JP2002522040A - 改変されたグリーン蛍光タンパク質 - Google Patents

改変されたグリーン蛍光タンパク質

Info

Publication number
JP2002522040A
JP2002522040A JP2000563686A JP2000563686A JP2002522040A JP 2002522040 A JP2002522040 A JP 2002522040A JP 2000563686 A JP2000563686 A JP 2000563686A JP 2000563686 A JP2000563686 A JP 2000563686A JP 2002522040 A JP2002522040 A JP 2002522040A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
substituted
gfp
dna
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000563686A
Other languages
English (en)
Inventor
フィリップ、バスティエンス
ライナー、ペッパーコク
ステファン、ゲリー
Original Assignee
インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9817229.9A external-priority patent/GB9817229D0/en
Priority claimed from GBGB9817227.3A external-priority patent/GB9817227D0/en
Priority claimed from GBGB9817225.7A external-priority patent/GB9817225D0/en
Application filed by インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド filed Critical インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド
Publication of JP2002522040A publication Critical patent/JP2002522040A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

(57)【要約】 グリーン蛍光タンパク質の機能性部分を含んでなるポリペプチドであって、バリン（Ｖ）（１６３）がアラニン（Ａ）で置換されており、セリン（Ｓ）（１７５）がグリシンで置換されており、イソロイシン（Ｉ）（１６７）がトレオニン（Ｔ）で置換されており、フェニルアラニン（Ｆ）（６４）がロイシン（Ｌ）で置換されており、セリン（Ｓ）（６５）がトレオニン（Ｔ）で置換されており、セリン（Ｓ）（７２）がアラニン（Ａ）で置換されており、かつ、トレオニン（Ｔ）（２０３）がチロシン（Ｙ）で置換されていることを特徴とする、ポリペプチド。タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびこのタンパク質のレポーター分子としての使用も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、蛍光タンパク質、特に「グリーン蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）、お
よび野生型ＧＦＰと比較してスペクトル特性が変化したその突然変異体に関する
。
【０００２】背景技術 生物学的系の蛍光分析法は、多くの生物学的手法と比較して、幾つかの場合に
、非侵襲的に行うことができる利点を有し、またそれらは多くの反応が同時に行
われている複雑な生物学的系において特定の反応を同時に分析することができる
ので、数年間用いられてきている。蛍光分析法の物理的手法の開発と共に、例え
ば細胞内での反応のモニターとして用いられる生物学的レポーター構築物が開発
されてきた。特に、固有蛍光に補助因子を必要としない蛍光タンパク質の開発は
、このようなタンパク質を遺伝子構築物を介して細胞中に導入して、発現させる
ことができることを意味している。
【０００３】 固有蛍光タンパク質、特にいわゆるAequorea victoria「グリーン蛍光タンパ
ク質」または「ＧＦＰ」（それらは青色または黄色であることがあるが）が知ら
れている。Miyawaki et al. (1997) Nature, 388, 882-887には、ＧＦＰを基剤
とするＣａ２＋感知系が記載されており、Mitra et al. (1996) Gene, 173, 13-
17には、プロテアーゼ阻害剤の同定に用いられる２個のＧＦＰを基剤とする系が
記載されている。ＷＯ９７／２８２６１号公報には、プロテアーゼ開裂部位を含
むペプチドによってＧＦＰ供与体とＧＦＰ受容体とが連結されている２ＧＦＰ系
が開示されている。ＷＯ９５／０７４６３号公報にはＧＦＰの使用が記載されて
おり、ＷＯ９６／２３８９８号公報は、ＧＦＰを用いる生物学的に活性な物質の
検出法に関する。Heim & Tsien (1996) Current Biology, 6, 178-182は、光度
が改良され、より長波長および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を有する遺
伝子操作したＧＦＰに関し、Poppenborg et al. (1997) J. Biotechnol., 58, 7
9-88は、バイオプロセスのモニター用のレポーターとしてのＧＦＰに関する。Pa
rk & Raines (1997) Protein Science, 6, 2344-2349は、タンパク質−タンパク
質相互作用のためのシグナルとしてのＧＦＰに関し、Niswender et al. (1995)
J. Microscopy, 180, 109-116は、培養細胞におけるＧＦＰの定量的イメージン
グに関する。Chalfie et al. (1994) Science, 263, 802-805は、遺伝子発現用
のマーカーとしてのＧＦＰに関する。Hampton et al. (1996) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 93, 828-833は、ＧＦＰにより膜タンパク質の局在化および分解の
イン・ビボでの検討に関し、Heim et al. (1995) Nature, 373, 663-664は、変
更した蛍光特性を有する突然変異体ＧＦＰに関し、Mosser et al. (1997) BioTe
chniques, 22, 150-161は、誘導遺伝子生成物を発現する細胞のスクリーニング
および選択のためのＧＦＰをコードするディシストロニック発現カセット(dicis
tronic expression cassette)の使用に関し、Suarez et al. (1997) Gene, 196,
69-74は、細菌の遺伝学的分析のためのＧＦＰを基剤とするレポーター系に関す
る。Niedenthal et al. (1996) Yeast, 12, 773-778は、発芽酵母における遺伝
学発現および亜細胞性局在化のマーカーとしてのＧＦＰに関し、Prescott et al
. (1997) FEBS Lett., 411, 97-101は、酵母における組み立てたミトコンドリア
ＡＴＰシンターゼのマーカーとしてのＧＦＰの使用に関する。ＧＦＰおよびそれ
らの使用は、Pozzan et al. (1997) Nature, 388, 834-835、Misteli & Spector
(1997) Nature Biotechnology, 15, 961-964、およびCubitt et al. (1995) Tr
ends Biochem. Sci., 20, 448-455に概説されている。
【０００４】 多くの変異体ＧＦＰが知られているが、特性が改良された、特に改良されたま
たは新規なスペクトル特性を有し、生物学的系、特に蛍光共鳴エネルギー転移（
ＦＲＥＴ）を用いて生物学的系を検討するものに用いる変異体ＧＦＰの要望が続
いている。
【０００５】 生物学的系の検討を目的とするＦＲＥＴに基づく方法の例は、「生物学的系の
蛍光分析法」と題する英国特許出願第９８１７２２９．９号明細書、およびこの
出願に基づいて優先権を主張し、この出願と同日に出願されたＰＣＴ出願明細書
に詳細に記載されている。ＦＲＥＴに基づく方法のもう一つの例は、Miyawaki e
t al. (1997) Nature, 388, 882-887に記載されている。
【０００６】
【発明の概要】
本発明の第一の態様は、グリーン蛍光タンパク質の機能性部分を含んでなるポ
リペプチドであって、バリン（Ｖ）１６３がアラニン（Ａ）で置換されており、
セリン（Ｓ）１７５がグリシンで置換されており、イソロイシン（Ｉ）１６７が
トレオニン（Ｔ）で置換されており、フェニルアラニン（Ｆ）６４がロイシン（
Ｌ）で置換されており、セリン（Ｓ）６５がトレオニン（Ｔ）で置換されており
、セリン（Ｓ）７２がアラニン（Ａ）で置換されており、トレオニン（Ｔ）２０
３がチロシン（Ｙ）で置換されていることを特徴とする、ポリペプチドを提供す
る。
【０００７】
【発明の具体的説明】
「機能性部分」とは、ＧＦＰの他の部分の非存在下で、この部分が蛍光性であ
る部分のような有用な蛍光特性を生じさせるタンパク質の部分であるという意味
を包含する。本発明のこの第一の態様に関して、ＧＦＰ、または所定の突然変異
を有するＧＦＰの機能性部分を含んでなるポリペプチドは、更に所望な特性を与
えることがある他の突然変異も包含することができることを理解されるであろう
。
【０００８】 本発明の第二の態様は、下記アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【化１】
【０００９】 これは、図３に示される配列である。
【００１０】 好都合なことには、元のＧＦＰとの差を、標準的１文字アミノ酸コードを用い
て、Ｓ２Ｇ、Ｈ２５Ｑ、Ｓ３０Ｒ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ７２Ａ、Ｑ８０Ｒ、
Ｆ８４Ｌ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｔ２０３Ｙ、Ｋ２０９Ｑ、Ｎ
２１２Ｈ、Ｅ２１３Ｇ、Ａ２１６Ｓ、＋２３９Ｓ、＋２４０Ｆとしてまとめるこ
とができる。
【００１１】 単一タンパク質に関して「グリーン蛍光タンパク質」とは、Prasher et al. (
1992) Gene, 111, 229-233に記載されておりかつそのアミノ酸配列が図１に示さ
れている野生型グリーン蛍光タンパク質を意味する。上記のように、ＧＦＰとい
う用語は、実際には黄色または青色蛍光を発する変異体を表すのに用いることが
できる。
【００１２】 本発明の特に好ましいポリペプチド（変異体ＧＦＰ）の配列は図３に示されて
おり、その配列は、図４および５におけるA. victoriaＧＦＰおよびmmＧＦＰ５
（Zernicka-Goeta et al. (1997) Development, 124, 1133-1137）と比較される
。
【００１３】 上記のような突然変異を含むポリペプチドの機能性部分を、蛍光性残基を有す
ることが望ましい任意の適当なポリペプチドに組込むことができることを理解さ
れるであろう。典型的には、機能性部分は、蛍光または蛍光の変化が適当な条件
下で測定されるポリペプチドに包含される。従って、ポリペプチドは、（その発
現を蛍光測定法によって測定することができるので）レポーター分子として表さ
れるものであることができる。あるいは、機能性部分は、ＦＲＥＴを用いる生物
学的系に用いられるポリペプチドに包含することができる。例えば、本発明のポ
リペプチドとしては、上記の蛍光性部分を含むポリペプチドが挙げられ、これは
別の蛍光性残基と共に用いられ、ＦＲＥＴ反応において供与体または受容体とし
て作用する。最も好適には、本発明のポリペプチドは、上記の機能性部分の他に
、同じポリペプチド鎖に他の蛍光性残基を含み、蛍光性残基の対は、ＦＲＥＴ反
応において供与体−受容体対として作用することができる。従って、本発明のポ
リペプチドは、典型的には少なくとも上記のような突然変異を含むポリペプチド
の機能性部分を含む融合タンパク質である。
【００１４】 従って、本発明のポリペプチドは、任意の適当な従来技術のＦＲＥＴ法で用い
ることができる。
【００１５】 突然変異は蛍光寿命を著しく高くするので、本発明のポリペプチドは、「生物
学的系の蛍光分析法」と題する英国特許出願第９８１７２２９．９号明細書、お
よびこの出願に基づいて優先権を主張し、この出願と同日に出願されたＰＣＴ出
願明細書に記載されているＦＲＥＴ法に特に適している。少なくとも本発明の第
二の態様の分子に関しては、５１４nmで励起し、５３１nmで発光するので、本発
明のポリペプチドは受容体分子として特に適していると思われる。
【００１６】 本発明の特に好ましいポリペプチドは、図３に示されているアミノ酸配列を有
するものである。
【００１７】 本発明の更に好ましいポリペプチドは、上記のアミノ酸置換を含むグリーン蛍
光タンパク質の少なくとも７〜２２９の残基を含んでなるものである。ＧＦＰの
蛍光に要する最小ドメインは、アミノ酸７〜２２９であると考えられている(Li
et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 28545-28549。また、この情報およびＧＦ
Ｐについての他の情報は、Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Ci
rcle, Palo Alto, CA 94303, USA (xqli@CLONTECH.com)から入手できる。
【００１８】 グリーン蛍光タンパク質の少なくとも７〜２２９の残基は、本発明の第一の態
様について記載されたアミノ酸置換を含むだけでなく、元のA. victoriaＧＦＰ
と比較して、アミノ酸配列Ｈ２５Ｇ、Ｓ３０Ｒ、Ｑ８０Ｒ、Ｆ８４Ｌ、Ｋ２０９
Ｑ、Ｎ２１２Ｈ、Ｆ２１３Ｇ、およびＡ２１６Ｓも含むのが好ましい。
【００１９】 更にもう一つの好ましいポリペプチドは、別の蛍光残基を含んでなるものであ
る。特に、別の蛍光残基は、変異体ＧＦＰの上記部分を用いるＦＲＥＴが可能な
ものである。典型的には、本発明の特に好ましいポリペプチドは、上記突然変異
を含むポリペプチドの少なくとも機能性部分を含みかつ別の突然変異体ＧＦＰを
含む融合タンパク質である。
【００２０】 本発明の第三の態様は、本発明の第一または第二の態様のポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡで
よく、ＤＮＡが好ましい。本発明の特に好ましいポリヌクレオチドを図３に示す
が（ＤＮＡ配列）、遺伝子コードが縮重しているため、他のポリヌクレオチドが
同じポリペプチド（すなわち、図３に示したアミノ酸配列を有する）をコードす
ることができることを理解されるであろう。
【００２１】 本発明の第四の態様は、本発明の第一または第二の態様のポリペプチドをコー
ドする発現ベクターを提供する。
【００２２】 本発明の発現ベクターおよび他のポリヌクレオチドは、Sambrook et al. (198
9) 分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual)、Cold Spring Harbor Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
クに記載されているような標準的実験室分子生物学の方法によって構築すること
ができ、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００２３】 本発明のポリヌクレオチド（典型的には、ＤＮＡ）を適当な宿主で発現させて
、本発明のポリペプチドを含んでなるポリペプチドを生成することができる。従
って、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、本明細書に含まれる教示を
考慮して適宜改良した既知の手法に従って用い、発現ベクターを構築した後、適
当な宿主細胞を形質転換して本発明のポリペプチドを発現させ、生成することが
できる。このような手法としては、１９８４年４月３日にRutter et al.に発行
された米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日にWeissmanに発
行された第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日にCrowlに発行された
第４，５８２，８００号、１９８７年６月３０日にMark et al.に発行された第
４，６７７，０６３号、１９８７年７月７日にGoeddelに発行された第４，６７
８，７５１号、１９８７年１１月３日にItakura et al.に発行された第４，７０
４，３６２号、１９８７年１２月１日にMurrayに発行された第４，７１０，４６
３号、１９８８年７月１２日にToole, Jr. et al.に発行された第４，７５７，
００６号、１９８８年８月２３日にGoeddel et al.に発行された第４，７６６，
０７５号、および１９８９年３月７日にStalkerに発行された第４，８１０，６
４８号明細書に開示されているものが挙げられ、上記特許明細書の内容は、その
開示の一部として本明細書に引用される。
【００２４】 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、多種多
様な他のＤＮＡ配列と連結して適当な宿主に導入することができる。コンパニオ
ンＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入の仕方、およびエピソーム保持
または組込みが所望であるかどうかによって変化する。
【００２５】 一般に、ＤＮＡは、発現に適正な配向および正確なリーディングフレームで、
プラスミドのような発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡを、所望な
宿主によって認識される適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結
することができるが、このような調節は一般に発現ベクターで利用可能である。
次に、このベクターを、標準的手法によって宿主に導入する。一般に、宿主の総
てがベクターによって形質転換されるのではない。従って、形質転換される宿主
細胞を選択する必要がある。１つの選択法は、抗生物質耐性のような形質転換細
胞で選択可能な形質をコードする任意の必要な調節要素と共に、ＤＮＡ配列を発
現ベクターに組込むことを伴う。あるいは、このような選択可能な形質について
の遺伝子が、所望な宿主細胞を同時形質転換するのに用いるもう一つのベクター
上にあることができる。
【００２６】 次に、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を、十分な時間
、本明細書に開示されている教示を考慮して当業者に知られている適当な条件下
で培養し、ポリペプチドを発現させた後、これを回収することができる。
【００２７】 細菌（例えば、E. coliおよびBacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharo
myces cerivisiae）、糸状菌（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞、
および昆虫細胞など多くの発現系が知られている。
【００２８】 ベクターとしては、ベクターは他の原核生物以外の種類の細胞での発現に用い
られるものであるが、原核生物で増殖するためのColE1 oriのような原核性レプ
リコンが挙げられる。ベクターとしては、形質転換されるE. coliのような細菌
宿主細胞での発現（転写および翻訳）を指定することができる原核性プロモータ
ーのような適当なプロモーターを挙げることもできる。
【００２９】 プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を引起すＤＮＡ配列に
よって形成される発現調節要素である。典型的な細菌宿主と適合性のプロモータ
ー配列は、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含
むプラスミドベクターにおいて提供される。
【００３０】 典型的な原核ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories（リッチモンド、
カリフォルニア、米国）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２
およびｐＢＲ３２９，およびPharmacia（ピスカタウェイ、ニュージャージー、
米国）から入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【００３１】 典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia（ピスカタウェイ、ニ
ュージャージー、米国）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クロ
ーニングした遺伝子を発現させるＳＶ４０後期プロモーターを用いており、最高
水準の発現は、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原産生細胞に見出される。
【００３２】 誘導可能な哺乳類の発現ベクターの例は、ｐＭＳＧであり、これもまたPharma
ciaから入手可能である。このベクターは、クローニングした遺伝子を発現させ
るマウス哺乳類腫瘍ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導プロ
モーターを用いている。
【００３３】 有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−
４１６であり、一般にStratagene Clong Systems（ラジョラ（La Jolla）、カリ
フォルニア９２０３７、米国）から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、
ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は酵母組込みプラスミド（Ｙ
Ｉｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３
を組込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ
）である。
【００３４】 様々な方法が、相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターに操作可能に連結す
る目的で開発されている。例えば、相補的ホモポリマー領域を、ベクターＤＮＡ
に挿入されるＤＮＡセグメントに添加することができる。次に、ベクターおよび
ＤＮＡセグメントを、相補的ホモポリマートレイル間で水素結合によって連結し
て、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００３５】 １個以上の制限部位を有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに
連結するための代替法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成し
たＤＮＡセグメントを、突出３′−一本鎖末端を３′−５′−エキソヌクレオリ
ーシス活性で除去し、陥凹３′−末端に重合活性を満たす酵素であるバクテリオ
ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはE. coliＤＮＡポリメラーゼＩで処理す
る。
【００３６】 従って、これらの活性の組合せにより、平滑末端ＤＮＡセグメントが得られる
。次に、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのよう
な平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下にて大モル過
剰量のリンカー分子とインキュベーションする。従って、反応の生成物は、その
両端にポリマー性リンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次に、これら
のＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で開裂し、このＤＮＡセグメントと適合す
る末端を産生する酵素で開裂した発現ベクターに連結させる。
【００３７】 様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーが、International
Biotechnologies Inc.（ニューヘーヴン、コネチカット、米国）など多数の供給
元から発売されている。
【００３８】 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改質するのに望ましい方法は、Sa
iki et al. (1988) Science, 239, 487-491によって開示されているポリメラー
ゼ連鎖反応を用いる方法である。
【００３９】 この方法では、酵素学的に増幅されるＤＮＡに、２つの特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーを隣接させ、これら自身を増幅したＤＮＡに組込ませる。この特
異的プライマーは、当該技術分野で知られている方法を用いて発現ベクターへの
クローニングに用いることができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有するこ
とができる。
【００４０】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換した宿主細胞
にも関する。宿主細胞は、原核または親核性のいずれであることもできる。細菌
細胞は好ましい原核宿主細胞であり、典型的には、例えばBethesda Resarch Lab
oratories Inc.（ベテスダ、メリーランド、米国）から入手可能なE. coli DH5
株、およびAmerican Type Culture Collection (ATCC)（ロックビル、メリーラ
ンド、米国）から入手可能なＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３号）のようなE. coli
の菌株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母および哺乳類細胞、好まし
くはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞系由来のものなどの脊椎動物細
胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、一般にStratagene Cloning Systems（
ラジョラ、カリフォルニア９２０３７、米国）から入手可能なＹＰＨ４９９、Ｙ
ＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、ATCC
からＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、
ATCCからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／
３Ｔ３、およびATCCからＣＲＬ１６５０として入手可能なサル腎臓由来のＣＯＳ
−１細胞が挙げられる。
【００４１】 本発明のＤＮＡ構築物を用いる適当な細胞宿主の形質転換は、典型的には用い
るベクターの種類によって変化する周知の方法によって行われる。原核宿主細胞
の形質転換に関しては、例えばCohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 69, 2110、およびSambrook et al. (1989) 分子クローニング、実験室マニ
ュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Press
、コールドスプリングハーバー、ニューヨークを参照されたい。酵母細胞の形質
転換は、Sherman et al. (1986) 酵母遺伝学の方法、実験室マニュアル(Methods
In Yeast Genetics, A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバー、ニ
ューヨークに記載されている。Beggs (1978) Nature, 275, 104-109の方法を用
いることもできる。脊椎動物細胞に関しては、これらの細胞のトランスフェクシ
ョンに用いられる試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン
またはリポソーム処方物は、Stratagene Cloning Systems、またはLife Technol
ogies Inc.（ガイテルスバーグ、メリーランド２０８７７、米国）から入手可能
である。
【００４２】 エレクトロポレーションも、細胞の形質転換に有用であり、酵母細胞、細菌細
胞および脊椎動物細胞の形質転換について当該技術分野で周知である。
【００４３】 例えば、多くの細菌種を、Luchansky et al. (1988) Mol. Microbiol., 2, 63
7-646に記載の方法によって形質転換することができ、上記文献の内容は、その
開示の一部として本明細書に引用される。非常に多くの形質転換体が、２５μFD
で６２５０Ｖ／cmを用いて２．５ＸＰＥＢに懸濁したＤＮＡ−細胞混合物のエレ
クトロポレーションの後に一貫して回収される。
【００４４】 エレクトロポレーションによる酵母の形質転換の方法は、Becker & Guarente
(1990) Methods Enzymol., 194, 182に開示されている。
【００４５】 良好に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、周
知の手法によって同定することができる。例えば、本発明の発現構築物の導入か
ら得られる細胞を生育し、本発明のポリペプチドを産生させることができる。細
胞を回収して、リーシスを行い、それらのＤＮＡ含量をSouthern (1975) J. Mol
. Biol., 98, 503またはBerent et al. (1985) Biotech., 3, 208に記載されて
いるような方法を用いて、ＤＮＡの存在について検討することができる。あるい
は、上清におけるタンパク質の存在を、抗体を用いて検出することもできる。
【００４６】 しかしながら、ポリペプチドを発現する形質転換細胞を同定するのに好都合な
方法は、それらの細胞が蛍光性であることである。
【００４７】 組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指定することができるときには、組換えＤ
ＮＡの存在についての直接分析の他に、形質転換の成功を周知の免疫学的方法に
よって確認することができる。例えば、発現ベクターを用いて良好に形質転換し
た細胞は適当な抗原性を示すタンパク質を産生する。形質転換されていると考え
られる細胞の試料を回収して、適当な抗体を用いてタンパク質について分析する
。形質転換および発現は、この場合には蛍光タンパク質の産生によって示される
ことは勿論である。
【００４８】 従って、形質転換宿主細胞自身の他に、本発明は栄養培地中でのこれらの細胞
の培養物、好ましくはモノクローン性（クローン的に均質な）培養物、またはモ
ノクローン性培養物由来の培養物も意図している。
【００４９】 特に適当な「開始」ベクターは、Invitrogen（Invitrogen BV、デシェルプ１
２、９３５１ＮＶレーク、オランダ国）によって分配されているｐｃＤＮＡ３．
１である。本発明についてのこのベクターの重要な特徴は、(i)哺乳類細胞にお
けるインサートの高水準発現のためのサイトメガロウイルスエンハンサー−プロ
モーター（インサートは、例えば上記のポリペプチドをコードするｃＤＮＡであ
り、ベクターにクローニングされねばならない）、(ii)前進および復帰配向での
多重クローニング部位、(iii)真核細胞における選択マーカーの発現カセット（
ネオマイシン、ゼオシンまたはヒューグロマイシン）である。
【００５０】 本発明のポリペプチドをイン・ビトロ分析法などのようにエクス・ビボで用い
ようとするときには、細菌系（E. coliなど）、または酵母または昆虫細胞、ま
たは多量のタンパク質を容易に発現するようにデザインした他の系でポリペプチ
ドを発現するのが好都合であることがある。本発明のポリペプチドをイン・ビボ
分析法で用いようとするときには、分析を行う細胞、典型的には哺乳類細胞中で
発現させるのが好都合である。
【００５１】 特に好ましい態様では、本発明のポリペプチド（ＹＦＰ５などをコードするＤ
ＮＡ）を、検討を行っている遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素に融合さ
せることができる。哺乳類細胞中に安定的に導入されるこのようなＤＮＡを、検
討を行っているそれぞれの遺伝子の発現のレポーターとして用いることができる
。活性の読み出しは、ポリペプチドの特異蛍光の測定によって決定することがで
きる発現したＹＦＰ５のようなポリペプチドの量である。同様なＤＮＡを、表１
に示されるように他のＧＦＰについて生成させることができる（以下参照）。そ
れらは重複スペクトルを有するので、同一細胞で同時に用いることはできない。
しかしながら、蛍光寿命イメージングＣＦＰを用いると、例えばＭｍＧＦＰ５お
よびＹＦＰ５は、それらの寿命が互いに十分離れているので、同時に用いること
ができる。複合周波数ＦＬＩＭ（蛍光寿命イメージング）を用いて、同一細胞で
発現されたこれら３種類のＧＦＰ突然変異体の相対量を、高精度で、従って少な
くとも３個の遺伝子のプロモーター活性で測定することができる。
【００５２】 複合周波数ＦＬＩＭは、「複合周波数蛍光寿命イメージング」と題する英国特
許出願第９８１７２２７．３号明細書、およびこの出願に基づいて優先権を主張
し、この出願と同日に出願されたＰＣＴ出願明細書に記載されている。
【００５３】 本発明を、下記の図面および例に関して更に詳細に説明する。
【００５４】
【実施例】例１：突然変異体ＧＦＰの構築、およびその特性 ＹＦＰ５と呼ばれ、ＭｍＧＦＰ５のレッドシフト突然変異体である突然変異体
ＧＦＰを、ＭｍＧＦＰ５のＰＣＲ介在位置指定突然変異誘発によって生成させた
(Zernicka-Goetz et al. (1997) Development, 124, 1133-1137)。ＭｍＧＦＰ５
は、Ｖ１６３Ａ、Ｓ１７５Ｇ、Ｉ１６７Ｔ、Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔで突然変異
したｗｔＧＦＰであり、突然変異Ｖ１６３Ａ、Ｓ１７５ＧおよびＩ１６７ＴをSi
emering et al. (1996) Current Biol., 6, 1653-によってｗｔＧＦＰに導入し
、Zernicka-Goetz et al.は突然変異Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔを導入した。この
方法では、プライマー対
【化２】 および
【化３】 および
【化４】 および
【化５】 を用いて突然変異Ｓ７２ＡおよびＴ２０３ＹをＭｍＧＦＰ５に導入した。下線
部のヌクレオチドは、ミスマッチを示す。
【００５５】 様々なＧＦＰの蛍光寿命を、表１に示す。
【００５６】表１の文献 １．Heim & Tsien (1996). 「光度の改良、より長波長、および蛍光共鳴エネル
ギー転移のためのグリーン蛍光タンパク質の操作(Engineering green fluoresce
nt protein for improved brightness, longer wavelength and fluorescence r
esonance energy transfer)」Curr. Bio., 6, 178-182. ２．Orme M et al. (1996).「Aequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質の結晶
構造(Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protei
n)」Science, 273, 1392-1395. ３．Zernicka-Goetz et al. (1997).「生きているマウス胎児における細胞の運
命の検討(Following cell fate in the living mouse embryo)」Development, 1
24, 1133-1137. ４．Miyawaki et al. (1997).「グリーン蛍光タンパク質およびカルモデュリン
を基剤とするＣａ２＋の蛍光指示薬(Fluorescent indicators for Ca2+ based o
n green fluorescent proteins and calmodulin)」Nature, 388, 882-887.
【００５７】 最終的なＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐ
ＥＦＴ７ＭＣＳにサブクローニングした。このベクターは、ｐＥＦ−ＢＯＳを基
剤としている（Nucleic Acids Res. (1990) Sep. 11; 18(17), 5322 「ｐＥＦ−
ＢＯＳ、強力な哺乳類発現ベクター」Mizushima S., Nagata S.）。Ｎｅｏ耐性
発現カセットを含むｐＥＦ−ＢＯＳの改質バージョンは、G. Baier、インスブル
ックから得た。ベクターを更に小さくし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
、並びにヒトＥＦ１αプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位の下流の
数個のユニーク制限酵素部位を導入したＮｅｏ発現カセット。
【００５８】 本明細書に記載の任意の他の適当なベクターを用いて、突然変異ＧＦＰを発現
させることができる。導入された突然変異は、Sequenaseを用いる配列決定法に
よって確かめた。ＹＦＰ５の配列を、図３に示す。
【００５９】 それぞれのＧＦＰ突然変異体を、ベクターｐＥＦＴ７ＭＣＳＡを基剤とし、ｃ
ＤＮＡをコードするそれぞれのＧＦＰのインサートを有するプラスミドの微量注
入（Peperkok et al., 1997 「微量注入およびトランスジェネーシス(Microinje
ction and Transgenesis)」Cid-Arregui and Garcia-Carranca監修、Springer、
ハイデルベルク、１４５〜１５４頁）によって細胞中で発現させた。微量注入か
ら２時間後に、細胞をＦＬＩＭ顕微鏡セットアップ上に置き、それぞれの寿命を
生細胞中で３７℃で測定した。任意の適当な発現系または寿命検出系を用いるこ
とができる。
【００６０】 ＹＦＰ５は、他のＧＦＰ突然変異体よりも良好に分離しかつかなり長い寿命を
示し、多重標識ＦＬＩＭ実験における理想的なパートナーとなる。
【００６１】
【表１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 A. victoriaグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡおよびアミノ酸配
列。
【図２】 従来技術による突然変異体ＧＦＰのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列（mmＧＦＰ;
Zernicka-Goetz et al.）。
【図３】 例１に更に詳細に記載されている本発明のポリペプチド（mmＹＦＰまたはｍＹ
ＦＰ５またはＹＦＰ５と呼ばれる）のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。
【図４ａ】 図１〜３からのｃＤＮＡ配列の比較。
【図４ｂ】 図１〜３からのｃＤＮＡ配列の比較（図４Ａのつづき）。
【図４ｃ】 図１〜３からのｃＤＮＡ配列の比較（図４Ａのつづき）。
【図５】 図１〜３からのアミノ酸配列の比較。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１０月１９日（２０００．１０．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９８１７２２９．９ (32)優先日 平成10年８月８日(1998．8．8) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ステファン、ゲリー イギリス国ハーツ、ポッターズ、バー、フ ランプトン、ロード、11 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 CA04 CA07 GA25 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ89 QR80 QX02 4B065 AA90 AB01 AC14 BA02 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 CA50 DA50 EA50

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 グリーン蛍光タンパク質の機能性部分を含んでなるポリペプチドであって、バ
    リン（Ｖ）１６３がアラニン（Ａ）で置換されており、セリン（Ｓ）１７５がグ
    リシンで置換されており、イソロイシン（Ｉ）１６７がトレオニン（Ｔ）で置換
    されており、フェニルアラニン（Ｆ）６４がロイシン（Ｌ）で置換されており、
    セリン（Ｓ）６５がトレオニン（Ｔ）で置換されており、セリン（Ｓ）７２がア
    ラニン（Ａ）で置換されており、かつ、トレオニン（Ｔ）２０３がチロシン（Ｙ
    ）で置換されていることを特徴とする、ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 下記アミノ酸配列を有するポリペプチド。 【化１】
  3. 【請求項３】 更にアミノ酸置換Ｓ２Ｇ、Ｈ２５Ｇ、Ｓ３０Ｒ、Ｑ８０Ｒ、Ｆ８４Ｌ、Ｎ２１
    ２Ｈ、Ｅ２１３Ｇ、Ａ２１６Ｓ、および追加の残基２３９Ｓおよび２４０Ｆを有
    する、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のアミノ酸置換を含むグリーン蛍光タンパ
    ク質の少なくとも７〜２２９位の残基を含んでなる、ポリペプチド。
  5. 【請求項５】 他の蛍光残基を含んでなる、請求項１、３および４のいずれか一項に記載の、
    ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 他の蛍光残基がグリーン蛍光タンパク質またはその変異体である、請求項５に
    記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 融合ポリペプチドである、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載のポリ
    ペプチド。
  8. 【請求項８】 融合ポリペプチドが、ＦＲＥＴを使用する生物学的系で用いられるものである
    、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チド。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする発現ベクター
    。
  11. 【請求項１１】 請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載の発現ベクターを
    含んでなる、宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドの、細胞におけるレポータ
    ー分子としての使用。
  13. 【請求項１３】 請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８に記載の発現ベクターの、
    細胞においてレポーター分子を発現させるための使用。
  14. 【請求項１４】 本明細書に記載の任意の新規な蛍光タンパク質。
JP2000563686A 1998-08-08 1999-08-06 改変されたグリーン蛍光タンパク質 Pending JP2002522040A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9817229.9 1998-08-08
GBGB9817229.9A GB9817229D0 (en) 1998-08-08 1998-08-08 Fluorescent assay for biological systems
GBGB9817227.3A GB9817227D0 (en) 1998-08-08 1998-08-08 Multiple frequency fluorescence lifetime imaging
GB9817227.3 1998-08-08
GBGB9817225.7A GB9817225D0 (en) 1998-08-08 1998-08-08 Fluorescent protein
GB9817225.7 1998-08-08
PCT/GB1999/002596 WO2000008054A1 (en) 1998-08-08 1999-08-06 Modified green fluorescent protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002522040A true JP2002522040A (ja) 2002-07-23

Family

ID=27269431

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000563686A Pending JP2002522040A (ja) 1998-08-08 1999-08-06 改変されたグリーン蛍光タンパク質
JP2000564028A Pending JP2002542453A (ja) 1998-08-08 1999-08-06 生物学的系についての蛍光分析法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000564028A Pending JP2002542453A (ja) 1998-08-08 1999-08-06 生物学的系についての蛍光分析法

Country Status (4)

Country Link
EP (3) EP1102791A1 (ja)
JP (2) JP2002522040A (ja)
AU (3) AU5429399A (ja)
WO (3) WO2000008443A1 (ja)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE348155T1 (de) 1996-11-20 2007-01-15 Introgen Therapeutics Inc Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren
US6261782B1 (en) 1999-04-06 2001-07-17 Yale University Fixed address analysis of sequence tags
US6403319B1 (en) 1999-08-13 2002-06-11 Yale University Analysis of sequence tags with hairpin primers
CA2419503A1 (en) * 2000-08-14 2003-02-14 Michiyuki Matsuda Protein monitoring the activity of low-molecular weight gtp-binding protein
WO2002014372A1 (fr) * 2000-08-14 2002-02-21 Michiyuki Matsuda Proteine de surveillance d'activite pour proteine de faible poids moleculaire se liant a la guanosine triphosphate (gtp)
AU2001232219A1 (en) * 2000-08-14 2001-06-06 Michiyuki Matsuda Protein monitoring the activity of small gtp-binding protein
GB0024351D0 (en) * 2000-10-04 2000-11-22 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Dye-labelled peptide and method
US6447995B1 (en) 2000-10-04 2002-09-10 Genvec, Inc. Utilizing intrinsic fluorescence to detect adenovirus
JP2005504261A (ja) * 2001-01-12 2005-02-10 アフィボディ・アーベー 検出方法
US7425430B2 (en) * 2001-03-23 2008-09-16 Japan Science And Technology Corporation Probe for visualizing phosphorylation/dephosphorylation of protein and method of detecting and quantifying phosphorylation/dephosphorylation of protein
GB0109858D0 (en) 2001-04-23 2001-06-13 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Fluorscent proteins
GB0208989D0 (en) * 2002-04-19 2002-05-29 Amersham Biosciences Uk Ltd Methods for measuring enzyme activity
US7890157B2 (en) 2003-08-19 2011-02-15 Cedars-Sinai Medical Center Method for fluorescence lifetime imaging microscopy and spectroscopy
US20110039254A1 (en) 2004-09-14 2011-02-17 Pinheiro Leonardo B Chromosomal Insertion of Gfp Into Bacteria For Quality Control
WO2006042907A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Wallac Oy A novel probe and its use in bioaffinity assays
WO2006055735A2 (en) * 2004-11-16 2006-05-26 Illumina, Inc Scanner having spatial light modulator
EP2194485B1 (en) 2004-11-16 2012-10-17 Illumina, Inc. Method and apparatus for reading coded microbeads
DE102005005438A1 (de) * 2005-02-05 2006-08-24 Bayer Healthcare Ag Mutanten des fluoreszierenden Proteins CGFPs, sowie deren Verwendung
US7830575B2 (en) 2006-04-10 2010-11-09 Illumina, Inc. Optical scanner with improved scan time
DE102006026586A1 (de) * 2006-06-07 2007-12-13 Bayer Healthcare Ag Fluoreszierende Proteine wfCGFP, sowie deren Verwendung
EP2108129A4 (en) 2007-01-30 2013-06-12 Ge Healthcare Bio Sciences TIME-RESOLVED FLUORESCENCE IMAGING SYSTEM
DE102008033214A1 (de) 2008-07-15 2010-01-21 Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG Verfahren zur optischen Bestimmung einer Messgröße eines Messmediums
EP2382470B1 (en) 2009-01-29 2014-12-10 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Measuring g protein coupled receptor activation
WO2010092752A1 (ja) * 2009-02-10 2010-08-19 三井造船株式会社 蛍光検出装置及び蛍光検出方法
JP5569894B2 (ja) * 2009-03-26 2014-08-13 学校法人東京農業大学 記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法
CN102597746A (zh) * 2009-09-29 2012-07-18 三井造船株式会社 Fret测量方法及装置
WO2014168734A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Cedars-Sinai Medical Center Time-resolved laser-induced fluorescence spectroscopy systems and uses thereof
CN105283561A (zh) 2013-04-04 2016-01-27 佐治亚州立大学研究基金会公司 使用纳米粒子辅助信号放大的rna微芯片检测
FR3020874A1 (fr) * 2014-05-12 2015-11-13 Univ Bourgogne Procede de detection d'un transfert d'energie par resonance de fluorescence et cytometre en flux pour la mise en œuvre de ce procede
CN104359880B (zh) * 2014-11-05 2017-03-15 合肥学院 对痕量百草枯检测的CdTe量子点荧光探针的化学制备方法
JP6525199B2 (ja) * 2014-11-26 2019-06-05 国立大学法人広島大学 インスリンの検出方法、および、インスリンの検出キット
JP6937294B2 (ja) 2015-09-16 2021-09-22 ぺタオミクス， インコーポレイテッド ゲノムターゲットエンリッチメント及び選択的ｄｎａシーケンシングのための方法及び組成物
WO2017156413A1 (en) * 2016-03-10 2017-09-14 University Of Notre Dame Super-sensitivity multiphoton frequency-domain fluorescence lifetime imaging microscopy
CA3019590A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Black Light Surgical, Inc. Systems, devices, and methods for time-resolved fluorescent spectroscopy
CN107271422B (zh) * 2017-08-02 2019-08-23 华南师范大学 一种基于激发发射光谱分离同时测量受体-供体量子产额之比与消光系数之比的方法
CN112129737B (zh) * 2020-09-24 2022-03-15 华南师范大学 一种同时自动测量fret系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用
CN112444509B (zh) * 2020-11-12 2022-04-19 中国科学技术大学 一种活细胞内检测clk3激酶活性的生物探针及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4937457A (en) * 1989-02-10 1990-06-26 Slm Instruments, Inc. Picosecond multi-harmonic fourier fluorometer
WO1990009637A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-23 Research Corporation Technologies, Inc. Method and means for parallel frequency acquisition in frequency domain fluorometry
US5151869A (en) * 1990-02-16 1992-09-29 The Boc Group, Inc. Frequency domain fluorometry using coherent sampling
US5196709A (en) * 1991-05-03 1993-03-23 University Of Maryland Systems Fluorometry method and apparatus using a semiconductor laser diode as a light source
US5625048A (en) * 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
GB9504446D0 (en) * 1995-03-06 1995-04-26 Medical Res Council Improvements in or relating to gene expression
ATE184613T1 (de) * 1995-09-22 1999-10-15 Novo Nordisk As Varianten des grünen fluoreszenzproteins, gfp
US6803188B1 (en) * 1996-01-31 2004-10-12 The Regents Of The University Of California Tandem fluorescent protein constructs
US6124128A (en) * 1996-08-16 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Long wavelength engineered fluorescent proteins
AU5090498A (en) * 1997-01-07 1998-08-03 California Institute Of Technology Optical sensors of cell signaling

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002542453A (ja) 2002-12-10
AU5429399A (en) 2000-02-28
EP1102976A1 (en) 2001-05-30
AU5429299A (en) 2000-02-28
WO2000008443A1 (en) 2000-02-17
EP1102791A1 (en) 2001-05-30
WO2000008054A1 (en) 2000-02-17
EP1102977A1 (en) 2001-05-30
WO2000008444A1 (en) 2000-02-17
AU5429199A (en) 2000-02-28
WO2000008443A9 (en) 2000-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002522040A (ja) 改変されたグリーン蛍光タンパク質
JP5963391B2 (ja) Ａｎｔｈｏｚｏａ綱の非生物発光性種由来の蛍光タンパク質、そのようなタンパク質をコードする遺伝子、およびそれらの使用
US5912137A (en) Assays for protein kinases using fluorescent
US5925558A (en) Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
JP4232992B2 (ja) 長波長の工学的に作製された蛍光タンパク質
JP2011182796A (ja) タンパク質断片の相補性アッセイのための蛍光タンパク質断片
US7888113B2 (en) Modified green fluorescent proteins and methods for using same
EP0915989B1 (en) Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
JPH06217779A (ja) アポエクオリンをコードするヌクレオチド配列、該配列を含む組換えベクター及び該ベクターを含む組換え微生物
JPH10509881A (ja) 改変緑色蛍光タンパク質
US8138320B2 (en) Fluorescent proteins and methods for using same
US20030013849A1 (en) Renilla reniformis green fluorescent protein
JP4480674B2 (ja) コペポーダ種由来の蛍光たんぱく質および該たんぱく質の使用方法
US6916623B2 (en) Methods for producing protein domains and analyzing three dimensional structures of proteins by using said domains
EP3978612A1 (en) Method for quantitative co-expressing multiple proteins in vitro and application thereof
US8563703B2 (en) Fluorescent proteins and methods for using same
JPH10234382A (ja) 蛍光タンパク質