JPH10234382A - 蛍光タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高温下でも強い傾向を発する蛍光タンパク質
を提供することを課題とする。 【解決手段】 野生型のGFPcDNAにランダムに変異を導
入し、その中から強い蛍光を発するGFPをコードしてい
るcDNAを単離し、そのcDNAに導入された変異を検出し
た。さらに、この変異に加え、野生型GFPより強い蛍光
を発する改良型GFPに導入された既知の変異を導入したG
FPcDNAを構築し、この2つの変異を持つ蛍光タンパク質
を大腸菌内で高温下にて発現させた。この結果、該蛍光
タンパク質は、高温下でも蛍光型になり、既知の改良型
GFPよりも極めて強い蛍光を発した。また、該蛍光タン
パク質は動物細胞において発現させた場合でも、強い蛍
光を発した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光強度が高めら
れた改変蛍光タンパク質およびその使用などに関する。

【０００２】

【従来の技術】クラゲ（Aequorea victoria）由来のGFP
（green fluorescent protein）は、強い蛍光を発する
タンパク質であり、特に、生細胞におけるタンパク質局
在の解析の標識として用いたり、プロモーター解析のた
めのレポーターとして用いたりすることが可能であるこ
とから、近年非常に注目されている。

【０００３】しかし、野生型GFPの蛍光強度は発現時の
細胞培養条件に大きく依存し、例えば、哺乳類培養細胞
や酵母において培養温度を37℃近くまで上昇させた場
合、発現したGFPの多くが蛍光型になれず、このため細
胞内で微弱な蛍光しか発しないという問題点があった。

【０００４】ところで、野生型のGFPの蛍光は、1次配列
上の連続するアミノ酸3残基「Ser(65)-Tyr-Gly」が形成
する発色団（chromophore）に起因することが知られて
いる。

【０００５】このため、この発色団配列中の65番目のセ
リンをトレオニンに変異させ、野生型GFPより強い蛍光
を発生するように改変した「S65T変異体」が開発され
（R.Heim, A.B.Cubitt, and R.Y.Tsien. Nature.,373 6
63-664(1995)）、現在、広く実用化されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、高温下にお
いて従来の蛍光タンパク質よりも強い蛍光を発する蛍光
タンパク質を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、野生型のGFPcDNA（配列番号：１）
にランダムに変異を導入し、その中から強い蛍光を発す
るGFPをコードしているcDNAの単離を行った。即ち、本
発明者らは、PCR法によりランダムに変異を導入したGFP
cDNAを調製し、これをプラスミドに組み込み、大腸菌に
導入した。次いで、発現したGFPにより37℃で特に明る
い蛍光を発するクローンを選抜し、このクローンから導
入したプラスミドを回収し、プラスミドに組み込まれた
変異GFPの塩基配列を解析した。この結果、本発明者ら
は、得られた変異GFPでは、野生型GFPの147番目のアミ
ノ酸であるセリンがプロリンに置換されており、この変
異はGFPの発色団配列から離れた位置に存在することを
見出した。

【０００８】次いで、本発明者らは、さらに強い蛍光を
発するGFPを単離するために、この147番目のアミノ酸の
変異に加え、強い蛍光を発する「S65T変異体」に導入さ
れている変異（65番目のセリンのトレオニンへの変異）
を導入したGFPcDNA（配列番号：３）を構築した。そし
て、この2つの変異を有するGFPcDNAを含むプラスミドを
大腸菌に導入し、この変異GFP（アミノ酸配列を配列番
号：２に示す）を高温下（37℃）にて大腸菌内で発現さ
せ、その蛍光強度及び濃度の測定を行った。この結果、
本発明者らは、該変異GFPの発光量が、対照として用い
た「S65T」変異体と比較して顕著に増大しており、また
細胞内での存在量も顕著に増大していることを見出し
た。即ち、本発明者らは、野生型のGFPに2つの変異を導
入することにより、高温下（37℃）においても蛍光型に
なることができ、かつ、既知の変異GFPよりも極めて強
い蛍光を発するタンパク質を製造することに成功した。

【０００９】さらに、本発明者らは、この2つの変異を
有する蛍光タンパク質の動物細胞における有効性の検討
を行った。即ち、動物細胞発現ベクターに2つの変異の
導入された蛍光タンパク質のcDNAを組み込み、これをマ
ウス由来細胞に導入した。次いで、該細胞を高温下（37
℃）にて培養後、細胞内で発現した該蛍光タンパク質の
蛍光像の検出を行った。この結果、本発明者らは、該蛍
光タンパク質が動物細胞内でも明るい蛍光を発し、しか
もこの蛍光が対照として用いた「S65T変異体」よりも顕
著に強いことを見出した。

【００１０】即ち、本発明は、高温下（37℃）において
も蛍光型となって強い蛍光を発することができ、かつ、
動物細胞においても適用可能な蛍光タンパク質、及びそ
の利用法に関し、より具体的には、（１） 配列番号２
に記載のアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質、（２）
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列（但し６５位がトレオニン、１４７位がプロリンで
ある）を含む蛍光タンパク質、（３） （１）または
（２）に記載の蛍光タンパク質をコードするDNA、
（４） （３）に記載のDNAを含むベクター、（５）
被検プロモーターの下流に（３）に記載のDNAを配置し
たことを特徴とする、（４）記載のベクター、（６）
（４）に記載のベクターを保持する宿主細胞、（７）
（６）に記載の宿主細胞を培養し、産生されたタンパク
質を回収する工程を含む、（１）または（２）に記載の
蛍光タンパク質の製造方法、（８） （５）に記載のベ
クターを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる蛍光
を検出する過程を含む、被検プロモーターの活性の測定
方法、（９） 被検アミノ酸配列と融合されたことを特
徴とする、（１）または（２）に記載の蛍光タンパク
質、（１０） （９）に記載の蛍光タンパク質を細胞に
導入し、該蛍光タンパク質の該細胞内における分布を観
察することを特徴とする、被検アミノ酸配列の細胞内に
おけるターゲッティング活性を検出する方法、（１１）
（９）に記載の蛍光タンパク質をコードするDNAが発
現可能に挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該蛍
光タンパク質の該細胞内における分布を観察することを
特徴とする、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲ
ッティング活性を検出する方法、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、野生型GFPのアミノ酸
配列中のアミノ酸のうち65番目のセリンがトレオニン
に、147番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸
配列を含む蛍光タンパク質に関する。本発明のタンパク
質は、この2つの変異を有することにより、現在広く実
用化されている「S65T変異体」の約3倍の蛍光を発し、
細胞内で発現させた場合に「S65T変異体」よりも高濃度
で存在する（2つの変異を有することで蛍光強度のみな
らずタンパク質の安定性も増したためと推定される）と
いう特徴を有し、さらに、高温下（37℃）においても蛍
光型になることができるという特徴を有する。

【００１２】従って、本発明のタンパク質においては、
アミノ酸配列中の65位がトレオニンであり、147位がプ
ロリンであることが重要であり、65位及び147位以外の
アミノ酸を適宜置換、欠失、付加することにより得られ
る、本発明のタンパク質と本質的に同じタンパク質も本
発明の範囲に含まれる。ここで「本質的に同じタンパク
質」とは、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中のアミ
ノ酸のうち蛍光に実質的に影響しないアミノ酸が置換、
欠失、または付加されたタンパク質を指す。

【００１３】なお、当業者であれば周知技術である部位
特異的変異誘発法など（実験医学別冊 遺伝子工学ハン
ドブック 246-258 (1991)）を用いて、容易にこのよう
な改変タンパク質をコードするDNAを構築し、本発明の
タンパク質を得ることが可能である。

【００１４】本発明のタンパク質は、例えば、以下の方
法により製造することが可能である。まず、野生型GFPc
DNAの塩基配列（配列番号：１）のうち、65番目のセリ
ン及び147番目のセリンに対応する塩基配列をそれぞれ
トレオニン、プロリンに対応する塩基配列に置換したGF
PcDNAが作製される。このGFPcDNAの作製は、部位特異的
変異誘発導入法などにより、野生型GFPの193番目（翻訳
開始コドン「ATG」の「A」を1とする）の「T」を「A」
に、439番目の「T」を「C」に置換することにより行う
ことが可能である。次いで、作製されたcDNAを適当な発
現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、宿主細胞内
で本発明のタンパク質を発現させる。

【００１５】発現ベクターとしては、特に制限はない
が、大腸菌においては、例えば、「pQE30」、「pQE3
1」、「pQE32」（キアゲン社製）、「pET3a」、「pET3
b」、「pET3c」（ノバゲン社製、宝酒造）、「pGEX-5X-
1」、「pGEX-5X-2」、「pGEX-5X-3」（ファルマシア社
製）や「pUC118」（宝酒造）などのベクターが好適に用
いられる。

【００１６】ベクターの宿主細胞への導入は、常法、例
えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法
などの方法により行うことができる。

【００１７】また、ベクターを導入し、本発明のタンパ
ク質を発現させるための宿主細胞としては、特に制限は
なく、大腸菌においては、例えば、「HB101」,「DH5」,
「TG1」,「JM109」,「XL1-blue」,「BL21(DE3)」,「BL2
1(DE3)pLysS」などを用いることができる。

【００１８】宿主細胞内で発現させた本発明のタンパク
質は、例えば、以下の方法により精製し、回収すること
が可能である。即ち、本発明のタンパク質が宿主細胞内
で可溶性タンパク質として存在すれば、超音波破砕等に
より宿主細胞を破壊したのち、例えば、硫安沈澱、DEAE
セルロースカラムクロマトグラフィーなどの方法により
精製することが可能である。また不溶性タンパク質とし
て存在していれば、例えば、グアニジン塩酸等の変性剤
を用いて可溶化したのち、透析により徐々に塩濃度を下
げ可溶化されているタンパク質について上記と同様な方
法を用いて精製することが可能である。なお、本発明の
タンパク質が「His-tag」（キアゲン社製）との融合タ
ンパク質の場合には、「Ni-NTA resin」（キアゲン社
製）を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー
により、精製することが可能である。また、グルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質
である場合には、グルタチオンーセファロースカラムを
用いたアフィニティーを利用した精製を行うことが可能
である。

【００１９】本発明のタンパク質は、特に、標識として
の利用価値が高い。即ち、本発明のタンパク質を被検ア
ミノ酸配列との融合タンパク質として精製し、マイクロ
インジェクション法などの手法により細胞内に導入し、
該融合タンパク質の分布を経時的に観察すれば、被検ア
ミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検
出することが可能である。被検アミノ酸配列としては、
特に制限はないが、例えば、ターゲティングシグナル
（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）
等が好適である。なお、本発明のタンパク質は、マイク
ロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外
に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この
場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAが発現
可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。

【００２０】また、本発明のタンパク質は、レポーター
タンパク質としてプロモーター活性の測定に用いること
も可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発
明のタンパク質をコードするDNAが配置されたベクター
を構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せら
れる本発明のタンパク質の蛍光を検出することにより、
被検プロモーターの活性を測定することが可能である。
被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するもの
であれば、特に制限はない。

【００２１】上記被検アミノ酸配列のターゲティング活
性の検出やプロモーター活性の測定において用いられる
ベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細
胞用ベクターでは、「pNEO」（P. Southern, and P. Be
rg (1982) J. MOl. Appl. Genet. 1:327）、「pCAGGS」
（H.Niwa,K.Yamamura,and J.Miyazaki. Gene 108,193-2
00(1991)）、「pRc/CMV」（インビトロゲン社製）、「p
CDM8」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクター
では、「pRS303」,「pRS304」,「pRS305」,「pRS306」,
「pRS313」,「pRS314」,「pRS315」,[pRS316]（R.S.Sik
orski and P.Hieter (1989) Genetics 122: 19-27）、
「pRS423」,「pRS424」,「pRS425」,「pRS426」（T.W.C
hristianson, R.S.Sikorski, M.Dante, J.H.Shero, and
P. Hieter (1992) Gene 110: 119-122）などが好適に
用いられる。

【００２２】また、用いることが可能な細胞にも、特に
制限はない。種々の動物細胞、例えば、L細胞、BalbC-3
T3細胞、NIH3T3細胞、CHO(Chinese hamster ovary)細
胞、HeLa細胞、NRK(normal rat kidney)細胞、「Saccha
romyces cerevisiae」などの酵母細胞や大腸菌（E. col
i）細胞などが好適に用いられる。

【００２３】ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、
リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの
常法により行うことができる。

【００２４】本発明のタンパク質の蛍光は、生細胞のま
ま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍
光顕微鏡（カールツァイス社 アキシオフォト フィル
ターセット09）や画像解析装置（ATTO デジタルイメー
ジアナライザー）などを用いて行うことが可能である。

【００２５】なお、本発明のタンパク質をコードするDN
Aは、タンパク質の折り畳み（folding）の解析やエネル
ギー伝達を利用した分子−分子相互作用の解析に利用す
ることも可能である。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００２７】[実施例１] 蛍光強度の高いGFPをコード
するcDNAのクローニング ランダムな変異の導入されたGFPcDNAを増幅するために
野生型のGFPcDNAを鋳型とし、5'センスプライマー（配
列番号:４：5'-GGGCCCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC
-3'：7〜12番目の塩基がBamHI site(アンダーライン部
分)であり、13〜15番目が開始コドンである。）及び3'
アンチセンスプライマー（配列番号:５：5'-GCGCACGGTA
CCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG -3'：7〜12番目がKpnI
site(アンダーライン部分)であり、13〜15番目が終止
コドンである。）を用いて、「Low fidelity PCR ampli
fication」を行った。具体的には、 100μlの反応溶液
（100ngの鋳型DNA「pAGN1」, 1mMの各オリゴヌクレオチ
ドプライマー,1mMの各dNTP, 10mMのTris-Cl (pH8.3), 5
0mMのKCl, 1.5mMのMgCl₂, 0.5mMのMnCl₂,及び1mlの「Ta
KaRa Taq 」(宝酒造））に対し、「94℃で1分, 55℃で2
分,72 ℃で3分(最後のサイクルでは72 ℃で10分）」の
処理を30サイクル行った。これにより得られたPCR産物
を大腸菌の発現ベクター「pQE30」（Qiagen社製）に、
「Ligation high」（東洋紡）を用いて挿入した。

【００２８】次いで、得られたプラスミドを大腸菌XL1-
blueのコンピテント細胞に導入し、300コロニーずつ10
プレートに撒いた。37℃で20時間の培養後、UV照射を行
い、特に明るい蛍光を示したコロニーを単離した。単離
したコロニーからプラスミドを回収し、得られたプラス
ミドを、合成オリゴをプローブとして、「DNA Sequenci
ng Kit 402079」（パーキンエルマー社製）を用いて塩
基配列の決定を行った。

【００２９】この結果、野生型のGFPの147番目のセリン
をプロリンに変異させたクローン（以下、このクローン
を「S147P変異体」と称する）を得た。

【００３０】[実施例２] S147P変異とS65T変異の２つ
の変異を有するGFPの調製及び該GFPの蛍光強度の測定 「S147P変異体」は、GFPの蛍光を決定していると考えら
れる発色団の配列以外の部分に変異を有していた。そこ
で、本発明者は、強い蛍光を発するGFP発色団配列の変
異体で広く実用化されている「S65T変異体」の「S65T変
異」と上記「S147P変異」の2つの変異を有するGFP（以
下、この変異体を「S65T/S147P変異体」と称する）のcD
NAの作製を行った。

【００３１】「pRSETB」(インビトロゲン社製)のBamHI
部位に野生型GFPの65番目のセリンをトレオニン(S65T)
に変えた変異型GFPを組み込んだプラスミド「pRSETB-GF
P(S65T)」（Nature 373 663-664(1995)：カリフォルニ
ア大学のRoger Y. Tsien博士より供与された。なお、こ
のプラスミドは、「pGFPcDNA vector」(クロンテック社
製)を基に上記の部位特異的変異導入法により調製でき
る）を鋳型とし、このGFPの5'側にSmaIサイトを含むプ
ライマー（配列番号:６：5'-TTCACCCGGGATGAGTAAAGGAGA
AGAACTT-3'：5〜10番目の塩基がSmaI site(アンダーラ
イン部分)であり、 11〜13番目が開始コドンである）、
3'側にEcoRIサイトを含むプライマー（配列番号:７：5'
-GCACGAATTCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3'：5〜10番目の
塩基がEcoRI site(アンダーライン部分)であり、19〜21
番目が終止コドンである）を作製してPCRを行った後、S
maI,EcoRIで消化し、その断片を「pGEM-7Zf(+)」（プロ
メガ社製）のSmaI, EcoRIサイトに挿入した「pGEM-GFP
(S65T)」を作製した。「pGEM-GFP(S65T)」をSmaI, XbaI
で消化し、GFP断片を「pUC118」（宝酒造社製）のSmaI,
XbaIサイトにクローニングし、「pUCGFP(S65T)」を作製
した。さらに「pUCGFP(S65T)」をKpnI, HindIIIで消化
し、GFP断片を「pQE31」(キアゲン社）のKpnI, HindIII
サイトにクローニングし、「pQE31GFP(S65T)」を作製し
た。「pQE31GFP(S65T)」をNdeIで消化後、その骨格側の
大断片と「pQA2（pQE30GFP(S147P)）」をNdeI消化した
小断片とをリガーゼを用いて連結したプラスミド、2つ
の変異をもつ「pQB2（pQE31GFP(S65T/S147P)）」を構築
した。

【００３２】次いで、得られたプラスミドを大腸菌XL1-
blueのコンピテント細胞に導入し、37℃で終夜培養した
菌体100μl（LB培地）を10mlのLB培地に植え次ぎ、37℃
で３時間180rpmで振とう培養を行った。次いで、細胞を
収穫し、100μlのバッファーA（50mMのTris-Cl (pH7.
5)、20mM EDTA、2mM PMSF）に最終的に「OD₆₀₀=約0.5」
になるように懸濁し、SDS（終濃度0.1%）を添加し、こ
の細胞懸濁液をボルテックス後、15,000Gで10分遠心
し、その上清を蛍光強度測定及びGFP濃度測定に用い
た。

【００３３】なお、蛍光強度測定は、励起波長480nm、
蛍光波長510nmにて、「DensitographLumino-CCD」（Att
o）を用いて行った。また、GFP濃度は、一次抗体として
ウサギ抗GFP抗体（クローンテック社製）を用い、2次抗
体として化学発光を利用したECLウェスタンブロッティ
ング検出キット（アマシャム社製）を用いて測定した。
以上の結果を表１に示す。なお、表中の数字の単位はす
べて相対値を用いた。

【００３４】

【表１】 表１から明らかなように、S147P変異の導入により、37
℃でのGFP濃度（細胞内存在量）及び蛍光強度がともに
顕著に上昇した。また、GFP濃度当たりの蛍光強度も従
来のS65T変異体と比較して約3倍に増加した。

【００３５】[実施例３] 「S65T/S147P変異体」及び
「S65T変異体」の励起・蛍光スペクトルの測定 「S65T/S147P変異体」のcDNAを「pGEX5X-2」(ファルマ
シア社製)に組み込み、大腸菌に導入し、「S65T/S147P
変異体」をGST（glutation S-transferase）との融合タ
ンパク質として発現させた。これをグルタチオンセファ
ロース4Bカラム（ファルマシア社製）にて精製し、融合
タンパク質の励起・蛍光スペクトルを測定した。なお、
対照として、「S65T変異体」を用いた。この結果、励起
波長について「S65T/S147P」は496nm、「S65T」は490nmで両
者の間では大きな差は認められなかった。また蛍光波長
のピークは両者とも512nmと同じであった（図１）。こ
のことから「S65T/S147P」は「S65T」と全く同じ方法で励起
し、また蛍光を測定することが可能であることが判明し
た。なお、すべてのスペクトルにおいて、縦軸はピーク
を1.0とした。

【００３６】[実施例４] 「S65T/S147P変異体」の哺乳
動物細胞での効果 EcoRIで消化した動物細胞発現ベクター「pUC-CAGGS(Xho
l)」（「pCAGGS」：I.Miyamoto, N.Miura, H.Niwa, J.M
iyazaki,and K.Tanaka (1992) J. Biol.Chem.267: 1218
2-12187）に「Ligation high」（東洋紡）を用いてEcoR
Iで消化した「S65T/S147P変異体」のcDNAを挿入し、マ
ウス由来のL cellにカルシウム沈殿法で一過的トランス
フェクトした。その細胞を37度で48時間培養した後に10
%ホルマリンで固定し、蛍光顕微鏡によりノマルスキー
(Nomarski)像およびFITCフィルターでの蛍光像(GFPの蛍
光)を検出した（図２Ａ下段）。なお、対照として「S65
T変異体」のcDNAを用いた（図２Ａ上段）。この結果、
「S65T変異体」と比較して、「S65T/S147P変異体」を発
現する細胞は、より明るい蛍光像を示した（図２Ａ右
下）。

【００３７】また、観察した細胞の内、蛍光を発する細
胞の割合、及び細胞の蛍光の強さを測定した（図２
Ｂ）。図の横軸は、最も蛍光の強かった細胞の蛍光強度
を１とした場合における「S65T/S147P」は「S65T/S147P」は
蛍光強度を示し、図の縦軸は、蛍光細胞の細胞数を示
す。

【００３８】この結果、「S65T/S147P変異体」のcDNAを
挿入された細胞では、対照と比較して、より高い割合で
細胞が蛍光を発していた。また、蛍光強度も対照と比較
して顕著に高かった。

【００３９】

【発明の効果】本発明により野生型GFPの65番目と147番
目のアミノ酸がそれぞれトレオニン、プロリンに置換さ
れたタンパク質が提供された。本発明のタンパク質は、
37℃の温度条件下においても蛍光型となり、また従来広
く用いられてきた改良型ＧＦＰの約3倍の強い蛍光を発
すると共に可溶性タンパク質としての発現量も２倍程度
増加しているため、従来のタイプに比べ結果として37℃
で約6倍程度明るい蛍光を発することが明らかとなっ
た。この改良型GFPは従来のものに比べ37℃での差が顕
著であること、微生物のみならず動物細胞でも適用可能
であることから、特に動物細胞や幅広い温度で生育可能
な酵母などに有効と考えられる。本発明のGFPは、タン
パク質の標識として用い、生細胞における分子の局在を
観察する目的に適しているだけでなく、プロモーター解
析におけるレポータータンパク質として、またタンパク
質の高次構造変化のマーカーとしても有効と考えられ、
今後広く細胞生物学、遺伝子工学分野においての利用が
期待される。

【００４０】

【配列表】

配列番号 : 1 配列の長さ : 717 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 1..714 特徴を決定した方法: E 配 列 ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 GAA TTA GAT GGT GAT GTT AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 GGT GAA GGT GAT GCA ACA TAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 ACT ACT GGA AAA CTA CCT GTT CCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 TCT TAT GGT GTT CAA TGC TTT TCA AGA TAC CCA GAT CAT ATG AAA CGG 240 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 CAT GAC TTT TTC AAG AGT GCC ATG CCC GAA GGT TAT GTA CAG GAA AGA 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 ACT ATA TTT TTC AAA GAT GAC GGG AAC TAC AAG ACA CGT GCT GAA GTC 336 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 AAG TTT GAA GGT GAT ACC CTT GTT AAT AGA ATC GAG TTA AAA GGT ATT 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 GAT TTT AAA GAA GAT GGA AAC ATT CTT GGA CAC AAA TTG GAA TAC AAC 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 TAT AAC TCA CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAA AAG AAT GGA 480 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 ATC AAA GTT AAC TTC AAA ATT AGA CAC AAC ATT GAA GAT GGA AGC GTT 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 CAA CTA GCA GAC CAT TAT CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GAT GGC CCT 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 GTC CTT TTA CCA GAC AAC CAT TAC CTG TCC ACA CAA TCT GCC CTT TCG 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 AAA GAT CCC AAC GAA AAG AGA GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTA 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 ACA GCT GCT GGG ATT ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA 714 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 TAA 717 配列番号 : 2 配列の長さ : 238 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Pro His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 配列番号 : 3 配列の長さ : 717 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 1..714 特徴を決定した方法: E 配 列 ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT 48 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 GAA TTA GAT GGT GAT GTT AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG 96 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 GGT GAA GGT GAT GCA ACA TAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC 144 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 ACT ACT GGA AAA CTA CCT GTT CCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC 192 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 ACT TAT GGT GTT CAA TGC TTT TCA AGA TAC CCA GAT CAT ATG AAA CGG 240 Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 CAT GAC TTT TTC AAG AGT GCC ATG CCC GAA GGT TAT GTA CAG GAA AGA 288 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 ACT ATA TTT TTC AAA GAT GAC GGG AAC TAC AAG ACA CGT GCT GAA GTC 336 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 AAG TTT GAA GGT GAT ACC CTT GTT AAT AGA ATC GAG TTA AAA GGT ATT 384 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 GAT TTT AAA GAA GAT GGA AAC ATT CTT GGA CAC AAA TTG GAA TAC AAC 432 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 TAT AAC CCA CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAA AAG AAT GGA 480 Tyr Asn Pro His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 ATC AAA GTT AAC TTC AAA ATT AGA CAC AAC ATT GAA GAT GGA AGC GTT 528 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 CAA CTA GCA GAC CAT TAT CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GAT GGC CCT 576 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 GTC CTT TTA CCA GAC AAC CAT TAC CTG TCC ACA CAA TCT GCC CTT TCG 624 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 AAA GAT CCC AAC GAA AAG AGA GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTA 672 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 ACA GCT GCT GGG ATT ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA 714 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 TAA 717 配列番号 : 4 配列の長さ : 36 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GGGCCCGGAT CCATGAGTAA AGGAGAAGAA CTTTTC 36 配列番号 : 5 配列の長さ : 39 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GCGCACGGTA CCTTATTTGT ATAGTTCATC CATGCCATG 39 配列番号 : 6 配列の長さ : 31 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 TTCACCCGGG ATGAGTAAAG GAGAAGAACT T 31 配列番号: 7 配列の長さ : 33 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GCACGAATTC TATTTGTATA GTTCATCCAT GCC 33

【図面の簡単な説明】

【図１】「S65T/S147P変異体」及び「S65T変異体」の励
起・蛍光スペクトルの測定結果を示す図である。

【図２】図２Ａは、「S65T/S147P変異体」及び「S65T変
異体」のcDNAが導入された細胞を蛍光顕微鏡により検出
し、そのノマルスキー像及び蛍光像を示す顕微鏡写真で
ある。図２Ｂは、被検細胞の中で蛍光を発する細胞の割
合及びその細胞の蛍光の強さの測定結果を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む
   蛍光タンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
   されたアミノ酸配列（但し６５位がトレオニン、１４７
   位がプロリンである）を含む蛍光タンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の蛍光タンパク
   質をコードするDNA。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のDNAを含むベクター。
5. 【請求項５】 被検プロモーターの下流に請求項３に記
   載のDNAを配置したことを特徴とする、請求項４記載の
   ベクター。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のベクターを保持する宿
   主細胞。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の宿主細胞を培養し、産
   生されたタンパク質を回収する工程を含む、請求項１ま
   たは２に記載の蛍光タンパク質の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項５に記載のベクターを宿主細胞に
   導入し、該細胞から発せられる蛍光を検出する過程を含
   む、被検プロモーターの活性の測定方法。
9. 【請求項９】 被検アミノ酸配列と融合されたことを特
   徴とする、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の蛍光タンパク質を細
    胞に導入し、該蛍光タンパク質の該細胞内における分布
    を観察することを特徴とする、被検アミノ酸配列の細胞
    内におけるターゲッティング活性を検出する方法。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の蛍光タンパク質をコ
    ードするDNAが発現可能に挿入されたベクターを宿主細
    胞に導入し、該蛍光タンパク質の該細胞内における分布
    を観察することを特徴とする、被検アミノ酸配列の細胞
    内におけるターゲッティング活性を検出する方法。