JP4794887B2 - 蛍光蛋白質 - Google Patents

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本発明は、新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、単量体で存在することができる新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
クラゲのエクオレア・ビクトリア(Aequorea victoria)に由来する緑色蛍光蛋白質(GFP)は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的(semi-rational)突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはpH感受性を改変したといった様々なGFP変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をGFP等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるGFP変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質(YFP)が挙げられる。また、GFP変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質(CFP)があり、ECFP(enhanced cyan fluorescent protein)が知られている。また、イソギンチャク(Discoma sp.)からは赤色蛍光蛋白質(RFP)も単離されており、DasRedが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の4種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
一方、イシサンゴ目のミドリイシより単離された青緑色蛍光蛋白質(Midoriishi-Cyan;MiCy)(特願2003−170326:国際公開WO2004/111235号公報)は分子量測定の結果、55kDa(アミノ酸配列から計算される分子量は29kDa)を示し、通常は二量体を形成していると考えられる。近年、蛍光蛋白質を用いて細胞や分子をラベルする需要が急速に高まっている。細胞をラベルする際には蛍光蛋白質が多量体を形成しようと、蛍光蛋白質自身は細胞質中に漂っているだけなので問題は起こらないが、分子をラベルする際には問題が生じてくる。例えば、ラベルしたい分子が多量体を形成する場合、ターゲット分子と蛍光蛋白質分子が互いに多量体を形成し合い、巨大なポリマーを形成してしまう可能性がある。また、どちらかの多量体形成が阻害された時には、その多量体形成できない分子が本来の性質を失うことになる。蛍光蛋白質を複数用いた分子内FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)のプローブにおいても同じく、多量体形成蛍光蛋白質同士を一本のペプチド鎖として発現させた場合に、互いが多量体形成をしあうためにFRETの観測は困難を極める。
国際公開WO2004/111235号公報
本発明は、多量体を形成する蛍光蛋白質を単量体化することにより、分子のラベルを行った際に現われうる不具合を解消することを解決すべき課題とする。即ち、本発明は、蛍光蛋白質が多量体化しようとすることによるターゲットとする融合蛋白質の機能阻害を防止することを解決すべき課題とする。現行のFRET測定系では、蛍光物質又は発光物質をドナーとして使用し、蛍光物質をアクセプターとして使用するのが通常であるが、アクセプターは吸収特性があれば蛍光を発しなくてもFRETの測定は可能である。逆に、アクセプターが蛍光を発しなければ、それだけ蛍光取得の波長域に空きができるため、複数のFRET測定が可能となる。また、蛍光寿命を測定するライフタイムイメージングではFRETのドナーの蛍光寿命を測定すればFRETが起こっているか否かを判別できるため、蛍光を発しない色素蛋白質をアクセプターとして用いたFRET系は同時に複数のFRETを測定することができる。本発明は、上記したようなFRET系を構築することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、イシサンゴに属するミドリイシ(Acropora sp.)より単離された青緑蛍光蛋白質MiCyに変異を導入し、単量体として機能するmMiCyを作製することに成功した。さらに、ドナーに蛍光蛋白質(mMiCy)を用い、アクセプターに色素蛋白質(KP)を用いたFRET測定系を構築することにより、同時に複数のFRETを測定可能なFRET系を提供することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有し、かつ単量体で存在するアミノ酸配列:
本発明の別の側面によれば、以下の何れかのDNAが提供される。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、単量体で存在する蛍光蛋白質をコードするDNA:
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有するDNAが提供される。
(a)配列番号1に記載の塩基配列;又は、
(b)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、単量体で存在する蛍光蛋白質をコードする塩基配列:
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のDNAを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のDNA又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とを融合させて得られる融合蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光蛋白質の蛍光スペクトルとFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を引き起こすのに十分な重なりをもつ吸収スペクトルを示す色素蛋白質と、本発明の蛍光蛋白質とをリンカー配列を介して連結することにより得られるFRET測定用融合蛋白質が提供される。
好ましくは、色素蛋白質は、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質である。
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号4に記載のアミノ酸配列と同等の吸光特性を有するアミノ酸配列:
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光蛋白質、DNA、組み換えベクター、形質転換体、融合蛋白質、又はFRET測定用融合蛋白質の何れかを含む、蛍光試薬キットが提供される。
配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する色素蛋白質KPはコモチイソンギンチャクより単離された赤紫色の色素蛋白質で4量体を形成する。KPの吸収スペクトルとmMiCyの蛍光スペクトルはFRETを起こすのに十分な重なり(スペクトラルオーバーラップ)を持った。本発明では、この多量体を形成する色素蛋白質(KP)と蛍光蛋白質(mMiCy)をリンカーでつなぎ、FRETの系を構築した。ドナーに蛍光蛋白質(mMiCy)を用い、アクセプターに色素蛋白質(KP)を用いたFRET測定系の構築を行い、1波長励起1波長測光によるCaspase3の活性測定系を確率した。アクセプターが蛍光を発しなければ、それだけ蛍光取得の波長域に空きができるため、複数のFRET測定が同時に可能となる。また、ライフタイムイメージングでFRETのドナーの蛍光寿命を測定すれば、蛍光を発しない色素蛋白質をアクセプターとして用いたFRET系は同時に複数のFRETを測定することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
(1)本発明の蛍光蛋白質
イシサンゴに属するミドリイシ(Acropora sp.)より単離された青緑蛍光蛋白質MiCyは2量体を形成する。細胞をラベルする際には蛍光蛋白質が何量体を形成しようと、蛍光蛋白質自身は細胞質中に漂っているだけなので問題は起こらないが、分子をラベルする際には問題が生じてくる場合が容易に考えられる。例えば、ラベルしたい分子が多量体を形成する場合、ターゲット分子と蛍光蛋白質分子が互いに多量体を形成し合い、巨大なポリマーを形成してしまう可能性がある。また、どちらかの多量体形成が阻害された時には、その多量体形成できない分子が本来の性質を失うことになりかねない。蛍光蛋白質を複数用いた分子内FRET(蛍光エネルギー共鳴移動)のプローブにおいても同じく、多量体形成蛍光蛋白質同士を一本のペプチド鎖として発現させた場合に、互いが多量体形成をしあうためにFRETの観測は困難をきわめる。それらを解決すべく、2量体を形成するMiCyに変異導入し、単量体として機能するmMiCyの作製を行った。
本発明の蛍光蛋白質(mMiCy)は、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質である。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有し、かつ単量体で存在するアミノ酸配列:
本発明の蛍光蛋白質(mMiCy)の蛍光ピークは496nmであり、吸収及び励起のピークは470nmである。なお、MiCyの蛍光ピークは495nm、吸収及び励起ピークは472nmであり、両者について蛍光、励起および吸収の性質は類似している。
本明細書で言う「1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列」における「1から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個程度を意味する。
本明細書で言う「蛍光を有する」および「蛍光蛋白質」とは、蛍光を発することができる全ての場合を包含し、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、pH感受性などの諸特性は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と比較して、変動していてもよいし、同様のままでもよい。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするDNAを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号2に記載したアミノ酸配列並びに配列番号1に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いてミドリイシ(Acropora sp.)由来のcDNAライブラリーまたはMiCy遺伝子などを鋳型にしてPCRを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAの一部の断片を上記したPCRにより得た場合には、作製したDNA断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするDNAを得ることができる。このDNAを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
(2)本発明のDNA
本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAの具体例としては、以下の何れかのDNAが挙げられる。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、単量体で存在する蛍光蛋白質をコードするDNA:
本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAのさらなる具体例としては、以下の何れかのDNAが挙げられる。
(a)配列番号1に記載の塩基配列;又は、
(b)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、単量体で存在する蛍光蛋白質をコードする塩基配列:
本発明のDNAは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって製造することもできる。本発明のDNA又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるPCR、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するDNAを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載されている。
(3)本発明の組み換えベクター
本発明のDNAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター(例えばプラスミド等)でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のDNAは、転写に必要な要素(例えば、プロモーター等)が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillusstearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Subtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのPR若しくはPLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、SV40プロモータ、MT−1(メタロチオネイン遺伝子)プロモータ、またはアデノウイルス2主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子1プロモータ、またはバキュウロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH2-4cプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。
また、本発明のDNAは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはTPI1ターミネータ若しくはADH3ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばSV40またはアデノウイルス5E1b領域由来のもの)、転写エンハンサ配列(例えばSV40エンハンサ)および翻訳エンハンサ配列(例えばアデノウイルス VA RNA をコードするもの)のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列を具備してもよく、その一例としてはSV40複製起点(宿主細胞が哺乳類細胞のとき)が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)またはシゾサッカロマイセス・ポンベTPI遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のDNA、プロモータ、および所望によりターミネータおよび/または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
(4)本発明の形質転換体
本発明のDNA又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のDNAまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のDNA構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞、BHK細胞、CHL細胞またはCHO細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたDNA配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる(例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1;及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載)。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたDNA構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
(5)本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするDNAを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号2に記載したアミノ酸配列及び配列番号1に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むDNA断片を鋳型にしてPCRを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAを構築するのに必要なDNA断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするDNA断片も入手する。
次いで、これらのDNA断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするDNAを得ることができる。このDNAを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質(被検アミノ酸配列)の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル(例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列)等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするDNAが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「pNEO」(P. Southern, and P. Berg (1982) J. MOl. Appl. Genet. 1:327)、「pCAGGS」(H.Niwa,K.Yamamura,and J.Miyazaki. Gene 108,193-200(1991))、「pRc/CMV」(インビトロゲン社製)、「pCDM8」(インビトロゲン社製)などが、酵母用ベクターでは、「pRS303」,「pRS304」,「pRS305」,「pRS306」,「pRS313」,「pRS314」,「pRS315」,[pRS316](R.S.Sikorski and P.Hieter (1989) Genetics 122: 19-27)、「pRS423」,「pRS424」,「pRS425」,「pRS426」(T.W.Christianson, R.S.Sikorski, M.Dante, J.H.Shero, and P. Hieter (1992) Gene 110: 119-122)などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、L細胞、BalbC-3T3細胞、NIH3T3細胞、CHO(Chinese hamster ovary)細胞、HeLa細胞、NRK(normal rat kidney)細胞、「Saccharomyces cerevisiae」などの酵母細胞や大腸菌(E. coli)細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質(蛋白質Xとする)とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Xの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするDNAで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Xの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Xとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡(カールツァイス社 アキシオフォト フィルターセット09)や画像解析装置(ATTO デジタルイメージアナライザー)などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光蛋白質の場合、励起光460〜480nm、蛍光480〜510nm程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却CCDカメラを使用する。冷却CCDカメラは、CCDを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
さらに本発明の蛍光蛋白質は、他の色素蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質を構築することができる。本発明の蛍光蛋白質に融合させる他の色素蛋白質の種類は特に限定されないが、本発明の蛍光蛋白質の蛍光スペクトルとFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を引き起こすのに十分な重なりをもつ吸収スペクトルを示す色素蛋白質を用いることが好ましい。
このような色素蛋白質の好ましい具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が挙げられる。
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列;又は、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号4に記載のアミノ酸配列と同等の吸光特性を有するアミノ酸配列:
分子間の相互作用を分析する手法の一つとして、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)が知られている。FRETでは、例えば、第一の蛍光蛋白質としてのシアン蛍光蛋白質(CFP)で標識した第一の分子と、第二の蛍光蛋白質としての黄色蛍光蛋白質(YFP)で標識した第二の分子とを共存させることにより、黄色蛍光蛋白質(YFP)をアクセプター分子として作用させ、シアン蛍光蛋白質(CFP)をドナー分子として作用させ、両者の間でFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)を生じさせることにより、第一の分子と第二の分子との間の相互作用を可視化することができる。即ち、FRETでは2種類の分子にそれぞれ異なる色素を導入し、エネルギーレベルの高い方の色素(ドナー分子)を選択的に励起し、その色素の蛍光を測定し、もう一方の色素(アクセプター分子)からの長波長蛍光も測定して、それらの蛍光変化量によって分子間の相互作用を可視化する。両方の色素が、2種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少とアクセプター分子の蛍光の増加が1波長励起2波長測光法により観測される。しかし、アクセプター分子に色素蛋白質を用いた場合は、両方の色素が、2種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少を生じ1波長励起1波長測光法により観測することができる。即ち、測定機器の簡易化が可能となる。配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する色素蛋白質(KP)(国際公開WO03/104461号公報)は、上記したようなFRETにおけるアクセプター分子としての利用価値が高い。なお、色素蛋白質(KP)をコードする塩基配列を配列番号3に示す。
(6)本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、DNA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも1種以上を含むことを特徴とする、蛍光試薬キットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
蛍光蛋白質又はDNAなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例1:単量体青緑蛍光蛋白質(mMiCy)の作製
イシサンゴに属するミドリイシ(Acropora sp.)より単離された青緑蛍光蛋白質MiCyは2量体を形成する。このような2量体を形成する蛍光蛋白質をFRETにおいてそのまま利用すると観測が困難になる等の問題が生じることから、2量体を形成するMiCyに変異導入し、単量体として機能するmMiCyの作製を行った。
(1)変異導入
MiCyのアミノ酸配列(国際公開WO2004/111235号公報)から多量体形成界面を予測し、多量体形成界面のアミノ酸を置換し、なおかつ蛍光特性を保持するようMiCyの単量体化を行った。点変異導入はMiCyを挿入した大腸菌発現ベクター(pRSET B)に点変異導入プライマーをもちいてPCRをかけることにより行った。PCRに用いたプライマーは5’側のリン酸化を行った。
(a)プライマーの5'リン酸化
反応液の組成:
100μM primer 2μl
10× T4 polynucleotide kinase buffer 5μl
100μM ATP 0.5μl
滅菌水 41.5μl
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) 1μl
上記の混合物を37℃で30分間インキュベートした。用いたプライマーは以下の通りである。
gaagggaaac agacgtccga attagtg (配列番号5)
gtgatcatca agnnnaaggg aaaacccctt (配列番号6)
atactgtcaa cannntttca atatggaaac (配列番号7)
catctttcat ggcacaaact ttcccgctg (配列番号8)
gggataagtc ctccgaaaaa atgagtg (配列番号9)
cagagatgcc agttacactc cacttac (配列番号10)
(nはa,t,g又はcを示す)
(b)点変異導入PCR
反応液の組成:
5'リン酸化プライマー 4μl
template(MiCy−pRSET B) 100ng
10× polymerase buffer 2.5μl
10× DNA ligase buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 1μl
polymerase(pfu)2.5U/μl 1μl
Taq DNA ligase 40U/μl 0.5μl
滅菌水で計50μlとする。
プログラム
サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
1)65℃ 5 min
2)95℃ 2 min
3)95℃ 20 sec
4)52℃ 20 sec
5)65℃ 8 min
6)75℃ 7 min
7)4℃ hold
3)〜5)を25サイクル
(c)Dpn1処理
PCR後のサンプルにDpn1を1μl加えて37℃に1時間インキュベートしてテンプレートプラスミドを切断した。
(d)大腸菌への形質転換
Dpn1処理後のサンプルを大腸菌JM109(DE3)に形質転換して変異導入後のMiCyを発現させた。
(e)変異導入後のMiCy(mMiCy)の解析
変異導入後のMiCy変異体の塩基配列を解析し、アミノ酸配列を決定した。結果として43番目のメチオニン(M)をトレオニン(T)に、51番目のセリン(S)をプロリン(P)に、66番目のアラニン(A)をバリン(V)に、129番目のバリン(V)をトレオニン(T)に、149番目のフェニルアラニン(F)をセリン(S)に、179番目のフェニルアラニン(F)をロイシン(L)に置換されたmMiCyを得た。mMiCyの塩基配列を配列番号1に示し、アミノ酸配列を配列番号2に示す。
大腸菌JM109(DE3)に発現させたリコンビナントmMiCy蛋白質はNi-NTAで精製した。リコンビナントmMiCy蛋白質の蛍光特性を解析した。mMiCyの蛍光ピークは496nm、吸収及び励起のピークは470nmを示した。MiCyの蛍光ピークは495nm、吸収及び励起ピークは472nmと、ほとんど蛍光、励起および吸収等の性質は変異導入後も変わらなかった。mMiCyの蛍光、励起、吸収及びpH感受性を図に示す(図1〜4)。蛍光ピークおよび吸収ピークのpHによる変動は一致し、量子収率に対するpH感受性は無いことが示された。pH感受性の測定は下記の緩衝液で希釈して蛍光スペクトル及び吸収スペクトルを測定し、ピーク値をプロットした。
各pHの緩衝液は次の通り、
pH4、5 : 酢酸バッファー
pH6 : MESバッファー
pH7、8 : HEPESバッファー
pH9、10 : グリシンバッファー
pH11 : リン酸バッファー
(2)分子量測定
mMiCyをpRSETBのBamH1―EcoR1サイトにサブクローニングし大腸菌JM109(DE3)に形質転換してリコンビナント蛋白質を発現させた。発現させたリコンビナント蛋白質はNi-NTAで精製した。精製したリコンビナント蛋白質mMiCyの分子量を超遠心分析により求めた。mMiCy蛋白質溶液を150mM KCl、50mM HEPES-KOH pH7.4で調製した。機器は超遠心機XL-1(ベックマン・コールター)を使用した。25000rpmで22時間遠心し、mMiCyの吸収極大(470nm)の吸収値を測定した。その結果、精製用タグ等の配列を含んだその分子量は34.8kDaと算出され、これはアミノ酸配列から予測される29.8kDaとほぼ一致し、mMiCyは多量体を形成しない単量体であることが確認された。2量体を形成するMiCyは超遠心分析から59.7kDaと算出された(図5及び6)。
実施例2:多量体を形成する色素蛋白質KPと蛍光蛋白質mMiCyを用いたFRET測定系構築
現行のFRET測定系では蛍光物質または発光物質をドナーに、蛍光物質にアクセプターを使用するのが通常であるが、アクセプター側は吸収特性があれば蛍光を発しなくてもFRETの測定は可能である。逆にアクセプターが蛍光を発しなければ、それだけ蛍光取得の波長域に空きができるために、複数のFRET測定が可能となる。また、蛍光寿命を測定するライフタイムイメージングではFRETのドナーの蛍光寿命を測定すればFRETが起こっているか否かを判別できるため、同じく、蛍光を発しない色素蛋白質をアクセプターに用いたFRET系は同時に複数のFRETを測定可能とする。そこでドナーに蛍光蛋白質(mMiCy)を用い、アクセプターに色素蛋白質(KP)を用いたFRET測定系の構築を行なった。
色素蛋白質KP(塩基配列を配列番号3に示し、アミノ酸配列を配列番号4に示す)はコモチイソギンチャクより単離された赤紫色の色素蛋白質で4量体を形成した。KPの吸収スペクトルとmMiCyの蛍光スペクトルはFRETをおこすのに十分な重なり(スペクトラルオーバーラップ)をもった(図7)。この多量体を形成する色素蛋白質KPとmMiCyをリンカーでつなぎ、FRETの系を構築した。リンカー配列にはCaspase3またはCaspase7の認識配列であるDEVD(Asp-Glu-Val-Asp)を含み、長さの違うものを8種作製した。Caspase3のリンカー切断に伴うFRETの変化をmMiCyの蛍光シグナル(496nm)から得た。
(a)リンカーの設計
以下、8種(3-3〜5-4)のリンカー(アミノ酸配列)を設計し、KPとmMiCyの間に挿入し発現させた。
3-3: SGGDEVDGTG (配列番号11)
3-4: SGGDEVDGTGG (配列番号12)
3-5: SGGDEVDGTGGS (配列番号13)
4-3: GSGGDEVDGTG (配列番号14)
4-4: GSGGDEVDGTGG (配列番号15)
4-5: GSGGDEVDGTGGS (配列番号16)
5-3: GGSGGDEVDGTG (配列番号17)
5-4: GGSGGDEVDGTGG (配列番号18)
(b)リコンビナント融合蛋白質の作製
設計したリンカーのN末端側にmMiCyを、C末端側にKP(国際公開WO03/104461号公報)をつなぎ、[mMiCy-リンカー-KP]の形でpRSETBのBamH1―EcoR1サイトにサブクローニングし大腸菌JM109(DE3)に形質転換してリコンビナント蛋白質を発現させた。発現させたリコンビナント融合蛋白質はNi-NTAで精製した。精製したリコンビナント融合蛋白質を用いてCaspase3の活性測定を行った。
リンカー3-3、3-4、3-5、4-3、4-4、4-5、5-3、及び5-4をそれぞれ用いた場合のリコンビナント融合蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号20、22、24、26、28、30、32及び34に示す、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号19、21、23、25、27、29、31及び33に示す。
(c)Caspase3の活性測定
Caspase3の活性はFRETの変化としてmMiCyの蛍光値の増加から得た。活性測定にはリコンビナントActive−Caspase3(MBL:BV-1083-9)を用いた。20mM HEPES-KOH pH7.4、100mM NaCl、0.1%CHAPS、10%sucrose溶液中に各リコンビナント融合蛋白質を0.25mg/mlになるようにして、リコンビナントActive−Caspase3を1unit加えて30度で反応させた。反応液を30分ごとにサンプリングし50倍希釈して440nmで励起したときの蛍光の増加を測定した。mMiCyの蛍光ピーク(496nm)をプロットした(図8及び9)。また、蛍光増加の比が高かったリンカー3-4とリンカー4-5を用いたリコンビナント融合蛋白質でCaspase3によるペプチド鎖の切断を行い、12.5%アクリルアミドゲルで電気泳動した。60kDa(融合蛋白質)が約30kDaの2本のバンド(KPとmMiCy(両者のアミノ酸数はほとんど変わらないが、mMiCyの方が3.8kDaの精製用タグ配列等のついた分大きい))として検出され、Caspase3によるペプチド鎖の切断を確認した(図10)。色素蛋白質KPと蛍光蛋白質mMiCyを用いたFRET測定系で1波長励起1波長測光によるCaspase3の活性測定ができた。
図1は、mMiCyの吸収スペクトル(pH8)を示す。 図2は、mMiCyの励起スペクトル(EX)と蛍光スペクトル(EM)を示す。 図3は、mMiCyのpH感受性(蛍光)を示す。 図4は、mMiCyのpH感受性(吸収)を示す。 図5は、超遠心分析(mMiCy:34.8kDa)を示す。 図6は、超遠心分析(MiCy:59.7kDa)を示す。 図7は、mMiCyの励起スペクトル(EX)、蛍光スペクトル(EM)およびKPの吸収スペクトル(abs)を示す。 図8は、caspase3によるペプチド切断に伴う蛍光の回復(495nm)を示す。 図9は、caspase3によるペプチド切断に伴う蛍光増加の割合(切断前を1とする)を示す。 図10は、SDS-PAGEによる切断の確認を示す。
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Fluorescent protein
<130> A41845A
<160> 34
<210> 1
<211> 696
<212> DNA
<213> Acropora sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(696)
<223>
<400> 1
atg tct tat tca aag caa ggc atc gca caa gaa atg cgg acg aaa tac 48
Met Ser Tyr Ser Lys Gln Gly Ile Ala Gln Glu Met Arg Thr Lys Tyr
1 5 10 15
cgt atg gaa ggc agt gtc aat ggc cat gag ttc acg atc gaa ggt gta 96
Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Val
20 25 30
gga act gga aac cct tac gaa ggg aaa cag acg tcc gaa tta gtg atc 144
Gly Thr Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Ser Glu Leu Val Ile
35 40 45
atc aag cct aag gga aaa ccc ctt cca ttc tcc ttt gac ata ctg tca 192
Ile Lys Pro Lys Gly Lys Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser
50 55 60
aca gtc ttt caa tat gga aac aga tgc ttc aca aag tac cct gca gac 240
Thr Val Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Cys Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp
65 70 75 80
atg cct gac tat ttc aag caa gca ttc cca gat gga atg tca tat gaa 288
Met Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly Met Ser Tyr Glu
85 90 95
agg tca ttt cta ttt gag gat gga gga gtt gct aca gcc agc tgg agc 336
Arg Ser Phe Leu Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Ala Ser Trp Ser
100 105 110
att cgt ctc gaa gga aat tgc ttc atc cac aat tcc atc tat cat ggc 384
Ile Arg Leu Glu Gly Asn Cys Phe Ile His Asn Ser Ile Tyr His Gly
115 120 125
aca aac ttt ccc gct gat gga ccc gta atg aag aag cag aca att ggc 432
Thr Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Gln Thr Ile Gly
130 135 140
tgg gat aag tcc tcc gaa aaa atg agt gtg gct aaa gag gtg cta aga 480
Trp Asp Lys Ser Ser Glu Lys Met Ser Val Ala Lys Glu Val Leu Arg
145 150 155 160
ggt gat gtg act cag ttt ctt ctg ctc gaa gga ggt ggt tac cag aga 528
Gly Asp Val Thr Gln Phe Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly Tyr Gln Arg
165 170 175
tgc cag tta cac tcc act tac aaa aca gag aag cca gtc gca atg ccc 576
Cys Gln Leu His Ser Thr Tyr Lys Thr Glu Lys Pro Val Ala Met Pro
180 185 190
ccg agt cat gtc gta gaa cat caa att gtg agg acc gac ctt ggc caa 624
Pro Ser His Val Val Glu His Gln Ile Val Arg Thr Asp Leu Gly Gln
195 200 205
act gca aaa ggc ttc aag gtc aag ctg gaa gaa cat gct gag gct cat 672
Thr Ala Lys Gly Phe Lys Val Lys Leu Glu Glu His Ala Glu Ala His
210 215 220
gtt aac cct ttg aag gtt aaa taa 696
Val Asn Pro Leu Lys Val Lys
225 230
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> Acropora sp.
<400> 2
Met Ser Tyr Ser Lys Gln Gly Ile Ala Gln Glu Met Arg Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Val
20 25 30
Gly Thr Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Ser Glu Leu Val Ile
35 40 45
Ile Lys Pro Lys Gly Lys Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser
50 55 60
Thr Val Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Cys Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp
65 70 75 80
Met Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly Met Ser Tyr Glu
85 90 95
Arg Ser Phe Leu Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Ala Ser Trp Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Glu Gly Asn Cys Phe Ile His Asn Ser Ile Tyr His Gly
115 120 125
Thr Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Gln Thr Ile Gly
130 135 140
Trp Asp Lys Ser Ser Glu Lys Met Ser Val Ala Lys Glu Val Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asp Val Thr Gln Phe Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly Tyr Gln Arg
165 170 175
Cys Gln Leu His Ser Thr Tyr Lys Thr Glu Lys Pro Val Ala Met Pro
180 185 190
Pro Ser His Val Val Glu His Gln Ile Val Arg Thr Asp Leu Gly Gln
195 200 205
Thr Ala Lys Gly Phe Lys Val Lys Leu Glu Glu His Ala Glu Ala His
210 215 220
Val Asn Pro Leu Lys Val Lys
225 230
<210> 3
<211> 690
<212> DNA
<213> Cnidopus japonicus
<400> 3
atg gct tca atg att aaa gac gtt atg cgc ttc aag atg aac atg gaa 48
Met Ala Ser Met Ile Lys Asp Val Met Arg Phe Lys Met Asn Met Glu
1 5 10 15
ggg acg gtt aac ggc cac cac ttc aag tgt gaa gct gat gga gag ggc 96
Gly Thr Val Asn Gly His His Phe Lys Cys Glu Ala Asp Gly Glu Gly
20 25 30
aag cca tat gaa ggg act caa ctc gga aga ata agg gtc acc gaa ggc 144
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Leu Gly Arg Ile Arg Val Thr Glu Gly
35 40 45
ggg cca ttg ccg ttt tct ttc gac atc ttg tcg act tgc act caa tat 192
Gly Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser Thr Cys Thr Gln Tyr
50 55 60
gga agc aag acc atg atc aag cat ttg tcc ggg att cca gac tac ttt 240
Gly Ser Lys Thr Met Ile Lys His Leu Ser Gly Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
aag cag tct ttt cca gaa gga ttc acc tgg gaa agg aac aca atc tat 288
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Asn Thr Ile Tyr
85 90 95
gag gat ggt ggt cac ctc aca gct cac caa gac act agt ctt aag gga 336
Glu Asp Gly Gly His Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Lys Gly
100 105 110
gat tgc ctg atc tat aaa gtg aaa gtc ctt gga ggt aat ttt cct gcc 384
Asp Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Gly Asn Phe Pro Ala
115 120 125
aat ggc cct gtg atg cag aag aag agc aaa gga tgg gaa ccc tgt acc 432
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Ser Lys Gly Trp Glu Pro Cys Thr
130 135 140
gaa atg ctt tat cca cgt gat gga gtg ctt tgt ggc caa aca ttg atg 480
Glu Met Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Cys Gly Gln Thr Leu Met
145 150 155 160
gca ctt aaa tgc gcc aat ggt aaa aat ctg act tgc cag cta aga tct 528
Ala Leu Lys Cys Ala Asn Gly Lys Asn Leu Thr Cys Gln Leu Arg Ser
165 170 175
act tac agg tcc aga aaa caa gcc agt gca ttg cag aca cca ggc ttc 576
Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Gln Ala Ser Ala Leu Gln Thr Pro Gly Phe
180 185 190
cat ttc gga gac cat cgt att gag ata ctc aag gaa gca gag ggg ggc 624
His Phe Gly Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys Glu Ala Glu Gly Gly
195 200 205
aat tac ttt gag cag cac gaa aca tca gtc gcc agg tac tgt gat gtt 672
Asn Tyr Phe Glu Gln His Glu Thr Ser Val Ala Arg Tyr Cys Asp Val
210 215 220
gcc ccg tca aag cac tga 690
Ala Pro Ser Lys His
225
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Cnidopus japonicus
<400> 4
Met Ala Ser Met Ile Lys Asp Val Met Arg Phe Lys Met Asn Met Glu
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Gly His His Phe Lys Cys Glu Ala Asp Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Leu Gly Arg Ile Arg Val Thr Glu Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser Thr Cys Thr Gln Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Met Ile Lys His Leu Ser Gly Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Asn Thr Ile Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly His Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Lys Gly
100 105 110
Asp Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Gly Asn Phe Pro Ala
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Ser Lys Gly Trp Glu Pro Cys Thr
130 135 140
Glu Met Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Cys Gly Gln Thr Leu Met
145 150 155 160
Ala Leu Lys Cys Ala Asn Gly Lys Asn Leu Thr Cys Gln Leu Arg Ser
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Gln Ala Ser Ala Leu Gln Thr Pro Gly Phe
180 185 190
His Phe Gly Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys Glu Ala Glu Gly Gly
195 200 205
Asn Tyr Phe Glu Gln His Glu Thr Ser Val Ala Arg Tyr Cys Asp Val
210 215 220
Ala Pro Ser Lys His
225
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 5
gaagggaaac agacgtccga attagtg 27
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<220>
<222> (13), (14) and (15)
<223> any nucleotide
<400> 6
gtgatcatca agnnnaaggg aaaacccctt 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<220>
<222> (13), (14) and (15)
<223> any nucleotide
<400> 7
atactgtcaa cannntttca atatggaaac 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 8
catctttcat ggcacaaact ttcccgctg 29
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 9
gggataagtc ctccgaaaaa atgagtg 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 10
cagagatgcc agttacactc cacttac 27
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 11
Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 12
Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 13
Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 14
Gly Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 15
Gly Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 16
Gly Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 17
Gly Gly Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide
<400> 18
Gly Gly Ser Gly Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Gly Gly
1 5 10


<210> 19
<211> 1413
<212> DNA
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused DNA
<220>
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<223>
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<223>
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Ile Lys Pro Lys Gly Lys Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser
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Ile Arg Leu Glu Gly Asn Cys Phe Ile His Asn Ser Ile Tyr His Gly
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Thr Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Gln Thr Ile Gly
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Gly Gly Ser Met Ala Ser Met Ile Lys Asp Val Met Arg Phe Lys Met
245 250 255
Asn Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His His Phe Lys Cys Glu Ala Asp
260 265 270
Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Leu Gly Arg Ile Arg Val
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<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused DNA
<220>
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<223>
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<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused DNA
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gat gga gag ggc aag cca tat gaa ggg act caa ctc gga aga ata agg 864
Asp Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Leu Gly Arg Ile Arg
275 280 285
gtc acc gaa ggc ggg cca ttg ccg ttt tct ttc gac atc ttg tcg act 912
Val Thr Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser Thr
290 295 300
tgc act caa tat gga agc aag acc atg atc aag cat ttg tcc ggg att 960
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cca gac tac ttt aag cag tct ttt cca gaa gga ttc acc tgg gaa agg 1008
Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg
325 330 335
aac aca atc tat gag gat ggt ggt cac ctc aca gct cac caa gac act 1056
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Ser Leu Lys Gly Asp Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Gly
355 360 365
aat ttt cct gcc aat ggc cct gtg atg cag aag aag agc aaa gga tgg 1152
Asn Phe Pro Ala Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Ser Lys Gly Trp
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gaa ccc tgt acc gaa atg ctt tat cca cgt gat gga gtg ctt tgt ggc 1200
Glu Pro Cys Thr Glu Met Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Cys Gly
385 390 395 400
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cag cta aga tct act tac agg tcc aga aaa caa gcc agt gca ttg cag 1296
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420 425 430
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tac tgt gat gtt gcc ccg tca aag cac tga 1422
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused protein
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<210> 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused DNA
<220>
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<223>
<400> 31
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275 280 285
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290 295 300
act caa tat gga agc aag acc atg atc aag cat ttg tcc ggg att cca 960
Thr Gln Tyr Gly Ser Lys Thr Met Ile Lys His Leu Ser Gly Ile Pro
305 310 315 320
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Asp Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Asn
325 330 335
aca atc tat gag gat ggt ggt cac ctc aca gct cac caa gac act agt 1056
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435 440 445
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465 470
<210> 32
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused protein
<400> 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1422)
<223>
<400> 33
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435 440 445
gca gag ggg ggc aat tac ttt gag cag cac gaa aca tca gtc gcc agg 1392
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465 470
<210> 34
<211> 473
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant fused protein
<400> 34
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435 440 445
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450 455 460
Tyr Cys Asp Val Ala Pro Ser Lys His
465 470


Claims (9)

  1. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
    (a)配列番号2に記載のアミノ酸配列;又は、
    (b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有し、かつ単量体で存在するアミノ酸配列:
  2. 以下の何れかのDNA。
    (a)配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするDNA;又は、
    (b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、単量体で存在する蛍光蛋白質をコードするDNA:
  3. 以下の何れかの塩基配列を有するDNA。
    (a)配列番号1に記載の塩基配列;又は、
    (b)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、単量体で存在する蛍光蛋白質をコードする塩基配列:
  4. 請求項2又は3に記載のDNAを有する組み換えベクター。
  5. 請求項2又は3に記載のDNA又は請求項4に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
  6. 請求項1に記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とを融合させて得られる融合蛋白質。
  7. 請求項1に記載の蛍光蛋白質の蛍光スペクトルとFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を引き起こすのに十分な重なりをもつ吸収スペクトルを示す色素蛋白質と、請求項1に記載の蛍光蛋白質とをリンカー配列を介して連結することにより得られるFRET測定用融合蛋白質。
  8. 色素蛋白質が、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質である、請求項7に記載のFRET測定用融合蛋白質。
    (a)配列番号4に記載のアミノ酸配列;又は、
    (b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の吸光特性を有するアミノ酸配列:
  9. 請求項1に記載の蛍光蛋白質、請求項2又は3に記載のDNA、請求項4に記載の組み換えベクター、請求項5に記載の形質転換体、請求項6に記載の融合蛋白質、又は請求項7若しくは8に記載のFRET測定用融合蛋白質の何れかを含む、蛍光試薬キット。
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