CN102597746A - Fret测量方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种FRET测量方法及装置，能够求出在标记作为测量对象的活细胞的蛋白质的供体分子中与受体分子结合且发生FRET的供体分子的比例，其中，对于第一分子的浓度和第二分子的浓度比不同的多个预先测量样品，计算出第一分子的荧光寿命，并计算出第一分子的荧光寿命的最小值；照射对强度进行了时间调制的激光，并测量出测量样品被激光照射而发出的荧光；利用所测量的荧光信号，计算出第一分子的荧光寿命；利用第一分子的荧光寿命的最小值和所计算出的第一分子的荧光寿命，计算出测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。

Description

FRET测量方法及装置

技术领域

本发明涉及通过激光照射供体分子（第一分子）接收能量、能量从供体分子转移到受体分子（第二分子）的FRET（Fluorescence Resonance EnergyTransfer:萤光共振能量转移）的测量方法及装置。具体来说，涉及关于供体分子和受体分子的对，通过荧光测量两个分子之间的相互作用的FRET测量技术。

背景技术

目前，作为医疗、制新药、食品产业中后基因的相关技术，蛋白质的功能分析变得越来越重要。特别是，为了分析细胞作用，需要研究活细胞中活体物质的蛋白质与其它蛋白质或低分子化合物之间的相互作用（结合、分离）。

利用荧光共振能量转移（FRET）现象对活细胞中活体物质的蛋白质和其它蛋白质或低分子化合物之间的相互作用进行分析。对通过FRET现象产生的荧光进行测量，由此能够对几纳米波段中的分子间的相互作用进行测量。

例如，公开了一种利用FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ^* _d和受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ_d求出表示从供体分子向受体分子的能量转移程度的FRET效率的技术（专利文献1）。

在上述专利文献1中FRET效率通过1－τ^* _d/τ_d求出。

专利文献1：特开2007-240424号公报

发明内容

但是，上述FRET效率受到相对于供体分子浓度的受体分子浓度比例的影响，因此利用上述技术难以定量求出包含在细胞等的蛋白质的相互作用的强度。

因此，本发明的目的在于提供一种不受相对于供体分子浓度的受体分子浓度比例的影响的情况下能够定量进行FRET测量的FRET测量方法及装置。

为了解决上述课题，本发明的FRET测量方法将激光照射在用第一分子和第二分子进行标记的测量样品上，由此测量出能量从第一分子向第二分子转移的FRET，其特征在于，包括如下步骤：最短荧光寿命计算步骤，相对于第一分子浓度和第二分子浓度比不同的多个预先测量样品计算出第一分子的荧光寿命，并计算出第一分子的荧光寿命的最小值；照射步骤，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；测量步骤，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；第一分子荧光寿命计算步骤，利用所述测量步骤中被测量的荧光信号计算出第一分子的荧光寿命；FRET发生率计算步骤，利用在所述最短荧光寿命计算步骤中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和计算出的所述第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。

另外，所述FRET发生率计算步骤优选的是在所述FRET发生率计算步骤中进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。

另外，本发明的FRET测量方法包括观察矩阵计算步骤，在该步骤中从所述测量步骤中测量的荧光信号，计算出在所述照射步骤中用于求出第一分子被激光照射而发出的荧光信息和第二分子发出的荧光信息的矩阵，所述观察矩阵计算步骤优选包括：第一步骤，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号求出所述矩阵成分的一部分；第二步骤，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号求出所述矩阵成分的一部分。

另外，本发明的FRET测量方法优选的是包括解离常数计算步骤，在该步骤中利用所述FRET发生率计算步骤中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子结合情况的解离常数。

另外，计算所述第一分子荧光寿命的步骤优选的是利用所述测量步骤中被测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差计算出第一分子的荧光寿命。

另外，在所述第一步骤中，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分，在所述第二步骤中，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分。

另外，本发明的FRET测量方法包括：第一分子浓度计算步骤，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；第二分子浓度计算步骤，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子浓度；在所述解离常数计算步骤中优选的是，利用在所述第一分子浓度计算步骤中计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算步骤中计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。

另外，为了解决上述课题，本发明的FRET测量装置将激光照射在用第一分子和第二分子标记的测量样品上，由此测量出能量从第一分子向第二分子转移的FRET，其特征在于，包括：激光光源部，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；测量部，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；荧光寿命计算部，利用所述测量部测量的荧光信号计算出第一分子荧光寿命；最短荧光寿命计算部，利用第一分子浓度和第二分子浓度比不同的多个预先测量样品中的第一分子荧光寿命，计算出第一分子荧光寿命的最小值；FRET发生率计算部，利用在所述最短荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和在所述荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。

另外，所述FRET发生率计算部优选的是进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。

另外，本发明的FRET测量装置包括观察矩阵计算部，在该步骤中从所述测量部中测量的荧光信号计算出用于求出在所述照射步骤中通过激光照射而第一分子发出的荧光的信息和第二分子发出的荧光的信息的矩阵，在所述观察矩阵计算部，优选的是，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分，并且利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分。

另外，本发明的FRET测量装置优选的是包括解离常数计算部，在该部中利用在所述FRET发生率计算部中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子的结合状况的解离常数。

另外，所述荧光寿命计算部优选的是利用在所述测量部测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差计算出第一分子的荧光寿命。

另外，优选的是，所述观察矩阵计算部利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光，用所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分，并且利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光，用所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分。

另外，优选的是，本发明的FRET测量装置包括：第一分子浓度计算部，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；第二分子浓度计算部，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子的浓度；所述解离常数计算部利用在所述第一分子浓度计算部计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算部计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。

根据本发明的FRET测量方法以及装置，在不受相对于供体分子的浓度的受体分子的浓度比的影响下能够定量进行FRET测量。

附图说明

图1为本发明的FRET测量装置的一个实施方式的流式细胞仪的概略构成图；

图2为表示供体分子和受体分子的能量吸收光谱和荧光发射光谱的一例的图；

图3为表示图1所示的流式细胞仪的测量部的一例的概略构成图；

图4为表示图1所示的流式细胞仪的控制和处理部的一例的概略构成图；

图5为表示图1所示的流式细胞仪的分析装置的一例的概略构成图；

图6为表示FRET测量流程的一例的图；

图7为表示FRET效率和α关系的图；

图8为表示FRET发生时的荧光发光动力学的模式图；

图9为表示观察矩阵的测量例的图；

图10为测量最大FRET效率和最短荧光寿命的流程图的一例；

图11为测量观察矩阵的流程图的一例；

图12为样品测量的流程图的一例。

符号说明

10流式细胞仪

12样品

20管道

22回收容器

30激光光源部

40、50测量部

51透镜系统

52分色镜

53、54带通滤波器

55、56光电转换器

100控制和处理部

110信号生成部

112振荡器

114功率分配器

116、118放大器

120信号处理部

122、124放大器

126相位差检测部

130控制部

132低通滤波器

134放大器

136A/D转换器

138系统控制部

150分析装置

152CPU

154存储器

156输入输出端口

158荧光寿命计算单元

160FRET效率计算单元

162最短荧光寿命计算单元

164FRET发生率计算单元

166观察矩阵计算单元

168第一分子浓度计算单元

170第二分子浓度计算单元

172解离常数计算单元

200显示器

具体实施方式

下面，对本发明的FRET测量方法和装置进行详细说明。

图1为本发明的FRET测量装置的一个实施方式的流式细胞仪10的概略构成图。

本发明的流式细胞仪10例如将激光照射在由供体分子和受体分子标记作为测量对象的活细胞中的蛋白质的样品12（测量样品）上，并测量样品12发出的荧光。流式细胞仪10通过利用被测量的荧光信号求出在供体分子中发生FRET的供体分子的比例的κ_FRET。进一步，流式细胞仪10除了κ_FRET之外还求出供体分子的浓度、受体分子的浓度、解离常数Ｋ_d的值。如图1所示，流式细胞仪10包括管道20、激光光源部30、测量部40、50、控制和处理部100、分析装置150。

在管道20中，使形成高速流的鞘液与样品12一起流动。在管道20的出口处设置有回收样品12的回收容器22。

激光光源部30向样品12照射对强度进行了时间调制的激光。通过向样品12照射激光，供体分子和受体分子分别吸收能量。例如，供体分子为CFP（CyanFluorescent Protein）、受体分子为YFP（Yellow Fluorescent Protein）时，使用供体分子主要吸收能量的波长为405nm~450nm的激光。激光光源部30为例如半导体激光激光器。激光光源部30发射的激光的输出为例如5mW~100mW。

在此，对激光光源部30照射的激光的波长和供体分子以及受体分子吸收能量的波长的关系、以及FRET的发生进行说明。

图2为表示供体分子为CFP、受体分子为YFP时的能量吸收光谱和荧光发射光谱的图。曲线A₁为供体分子的能量吸收光谱，曲线A₂为供体分子荧光发射光谱。另外，曲线B₁为受体分子的能量吸收光谱，曲线B²为受体分子的荧光发射光谱。

如图2所示，供体分子主要吸收能量的波段为405nm~450nm。另外，受体分子主要吸收能量的波段为470nm~530nm。

一般来说，当供体分子和受体分子的距离为2nm以下时，通过激光照射供体分子吸收的能量的一部分通过库伦相互作用向受体分子移动。受体分子吸收通过库伦相互作用从供体分子转移的能量而被激发，由此发出荧光。该现象被称之为荧光共振能量转移（FRET）。

作为供体分子使用CFP，作为受体分子使用YFP时也发生FRET。即，通过库伦相互作用能量从供体分子向受体分子转移，由此受体分子被激发而发出荧光。

进一步，如图2所示，供体分子的能量吸收光谱A₁和受体分子的能量吸收光谱B₁部分重叠。因此，受体分子发出通过激光直接激发而导致的荧光。

再返回图1，测量部40按照夹着管道20与激光光源部30相对而置的方式配置。测量部40包括光电转换器，通过在测量点上通过的样品12使激光发生前向散射，由此输出样品12通过测量点的检测信号。从测量部40输出的信号供给到控制和处理部100。从测量部40供给到控制和处理部100的信号作为通知样品12通过管道20中的测量点的时间的触发信号来使用。

测量部50配置在通过测量点、相对于发射自激光光源部30的激光发射方向呈正交的平面和通过测量点、相对于管道20中的样品12移动方向呈正交的平面的交线上。测量部50包括光电倍增管或雪崩光电二极管等光电转换器，以接收样品在测量点被激光照射后所发出的荧光。

在此，参照图3详细说明测量部50的构成。如图3所示，测量部50包括透镜系统51、分色镜52、带通滤波器53、54、光电转换器55、56。

透镜系统51将样品12发出的荧光进行聚焦。分色镜52按照将受体分子发出的荧光进行透射、将供体分子发出的荧光反射的方式设定反射、透射波长。

带通滤波器53、54被设置在光电转换器55、56的受光面的前面，带通滤波器53、54仅使具有规定波段的荧光透射。具体来说，带通滤波器53按照透射主要是供体分子发出荧光的波段（图2中的由A表示的波段）的荧光的方式设定。另外，带通滤波器54按照透射主要是受体分子发出荧光的波段（图2中的由B表示的波段）的荧光的方式设定。在下面的说明中，在图2中由A表示的波段称之为“供体波段”，由B表示的波段称之为“受体波段”。

另外，如图2所示，表示供体分子的荧光发射光谱的曲线A₂通过受体波段，表示受体分子的荧光发射光谱的曲线B₂通过供体波段。因此，在按照透射供体波段的荧光的方式设定的带通滤波器53中，不仅透射供体分子发出的荧光，也少量地透射受体分子发出的荧光。同样，在按照透射受体分子发出的荧光的方式设定的带通滤波器54中，不仅透射受体分子发出的荧光，也少量地透射供体分子发出的荧光。如后面所述，分析装置150利用观察矩阵校正包含各波段上漏泄的荧光的荧光信号，并求出供体分子发出的荧光的信息和受体分子发出的荧光的信息。

光电转换器55、56将所接收的光转换成电信号。光电转换器55、56为包括例如光电倍增管的传感器。光电转换器55、56所接收的荧光比强度调制的激光相位滞后。因此，光电转换器55、56接收具有相对于强度调制的激光的相位差信息的光信号，并将其转换成电信号。从光电转换器55、56输出的信号（荧光信号）供给到控制和处理部100。

在此，参照图4详细说明控制和处理部100的构成。如图4所示，控制和处理部100包括信号生成部110、信号处理部120、控制部130。

信号生成部110生成用于将激光强度进行时间调制的调制信号。调制信号为例如规定频率的正弦波信号，被设定为10MHz~100MHz的范围的频率。

信号生成部110包括振荡器112、功率分配器114、放大器116、118。通过振荡器112生成的调制信号通过功率分配器114分成后供给到激光光源部30和信号处理部120。信号生成部110将调制信号供给到信号处理部120，这是因为如后所述，作为测量相对于调制信号的荧光信号的相位差的参照信号来使用。另外，调制信号作为用于调制激光光源部30发射的激光振幅的信号使用。

信号处理部120利用从光电转换器55、56输出的荧光信号，抽样样品12发出的荧光的信息。样品12发出的荧光信息为例如与荧光强度相关的信息或与荧光寿命相关的信息。信号处理部120包括放大器122、124、相位差测量器126。

放大器122、124将从光电转换器55、56输出的信号进行放大，将被放大的信号输出至相位差检测器126。

相位差检测器126针对从光电转换器55、56输出的各荧光信号检测出相对于调制信号的相位差。相位差检测器126包括未图示的IQ混频器。IQ混频器通过将参照信号和荧光信号相乘来计算出包含荧光信号的cos成分（实数部）和高频成分的处理信号。另外，IQ混频器通过将参照信号的相位位移90度后的信号和荧光信号的相乘来计算出包含荧光信号的sin成分（虚数部）和高频成分的处理信号。

控制部130按照信号生成部110生成具有规定频率的正弦波信号的方式控制信号生成部110。另外，控制部130从通过信号处理部所输出的包含荧光信号的cos成分和sin成分的处理信号中去除高频成分而求出荧光信号的cos成分和sin成分。

控制部130包括低通滤波器132、放大器134、A/D转换器136、系统控制器138。低通滤波器132从信号处理部输出的包含荧光信号的cos成分、sin成分和高频成分的信号中去除高频成分。放大器134对通过低通滤波器132去除高频成分的信号的荧光信号的cos成分、sin成分的处理信号进行放大，并将其输出至A/D转换器136。A/D转换器136将对荧光信号的cos成分、sin成分的处理信号进行取样，并供给至分析装置150。系统控制器138接收将从测量部40输出的触发信号的输入。另外，系统控制器138控制振荡器112和A/D转换器136。

分析装置150从荧光信号的cos成分（实数部）、sin成分（虚数部）的处理信号计算出荧光寿命、FRET效率、最短荧光寿命、FRET发生率、观察矩阵、供体分子的浓度、受体分子的浓度、解离常数等。

分析装置150是在计算机上使规定程序启动的装置。图5为表示分析装置150的概略构成图。如图5所示，分析装置150包括CPU152、存储器154、输入输出端口156、荧光寿命计算单元158、FRET效率计算单元160、最短荧光寿命计算单元162、FRET发生率计算单元164、观察矩阵计算单元166、第一分子浓度计算单元168、第二分子浓度计算单元170、解离常数计算单元172。

另外，在分析装置150上连接有显示器200。

CPU152为设置在计算机上的运算处理器。CPU152实质地执行荧光寿命计算单元158、FRET效率计算单元160、最短荧光寿命计算单元162、FRET发生率计算单元164、观察矩阵计算单元166、第一分子浓度计算单元168、第二分子浓度计算单元170、解离常数计算单元172的各种计算。

存储器154包括：ROM，存储有通过在计算机上执行来形成荧光寿命计算单元158、FRET效率计算单元160、最短荧光寿命计算单元162、FRET发生率计算单元164、观察矩阵计算单元166、第一分子浓度计算单元168、第二分子浓度计算单元170、解离常数计算单元172的程序；RAM，存储通过这些单元计算的处理结果或从输入输出端口156供给的数据。

输入输出端口156用于接收提供自控制部130的荧光信号的cos成分（实数部）、sin成分（虚数部）的值的输入。另外，输入输出端口156将通过各单元计算出的处理结果输出到显示器200上。

显示器200显示通过各单元求出的各种信息或处理结果等。

荧光寿命计算单元158利用通过测量部50测量的荧光信号计算出供体分子的荧光寿命。例如，荧光寿命计算单元158从由控制部130供给的荧光信号的cos成分以及sin成分的值求出相对于调制信号的荧光信号的相位差。另外，荧光寿命计算单元158利用所求出的相位差计算出供体分子的荧光寿命、受体分子的荧光寿命。具体来说，荧光寿命计算单元158通过将相位差的tan成分用调制信号的角频率相除来计算荧光寿命。荧光寿命由被激光照射而发出的荧光成分为一次滞后系统的弛豫响应时的荧光弛豫时间常数表示。

进一步，荧光寿命计算单元158计算出后述的受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ_D、FRET发生时的供体分子的平均荧光寿命τ^* _D、受体分子的荧光寿命τ_Ａ。

FRET效率计算单元160利用在荧光寿命计算单元158计算出的受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ_D、FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ^* _D，计算出表示根据FRET的能量转移程度的FRET效率E^*。具体来说，FRET效率计算单元160计算由后述的式（14）规定的FRET效率E^*。

最短荧光寿命计算单元162计算作为FRET效率E^*的最大值的最大FRET效率E_max。如后述，FRET效率E^*根据由式（16）定义的活细胞中的供体分子的浓度C_D[M]和受体分子的浓度C_A[M]之比α进行变化。最短荧光寿命计算单元162利用FRET效率计算单元160相对于多个α计算出的FRET效率E^*的结果，计算出最大FRET效率E_max。

另外，如后述的式（18）所示，如果最大FRET效率E_max被定下来，则作为供体分子的荧光寿命的最小值的最短荧光寿命τ_Dmin也被定下来，最短荧光寿命计算单元162利用计算出的最大FRET效率E_max计算出最短荧光寿命τ_Dmin。

FRET发生率计算单元164计算出被后述的式（7）定义、且在活细胞中的供体分子中与受体分子结合、且发生FRET的供体分子的比例κ_FRET。具体来说，FRET发生率计算单元164利用受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ_D、FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ^* _D、最短荧光寿命τ_Dmin计算出κ_FRET。更加具体地说，FRET发生率计算单元164根据后述的式（49）计算出κ_FRET。

另外，FRET效率E^*、最大FRET效率E_max、供体分子的荧光寿命τ_D、FRET发生时的供体分子的荧光寿命τ^* _D、最短荧光寿命τ_Dmin之间存在由后述的式（14）、式（18）所示的关系。因此，FRET发生率计算单元164适当地利用满足式（14）、式（18）的关系的相互等价的物理量能够计算出κ_FRET。

观察矩阵计算单元166计算出被后述的式（31）定义的观察矩阵。具体来说，对仅体现供体分子的样品、仅体现受体分子的样品照射激光，利用所测量的荧光信号的结果，通过后述的式（40）至式（43）计算出观察矩阵。通过观察矩阵计算单元166计算出的观察矩阵通过校正透射供体波段的荧光信号以及透射受体波段的荧光信号，被用于求出供体分子发出的荧光信息、以及受体分子发出的荧光信息。

第一分子浓度计算单元168利用供体分子发出的荧光信息，计算出作为活细胞的样品12中的供体分子的浓度。具体来说，第一分子浓度计算第一168根据后述的式（15）计算出供体分子的浓度。

第二分子浓度计算单元170利用受体分子发出的荧光信息，计算出作为活细胞的样品12中的受体分子的浓度。具体来说，第二分子浓度计算单元170根据后述的式（52）计算出受体分子的浓度。

解离常数计算单元172计算出被后述的式（19）定义的、且作为供体分子和受体分子的结合强度相关的参数的解离常数K_d。具体来说，解离常数计算单元172利用FRET发生率计算单元164计算出的κ_FRET、第一分子浓度计算单元168计算出的供体分子的浓度、第二分子浓度计算单元170计算出的受体分子的浓度，计算出解离常数K_d。更加具体地说，解离常数计算单元172根据后述的式（20）或者式（21）计算出解离常数K_d。

<FRET测量方法的概要>

下面，说明在FRET测量中所使用的各种常数。

图6为表示FRET测量方法的一例的图。如图6所示，首先，在第一的预先测量中测量最大FRET效率E_max和最短荧光寿命τ_Dmin。另外，在第二的预先测量中测量观察矩阵。接着，在作为主测量的样品测量中测量作为在活细胞的测量样品中的供体分子中发生FRET的供体分子的比例的κ_FRET。接着，利用所测量的κ_FRET测量表示供体分子和受体分子的结合情况的解离常数K_d。

首先，说明激光的输出和被该激光激发的荧光分子电子数的关系。如果将单位时间且单位体积激发的荧光分子的电子数设为N₀[1/m³s]，则根据朗伯比尔定律（Lambert-Beer），N₀如下表示。

[数1]

N₀＝J_LA(1-10-^εCl)/V  (1)

在此，J_L[1/m²s]表示激光的单位面积、单位时间的能量（光子数）、A[m²]表示激光照射的面积，ε[1/Mm]表示荧光分子的摩尔吸光系数、C[M]表示荧光分子的浓度、l[m]表示光路长度，V[m³]表示激光照射的物体的体积。

荧光分子的浓度非常低时，式（1）可以接近于如下。

[数2]

N₀＝ln10·J_L∈C    (2)

另外，如果将激光波长表示为λ[m]、输出表示为P[W]，则下面的关系成立。

[数3]

J_LA＝Pλ/hc    (3)

在此，h[J·s]为普朗克常数、c[m/s]为光速度。

假设激光的截面形状为椭圆形、强度分布为二维高斯分布。此时，直径为Dc[m]的圆形的活细胞通过被激光照射而受到的平均功率J_ex[1/m²s]由下述式表示。

[数4]

$J_{\mathrm{ex}}\left(t\right)=K_C\&CenterDot;J_L\left(t\right)=\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2\&CenterDot;P\left(t\right)---\left(4\right)$

在此，K_c为相对于激光的整个截面的功率照射到活细胞的功率的比例。K_c将利用例如辛普森公式等积分方法计算。

根据式（2）、式（4），被激光激发的单位时间、单位体积的荧光分子的电子数N_ex（t）如下表示。

[数5]

$N_{\mathrm{ex}}\left(t\right)=\ln 10\&CenterDot;\&Element;\mathrm{C\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D}_C^2\&CenterDot;P\left(t\right)\&equiv;K_{\mathrm{ex}}\&CenterDot;P\left(t\right)---\left(5\right)$

$K_{\mathrm{exD}}\&equiv;\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_D{C}_D\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D}_C^2$

$K_{\mathrm{exA}}\&equiv;\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_A{C}_A\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D}_C^2$

在此，如上所述地被定义的K_exD，K_exA，如后述在第二的预先测量中被用于计算观察矩阵。另外，K_exD，K_exA如后述被用于计算供体分子的浓度、以及受体分子的浓度。K_exD，K_exA作为常数存储于存储器154中，并适当地读取。

另外，荧光分子吸收光而其电子跃迁到激发状态所需的时间（10^-15秒程度）与发光跃迁过程（10^-9秒程度）相比非常短，因此，电子跃迁到激发状态所需的时间可以忽略不计。

（κ_FRET、FRET效率E^*、α）

接着，说明被激发的电子的跃迁过程和κ_FRET、FRET效率E^*、α的关系。如果将处于最低程度的激发状态的电子数表示为N（t），则N（t）满足下面的关系式。

[数6]

$\frac{\mathrm{dN}\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-(k_f+k_{\mathrm{nr}})N\left(t\right)+K_{\mathrm{ex}}\&CenterDot;P\left(t\right)---\left(6\right)$

在此，K_f[1/s]表示发光跃迁的速度常数，K_nr[1/s]表示无辐射跃迁的速度常数。上述的关系式（6）对供体分子、受体分子都能成立。在下面的说明中，关于供体分子的变数或常数加上字母D，另外，关于受体分子的变数或常数加上字母A。

接着，作为活细胞的样品12中的供体分子中与受体分子结合、且发生FRET的供体分子的比例定义为κ_FRET。即，如果活细胞中的供体分子的浓度表示为C_D[M]，发生FRET的分子的浓度表示为C_DA[M]，则κ_FRET满足下面的关系式。

[数7]

C_DA＝κ_FRET·C_D    (7)

在平衡状态中κ_FRET为常数。

通过发生FRET的共振能量转移的速度常数表示为K_t[1/s]，供体分子处于最低序位激发状态的电子数表示为N_D（t），受体分子处于最低序位激发状态的电子数表示为N_A（t）。式（6）中如果考虑到共振能量转移的速度常数K_t，则发生FRET的供体分子、不发生FRET的供体分子的激发电子数分别由式（8）、式（9）表示。

[数8]

$\frac{{\mathrm{d\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{N}_D\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-(k_{\mathrm{fD}}+k_{\mathrm{nrD}}+k_t){\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{N}_D\left(t\right)+{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{K}_{\mathrm{exD}}P\left(t\right)---\left(8\right)$

$\frac{d(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})N_D\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-(k_{\mathrm{fD}}+k_{\mathrm{nrD}})(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})N_D\left(t\right)+\left({1-\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}\right)K_{\mathrm{exD}}P\left(t\right)---\left(9\right)$

在此，K_fD[1/s]表示供体分子的发光跃迁速度常数，K_nrD[1/s]表示供体分子的无辐射跃迁速度常数，K_exDP（t）表示被激光激发的单位时间、单位体积的供体分子的电子数。

同样，关于对整个受体分子的激发电子，得到下面的关系式。

[数9]

$\frac{{\mathrm{dN}}_A\left(t\right)}{\mathrm{dt}}={\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t{N}_D\left(t\right)-(k_{\mathrm{fA}}+k_{\mathrm{nrA}})N_A\left(t\right)+K_{\mathrm{exA}}P\left(t\right)---\left(10\right)$

在此，K_fA[1/s]表示受体分子的发光跃迁速度常数，K_nrA[1/s]表示受体分子的无辐射跃迁速度常数，K_exAP（t）表示被激光激发的单位时间、单位体积的受体分子的电子数。

如果K_D≡K_fD＋K_nrD、K_A≡K_fA＋K_nrA，则关于供体分子、受体分子的处于激发状态的电子数的微分方程式如下表示。

[数10]

$\frac{{\mathrm{d\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{N}_D\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-(k_D+k_t){\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FERT}}{N}_D\left(t\right)+{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{K}_{\mathrm{exD}}P\left(t\right)---\left(11\right)$

$\frac{d(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})N_D\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-k_D(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})N_D\left(t\right)+\left({1-\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}\right)K_{\mathrm{exD}}P\left(t\right)---\left(12\right)$

$\frac{{\mathrm{dN}}_A\left(t\right)}{\mathrm{dt}}={\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t{N}_D\left(t\right)-k_A{N}_A\left(t\right)+K_{\mathrm{exA}}P\left(t\right)---\left(13\right)$

在此，将表示通过FRET的能量转移程度的FRET效率E^*如下定义。

[数11]

$E^{*}=\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t}{k_D+{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t}---\left(14\right)$

τ_D为受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命。τ_D和速度常数的关系如下。

[数12]

${\mathrm{\&tau;}}_D=\frac{1}{k_D}---\left(15\right)$

FRET效率E^*根据活细胞中的供体分子的浓度C_D[M]和受体分子的浓度C_A[M]的比进行变化。在此，将活细胞中的供体分子的浓度C_D[M]和受体分子的浓度C_A[M]的比α如下定义。

[数13]

$\mathrm{\&alpha;}\&equiv;\frac{C_A}{C_D}---\left(16\right)$

如图7所示，如果α变大，FRET效率E^*就饱和。这可以理解为如果α变大，活细胞中的几乎全部供体分子将发生FRET。活细胞中的全部供体分子发生FRET的情况意味着κ_FRET为1。当κ_FRET=1时的供体分子的荧光寿命称之为最短荧光寿命τ_Dmin。另外，FRET效率E^*饱和的值称之为最大FRET效率E_max。根据式（14），将最短荧光寿命τ_Dmin、最大FRET效率E_max如下表示。

[数14]

${\mathrm{\&tau;}}_{D\min }=\frac{1}{k_D+k_t}---\left(17\right)$

$E_{\max }=\frac{k_t}{k_D+k_t}=1-\frac{{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }}{{\mathrm{\&tau;}}_D}---\left(18\right)$

（解离常数K_d）

接着，作为供体分子和受体分子的结合强度相关的参数，将解离常数K_d如下定义。

[数15]

$K_d\&equiv;\frac{C_{\mathrm{Dfree}}\&CenterDot;C_{\mathrm{Afree}}}{C_{\mathrm{DA}}}=\frac{(C_D-C_{\mathrm{DA}})\&CenterDot;(C_A-C_{\mathrm{DA}})}{C_{\mathrm{DA}}}---\left(19\right)$

在此，C_Dfree[M]表示不与受体分子结合的供体分子的浓度，C_Afree[M]表示不与供体分子结合的受体分子的浓度。利用式（7）和式（6），式（19）可以如下表示。

[数16]

$K_d=(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})\&CenterDot;(\mathrm{\&alpha;}-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})\frac{C_D}{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}}---\left(20\right)$

$=(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}})\&CenterDot;(1-\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}}{\mathrm{\&alpha;}})\frac{C_A}{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}}---\left(21\right)$

解离常数K_d的值越小意味着供体分子和受体分子的结合越强。因此，在α小、供体分子的浓度C_D或受体分子的浓度C_A小的条件下，κ_FRET越大供体分子和受体分子的分子间相互作用越强。

如图6所示，解离常数K_d在样品测量中被求出。

（观察矩阵）

如上所述，观察矩阵是用于从供体波段和受体波段的荧光信号计算出供体分子发出的荧光信息、以及受体分子发出的荧光信息的矩阵。

首先，供体分子的荧光量F_D、受体分子的荧光量F_A，通过处于激发状态的电子数乘以发光跃迁速度常数，由下面的关系式表示。

[数17]

F_D(t)＝k_fD·N_D(t)＝k_fD(κ_FRETN_D(t)+(1-κ_FRET)N_D(t))    (22)

F_A(t)＝k_fA·N_A(t) (23)

如果将式（22）、式（23）进行拉普拉斯变换，并代入将式（11）~式（13）进行拉普拉斯变换的式，则供体分子的荧光量F_D、受体分子的荧光量F_A的拉普拉斯方程式如下表示。

[数18]

$F_D\left(s\right)=k_{f}D(\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}}{s+(k_D+k_t)}+\frac{1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}}{s+k_D})K_{\mathrm{exD}}P\left(s\right)---\left(24\right)$

$F_A\left(s\right)=k_{f}A(\frac{k_t{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{K}_{\mathrm{exD}}}{(s+(k_D+k_t))(s+k_A)}+\frac{K_{\mathrm{exA}}}{s+k_A})P\left(s\right)---\left(25\right)$

在此，受体分子的荧光寿命表示为τ_A≡1/K_A，如果利用式（15）、式（17），则式（24）、式（25）如下表示。

[数19]

$F_D\left(s\right)=k_{\mathrm{fD}}(\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }s}+\frac{(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}){\mathrm{\&tau;}}_D}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{D}s})K_{\mathrm{exD}}P\left(s\right)---\left(26\right)$

$F_A\left(s\right)=k_{\mathrm{fA}}(\frac{k_t{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{K}_{\mathrm{exD}}{\mathrm{\&tau;}}_A}{(1+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }s)(1+{\mathrm{\&tau;}}_{A}s)}+\frac{K_{\mathrm{exA}}{\mathrm{\&tau;}}_A}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{A}s})P\left(s\right)---\left(27\right)$

在本实施方式中，由下面的式表示的输出P（t）的激光照射到活细胞上。

[数20]

P(t)＝|P|e^jωt     (28)

此时，如果将式（26）、式（27）的微分方程式进行拉普拉斯变换，s＝jω（s为拉普拉斯运算符），则频率响应如下表示。

[数21]

$\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=k_{f}D{K}_{\mathrm{exD}}(\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;j}}+\frac{(1-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}){\mathrm{\&tau;}}_D}{1+{\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;j}})---\left(29\right)$

$\frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=k_{f}A(\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t{\mathrm{\&tau;}}_A}{1+{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;j}}\&CenterDot;\frac{K_{\mathrm{exD}}{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;j}}+\frac{{\mathrm{\&tau;}}_A{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{exA}}}{1+{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;j}})---\left(30\right)$

如上所述，在测量荧光时，用带通滤波器限定波段之后，用光电倍增管等光电转换器进行测量。在图3中，如果通过供体波段的带通滤波器53和光电转换器55测量的荧光量表示为F_DCh（jω），通过受体波段的带通滤波器54和光电转换器56测量的荧光量表示为F_ACh（jω），则下面的关系式成立。

[数22]

$\left[\begin{array}{c}\frac{F_{\mathrm{DCh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\\ \frac{F_{\mathrm{ACh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\end{array}\right]=\left[\begin{array}{cc}{K}_{\mathrm{DCh}}{W}_D& K_{\mathrm{DCh}}{W}_{\mathrm{AD}}\\ K_{\mathrm{ACh}}{W}_{\mathrm{DA}}& K_{\mathrm{ACh}}{W}_A\end{array}\right]\&CenterDot;\left[\begin{array}{c}\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\\ \frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\end{array}\right]---\left(31\right)$

在此，W_D表示根据供体波段的带通滤波器53的权重系数，W_A表示根据受体波段的带通滤波器54的权重系数。另外，W_AD表示受体分子发出的荧光向供体波段的漏泄系数，W_DA表示供体分子发出的荧光向受体波段的漏泄系数。另外，K_DCh表示包含供体波段的光电转换器55的感度的增益，K_Ach表示包含受体波段的光电转换器56的感度的增益。图8为表示发生FRET时的荧光发光动力学模式。式（31）的二行二列矩阵下面称之为观察矩阵。

式（31）意味着，通过利用观察矩阵，从所测量的供体波段和受体波段的荧光信号能够更加精确地计算出供体分子或受体分子发出的荧光信息。

下面，说明观察矩阵的计算方法。

首先，在仅体现供体分子的样品上照射激光并测量荧光信号。此时发出的荧光相当于在式（29）、式（30）中，κ_FRET＝0、K_fA=K_exA=0的条件下进行测量，因此由下面的式表示。

[数23]

$\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=\frac{k_{f}D{K}_{\mathrm{exD}}}{s+k_D}=\frac{k_{\mathrm{fD}}{K}_{\mathrm{exD}}{\mathrm{\&tau;}}_D}{1+{\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;j}}=\frac{k_{\mathrm{fD}}{\mathrm{\&tau;}}_D{K}_{\mathrm{exD}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}{e}^{j(-{\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;})}---\left(32\right)$

$\frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=0---\left(33\right)$

如果利用式（32）、式（33）和式（31），则通过带通滤波器测量的荧光信号如下表示。

[数24]

$\frac{F_{\mathrm{DCh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=K_{\mathrm{DCh}}{W}_D\frac{k_{\mathrm{fD}}{\mathrm{\&tau;}}_D{K}_{\mathrm{exD}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}{e}^{j(-\mathrm{ta}{n}^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;})}---\left(34\right)$

$\frac{F_{\mathrm{ACh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=K_{\mathrm{ACh}}{W}_{\mathrm{DA}}\frac{k_{\mathrm{fD}}{\mathrm{\&tau;}}_D{K}_{\mathrm{exD}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}{e}^{j{(-\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;})}---\left(35\right)$

同样，在仅体现受体分子的样品上照射激光，并测量荧光信号。此时发出的应该是相当于在式（29）、式（30）中，K_t=0、K_fD=K_exD=0的条件下进行测量，因此由下面的式表示。

[数25]

$\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=0---\left(36\right)$

$\frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=\frac{k_{\mathrm{fA}}{K}_{\mathrm{exA}}{\mathrm{\&tau;}}_A}{1+{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;j}}=\frac{k_{\mathrm{fA}}{\mathrm{\&tau;}}_A{K}_{\mathrm{exA}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}{e}^{j{(-\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;})}---\left(37\right)$

如果利用式（36）、式（37），则通过带通滤波器测量的荧光信号如下表示。

[数26]

$\frac{F_{\mathrm{DCh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=K_{\mathrm{DCh}}{W}_{\mathrm{AD}}\frac{k_{\mathrm{fA}}{\mathrm{\&tau;}}_A{K}_{\mathrm{exA}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}{e}^{j{(-\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;})}---\left(38\right)$

$\frac{F_{\mathrm{ACh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=K_{\mathrm{ACh}}{W}_A\frac{k_{\mathrm{fA}}{\mathrm{\&tau;}}_A{K}_{\mathrm{exA}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}{e}^{j({-\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;})}---\left(39\right)$

式（38）、式（39）的实数部相当于荧光信号的cos成分。另外，式（38）、式（39）的虚数部相当于荧光信号的sin成分。

在此，如果供体分子的量子产率表示为

受体分子的量子产率表示为

则

如果利用该关系式和式（5），则式（34）、式（35）、式（38）、式（39）的振幅分别如下表示。

[数27]

$\left|\frac{F_{\mathrm{DCh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\right|=K_{\mathrm{DCh}}{W}_D\frac{{\mathrm{\&phi;}}_D\&CenterDot;\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_D\&CenterDot;\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}\&CenterDot;C_D---\left(40\right)$

$\left|\frac{F_{\mathrm{ACh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\right|=K_{\mathrm{ACh}}{W}_{\mathrm{DA}}\frac{{\mathrm{\&phi;}}_D\&CenterDot;\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_D\&CenterDot;\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}\&CenterDot;C_D---\left(41\right)$

$\left|\frac{F_{\mathrm{DCh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\right|=K_{\mathrm{DCh}}{W}_{\mathrm{AD}}\frac{{\mathrm{\&phi;}}_A\&CenterDot;\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_A\&CenterDot;\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}\&CenterDot;C_A---\left(42\right)$

$\left|\frac{F_{\mathrm{ACh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\right|=K_{\mathrm{ACh}}{W}_A\frac{{\mathrm{\&phi;}}_A\&CenterDot;\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_A\&CenterDot;\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C/\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;}\right)}^2}}\&CenterDot;C_A---\left(43\right)$

量子产率

可以从文献值中计算出，也可以通过测量得出。另外，供体分子的摩尔吸光系数ε_D、受体分子的摩尔吸光系数ε_A可以从文献值中计算出，也可以通过测量得到。另外，激光的波长λ也是已知的值。作为相对于激光的整个截面的功率照射到活细胞的功率的比例的K_C，圆形的活细胞的直径D_C也可以通过其它途径计算出。另外，受体分子不存在时的供体分子的荧光寿命τ_D、受体分子的荧光寿命τ_A也可以利用流式细胞仪10计算出。这些数值信息存储于存储器154上。

图9为表示对仅体现供体分子的样品、仅体现受体分子的样品上照射激光，并测量荧光信号时所得到的结果的一例的图。

图9（a）为表示准备仅体现供体分子的样品，并对不同的供体分子的浓度C_D[M]测量供体波段的荧光信号的结果的图表。通过计算出图9（a）所示的图表的倾斜度，从式（40）计算出K_DChW_D的值。另外，图9（b）为表示准备仅体现供体分子的样品，并对不同的供体分子的浓度C_D[M]测量受体波段的荧光信号的结果的图表。通过计算出图9（b）所示的图表的倾斜度，从式（41）计算出K_AChW_DA的值。

另外，图9（c）为表示准备仅体现受体分子的样品，并对不同的受体分子的浓度C_A[M]测量供体波段的荧光信号的结果的图表。通过计算出图9（c）所示的图表的倾斜度，从式（42）计算出K_DChW_AD的值。另外，图9（d）为表示准备仅体现受体分子的样品，并对不同的受体分子的浓度C_A[M]测量受体波段的荧光信号的结果的图表。通过计算出图9（d）所示的图表的倾斜度，从式（43）计算出K_AChW_A的值。

如上所述，能够计算出观察矩阵。观察矩阵的值存储于存储器154上，并且测量样品时从存储器154读取而使用。

（供体分子的平均荧光寿命τ^* _D、供体分子的浓度C_D）

接着，说明样品测量中计算出的供体分子平均荧光寿命τ^* _D、供体分子的浓度C_D。

在求出观察矩阵的情况下，利用式（31）从所测量的荧光信号能够计算出供体分子被激光照射而发出的荧光信息。具体来说，对通过测量求得的荧光信号的F_DCh（jω）/P（jω），F_ACh（jω）/P（jω）乘以观察矩阵的逆矩阵，由此，如下所述，能够计算出供体分子发出的荧光信息F_D（jω）/P（jω）。

[数28]

$\left[\begin{array}{c}\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\\ \frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\end{array}\right]={\left[\begin{array}{cc}{K}_{\mathrm{DCh}}{W}_D& K_{\mathrm{DCh}}{W}_{\mathrm{AD}}\\ K_{\mathrm{ACh}}{W}_{\mathrm{DA}}& K_{\mathrm{ACh}}{W}_A\end{array}\right]}^{-1}\&CenterDot;\left[\begin{array}{c}\frac{F_{\mathrm{DCh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\\ \frac{F_{\mathrm{ACh}}\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\end{array}\right]---\left(44\right)$

在此，式（29）如下表示。

[数29]

$\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=k_{\mathrm{fD}}{K}_{\mathrm{exD}}\sqrt{\frac{{\{{\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}({\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\}}^2+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;}\right)}^2}{{(1-{\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{\mathrm{\&omega;}}^2)}^2+{\left\{({\mathrm{\&tau;}}_D+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\mathrm{\&omega;}\right\}}^2}}{e}^{j({\mathrm{\&theta;}}_{D1}-{\mathrm{\&theta;}}_{D2})}---\left(45\right)$

在此，相位角成分如下表示。

[数30]

${\mathrm{\&theta;}}_{D1}={\tan }^{-1}\frac{{\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;}}{{\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}({\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })}---\left(46\right)$

${\mathrm{\&theta;}}_{D2}={\tan }^{-1}\frac{\left({\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\right)\mathrm{\&omega;}}{1-{\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{\mathrm{\&omega;}}^2}---\left(47\right)$

此时，发生FRET时的供体分子的平均荧光寿命τ^* _D满足下面的关系式。

[数31]

$-{\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_D^{*}\mathrm{\&omega;}={\mathrm{\&theta;}}_{D1}-{\mathrm{\&theta;}}_{D2}---\left(48\right)$

τ^* _D是利用式（48）并通过荧光寿命计算单元158计算出。另外，在下面的说明中，将供体分子的平均荧光寿命τ^* _D简称为供体分子的荧光寿命。

在此，如果利用式（46）~式（48）解κ_FRET，则得到下面的式。

[数32]

${\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}=\frac{{\mathrm{\&tau;}}_D-\frac{{\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;}}{\tan ({\tan }^{-1}\frac{({\mathrm{\&tau;}}_D+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\mathrm{\&omega;}}{1-{\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{\mathrm{\&omega;}}^2}-{\tan }^{-1}{\mathrm{\&tau;}}_D^{*}\mathrm{\&omega;})}}{{\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }}---\left(49\right)$

另外，式（45）的振幅信息如下表示。

[数33]

$\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}=k_{\mathrm{fD}}{K}_{\mathrm{exD}}\sqrt{\frac{{\{{\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}({\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\}}^2+{\left({\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;}\right)}^2}{{(1-{\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{\mathrm{\&omega;}}^2)}^2+{\left\{({\mathrm{\&tau;}}_D+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\mathrm{\&omega;}\right\}}^2}}---\left(50\right)$

在此，通过

和式（5），供体分子的浓度C_D[M]如下地计算出。

[数34]

$C_D=\left|\frac{F_D\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\right|\&CenterDot;\sqrt{\frac{{\{{1-\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{\mathrm{\&omega;}}^2)}^2+{\left\{({\mathrm{\&tau;}}_D+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\mathrm{\&omega;}\right\}}^2}{\{{\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{({\mathrm{\&tau;}}_D-{\mathrm{\&tau;}}_{D\min })\}}^2+{({\mathrm{\&tau;}}_D{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;})}^2}}\&CenterDot;\frac{{\mathrm{\&tau;}}_D}{{\mathrm{\&phi;}}_D}\&CenterDot;\frac{\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2}{\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_D\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C}---\left(51\right)$

C_D是利用式（51）并通过第一分子浓度计算单元168计算出。

（受体分子的浓度C_A）

和供体分子的浓度计算同样地，在求出观察矩阵的情况下，利用式（31）从所测量的荧光信号能够计算出受体分子被激光照射而发出的荧光信息。具体来说，对通过测量求得的荧光信号的F_DCh（jω）/P（jω），F_ACh（jω）/P（jω）乘以观察矩阵的逆矩阵，由此，如式（44）能够计算出受体分子发出的荧光信息F_A（jω）/P（jω）。通过式（30）和式（5），将发生FRETA时的受体分子的浓度C_A[M]如下地计算出。

[数35]

$C_A=|\frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\&CenterDot;\frac{1+{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;j}}{k_{\mathrm{fA}}{\mathrm{\&tau;}}_A}-\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{K}_{\mathrm{exD}}}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;j}}|\&CenterDot;\frac{\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{D_C}^2}{\ln 10\&CenterDot;{\&Element;}_A\mathrm{\&lambda;}/\mathrm{hc}\&CenterDot;K_C}---\left(52\right)$

受体分子的浓度C_A是利用式（52）并通过第二分子浓度计算单元170计算出。在此，K_exA是实数部，因此从下述式（53）计算的K_exA的相位应该是0。

[数36]

$K_{\mathrm{exA}}=\frac{F_A\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}{P\left(\mathrm{j\&omega;}\right)}\&CenterDot;\frac{1+{\mathrm{\&tau;}}_A\mathrm{\&omega;j}}{k_{\mathrm{fA}}{\mathrm{\&tau;}}_A}-\frac{{\mathrm{\&kappa;}}_{\mathrm{FRET}}{k}_t{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }{K}_{\mathrm{exD}}}{1+{\mathrm{\&tau;}}_{D\min }\mathrm{\&omega;j}}---\left(53\right)$

通过查看K_exA的相位是否是0，以此确定是否能够正确评价FRET。

通过式（51）、式（52）计算α，因此能够通过式（20）或式（21）计算出解离常数K_d。解离常数K_d通过解离常数计算单元172计算出。

<FRET测量方法>

在本实施方式的FRET测量方法中，为了测量样品12的活细胞中的供体分子中与受体分子结合、且发生FRET的供体分子的比例κ_FRET或解离常数K_d，有必要预先测量几个参数。在下面的说明中，用于计算样品12的κ_FRET或解离常数K_d而进行的测量称之为“样品测量”，为了进行样品测量而预先进行的测量称之为“预先测量”。下面，首先说明预先测量。

<预先测量>

（最大FRET效率E_max、最短荧光寿命

的测量）

首先，作为第一预先测量，测量最大FRET效率E_max和最短荧光寿命

图10为测量最大FRET效率E_max和最短荧光寿命

的流程图的一例。

首先，准备被式（16）定义的、且活细胞中的供体分子的浓度C_D[M]和受体分子的浓度C_A[M]的比α不同的多个样品12（步骤S101）。

接着，利用参照图1说明的流式细胞仪对各个样品12测量在式（14）中被定义的FRET效率E^*（步骤S 102）。具体来说，利用荧光寿命计算单元158计算的荧光寿命，FRET效率计算单元160计算出FRET效率E^*。

最短荧光寿命计算单元162将对于各个样品12的FRET效率E^*的测量结果如图7所示地绘图，α非常大时FRET效率E^*从渐近值获得最大FRET效率E_max（步骤S103）。

接着，最短荧光寿命计算单元162从式（18）计算出最短荧光寿命

（步骤S104）。具体来说，最短荧光寿命计算单元162利用所计算出的最大FRET效率E_max计算出最短荧光寿命

根据本实施方式，通过在第一预先测量中测量最大FRET效率E_max和最短荧光寿命

在不受相对于供体分子的浓度的受体分子的浓度的比例影响，能够定量进行FRET测量。

（观察矩阵的测量）

接着，作为第二预先测量，测量观察矩阵。图11为测量观察矩阵的流程图的一例。图11（a）为表示精制供体分子，并利用不含受体分子的溶液的测量方法的一例，图11（b）为表示精制受体分子，并利用不含供体分子的溶液的测量方法的一例。

如图11（a）所示，首先，准备精制供体分子的溶液（步骤S201）。

接着，利用未图示的吸光光度计测量供体分子的浓度C_D[M]（步骤S202）。

接着，激光光源部30照射供体分子主要吸收能量的波长（例如，407nm）的激光，测量部50测量供体波段、受体波段各自所对应的荧光信号（步骤S203）。

接着，分析装置150获得所测量的荧光信号的振幅（步骤S204）。

分析装置150没有获得规定数量（例如，5点）的荧光信号的振幅时，稀释供体分子的浓度（步骤S205），并返回到步骤S202。然后，分析装置150直到获得规定数量的荧光信号的振幅为止，反复进行步骤S202~S205的操作。

分析装置150获得规定数量的荧光信号的振幅时，如图9（a）、图9（b）所示，观察矩阵计算单元166将荧光信号的振幅相对于供体分子的浓度C_D[M]进行绘图，并从该倾斜度根据式（40）、式（41）计算出观察矩阵的成分（步骤S206）。

另外，如图11（b）所示，准备精制受体分子的溶液（步骤S301）。

接着，利用未图示的吸光光度计测量受体分子的浓度C_A[M]（步骤S302）。

接着，激光光源部30照射供体分子主要吸收能量的波长（例如，407nm）的激光，测量部50测量供体波段、受体波段各自所对应的荧光信号（步骤S303）。

接着，分析装置150获得所测量的荧光信号的振幅（步骤S304）。

分析装置150没有获得规定数量（例如，5点）的荧光信号的振幅时，稀释受体分子的浓度（步骤S305），并返回到步骤S302。然后，分析装置150直到获得规定数量的荧光信号的振幅为止，反复进行步骤S302~S305的操作。

分析装置150获得规定数量的荧光信号的振幅时，如图9（c）、图9（d）所示，观察矩阵计算单元166将荧光信号的振幅相对于受体分子的浓度C_A[M]进行绘图，并从该倾斜度根据式（42）、式（43）计算出观察矩阵的成分（步骤S306）。

根据本实施方式，通过在第二预先测量中测量观察矩阵，从样品测量中被测量的供体波段和受体波段的各个荧光信号降低包含通过带通滤波器的权重系数或漏泄系数、光电转换器的灵敏度的增益的影响，从而能够更加精确地求出样品12发出的荧光信息。

通过预先测量所测量的值存储于存储器154上，测量样品时适当地被读取。

<样品测量>

预先测量结束后，进行作为主测量的样品测量。图12为样品测量的流程图的一例。

（κ_FRET的测量）

首先，利用参照图1说明的流式细胞仪将激光照射到样品12上，并测量样品12发出的荧光，由此测量供体波段和受体波段各自所对应的荧光信号（步骤S401）。这意味着测量式（44）的F_DCh（jω）/P（jω）、F_ACh（jω）/P（jω）的值。因此，如式（44）所示，通过对F_DCh（jω）/P（jω）、F_ACh（jω）/P（jω）乘以观察矩阵的逆矩阵，能够计算出供体分子发出的荧光信息F_D（jω）/P（jω）、以及受体分子发出的荧光信息F_A（jω）/P（jω）。

接着，荧光寿命计算单元158计算供体分子的荧光寿命τ^* _D（步骤S402）。具体来说，荧光寿命计算单元158根据上述的式（48），从输出自光电转换器55的荧光信号的相对于调制信号的相位差，计算出供体分子的荧光寿命τ^* _D。

接着，FRET发生率计算单元164利用在步骤S402测量的样品12的供体分子的荧光寿命τ^* _D计算出κ_FRET（步骤S403）。具体来说，FRET发生率计算单元164利用供体分子的荧光寿命τ^* _D，并根据式（49）计算出κ_FRET。式（49）的最短荧光寿命

在上述的第一预先测量中被求出，并利用从存储器154读取的值。

根据本实施方式，在预先测量中预先测量最短荧光寿命

因此能够求出κ_FRET。另外，根据本实施方式，能够测量过去其测量方法未曾被人所知的κ_FRET，因此，利用κ_FRET按照后述的方式能够求出解离常数K_d。

（供体分子的浓度C_D的测量）

接着，第一分子浓度计算单元168计算样品12的供体分子的浓度C_D[M]（步骤S404）。具体来说，第一分子浓度计算单元168利用供体分子发出的荧光信息，并根据式（51）计算出样品12的供体分子的浓度C_D[M]。如式（44）所示，式（51）的｜F_D（jω）/P（jω）｜通过对通过测量所求出的荧光信号F_DCh（jω）/P（jω）、F_ACh（jω）/P（jω）乘以观察矩阵的逆矩阵求出。观察矩阵利用上述的第二预先测量中求出的值。

（受体分子的浓度C_A的测量）

接着，第二分子浓度计算单元170计算出样品12的受体分子的浓度C_A[M]（步骤S405）。具体来说，第二分子计算单元170利用受体分子发出的荧光信息，并根据式（52），计算出样品12的受体分子的浓度C_A[M]。如式（44）所示，式（52）的｜F_A（jω）/P（jω）｜通过对通过测量所求出的荧光信号F_DCh（jω）/P（jω）、F_ACh（jω）/P（jω）乘以观察矩阵的逆矩阵求出。观察矩阵利用上述的第二预先测量中求出的值。

根据本实施方式，在预先测量中预先测量观察矩阵，因此能够更加精确地计算出供体分子的浓度C_D[M]、受体分子的浓度C_A[M]。另外，根据本实施方式，利用供体分子的浓度C_D[M]、受体分子的浓度C_A[M]，能够求出如后述的解离常数K_d。

（解离常数K_d的测量）

接着，解离常数计算单元172计算出样品12的解离常数K_d（步骤S406）。具体来说，解离常数计算单元172利用FRET发生率计算单元164计算出的κ_FRET、第一分子浓度计算单元168计算出的供体分子的浓度C_D[M]、第二分子浓度计算单元170计算出的受体分子的浓度C_A[M]，并根据式（20）或式（21）计算出解离常数K_d。

根据本实施方式，能够测量过去其测量方法未曾被人所知的解离常数K_d，该常数是标记活细胞的蛋白质的供体分子和受体分子的结合强度相关的参数。

另外，步骤S401~S406的顺序不局限于参照图12说明的顺序，将其顺序适当地调换也能够实施本发明。

以上，对本发明的FRET测量方法及装置进行了详细的说明，但是本发明并不局限于上述实施方式。例如，以具有任意的时间变化的波形对强度进行了调制的激光照射到测量样品上，并通过光谱分析法、傅里叶分析法、参数推定法等方法求出荧光强度或荧光寿命的方法也能够适用于本发明。

Claims (14)

1.一种FRET测量方法，将激光照射在用第一分子和第二分子进行标记的测量样品上，并测量能量从第一分子朝向第二分子转移的FRET，其特征在于，该测量方法包括如下步骤：

最短荧光寿命计算步骤，对于第一分子浓度和第二分子浓度之比不同的多个预先测量样品，计算出第一分子的荧光寿命，并计算出第一分子的荧光寿命的最小值；

照射步骤，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；

测量步骤，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；

第一分子荧光寿命计算步骤，利用所述测量步骤中被测量的荧光信号计算出第一分子的荧光寿命；

FRET发生率计算步骤，利用在所述最短荧光寿命计算步骤中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和计算出的所述第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。

2.根据权利要求1所述的FRET测量方法，其特征在于，

在所述FRET发生率计算步骤中，进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。

3.根据权利要求1或2所述的FRET测量方法，其特征在于，该方法包括观察矩阵计算步骤，在该步骤中从所述测量步骤中测量的荧光信号，计算出用于求出通过在所述照射步骤中被激光照射而第一分子发出的荧光信息和第二分子发出的荧光信息的矩阵，所述观察矩阵计算步骤包括：

第一步骤，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分；

第二步骤，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分。

4.根据权利要求1至3任一项所述的FRET测量方法，其特征在于，该方法包括解离常数计算步骤，在该步骤中利用所述FRET发生率计算步骤中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子结合情况的解离常数。

5.根据权利要求1至4任一项所述的FRET测量方法，其特征在于，在所述第一分子荧光寿命计算步骤中，利用在所述测量步骤中测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，计算出第一分子的荧光寿命。

6.根据权利要求3所述的FRET测量方法，其特征在于，

在所述第一步骤中，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分；

在所述第二步骤中，利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而测量的荧光信号的振幅、以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差，求出所述矩阵成分的一部分。

7.根据权利要求4所述的FRET测量方法，其特征在于，该方法包括：

第一分子浓度计算步骤，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；

第二分子浓度计算步骤，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子浓度；

在所述解离常数计算步骤中，利用在所述第一分子浓度计算步骤中计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算步骤中计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。

8.一种FRET测量装置，将激光照射在用第一分子和第二分子标记的测量样品上，由此测量出能量从第一分子朝向第二分子转移的FRET，其特征在于，包括：

激光光源部，将对强度进行了时间调制的激光照射在所述测量样品上；

测量部，测量所述测量样品被所述激光照射而发出的荧光；

荧光寿命计算部，利用所述测量部测量的荧光信号计算出第一分子荧光寿命；

最短荧光寿命计算部，利用第一分子浓度和第二分子浓度比不同的多个预先测量样品中的第一分子荧光寿命，计算出第一分子荧光寿命的最小值；

FRET发生率计算部，利用在所述最短荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命的最小值和在所述荧光寿命计算部中计算出的第一分子荧光寿命，计算出所述测量样品中的第一分子中发生FRET的第一分子的比例。

9.根据权利要求8所述的FRET测量装置，其特征在于，所述FRET发生率计算部是进一步利用第二分子不存在时的第一分子的荧光寿命求出所述比例。

10.根据权利要求8或9所述的FRET测量装置，其特征在于，

该装置包括：观察矩阵计算部，从所述测量部中测量的荧光信号计算出用于求出所述测量样品被激光照射而第一分子发出的荧光信息和第二分子发出的荧光信息的矩阵，

在所述观察矩阵计算部，利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分，并且

利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号，求出所述矩阵成分的一部分。

11.根据权利要求8至10任一项所述的FRET测量装置，其特征在于，包括解离常数计算部，在该部中利用在所述FRET发生率计算部中计算出的所述比例计算出表示第一分子和第二分子的结合状况的解离常数。

12.根据权利要求8至11所述的FRET测量装置，其特征在于，所述荧光寿命计算部利用在所述测量部测量的荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差计算出第一分子的荧光寿命。

13.根据权利要求10所述的FRET测量装置，其特征在于，在所述观察矩阵计算部，

利用对包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分，并且

利用对包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的浓度不同的多个样品照射对强度进行了时间调制的激光而在所述测量部测量的荧光信号的振幅以及所述荧光信号和调制所述激光的调制信号的相位差求出所述矩阵成分的一部分。

14.根据权利要求11所述的FRET测量装置，其特征在于，该装置包括：

第一分子浓度计算部，利用第一分子发出的荧光信息计算出第一分子的浓度；

第二分子浓度计算部，利用第二分子发出的荧光信息计算出第二分子的浓度；

所述解离常数计算部利用在所述第一分子浓度计算部计算出的第一分子浓度和在所述第二分子浓度计算部计算出的第二分子浓度计算出所述解离常数。

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