン酸プロティナーゼ（Hhizomucor
miehei aspartic proteinase）、A.ニガー中性αアミ
ラーゼ（A.neger neutral α−amylase）、A.ニガー酸
安定型αアミラーゼ（A.niger acid stable α−amylas
e）・グルコアミラーゼ若しくはA.アワモリ・グルコア
ミラーゼ（gluA）、リゾムコル・ミエヘイ・リパーゼ、
A.オリザエ・アルカリプロテアーゼ、A.オリザエ・トリ
オースリン酸イソメラーゼ、またはA.ニデュランス・ア
セタミダーゼをコードする遺伝子から誘導されたもので
ある。好ましいのは、TAKAアミラーゼプロモータおよび
gluAプロモータである。
例は、例えば、ADH3プロモータ（McKnight et al.,The
EMBO J.4（1985）,2093−2099）またはtpiAプロモータ
である。他の有用なプロモータの例は、A.オリザエTAKA
アミラーゼ（A.oryzae TAKA amylase）、リゾムコル・
ミエヘイ・アスパラギン酸プロティナーゼ（Hhizomucor
miehei aspartic proteinase）、A.ニガー中性αアミ
ラーゼ（A.neger neutral α−amylase）、A.ニガー酸
安定型αアミラーゼ（A.niger acid stable α−amylas
e）・グルコアミラーゼ若しくはA.アワモリ・グルコア
ミラーゼ（gluA）、リゾムコル・ミエヘイ・リパーゼ、
A.オリザエ・アルカリプロテアーゼ、A.オリザエ・トリ
オースリン酸イソメラーゼ、またはA.ニデュランス・ア
セタミダーゼをコードする遺伝子から誘導されたもので
ある。好ましいのは、TAKAアミラーゼプロモータおよび
gluAプロモータである。
バクテリア宿主細胞での使用に適したプロモータに
は、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニ
ック・アミラーゼ遺伝子（Bacillus stearothermophilu
s maltogenic amylase gene）、バチルス・リケニホル
ミスαアミラーゼ遺伝子（Bacillus licheniformis alp
ha−amylase gene）、バチルス・アミロリケファチエン
ス・BANアミラーゼ遺伝子（Bacillus amyloliquefacien
s BAN amylase gene）、バチルス・サブチリス・アルカ
リプロテアーゼ遺伝子（Bacillus Subtilis alkaline p
rotease gene）もしくはバチルス・プミルス・キシロシ
ダーゼ遺伝子（Bacillus pumilus xylosidase gene）の
プロモータ、またはファージ・ラムダのPR若しくはPLプ
ロモータ、大腸菌のlac、trp若しくはtacプロモータが
含まれる。
は、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニ
ック・アミラーゼ遺伝子（Bacillus stearothermophilu
s maltogenic amylase gene）、バチルス・リケニホル
ミスαアミラーゼ遺伝子（Bacillus licheniformis alp
ha−amylase gene）、バチルス・アミロリケファチエン
ス・BANアミラーゼ遺伝子（Bacillus amyloliquefacien
s BAN amylase gene）、バチルス・サブチリス・アルカ
リプロテアーゼ遺伝子（Bacillus Subtilis alkaline p
rotease gene）もしくはバチルス・プミルス・キシロシ
ダーゼ遺伝子（Bacillus pumilus xylosidase gene）の
プロモータ、またはファージ・ラムダのPR若しくはPLプ
ロモータ、大腸菌のlac、trp若しくはtacプロモータが
含まれる。
また、本発明の新規蛍光性タンパクをコードするDNA
配列は、必要であれば、例えばヒト成長ホルモンターミ
ネータ（Palmiter et al.,op.cit.）、または真菌宿主
についてはTPI1ターミネータ（Alber and Kawasaki,op.
cit.）若しくはADH3ターミネータ（McKnight et al.,o
p.cit.）のような適切なターミネータに機能的に結合さ
れてもよい。当該ベクターは更に、ポリアデニレーショ
ン信号（例えばSV40またはアデノウイルス5Elb領域由来
のもの）、転写エンハンサ配列（例えばSV40エンハン
サ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス
VA RNAをコードするもの）のような要素を具備してもよ
い。
配列は、必要であれば、例えばヒト成長ホルモンターミ
ネータ（Palmiter et al.,op.cit.）、または真菌宿主
についてはTPI1ターミネータ（Alber and Kawasaki,op.
cit.）若しくはADH3ターミネータ（McKnight et al.,o
p.cit.）のような適切なターミネータに機能的に結合さ
れてもよい。当該ベクターは更に、ポリアデニレーショ
ン信号（例えばSV40またはアデノウイルス5Elb領域由来
のもの）、転写エンハンサ配列（例えばSV40エンハン
サ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス
VA RNAをコードするもの）のような要素を具備してもよ
い。
当該組換えベクターは更に、該ベクターが問題の宿主
細胞内で複製することを可能にするDNA配列を具備して
もよい。このような配列の一例（宿主細胞が哺乳類細胞
のとき）は、SV40複製起点である。
細胞内で複製することを可能にするDNA配列を具備して
もよい。このような配列の一例（宿主細胞が哺乳類細胞
のとき）は、SV40複製起点である。
宿主細胞が酵母細胞であるとき、当該ベクターの複製
を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺
伝子REP1−３および複製起点である。
を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺
伝子REP1−３および複製起点である。
当該ベクターはまた、選別マーカー、例えば、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはシゾサッカロマイセ
ス・ポンベTPI遺伝子（Schizosaccharomyces pombe pom
be TPI geme）（P.R.Russell,Gene 40,1985,pp.125−13
0に記載されたもの）のように、その補体が宿主細胞に
欠けている遺伝子産物、または例えばアンピシリン、カ
ナマイシン、テトラサイクリン、クロラルフェニコー
ル、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤
に対する耐性を与える遺伝子産物を具備していてもよ
い。糸状菌については、選別マーカーにはamdS、pyrG、
argB、niaD、sCが含まれる。
ロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはシゾサッカロマイセ
ス・ポンベTPI遺伝子（Schizosaccharomyces pombe pom
be TPI geme）（P.R.Russell,Gene 40,1985,pp.125−13
0に記載されたもの）のように、その補体が宿主細胞に
欠けている遺伝子産物、または例えばアンピシリン、カ
ナマイシン、テトラサイクリン、クロラルフェニコー
ル、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤
に対する耐性を与える遺伝子産物を具備していてもよ
い。糸状菌については、選別マーカーにはamdS、pyrG、
argB、niaD、sCが含まれる。
本発明の蛍光性タンパクをコードするDNA配列、プロ
モータ、および任意にターミネータおよび／または分泌
シグナル配列をそれぞれライゲートし、これらを複製の
ための必要な情報を含んだ適切なベクターに挿入するた
めに用いられる方法は、当業者に周知である（例えば、
Sambrook et al.,op.cit.）。
モータ、および任意にターミネータおよび／または分泌
シグナル配列をそれぞれライゲートし、これらを複製の
ための必要な情報を含んだ適切なベクターに挿入するた
めに用いられる方法は、当業者に周知である（例えば、
Sambrook et al.,op.cit.）。
本発明のDNA構築物または組換えベクター宿を導入さ
れる宿主細胞は、本発明のDNA構築物を発現できる如何
なる細胞であってもよく、バクテリア、酵母、真菌およ
び高等真核細胞が含まれる。
れる宿主細胞は、本発明のDNA構築物を発現できる如何
なる細胞であってもよく、バクテリア、酵母、真菌およ
び高等真核細胞が含まれる。
培養に際して本発明のDNA構築物を発現できるバクテ
リア宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばバチルス株
（例えばB.subtilis、B.licheniformis、B.lentus、b.b
revis、B.stearothermophilus、B.alkalophilus、B.amy
loliquefaciens、B.coagulans、B.circulans、B.lautu
s、B.megatheriumまたはB.thuringiensis）またはスト
レプトマイセス株（S.lividansまたはS.murinus）、或
いは大腸菌のようなグラム陰性菌である。これらバクテ
リアの形質転換は、プロトプラスト形質転換によって、
またはそれ自体公知の方法でコンピテント細胞を用いる
ことにより行なえばよい（Sambrook et al.,supra）。
リア宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばバチルス株
（例えばB.subtilis、B.licheniformis、B.lentus、b.b
revis、B.stearothermophilus、B.alkalophilus、B.amy
loliquefaciens、B.coagulans、B.circulans、B.lautu
s、B.megatheriumまたはB.thuringiensis）またはスト
レプトマイセス株（S.lividansまたはS.murinus）、或
いは大腸菌のようなグラム陰性菌である。これらバクテ
リアの形質転換は、プロトプラスト形質転換によって、
またはそれ自体公知の方法でコンピテント細胞を用いる
ことにより行なえばよい（Sambrook et al.,supra）。
適切な哺乳類細胞の例は、HEK293およびHeLa細胞株、
一次細胞、およびCOS細胞株（例えばATCC CRL 1650）、
BHK細胞株（例えばATCC CRL 1632、ATCC CCL 10）、CHL
細胞株（例えばATCC CCL39）またはCHO細胞株（例えばA
TCC CCL 61）である。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞
に導入されたDNA配列を発現させる方法は、文献［例え
ばKaufman and Sharp,J.Mol.Biol.159（1982）,601−62
1;Southern and Berg,J.Mol.Appl.Genet.1（1982）,327
−341;Loyter et al.,Cell 14（1978）,725;Corsaro an
d Pearson,Somatic Cell Genetics 7（1981）,603;Grah
am and van der Eb,Virology 52（1973）,456;およびNe
umann et al.,EMBO J.1（1982）,841−845］に記載され
ている。
一次細胞、およびCOS細胞株（例えばATCC CRL 1650）、
BHK細胞株（例えばATCC CRL 1632、ATCC CCL 10）、CHL
細胞株（例えばATCC CCL39）またはCHO細胞株（例えばA
TCC CCL 61）である。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞
に導入されたDNA配列を発現させる方法は、文献［例え
ばKaufman and Sharp,J.Mol.Biol.159（1982）,601−62
1;Southern and Berg,J.Mol.Appl.Genet.1（1982）,327
−341;Loyter et al.,Cell 14（1978）,725;Corsaro an
d Pearson,Somatic Cell Genetics 7（1981）,603;Grah
am and van der Eb,Virology 52（1973）,456;およびNe
umann et al.,EMBO J.1（1982）,841−845］に記載され
ている。
適切な酵母細胞の例には、サッカロマイセスspp.また
はシゾサッカロマイセスspp.、特に、サッカロマイセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッ
カロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）
の株が含まれる。酵母細胞を異種DNAで形質転換して、
該形質転換細胞から異種ポリペプチドを製造する方法
は、例えば、米国特許第4,599,311号、同第4,931,373
号、同第4,870,008号、同第5,037,743号、および同第4,
854,075号に記載されており、これら全ての特許はここ
での引用によって本願明細書に組み込まれる。形質転換
細胞は、選別マーカーによって決定されるフェノタイ
プ、共通の薬剤耐性、または特定の栄養素（例えばロイ
シン）なしで増殖する能力によって選別される。酵母で
使用するための好ましいベクターは、米国特許第4,931,
373号に開示されたPOT1ベクターである。本発明の蛍光
性タンパクをコードするDNA配列の前には、例えば上記
のようにシグナル配列および任意にリーダー配列が存在
している。適切な酵母細胞の更なる例は、クルイベロマ
イセスの株（例えばK.lactis）、ハンセヌラ（Hansenul
a）の株（例えばH.polymorpha）、またはピキア（Pichi
a）の株（例えばP.pastoris）である［Gleeson et al.,
J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459−3465;米国特許第
4,882,279号を参照されたい］。
はシゾサッカロマイセスspp.、特に、サッカロマイセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッ
カロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）
の株が含まれる。酵母細胞を異種DNAで形質転換して、
該形質転換細胞から異種ポリペプチドを製造する方法
は、例えば、米国特許第4,599,311号、同第4,931,373
号、同第4,870,008号、同第5,037,743号、および同第4,
854,075号に記載されており、これら全ての特許はここ
での引用によって本願明細書に組み込まれる。形質転換
細胞は、選別マーカーによって決定されるフェノタイ
プ、共通の薬剤耐性、または特定の栄養素（例えばロイ
シン）なしで増殖する能力によって選別される。酵母で
使用するための好ましいベクターは、米国特許第4,931,
373号に開示されたPOT1ベクターである。本発明の蛍光
性タンパクをコードするDNA配列の前には、例えば上記
のようにシグナル配列および任意にリーダー配列が存在
している。適切な酵母細胞の更なる例は、クルイベロマ
イセスの株（例えばK.lactis）、ハンセヌラ（Hansenul
a）の株（例えばH.polymorpha）、またはピキア（Pichi
a）の株（例えばP.pastoris）である［Gleeson et al.,
J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459−3465;米国特許第
4,882,279号を参照されたい］。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス
spp.、ニューロスポラspp.、フザリウムspp.、またはト
リコデルマspp.の細胞であり、特にA.オリザエ、A.ニデ
ュラスまたはA.ニガーである。タンパクの発現のための
アスペルギルスspp.の使用は、例えばEP 272 277、EP 2
30 223、EP 184 438に記載されている。
spp.、ニューロスポラspp.、フザリウムspp.、またはト
リコデルマspp.の細胞であり、特にA.オリザエ、A.ニデ
ュラスまたはA.ニガーである。タンパクの発現のための
アスペルギルスspp.の使用は、例えばEP 272 277、EP 2
30 223、EP 184 438に記載されている。
宿主細胞として糸状菌が用いられるとき、それは、該
DNA構築部を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を
得ることにより、適宜本発明のDNA構築物で形質転換さ
れる。DNA配列は細胞内で安定に保持される傾向にある
ので、この組み込みは一般には有利とみなされる。該DN
A構築物の宿主染色体への組み込みは、従来の方法に従
い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行なえば
よい。昆虫細胞の形質転換およびその中での異種ポリペ
プチドの産生は、米国特許第4,745,051号、同第4,879,2
36号、同第5,155,037号、5,162,222号、EP 397,485号に
記載されているようにして行えばよく、これら特許は全
て、ここでの引用により本明細書に組み込まれる。宿主
として用いられる昆虫細胞株は、適切にはレピドプテラ
細胞株（Lepidoptera cell line）、例えばスポドプテ
ラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞また
はトリコプルシア・ニー（Trichoplusia ni）細胞（米
国特許第5,077,214号）である。培養条件は、適切に
は、例えばWO89/01029またはWO89/01028または上記参照
文献の何れかに記載されているものである。
DNA構築部を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を
得ることにより、適宜本発明のDNA構築物で形質転換さ
れる。DNA配列は細胞内で安定に保持される傾向にある
ので、この組み込みは一般には有利とみなされる。該DN
A構築物の宿主染色体への組み込みは、従来の方法に従
い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行なえば
よい。昆虫細胞の形質転換およびその中での異種ポリペ
プチドの産生は、米国特許第4,745,051号、同第4,879,2
36号、同第5,155,037号、5,162,222号、EP 397,485号に
記載されているようにして行えばよく、これら特許は全
て、ここでの引用により本明細書に組み込まれる。宿主
として用いられる昆虫細胞株は、適切にはレピドプテラ
細胞株（Lepidoptera cell line）、例えばスポドプテ
ラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞また
はトリコプルシア・ニー（Trichoplusia ni）細胞（米
国特許第5,077,214号）である。培養条件は、適切に
は、例えばWO89/01029またはWO89/01028または上記参照
文献の何れかに記載されているものである。
次いで、上記の形質転換またはトランスフェクトされ
た宿主細胞は、当該DNA構築物の発現を可能にする条件
下に適切な栄養培地中で培養された後、本発明のスクリ
ーニング方法に用いればよい。或いは、細胞を破壊した
後に、細胞抽出物および／または上清の蛍光を分析すれ
ばよい。
た宿主細胞は、当該DNA構築物の発現を可能にする条件
下に適切な栄養培地中で培養された後、本発明のスクリ
ーニング方法に用いればよい。或いは、細胞を破壊した
後に、細胞抽出物および／または上清の蛍光を分析すれ
ばよい。
細胞を培養するのに用いる培地は、適切な追加成分を
含有する最小培地または複合培地のような、上記宿主細
胞の増殖に適した如何なる慣用培地であってもよい。適
切な培地は商業的供給業者から入手可能であり、或いは
公表されたレシピ（例えばアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションのカタログ）に従って調製すること
が可能である。
含有する最小培地または複合培地のような、上記宿主細
胞の増殖に適した如何なる慣用培地であってもよい。適
切な培地は商業的供給業者から入手可能であり、或いは
公表されたレシピ（例えばアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションのカタログ）に従って調製すること
が可能である。
本発明の方法においては、本発明のDNA構築物で形質
転換またはトランスフェクトされた細胞を分光光度計ま
たは蛍光顕微鏡で適切に測定し、光励起および光放出の
走査として、液体培養中の細胞のスペクトル特性を決定
することができる。
転換またはトランスフェクトされた細胞を分光光度計ま
たは蛍光顕微鏡で適切に測定し、光励起および光放出の
走査として、液体培養中の細胞のスペクトル特性を決定
することができる。
以下、添付の図面を参照し、実施例に従って本発明を
更に詳細に説明する。
更に詳細に説明する。
実施例１
GFPをコードしているcDNAのクローニング
即ち、A.ビクトリアから単離された全RNAが、標準法
（Sambrook et al.,Molecular Cloning 2,eds（1989）
（Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring
Harbor,New York）,7.19−7.22）により、メーカー提示
によるAMV逆転写酵素（Promega,Madison,WI,USA）を使
用してcDNAに変換された。次に、該cDNAは、先般公表さ
れたGFP配列（Prasher et al.,Gene 111（1992）,229−
233;GenBank寄託番号M62653）を基に設計されたPCRプラ
イマーと、UlTmaTMポリメラーゼ（Perkin Elmer,Foster
City、CA USA）とを一緒に使用してPCR増幅された。該
プライマーの配列は:GFP2:TGGAATAAGCTTTATGAGTAAAGGAG
AAGAACTTTTおよびGP−1:AAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATT
GGAAGTCT。5'であった。（Hind III部位）および3'（Ec
oR I及びBamH I部位）プライマーに挿入された制限エン
ドヌクレース部位によって、若干修飾変更されたpUC19
ベクター中へのPCR増幅されたGFPcDNAのクローニングが
促進された。この構築の詳細は以下の通りである。LacZ
シャインダルガノAGGA、すぐ後に5'Hind III部位プラス
余剰Ｔ、及びGFP ATGコドンが続いて、LacZプロモータG
FP融合点で下記のようなDNA配列:PLacZ−AGGAAAGCTTTAT
G−GFPが提供された。GFP cDNAの3'末端には、公表され
たGFP配列（GenBank認識番号M62653）中のヌクレオチド
770に対応したベース対が、PCR生成されたBamH I、EcoR
Iリンカー領域を通じてpUC19マルチクローニング部位
（MCS）のEcoR I部位と融合された。
（Sambrook et al.,Molecular Cloning 2,eds（1989）
（Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring
Harbor,New York）,7.19−7.22）により、メーカー提示
によるAMV逆転写酵素（Promega,Madison,WI,USA）を使
用してcDNAに変換された。次に、該cDNAは、先般公表さ
れたGFP配列（Prasher et al.,Gene 111（1992）,229−
233;GenBank寄託番号M62653）を基に設計されたPCRプラ
イマーと、UlTmaTMポリメラーゼ（Perkin Elmer,Foster
City、CA USA）とを一緒に使用してPCR増幅された。該
プライマーの配列は:GFP2:TGGAATAAGCTTTATGAGTAAAGGAG
AAGAACTTTTおよびGP−1:AAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATT
GGAAGTCT。5'であった。（Hind III部位）および3'（Ec
oR I及びBamH I部位）プライマーに挿入された制限エン
ドヌクレース部位によって、若干修飾変更されたpUC19
ベクター中へのPCR増幅されたGFPcDNAのクローニングが
促進された。この構築の詳細は以下の通りである。LacZ
シャインダルガノAGGA、すぐ後に5'Hind III部位プラス
余剰Ｔ、及びGFP ATGコドンが続いて、LacZプロモータG
FP融合点で下記のようなDNA配列:PLacZ−AGGAAAGCTTTAT
G−GFPが提供された。GFP cDNAの3'末端には、公表され
たGFP配列（GenBank認識番号M62653）中のヌクレオチド
770に対応したベース対が、PCR生成されたBamH I、EcoR
Iリンカー領域を通じてpUC19マルチクローニング部位
（MCS）のEcoR I部位と融合された。
該DNA配列及びGFPの予想一次アミノ酸配列が、下記図
2aに示される。図2aに示されるものと同じアミノ酸配列
をコードしている別のDNA配列が、図2bに示される。ハ
イム（Heim）ら（1994）によって記載された青蛍光変異
物を生成するために、緑蛍光を青蛍光に変換することに
関わるY66H置換を持つPCRプライマーを、5'PCRプライマ
ーとして使用し、GFP特異的3'プライマーが組み合わさ
れた。テンプレートは、上記記載のGFPクローンであ
る。5'プライマーの配列は、5'−CTACCTGTTCCATGGCCAAC
GCTTGTCACTACTTTCCTCATGGTCTTCAATGCTTTTCTAGATACCC−
3'。その5'末端は、GFP配列中の位置164に対応する。Y6
6H置換に加えて、5'プライマーは位置223においてＡか
らＴへの置換を導入する。この変異によって、アミノ酸
を変えることなくXbal部位が創設される。該5'プライマ
ーはまた、自然に存在するNco1認識配列（GFP配列中、
位置173）を含む。3'プライマーの配列は:5'−AAGAATTC
GGATCCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCT−3'。5'末端からの位置
３は、GFP配列の3'末端に対応するEcoR I認識部位の第
一塩基である。その結果得られるPCR産物は、Nco1及びE
coR Iで消化され、Nco1−EcoR Iベクター断片中にクロ
ーンされて全Y66H−GFP遺伝子を再構築する。
2aに示される。図2aに示されるものと同じアミノ酸配列
をコードしている別のDNA配列が、図2bに示される。ハ
イム（Heim）ら（1994）によって記載された青蛍光変異
物を生成するために、緑蛍光を青蛍光に変換することに
関わるY66H置換を持つPCRプライマーを、5'PCRプライマ
ーとして使用し、GFP特異的3'プライマーが組み合わさ
れた。テンプレートは、上記記載のGFPクローンであ
る。5'プライマーの配列は、5'−CTACCTGTTCCATGGCCAAC
GCTTGTCACTACTTTCCTCATGGTCTTCAATGCTTTTCTAGATACCC−
3'。その5'末端は、GFP配列中の位置164に対応する。Y6
6H置換に加えて、5'プライマーは位置223においてＡか
らＴへの置換を導入する。この変異によって、アミノ酸
を変えることなくXbal部位が創設される。該5'プライマ
ーはまた、自然に存在するNco1認識配列（GFP配列中、
位置173）を含む。3'プライマーの配列は:5'−AAGAATTC
GGATCCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCT−3'。5'末端からの位置
３は、GFP配列の3'末端に対応するEcoR I認識部位の第
一塩基である。その結果得られるPCR産物は、Nco1及びE
coR Iで消化され、Nco1−EcoR Iベクター断片中にクロ
ーンされて全Y66H−GFP遺伝子を再構築する。
Y66H−GFHを含む発現ベクターを担持する大腸菌細胞
を一晩、1ml中に10マイクログラムのＮメチル・Ｎ・二
トロ・ニトロソグアニジン存在下で生育させた。プラス
ミドDNAを単離し、Y66H−GFPを含む764塩基対Hind3−Ec
oR I挿入物が単離され、Hind3−EcoR I消化ベクター断
片中にクローンされて、大腸菌中で該挿入物を発現させ
る。大腸菌の形質転換体は、365nm紫外光で励起され青
蛍光について検査され、野生型BFPよりも蛍光が強く現
れるコロニーを確認した。
を一晩、1ml中に10マイクログラムのＮメチル・Ｎ・二
トロ・ニトロソグアニジン存在下で生育させた。プラス
ミドDNAを単離し、Y66H−GFPを含む764塩基対Hind3−Ec
oR I挿入物が単離され、Hind3−EcoR I消化ベクター断
片中にクローンされて、大腸菌中で該挿入物を発現させ
る。大腸菌の形質転換体は、365nm紫外光で励起され青
蛍光について検査され、野生型BFPよりも蛍光が強く現
れるコロニーを確認した。
ある一つの特定コロニー由来の10ngDNAをテンプレー
トとして使用し、1.5ユニットとTaqポリメラーゼ（Perk
in Elmer）,0.1mM MnCl2,dGTP,dCTP,dTTPを各0.2mM、0.
05mMのdATP,1.7mMのMgCl2、及びメーカー提示の緩衝液
を含むPCR10反応が行われた。使用された該プライマー
は、該Y66H−GFP挿入物の側面に位置する。5'プライマ
ーの配列は、5'−AATTGGTACCAAGGAGGTAAGCTTTATGAG−
3'。これには、Hind3認識部位が含まれている。3'プラ
イマーの配列は、5'−CTTTCGTTTTGAATTCGGATCCCTTTAGTG
−3'。これにはEcoR I認識配列が含まれている。
トとして使用し、1.5ユニットとTaqポリメラーゼ（Perk
in Elmer）,0.1mM MnCl2,dGTP,dCTP,dTTPを各0.2mM、0.
05mMのdATP,1.7mMのMgCl2、及びメーカー提示の緩衝液
を含むPCR10反応が行われた。使用された該プライマー
は、該Y66H−GFP挿入物の側面に位置する。5'プライマ
ーの配列は、5'−AATTGGTACCAAGGAGGTAAGCTTTATGAG−
3'。これには、Hind3認識部位が含まれている。3'プラ
イマーの配列は、5'−CTTTCGTTTTGAATTCGGATCCCTTTAGTG
−3'。これにはEcoR I認識配列が含まれている。
PCR産物は、Hind3及びEcoR Iで消化され、Hind3−Eco
R I消化ベクター断片中にクローンされ、大腸菌形質転
換体中における挿入物の発現を可能にする。大腸菌形質
転換体は、365nm紫外光で励起されて、青蛍光について
検査された。Y66H−GFPよりも強い蛍光を現わすコロニ
ーが確認された。強蛍光を発する（BX12−1Aと呼称され
る）コロニー一つからプラスミッドDNAが単離され、Y66
H−GFP挿入物は、配列決定に供された。変異物F64Lが確
認された。この変異物は、Y66H−GFPのSHGトリペプチド
発色団配列に先行するフェニールアラニン残基をロイシ
ンで置換している。BX12−1AのY66H−GFP配列中には、
他のアミノ酸の変更はない。該DNA配列及びF64L−Y66H
−GFPの予測一次アミノ酸配列は、下記図３に示され
る。
R I消化ベクター断片中にクローンされ、大腸菌形質転
換体中における挿入物の発現を可能にする。大腸菌形質
転換体は、365nm紫外光で励起されて、青蛍光について
検査された。Y66H−GFPよりも強い蛍光を現わすコロニ
ーが確認された。強蛍光を発する（BX12−1Aと呼称され
る）コロニー一つからプラスミッドDNAが単離され、Y66
H−GFP挿入物は、配列決定に供された。変異物F64Lが確
認された。この変異物は、Y66H−GFPのSHGトリペプチド
発色団配列に先行するフェニールアラニン残基をロイシ
ンで置換している。BX12−1AのY66H−GFP配列中には、
他のアミノ酸の変更はない。該DNA配列及びF64L−Y66H
−GFPの予測一次アミノ酸配列は、下記図３に示され
る。
実施例２
F64L−GFPは、下記のように構築された。Y66H−GFPを
含む大腸菌発現ベクターは制限酵素Nco1及びXba Iで消
化されたNco1の認識配列は、下記に掲載されたF64L−Y6
6H−GFP配列中の位置173に位置し、Xba Iの認識配列は
位置221に位置している。該Nco1−Xba Iベクター大断片
は単離され、下記配列の合成Nco1−Xba I DNAリンカー
と連結された。一方のDNA鎖は配列:5'−CATGGCCAACGCTT
GTCACTACTCTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTT−3'を持ち、他方
のDNA一本鎖は、配列:5'−CTAGAAAAGCATTGAACACCATAAGA
GAGAGTAGTGACAAGCGTTGGC−3'を持つ。
含む大腸菌発現ベクターは制限酵素Nco1及びXba Iで消
化されたNco1の認識配列は、下記に掲載されたF64L−Y6
6H−GFP配列中の位置173に位置し、Xba Iの認識配列は
位置221に位置している。該Nco1−Xba Iベクター大断片
は単離され、下記配列の合成Nco1−Xba I DNAリンカー
と連結された。一方のDNA鎖は配列:5'−CATGGCCAACGCTT
GTCACTACTCTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTT−3'を持ち、他方
のDNA一本鎖は、配列:5'−CTAGAAAAGCATTGAACACCATAAGA
GAGAGTAGTGACAAGCGTTGGC−3'を持つ。
アニーリング後、該二本の鎖は、SYGに先行するF64L
置換を持つGFP発色団SYGの配列を含むNco 1−Xba I断片
を形成する。該DNA配列及びF64L−GFPを予測一次アミノ
酸配列が下記図４に示される。
置換を持つGFP発色団SYGの配列を含むNco 1−Xba I断片
を形成する。該DNA配列及びF64L−GFPを予測一次アミノ
酸配列が下記図４に示される。
S65T−GFP変異は、ハイムら（Nature vol.373,pp 663
−664,1995）によって記載されている。F64L−S65T−GF
Pは、下記のように構築された:Y66H−GFPを含む大腸菌
発現ベクターを、制限酵素Nco1及びXba Iで消化した。N
co1の認識配列は、下記に掲載されたF64L−Y66H−GFP配
列中の位置173に位置し、Xba Iの認識配列は位置221に
位置している。該Nco1−Xba Iベクター大断片は単離さ
れ、下記配列の合成Nco1−Xba I DNAリンカーと連結さ
れた。一方のDNA鎖は配列:5'−CATGGCCAACGCTTGTCACTAC
TCTCACTTATGGTGTTCAATGCTTTT−3'を持ち、他方のDNA鎖
は配列:5'−CTAGAAAAGCATTGAACACCATAAGTCAGAGTAGTGACA
AGCGTTGGC−3'を持つ。
−664,1995）によって記載されている。F64L−S65T−GF
Pは、下記のように構築された:Y66H−GFPを含む大腸菌
発現ベクターを、制限酵素Nco1及びXba Iで消化した。N
co1の認識配列は、下記に掲載されたF64L−Y66H−GFP配
列中の位置173に位置し、Xba Iの認識配列は位置221に
位置している。該Nco1−Xba Iベクター大断片は単離さ
れ、下記配列の合成Nco1−Xba I DNAリンカーと連結さ
れた。一方のDNA鎖は配列:5'−CATGGCCAACGCTTGTCACTAC
TCTCACTTATGGTGTTCAATGCTTTT−3'を持ち、他方のDNA鎖
は配列:5'−CTAGAAAAGCATTGAACACCATAAGTCAGAGTAGTGACA
AGCGTTGGC−3'を持つ。
アニーリング後、該二本の鎖は、GFP発色団中F64L及
びS65Tの変異を含むNco1−Xba I断片を形成する。該DNA
配列及びF64L−S65T−GFPの予測一次アミノ酸配列が下
記図５に示される。
びS65Tの変異を含むNco1−Xba I断片を形成する。該DNA
配列及びF64L−S65T−GFPの予測一次アミノ酸配列が下
記図５に示される。
大腸菌発現ベクターは、IPTG（イソプロピル・チオ・
ガラクトシド）誘導プロモータを含む。使用された大腸
菌菌株は、K803（Sambrokk et al.上記）のdel（lacZ）
MI5誘導体である。
ガラクトシド）誘導プロモータを含む。使用された大腸
菌菌株は、K803（Sambrokk et al.上記）のdel（lacZ）
MI5誘導体である。
pGFP−N1プラスミド（Clontech Laboratoriesから入
手可能）中に存在するGFPの対立遺伝子は、IPTGに誘導
される大腸菌発現ベクター中に下記方法によって導入さ
れた:1ng pGFP−N1プラスミドDNAをテンプレートとして
使用し、5'PCRプライマーが配列:5'−TGGAATAAGCTTTATG
AGTAAAGGAGAAGAACTTTT−3'を持ち、3'PCRプライマーが
配列:5'−GAATCGTAGATCTTTATTTGTATAGTTCATCCATG−3'を
持つ標準PCR反応を行った。
手可能）中に存在するGFPの対立遺伝子は、IPTGに誘導
される大腸菌発現ベクター中に下記方法によって導入さ
れた:1ng pGFP−N1プラスミドDNAをテンプレートとして
使用し、5'PCRプライマーが配列:5'−TGGAATAAGCTTTATG
AGTAAAGGAGAAGAACTTTT−3'を持ち、3'PCRプライマーが
配列:5'−GAATCGTAGATCTTTATTTGTATAGTTCATCCATG−3'を
持つ標準PCR反応を行った。
該プライマーは、ベクターpGFP−N1中のGFP−N1挿入
物の側面に位置する。該5'プライマーは、Hind3クロー
ニング部位によって先行されるATGk開始コドンを含む。
該3'プライマーは、Bg12クローニング部位が後に続くTA
A停止コドンを含む。
物の側面に位置する。該5'プライマーは、Hind3クロー
ニング部位によって先行されるATGk開始コドンを含む。
該3'プライマーは、Bg12クローニング部位が後に続くTA
A停止コドンを含む。
該PCR産物はHind3及びBgl2で消化され、Hind3−BamH1
で消化ベクター断片中、IPTGによって誘導可能なプロモ
ータの後方にクローンされて、IPTG存在下おいて大腸菌
における挿入物の発現を可能にする。
で消化ベクター断片中、IPTGによって誘導可能なプロモ
ータの後方にクローンされて、IPTG存在下おいて大腸菌
における挿入物の発現を可能にする。
pZeoSV−LacZプラスミド（Invitrogenから入手可能）
中に存在するLacZ遺伝子は、IPTGで誘導可能な大腸菌発
現ベクター中に下記方法によって導入される:1ngのpZeo
SV−LacZプラスミドDNAをテンプレートとして使用し、
5'PCRプライマーが配列:5'−TGGAATAAGCTTTATGGATCCCGT
CGTTTTACAACGTCGT−3'を持ち、3'PCRプライマーが配列:
5'−GCGCGAATTCTTATTATTATTTTTGACACCAGAC−3'を持つ標
準PCR反応を行った。プライマーは、ベクターpZeoSV−L
acZ中のLacZ挿入物の側面に位置する。5'プライマー
は、Hind3クローニング部位によって先行されるATG開始
コドンを含む。3'プライマーは、EcoR Iクローニング部
位が後に続くTAA停止コドンを含む。
中に存在するLacZ遺伝子は、IPTGで誘導可能な大腸菌発
現ベクター中に下記方法によって導入される:1ngのpZeo
SV−LacZプラスミドDNAをテンプレートとして使用し、
5'PCRプライマーが配列:5'−TGGAATAAGCTTTATGGATCCCGT
CGTTTTACAACGTCGT−3'を持ち、3'PCRプライマーが配列:
5'−GCGCGAATTCTTATTATTATTTTTGACACCAGAC−3'を持つ標
準PCR反応を行った。プライマーは、ベクターpZeoSV−L
acZ中のLacZ挿入物の側面に位置する。5'プライマー
は、Hind3クローニング部位によって先行されるATG開始
コドンを含む。3'プライマーは、EcoR Iクローニング部
位が後に続くTAA停止コドンを含む。
PCR産物は、Hind3及びEcoR Iで消化され、Hind3−Eco
R Iで消化ベクター断片中、IPTG誘導可能プロモータの
後方にクローンされ、IPTG存在下において大腸菌におけ
る挿入物の発現を可能にした。
R Iで消化ベクター断片中、IPTG誘導可能プロモータの
後方にクローンされ、IPTG存在下において大腸菌におけ
る挿入物の発現を可能にした。
GFP、GFP−N1、F64L−GFP、F64L−S65T−GFP、Y66H−
GFP、F64L−Y66H−GFP又はベータ・ガラクトシダーゼ
（バックグラウンドコントロールとして）発現する大腸
菌細胞中で生成される蛍光を、様々な条件下で測定し比
較するため、下記実験が行われた： IPTGによって誘導されると、様々な遺伝子産物中の一
つを発現させる発現プラスミドを含む大腸菌細胞を、ミ
リリットル中100マイクログラムのアンピシリンを含む
がIPTGは含まないLB培地中で生育させた。1mlの細胞懸
濁物中に、0.5mlの50％グリセロールを加え細胞を凍結
し、−80℃で凍結を維持した。
GFP、F64L−Y66H−GFP又はベータ・ガラクトシダーゼ
（バックグラウンドコントロールとして）発現する大腸
菌細胞中で生成される蛍光を、様々な条件下で測定し比
較するため、下記実験が行われた： IPTGによって誘導されると、様々な遺伝子産物中の一
つを発現させる発現プラスミドを含む大腸菌細胞を、ミ
リリットル中100マイクログラムのアンピシリンを含む
がIPTGは含まないLB培地中で生育させた。1mlの細胞懸
濁物中に、0.5mlの50％グリセロールを加え細胞を凍結
し、−80℃で凍結を維持した。
−80℃のグリセロール・ストックの細胞を、100μg/m
lのアンピシリンを含む2ml LB培地に播種し、37℃で６
時間曝気生育した。この播種物の２マイクロリットル
を、100μg/mlアンピシリンと1mMのIPTGを含む2mlのLB
培地を含む２本のチューブに各々移した。二本のチュー
ブセットは、二つの異なる温度・室温（22℃）及び37℃
の曝気インキュベートされた。
lのアンピシリンを含む2ml LB培地に播種し、37℃で６
時間曝気生育した。この播種物の２マイクロリットル
を、100μg/mlアンピシリンと1mMのIPTGを含む2mlのLB
培地を含む２本のチューブに各々移した。二本のチュー
ブセットは、二つの異なる温度・室温（22℃）及び37℃
の曝気インキュベートされた。
16時間後、0.2mlのサンプルをGFP、GFP−N1、F64L−G
FP、F64L−S65T−GFP、Y66H−GFP、F64L−Y66H−GFP又
はベータ・ガラクトシダーゼを発現する細胞より採取し
た。細胞をペレット化し、上澄み液を除去し、細胞を2m
lの水中に再懸濁し、キュベットに移した。
FP、F64L−S65T−GFP、Y66H−GFP、F64L−Y66H−GFP又
はベータ・ガラクトシダーゼを発現する細胞より採取し
た。細胞をペレット化し、上澄み液を除去し、細胞を2m
lの水中に再懸濁し、キュベットに移した。
蛍光発光スペクトルは、LS−50ルミノメータ（Perkin
−Elmer）で、励起しながら発光スリットを10nmに設定
して測定された。励起波長は、GFP、GFP−N1、F64L−GF
P、F64L−S65T−GFPについては398nm及び470nmに設定さ
れた。398nmは、GFP、GFP−N1、F64L−GFPの至適励起波
長に近く、470nmは、F64L−Y66H−GFPの至適励起波長に
近い。Y66H−GFP及びF64L−Y66H−GFPについては、励起
波長が380nmに設定された。380nmは、これらの誘導体の
至適励起波長に近い。ベータ・ガラクトシダーゼ発現細
胞を、バックグラウンド・コントロールとして含めた。
LS−50ルミノメータでの測定後、450nmにおける光学密
度を、スペクトロフォトメータ（Lambda UV/VIS,Perkin
−Elmer）で各サンプルについて測定した。これは、該
分析中全細胞の尺度とされた。ルミノメータは、サンプ
ルの光学密度に対して標準化された。
−Elmer）で、励起しながら発光スリットを10nmに設定
して測定された。励起波長は、GFP、GFP−N1、F64L−GF
P、F64L−S65T−GFPについては398nm及び470nmに設定さ
れた。398nmは、GFP、GFP−N1、F64L−GFPの至適励起波
長に近く、470nmは、F64L−Y66H−GFPの至適励起波長に
近い。Y66H−GFP及びF64L−Y66H−GFPについては、励起
波長が380nmに設定された。380nmは、これらの誘導体の
至適励起波長に近い。ベータ・ガラクトシダーゼ発現細
胞を、バックグラウンド・コントロールとして含めた。
LS−50ルミノメータでの測定後、450nmにおける光学密
度を、スペクトロフォトメータ（Lambda UV/VIS,Perkin
−Elmer）で各サンプルについて測定した。これは、該
分析中全細胞の尺度とされた。ルミノメータは、サンプ
ルの光学密度に対して標準化された。
実験結果は、下記図6a−6fに示され、次のように要約
され得る。
され得る。
16時間後、22℃で398nmの励起波長で、GFP、F64L−GF
Pについては大きなシグナルが、GFP−N1及びF64L−S65T
−GFPについては検出可能なシグナルが見られた。図6a
参照。
Pについては大きなシグナルが、GFP−N1及びF64L−S65T
−GFPについては検出可能なシグナルが見られた。図6a
参照。
16時間後、37℃で398nmの励起波長で、F64L−GFPにつ
いては大きなシグナルが、F62L−S65T−GFPについては
検出可能なシグナルが見られ、GFP、GFP−N1については
シグナルは検出不可であった。図6b参照。
いては大きなシグナルが、F62L−S65T−GFPについては
検出可能なシグナルが見られ、GFP、GFP−N1については
シグナルは検出不可であった。図6b参照。
16時間後、22℃で470nmの励起波長で、F64L−S65T−G
FPについては大きなシグナルが、GFP及びF64L−GFPにつ
いては検出可能なシグナルが見られ、GFP−N1について
はシグナルは検出不可であった。図6c参照。
FPについては大きなシグナルが、GFP及びF64L−GFPにつ
いては検出可能なシグナルが見られ、GFP−N1について
はシグナルは検出不可であった。図6c参照。
16時間後、37℃で470nmの励起波長で、F64L−S65T−G
FP及びF64L−GFPについては大きなシグナルが、GFP及び
GFP−N1についてはシグナルは、検出不可であった。図6
d参照。
FP及びF64L−GFPについては大きなシグナルが、GFP及び
GFP−N1についてはシグナルは、検出不可であった。図6
d参照。
16時間後、22℃で380nmの励起波長で、Y66H−GFP及び
64L−S65T−GFPについては、バックグラウンドを凌ぐ検
出可能な信号は見られなかった。図6e参照。
64L−S65T−GFPについては、バックグラウンドを凌ぐ検
出可能な信号は見られなかった。図6e参照。
16時間後、37℃で380nmの励起波長で、Y66H−GFPにつ
いてはバックグラウンドを凌ぐ検出可能な信号は見られ
なかった。F64L−S65T−GFPについては大きなシグナル
が見られた。図6f参照。
いてはバックグラウンドを凌ぐ検出可能な信号は見られ
なかった。F64L−S65T−GFPについては大きなシグナル
が見られた。図6f参照。
蛍光信号の差が発現レベルの差によるものであるかど
うかを決定するために、上記に記載のように分析された
大腸菌細胞からの全蛋白を,SDSポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動（BIO−RAD研究所からの12％Trisグリセリン
・ゲル）によって分画し、その後（ラビットからの）ポ
リクローナルGFP抗体でウエスタン・ブロット（Amersha
m InternationalからのECLウエスタンブロット）分析を
行った。その結果、GFP、GFP−N1、F64L−GFP、F64L−S
65T−GFP、Y66H−GFP及びF64L−Y66H−GFPの発現レベル
は22℃でも37℃でも同等であった。従って、蛍光シグナ
ルレベルの差は発現レベルの差によるものではない。
うかを決定するために、上記に記載のように分析された
大腸菌細胞からの全蛋白を,SDSポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動（BIO−RAD研究所からの12％Trisグリセリン
・ゲル）によって分画し、その後（ラビットからの）ポ
リクローナルGFP抗体でウエスタン・ブロット（Amersha
m InternationalからのECLウエスタンブロット）分析を
行った。その結果、GFP、GFP−N1、F64L−GFP、F64L−S
65T−GFP、Y66H−GFP及びF64L−Y66H−GFPの発現レベル
は22℃でも37℃でも同等であった。従って、蛍光シグナ
ルレベルの差は発現レベルの差によるものではない。
実施例３
哺乳動物細胞で発現されたときのGFP及びその誘導体に
おけるF64L置換の影響 F64L−Y66H−GFP,F64L−GFP,及びF64L−S65T−GFP
は、その発現がCMVプロモータのコントロール下でなさ
れるようにpcDNA3（Invitrogen,Ca,USA）中にクローン
された。野生型GFPは、CMVプロモータが発現をコントロ
ールしているpGFP−N1プラスミド（Clontech,Ca,USA）
から発現された。トランスフェクションに使用されるプ
ラスミドDNAは、Jetstar Plasmidキット（Genomed Inc.
NC,USA）を使用して精製され、蒸留水中に溶解された。
おけるF64L置換の影響 F64L−Y66H−GFP,F64L−GFP,及びF64L−S65T−GFP
は、その発現がCMVプロモータのコントロール下でなさ
れるようにpcDNA3（Invitrogen,Ca,USA）中にクローン
された。野生型GFPは、CMVプロモータが発現をコントロ
ールしているpGFP−N1プラスミド（Clontech,Ca,USA）
から発現された。トランスフェクションに使用されるプ
ラスミドDNAは、Jetstar Plasmidキット（Genomed Inc.
NC,USA）を使用して精製され、蒸留水中に溶解された。
トランスフェクションに使用された沈殿物は、下記の
成分を混合して作成された:44μｌの水中２μｇのDNAを
50μｌの2xHBS緩衝液（280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4,12m
Mデキストローゼ、50mM HEPES）及び6.2μｌの2M CaCl2
と混合した。トランスフェクション混合物は、細胞に添
加する前、室温で25分間インキュベートされた。HEK293
細胞（ATCC CRL 1573）は、約1.5ml培地（グルタマック
ス（gultamax−１）、4500mg/Lのグルコース、及び10％
ウシ胎児血清配合のDulbecco MEM、Gibco BRL,MD,USA）
の入った2cmX2cmのカバーグラス・チェンバー（Nunc,De
nmark）で育生された。該DNAは、細胞中に25−50％集密
に添加された。細胞は、37℃二酸化炭素のインキュベー
タで生育された。黙視判定の前に培地が除去され、1.5m
lのCa2+−HEPES緩衝液（5mM KCl、140mM NaCl、5.5mMグ
ルコース、1mMのMgSO4、1mM CaCl、10mM HEPES）がチェ
ンバーに添加された。
成分を混合して作成された:44μｌの水中２μｇのDNAを
50μｌの2xHBS緩衝液（280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4,12m
Mデキストローゼ、50mM HEPES）及び6.2μｌの2M CaCl2
と混合した。トランスフェクション混合物は、細胞に添
加する前、室温で25分間インキュベートされた。HEK293
細胞（ATCC CRL 1573）は、約1.5ml培地（グルタマック
ス（gultamax−１）、4500mg/Lのグルコース、及び10％
ウシ胎児血清配合のDulbecco MEM、Gibco BRL,MD,USA）
の入った2cmX2cmのカバーグラス・チェンバー（Nunc,De
nmark）で育生された。該DNAは、細胞中に25−50％集密
に添加された。細胞は、37℃二酸化炭素のインキュベー
タで生育された。黙視判定の前に培地が除去され、1.5m
lのCa2+−HEPES緩衝液（5mM KCl、140mM NaCl、5.5mMグ
ルコース、1mMのMgSO4、1mM CaCl、10mM HEPES）がチェ
ンバーに添加された。
トランスフェクタントは、Axiovert 135（カールツワ
イス（Carl Zeiss）,Germany）蛍光顕微鏡を使用して、
視覚化された。顕微鏡には、HBO100水銀励起源、40X Fl
uar、NA＝1.3対物レンズ（カールツワイス,Germany）が
取り付けられている。GFP、F64L−GFP及びF64L−S65T−
GFPを視覚化するために下記フィルターが使用された：
励起フィルター480/40nm,干渉フィルター505nm、発光フ
ィルター510LP nm（全て、Chroma Technologies Corp.,
Vt.USA）。F64L−Y66H−GFPを視覚化するために下記フ
ィルタが使用された：励起フィルター380/15nm,干渉フ
ィルター400nm、発光フィルター450/65nm（全て,Omega
Optical,Vt.USA）。数個のチェンバー中の細胞を平行し
てトランスフェクトするので、サンプル時点毎に新チェ
ンバーの採取が可能であった。インキュベーションが8.
5時間を超えた場合、培地を交換するしてCa2+沈殿物が
除去された。
イス（Carl Zeiss）,Germany）蛍光顕微鏡を使用して、
視覚化された。顕微鏡には、HBO100水銀励起源、40X Fl
uar、NA＝1.3対物レンズ（カールツワイス,Germany）が
取り付けられている。GFP、F64L−GFP及びF64L−S65T−
GFPを視覚化するために下記フィルターが使用された：
励起フィルター480/40nm,干渉フィルター505nm、発光フ
ィルター510LP nm（全て、Chroma Technologies Corp.,
Vt.USA）。F64L−Y66H−GFPを視覚化するために下記フ
ィルタが使用された：励起フィルター380/15nm,干渉フ
ィルター400nm、発光フィルター450/65nm（全て,Omega
Optical,Vt.USA）。数個のチェンバー中の細胞を平行し
てトランスフェクトするので、サンプル時点毎に新チェ
ンバーの採取が可能であった。インキュベーションが8.
5時間を超えた場合、培地を交換するしてCa2+沈殿物が
除去された。
表１に示すように、F64L変異体は、蛍光信号を著しく
増加させる（野生型GFP対F64L−GFP及びF64L−S65T−GF
P）。蛍光細胞は、トランスフェクション後、１−２時
間という早い時期に観察され、37℃で発色団に有効な成
熟が見られた。更にF64L変異体は、励起スペクトルがず
れる他のS65T変異体のようなGFP誘導体及び、F65L置換
なしでは哺乳動物細胞中で検出することはできない青変
異体を増加させている。（コメント:F64L−S65T−GFP及
びF64L−GFPの結果を比較すると、励起スペクトルが異
なる事、及び使用されたフィルターセットが、F64L−S6
5T−GFPに対して至適化されていることを考慮しなくて
はならない。F64L−GFP及びWT GFPは、同じスペクトル
特性を分け合っている。）
増加させる（野生型GFP対F64L−GFP及びF64L−S65T−GF
P）。蛍光細胞は、トランスフェクション後、１−２時
間という早い時期に観察され、37℃で発色団に有効な成
熟が見られた。更にF64L変異体は、励起スペクトルがず
れる他のS65T変異体のようなGFP誘導体及び、F65L置換
なしでは哺乳動物細胞中で検出することはできない青変
異体を増加させている。（コメント:F64L−S65T−GFP及
びF64L−GFPの結果を比較すると、励起スペクトルが異
なる事、及び使用されたフィルターセットが、F64L−S6
5T−GFPに対して至適化されていることを考慮しなくて
はならない。F64L−GFP及びWT GFPは、同じスペクトル
特性を分け合っている。）
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ
Ｇ０１Ｎ 21/78 33/58 Ｚ
33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 トゥリン、 ソレン
デンマーク国、デーコー − 2860 ソ
ボルグ、１ ティーブイ、ソールナベイ
53
(72)発明者 ポウルセン、 ラルス・コングスバク
デンマーク国、デーコー − 2840 ホ
ールテ、ベンゲスティエン ２エー
(72)発明者 ビョルン、 サラ・ペーターセン
デンマーク国、デーコー − 2800 リ
ングビイ、クランペンボルグベイ 102
(56)参考文献 Ｇｅｎｅ（1992）Ｖｏｌ．111，Ｎｏ.
２，Ｐ．229−233
ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｆｅ
ｂ．1995）Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．２，Ｐ.
151−154
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（1994）Ｖｏｌ．91，Ｐ.
12501−12504
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K
C12N 15/00 - 15/90
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＪＩＣＳＴ（ＪＯＩＳ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (23)
- 【請求項１】緑色蛍光性タンパク（GFP）から誘導され
た蛍光性タンパクであって、蛍光強度を増大させるため
に、発色団から上流に向って位置１にあるアミノ酸Ｆが
アミノ酸Ｌで置換され、且つ発色団がSYG,SHGまたはTYG
を含んでいて、増大した蛍光強度を与える蛍光性タンパ
ク。 - 【請求項２】請求項１に記載の蛍光性タンパクであっ
て、前記発色団がGFPの予想一次アミノ酸配列の位置65
−67にある蛍光性タンパク。 - 【請求項３】請求項１または２に記載の蛍光性タンパク
であって、該蛍光性タンパクを発現する細胞において、
該細胞を30℃以上の温度、好ましくは32℃〜39℃の温
度、より好ましくは35℃〜38℃の温度、最も好ましくは
約37℃の温度でインキュベートしたときに増大した蛍光
を生じる蛍光性タンパク。 - 【請求項４】請求項１〜３の何れか１項に記載の蛍光性
タンパクであって、該タンパクはアエクオレア・ビクト
リア（Aequorea victorea）由来である蛍光性タンパ
ク。 - 【請求項５】請求項１〜４の何れか１項に記載の蛍光性
タンパクであって、図３、図４または図５のアミノ酸配
列を有する蛍光性タンパク。 - 【請求項６】請求項１〜５の何れか１項に記載の蛍光性
タンパク（GFP）を含む融合化合物であって、前記GFPが
ポリペプチドに連結されている融合化合物。 - 【請求項７】請求項６に記載の融合化合物であって、前
記ポリペプチドがキナーゼ、好ましくはプロテインキナ
ーゼＡ若しくはプロテインキナーゼＣの触媒サブユニッ
ト、Erk1または細胞骨格要素である融合化合物。 - 【請求項８】請求項1,2,3,4,または５の蛍光性タンパク
または請求項６若しくは７の融合化合物をコードするヌ
クレオチド配列を含んでなる核酸。 - 【請求項９】前記ヌクレオチド配列が図3,図４および図
５に示す配列から選択される、請求項８に記載の核酸。 - 【請求項１０】適切な１以上の制御領域と、請求項８ま
たは９のヌクレオチド配列とを含み、該配列は前記制御
領域の制御下にあるDNA構築物 - 【請求項１１】請求項10に記載のDNA構築物であって、
天然のGFPプロモータ、或いは哺乳類の構造的もしくは
調節的プロモータ、ウイルスのプロモータ、酵母のプロ
モータ、糸状菌のプロモータまたはバクテリアプロモー
タの制御下にあるDNA構築物。 - 【請求項１２】請求項10または11のDNA構築物で形質転
換された宿主。 - 【請求項１３】バクテリア、酵母、真菌、ブロトゾアお
よび高度の真核生物から選択される、請求項12に記載の
宿主。 - 【請求項１４】ポリペプチドを製造する方法であって、
請求項12または13の宿主を培養することと、該宿主か
ら、前記ヌクレオチド配列によって発現されたポリペプ
チドを回収することとを具備した方法。 - 【請求項１５】請求項14に記載の方法であって、前記ヌ
クレオチド配列の発現が、天然のGFPプロモータによっ
て行われる方法。 - 【請求項１６】プロテインキナーゼ活性または脱リン酸
化活性を測定するためのインビトロ試験における、請求
項1,2,3,4,または５の蛍光性タンパクの使用であって、
純粋な形の前記蛍光性タンパクが生物学的サンプル、好
ましくは細胞抽出物に添加され、蛍光の何らかの変化が
記録される使用。 - 【請求項１７】生きた細胞内における遺伝子発現のため
のレポータとしての、請求項1,2,3,4、または５の蛍光
性タンパクの使用。 - 【請求項１８】生きた完全な細胞内における２以上の遺
伝子を同時にモニターするための、請求項1,2,3,4また
は５の蛍光性タンパクの使用。 - 【請求項１９】生きた細胞内における細胞小器官プロセ
スまたは細胞プロセスを同時に可視化するための細胞小
器官または細胞の標識としての、請求項1,2,3,4,または
５の蛍光性タンパクの使用。 - 【請求項２０】代謝活性、好ましくはキナーゼ活性およ
び脱リン酸化活性を測定するためのインビボ試験におけ
る、請求項12または13の宿主の使用。 - 【請求項２１】生きた細胞内における遺伝子発現のレポ
ータとして使用するための、請求項1,2,3,4,または５の
何れか１項に記載の蛍光性タンパク。 - 【請求項２２】生きた完全な細胞における２以上の遺伝
子の同時モニターに使用するための、請求項1,2,3,4,ま
たは５の何れか１項に記載の蛍光性タンパク。 - 【請求項２３】生きた細胞内における細胞小器官プロセ
スまたは細胞プロセスを同時に可視化するために、細胞
小器官標識または細胞標識として使用するための、請求
項1,2,3,4,または５項に記載の二以上の蛍光性タンパ
ク。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK1065/95 | 1995-09-22 | ||
| DK106595 | 1995-09-22 | ||
| PCT/DK1996/000051 WO1997011094A1 (en) | 1995-09-22 | 1996-01-31 | Novel variants of green fluorescent protein, gfp |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003170625A Division JP2004024258A (ja) | 1995-09-22 | 2003-06-16 | 緑色蛍光性タンパクであるｇｆｐの新規な変種 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11512441A JPH11512441A (ja) | 1999-10-26 |
| JP3535177B2 true JP3535177B2 (ja) | 2004-06-07 |
Family
ID=8100600
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51232697A Expired - Lifetime JP3535177B2 (ja) | 1995-09-22 | 1996-01-31 | 緑色蛍光性タンパクであるｇｆｐの新規な変種 |
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Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003170625A Pending JP2004024258A (ja) | 1995-09-22 | 2003-06-16 | 緑色蛍光性タンパクであるｇｆｐの新規な変種 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0851874B1 (ja) |
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| AU (1) | AU4482996A (ja) |
| CA (1) | CA2232727C (ja) |
| DE (1) | DE69604298T2 (ja) |
| DK (1) | DK0851874T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5777079A (en) * | 1994-11-10 | 1998-07-07 | The Regents Of The University Of California | Modified green fluorescent proteins |
| JP3535177B2 (ja) | 1995-09-22 | 2004-06-07 | バイオイメージ・アクティーゼルスカブ | 緑色蛍光性タンパクであるｇｆｐの新規な変種 |
| US6900304B2 (en) | 1996-01-31 | 2005-05-31 | The Regents Of The University Of California | Emission ratiometric indicators of phosphorylation |
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