KR20120112489A - 형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈 - Google Patents
형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120112489A KR20120112489A KR1020127016502A KR20127016502A KR20120112489A KR 20120112489 A KR20120112489 A KR 20120112489A KR 1020127016502 A KR1020127016502 A KR 1020127016502A KR 20127016502 A KR20127016502 A KR 20127016502A KR 20120112489 A KR20120112489 A KR 20120112489A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- fluorescence
- fluorescent
- beads
- relaxation time
- kinds
- Prior art date
Links
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 109
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 44
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 10
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
- G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
형광 비즈(beads)는 형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소를 포함하고, 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 절대 함유량이 다른 종류의 형광 비즈와 다르도록 설정되어 있다. 플로 사이트 미터(flow sight meter)는 이 형광 비즈를 사용하여 형광 검출을 행한다. 이로써, 종래에 비하여 1회의 계측에 의하여 다수의 종류의 비즈를 정밀도 높고 식별할 수 있다.
Description
본 발명은 형광 색소로 라벨(label)화된 형광 비즈(beads)가 발하는 형광을 사용하여 비즈의 종류를 식별하는 형광 검출 방법, 형광 색소로 라벨화된 형광 비즈를 제작하는 방법 및 형광 색소로 라벨화된 형광 비즈에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서 사용되는 플로 사이트 미터(flow sight meter)에서는, 형광 비즈(beads)에 레이저광을 조사함으로써 생체 물질이 결합한 형광 비즈가 발하는 형광을 검출하고, 이 형광에 의해 그 생체 물질이 결합하는 형광 비즈의 프로브(probe)의 종류를 식별하는 것이 행해지고 있다. 여기서, 형광 비즈에는, 프로브(상보적인 배열을 가지는 유전자의 단편이나 특정한 단백질에 결합하는 항체 등의 선택적 결합 기능을 가지는 물질)가 표면에 설치되어 있다.
플로 사이트 미터는, 구체적으로는 세포, DNA, RNA, 효소, 단백 등의 생체 물질이 소정의 형광 색소로 라벨(label)화된 상태로 포함되는 현탁액에, 식별 가능한 형광 색소로 염색되어 라벨화된 형광 비즈를 형광 시약으로서 혼합한 후, 압력을 부여하여 매초 10m정도의 속도로 관로내를 흐르는 시스액에 형광 비즈를 흐르게 하여 플로 셀(flow cell)을 형성한다. 이 플로 셀 중의 형광 비즈에 레이저광을 조사함으로써, 형광 비즈가 발하는 형광과 이 형광 비즈에 결합한 생체 물질이 발하는 형광을 수광한다. 그리고, 이들 형광으로부터 형광 비즈의 형광을 라벨로 해서 식별함으로써, 그 생체 물질이 결합하는 프로브의 종류를 특정할 수 있다.
특히, 형광 비즈마다 상이한 종류의 프로브를 설치하고 프로브의 종류마다 상이한 형광 색소로 식별 가능하도록 형광 비즈를 염색함으로써, 생체 물질이 어떠한 프로브에 결합하는지를 조사할 수 있다. 이와 같은 경우, 각종 프로브를 구비하는 다수의 형광 비즈를 생체 물질을 포함하는 현탁액에 혼합하여, 플로 사이트 미터로 단시간에 한번에 분석하는 것이 요구되고 있다.
그리고, 종래의 형광 검출 방법으로서, 형광 색소로 염색되어 있어, 프로브가 표면에 설치된 비즈가 발하는 형광을 사용하여 비즈의 종류를 식별하는 방법이 알려져 있다(특허 문헌 1). 이 방법에서는, 미리 형광 완화 시간이 상이한 2종류의 형광 색소를 혼합한 것으로 비즈가 염색되어, 이 비즈를 사용하여 형광 검출이 행해지는 경우 비즈의 형광을 검출하여 형광 완화 시간을 계측함으로써 비즈의 종류를 식별한다.
(선행 기술 문헌)
특허 문헌 1: 일본특허 제4300366호 공보
상기 방법에 의해, 1회의 계측으로 수백종류의 비즈(beads)를 식별 가능하게 하는 것이 가능하게 될 것으로 생각된다. 그러나, 형광 완화 시간의 1회의 계측으로 수백종류의 비즈를 반드시 정밀도 높게 식별할 수는 없다.
그래서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 종래에 비하여 1회의 계측에 의해 다수의 종류의 비즈를 정밀도 높게 식별할 수 있는 형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양은, 형광 색소로 라벨(label)화된 형광 비즈(beads)가 발하는 형광을 사용하여 비즈의 종류를 식별하는 형광 검출 방법에 있어서,
형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 상기 기본 형광 색소의 절대 함유량을 서로 상이하게 한 복수 종류의 합성 형광 색소로 라벨화된 형광 비즈를 사용하여, 복수개의 파장 대역마다 형광 강도와 형광 완화 시간을 계측하는 단계
계측된 상기 형광 강도, 상기 형광 완화 시간 및 상기 파장 대역의 정보를 사용하여 형광 비즈를 식별하는 단계를 가진다.
예를 들어 상기 기본 형광 색소가 2종류인 경우, 상기 기본 형광 색소의 각각의 형광 강도를 F1 및 F2으로 하고, 형광 완화 시간을 τ1 및 τ2로 하고, 상기 기본 형광 색소의 비율을 x(x는 1 미만의 정수(正數)) 및 (1-x)로 하고, 상기 절대 함유량에 의해 정해지는 정수(定數)를 α1 및α2로 했을 때,
상기 복수 종류의 합성 형광 색소는, 하기 수식 (1)에서 정해지는 합성 형광 강도 F 및 하기 수식 (2)에서 정해지는 합성 형광 완화 시간 τ가 서로 상이하도록, 상기 비율과 상기 절대 함유량이 설정되어 있는 것이 바람직하다.
수식 (1)
F=α1×τ1×x＋α2×τ2×(1-x)
수식 (2)
τ=｛α1×τ1 2×x＋α2×τ2 2×(1-x)}/F
또한, 본 발명의 일 태양은, 형광 색소로 라벨화된 복수 종류의 형광 비즈를 제작하는 방법에 있어서,
형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 상기 기본 형광 색소의 절대 함유량이 다른 종류의 형광 비즈 사이에서 서로 상이하도록 상기 비율 및 상기 절대 함유량을 설정하는 단계
설정한 상기 비율 및 상기 절대 함유량을 사용하여 얻어진 합성 형광 색소로 형광 비즈를 라벨화하는 단계를 가진다.
예를 들어 상기 기본 형광 색소가 2종류인 경우, 상기 기본 형광 색소의 각각의 형광 강도를 F1 및 F2로 하고, 형광 완화 시간을 τ1 및 τ2로 하고, 상기 기본 형광 색소의 비율을 x(x는 1 미만의 정수(正數)) 및 (1-x)로 하고, 상기 절대 함유량에 의해 정해지는 정수(定數)를 α1 및 α2로 했을 때,
상기 합성 형광 색소의 형광 강도 F 및 형광 완화 시간 τ는, 하기 수식 (3) 및 (4)에 따라 정해지는 것이 바람직하다.
수식 (3)
F=α1×τ1×x＋α2×τ2×(1-x)
수식 (4)
τ=｛α1×τ1 2×x＋α2×τ2 2×(1-x)}/F
또한, 본 발명의 일 태양은, 형광 색소로 라벨화된 복수 종류의 형광 비즈에 있어서,
형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소를 포함하고,
상기 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 상기 기본 형광 색소의 절대 함유량이 다른 종류의 형광 비즈 사이에서 서로 상이하도록 상기 비율 및 상기 절대 함유량이 설정되어 있다.
상기 태양의 형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈를 사용함으로써, 1회의 계측에 의해 다수의 종류의 비즈를 정밀도 높게 식별할 수 있는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예의 형광 검출 장치를 사용한 플로 사이트 미터(flow sight meter)의 개략 구성도이다.
도 2는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 광원부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 3은 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 수광부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 4는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 제어 처리부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 5는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 분석 장치의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 6a~6e는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터로 측정되는 데이터를 설명하는 도면이다.
도 2는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 광원부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 3은 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 수광부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 4는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 제어 처리부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 5는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 분석 장치의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 6a~6e는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터로 측정되는 데이터를 설명하는 도면이다.
이하 본 발명의 형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈를 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 형광 검출 방법을 실시하는 플로 사이트 미터(flow sight meter)(10)의 개략 구성도이다.
플로 사이트 미터(10)는 형광 비즈(12) 및 생체 물질(13)을 포함하는 시료 S를 시스(sheath)액과 함께 흘려, 소정의 주파수로 강도 변조한 레이저광을 측정점을 통과하는 시료 S에 조사하고, 이때 시료 S가 발하는 형광을 수광하여 형광을 검출한다.
형광 비즈(12)는 수μm정도의 직경을 가지는 구체(球體)이며, 합성 형광 색소를 함유한다. 형광 비즈(12)는 그 표면에 합성 형광 색소의 종류에 따라 상이한 프로브(probe)를 구비하고 있다. 합성 형광 색소는 합성 형광 색소의 종류에 따라 형광 강도 및 형광 완화 시간이 서로 상이하다. 즉, 형광 비즈(12)는 프로브마다 합성 형광 색소에 의해 라벨(label)화 되어 있다. 합성 형광 색소는 형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 기본 형광 색소 A~D의 비율을 서로 다르게 하고, 또한 기본 형광 색소 A~D의 절대 함유량을 서로 상이하게 하여 제작된 색소이다.
한편, 생체 물질(13)은 형광 단백 등의 형광 색소를 포함하며, 라벨화되어 있다.
플로 사이트 미터(10)는 신호 처리 장치(형광 검출 장치)(20), 분석 장치(80)를 가진다.
신호 처리 장치(20)는 레이저광을 플로 셀(flow cell)을 형성하는 시료 S에 조사하고, 시료 S 중의 형광 비즈(12)의 형광 색소가 발하는 형광과 형광 비즈(12)의 프로브에 결합한 생체 물질(13)의 형광 색소가 발하는 형광을 수광함으로써 광전 변환기로부터 출력한 형광 신호의 신호 처리를 한다.
분석 장치(80)는 신호 처리 장치(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 형광 비즈(12)의 프로브에 결합하는 생체 물질의 분석을 행한다.
그리고, 본 실시예에서는 프로브로서 DNA, 항체 등의 생체 물질과 결합하는 성질을 가지는 것(특이적인 결합을 하는 것)을 사용하지만, 본 발명에서는 그 외에 pH나 산화 환원 전위 등의 측정 환경의 상황에 대하여 넓게 반응하는 물질을 사용할 수 있고, 또 그에 한정되는 것은 아니다.
신호 처리 장치(20)는 레이저 광원부(22), 제1 및 제2 수광부(24, 26), 제어 처리부(28), 관로(30)를 가진다.
제어 처리부(28)는 레이저 광원부(22)로부터의 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조시키는 제어부 및 시료 S로부터의 형광 신호를 처리하는 신호 처리부를 포함한다. 관로(30)는 고속류를 형성하는 시스액에 포함시켜 시료 S를 흐르게 하여 플로 셀을 형성한다.
관로(30)의 출구에는 회수 용기(32)가 설치되어 있다. 플로 사이트 미터(10)에는 레이저광의 조사에 의해 단시간 내에 시료 S 중의 형광 비즈(12)에 결합한 생체 물질(13)을 다른 생체 물질(13) 또는 형광 비즈(12)로부터 분리하기 위한 셀 소터(cell sorter)를 배치하여 별개의 회수 용기로 분리하도록 구성할 수도 있다.
레이저 광원부(22)는 파장이 상이한 2개의 레이저광을 출사한다. 레이저광이 관로(30) 중의 소정의 위치에 집속하도록 렌즈계가 설치되고, 이 집속 위치에서 시료 S를 측정하는 측정점이 형성된다.
도 2는, 레이저 광원부(22)의 구성의 일례를 나타낸 도면이다.
레이저 광원부(22)는 가시광선 대역의 파장을 가지고 소정의 주파수로 강도 변조한 레이저광을 출사한다. 레이저 광원부(22)는 제1 광원(22a)과 제2 광원(22b)을 가진다. 제1 광원(22a)은 기본 형광 색소 A 및 기본 형광 색소 B의 광 흡수 파장 대역 및 생체 물질(13)의 형광 색소의 광 흡수 파장 대역에 파장을 가지는 레이저광을 조사한다. 그러므로, 기본 형광 색소 A 및 기본 형광 색소 B를 사용하여 제작된 합성 형광 색소 및 생체 물질(13)에 부착된 형광 색소는, 소정의 파장 대역에서 소정의 형광 강도 및 소정의 형광 완화 시간으로 형광을 발한다.
제2 광원(22b)은 기본 형광 색소 C 및 기본 형광 색소 D의 광 흡수 파장 대역에 파장을 가지는 레이저광을 조사한다. 그러므로, 기본 형광 색소 C 및 기본 형광 색소 D를 사용하여 제작된 합성 형광 색소는, 소정의 파장 대역에서 소정의 형광 강도 및 소정의 형광 완화 시간으로 형광을 발한다.
또한, 레이저 광원부(22)는 다이크로익 미러(dichroic mirror)(23a), 제1 렌즈계(23b), 제1 및 제2 레이저 드라이버(34a, 34b)를 가진다. 그리고, 다이크로익 미러(23a) 대신에 하프 미러(half mirror)를 사용할 수도 있다.
다이크로익 미러(23a)는 특정한 파장 대역의 레이저광을 투과하고, 다른 파장 대역의 레이저광을 반사한다. 제1 렌즈계(23b)는 레이저광 L1 및 L2로 이루어지는 레이저광 L1＋L2를 관로(30) 중의 측정점에 집속시킨다. 제1 및 제2 레이저 드라이버(34a, 34b)는, 제1 광원(22a) 및 제2 광원(22b) 각각 을 구동한다.
이들 레이저광을 출사하는 광원으로서, 예를 들어 반도체 레이저가 사용된다. 레이저광은, 예를 들어 5~100mW 정도의 출력이다.
한편, 레이저광 L1 및 L2의 강도 변조에 사용하는 주파수(변조 주파수)는 그 주기가 형광 완화 시간에 비해 약간 긴, 예를 들어 10~50MHz이다. 레이저광 L1 및 L2의 강도 변조의 주파수는 상이하다. 이것은, 레이저광으로 여기된 시료 S가 발하는 형광의 주파수도 서로 상이한 주파수로 하여, 어느 레이저광에서 여기한 형광인지를 알아 형광의 정보를 분리하기 위해서이다.
다이크로익 미러(23a)는 레이저광 L1를 투과하고 레이저광 L2를 반사하는 미러이다. 이 구성에 의해 레이저광 L1 및 L2가 합성되어 측정점의 시료(12)를 조사하는 1개의 조사광이 된다.
제1 및 제2 광원(22a, 22b)은 레이저광 L1, L2가 형광 색소를 여기해 특정한 파장 대역의 형광을 발하도록 미리 정해진 파장 대역에서 발진한다. 레이저광 L1, L2에 의해 여기되는 시료(12)는 관로(30)의 측정점을 통과할 때, 측정점에서 레이저광 L1, L2의 조사를 받아 소정의 파장으로 형광 비즈(12) 및/또는 생체 물질(13)이 형광을 발한다.
제1 수광부(24)는 관로(30)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있고, 측정점을 통과하는 시료 S에 의해 레이저광이 전방 산란함으로써, 시료 S가 측정점을 통과하는 것을 나타내는 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 이 제1 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 제어 처리부(28) 및 분석 장치(80)에 공급되어, 시료 S가 관로(30) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 트리거 신호, 처리 개시의 ON신호, OFF 신호로서 사용된다.
한편, 제2 수광부(26)는 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 수직 방향으로, 또한 관로(30) 중의 시료 S의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있고, 측정점에 의해 조사된 시료 S가 발하는 형광을 수광하는 복수개의 광전 변환기를 구비한다. 도 3은 제2 수광부(26)의 일례의 개략의 구성을 나타낸 개략 구성도이다.
도 3에 나타난 제2 수광부(26)는 시료 S로부터의 형광 신호를 집속시키는 제2 렌즈계(26a), 다이크로익 미러(26b1, 26b2), 밴드 패스 필터(band pass filter)(26c1, 26c2, 26c3), 광전자 증배관 등의 광전 변환기(수광 소자)(27a, 27b, 27c)를 가진다.
제2 렌즈계(26a)는 제2 수광부(26)에 입사한 형광을 광전 변환기(27a, 27b, 27c)의 수광면에 집속시키도록 구성되어 있다.
다이크로익 미러(26b1, 26b2)는 소정 범위의 파장 대역의 형광을 반사시키고, 그 이외는 투과시키는 미러이다. 밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3)로 필터링하여 광전 변환기(27a, 27b, 27c)로 소정의 파장 대역의 형광을 입력하도록, 다이크로익 미러(26b1, 26b2)의 반사파장 대역 및 밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3)의 투과 파장 대역이 설정되어 있다.
밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3)는, 각 광전 변환기(27a, 27b, 27c)의 수광면의 앞면에 설치되고, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 투과하는 형광의 파장 대역은, 기본 형광 색소 A~D가 발하는 형광과 생체 물질(13)의 형광 색소가 발하는 형광의 파장 대역에 대응하여 설정되어 있다. 구체적으로는, 파장 대역에 관하여 제1 광원(22a)으로부터 출사된 레이저광 L1의 조사에 의해 형광 비즈(12)의 형광 색소가 발하는 형광을 주로 수광하기 위한 파장 대역 R1, 제2 광원(22b)으로부터 출사된 레이저광 L2의 조사에 의해 형광 비즈(12)의 형광 색소가 발하는 형광을 주로 수광하기 위한 파장 대역 R2, 제1 광원(22a)으로부터 출사된 레이저광 L1의 조사에 의해 생체 물질(13)의 형광 색소가 발하는 형광을 주로 수광하기 위한 파장 대역 R3이 설정된다. 파장 대역 R1은 레이저광 L1로 조사된 시료 S 중, 기본 형광 색소 A 및 기본 형광 색소 B를 포함하여 제작된 합성 형광 색소가 발하는 형광의 파장을 포함한다. 파장 대역 R2는 레이저광 L2로 조사된 시료 S 중, 기본 형광 색소 C 및 기본 형광 색소 D를 포함하여 제작된 합성 형광 색소가 발하는 형광의 파장을 포함한다.
광전 변환기(27a, 27b, 27c)는 예를 들어 광전자 증배관 등의 센서를 구비하고, 광전면에서 수광한 광을 전기 신호로 변환하는 수광 소자이다. 여기서, 수광하는 형광은 소정의 주파수로 강도 변조를 받은 레이저광의 여기에 의해 기초한 것이므로, 출력되는 형광 신호도 소정의 주파수로 강도가 변동하는 신호로 된다. 이 형광 신호는, 제어 처리부(28)에 공급된다.
제어 처리부(28)는 도 4에 나타난 바와 같이, 신호 생성부(40), 신호 처리부(42), 신호 제어부(44)를 가지고 구성된다.
신호 생성부(40)는 레이저광 L1, L2의 강도를 소정의 주파수로 변조하기 위한 변조 신호를 생성하는 부분이다.
구체적으로는, 신호 생성부(40)는 제1 및 제2 발진기(46a, 46b), 파워 스플리터(48a, 48b) 및 제1 내지 제5 앰프(50a, 50b, 52a, 52b, 52c)를 가진다. 신호 생성부(40)는 생성되는 각 변조 신호를 레이저 광원부(22)의 제1 및 제2 레이저 드라이버(34a, 34b)에 공급하는 동시에 신호 처리부(42)에 공급한다. 신호 처리부(42)에 변조 신호를 공급하는 것은, 후술하는 바와 같이 광전 변환기(27a, 27b, 27c)로부터 출력되는 형광 신호를 검파하기 위한 참조 신호로서 사용하기 때문이다. 그리고, 변조 신호는 DC성분에 소정의 주파수의 정현파 신호가 실린 신호이며, 10~50MHz의 범위의 주파수로 설정된다. 제1 발진기(46a)와 제2 발진기(46b)는 서로 상이한 주파수 f1, f2의 신호를 발진하고, 상이한 주파수의 변조 신호를 생성한다. 그리고, 본 실시예에서는 서로 상이한 주파수 f1, f2의 신호를 변조 신호로서 사용하지만, 측정하고자 하는 형광이 밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3)로 충분히 분리 가능하면, 주파수 f1, f2를 상이하게 하지 않고 일치시켜도 된다.
또한, 제1 및 제2 발진기(46a, 46b)는 주파수 f1, f2를 자유롭게 변경할 수 있도록 구성해도 된다. 또한, 밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3)에 대해서도 사용하는 형광 비즈(12)의 종류에 맞추어 투과 파장 대역을 바꿀 수 있는 가변 필터를 사용해도 된다.
신호 처리부(42)는 광전 변환기(27a, 27b, 27c)로부터 출력되는 형광 신호를 사용하여 레이저광의 조사에 의해 발하는 형광의 형광 강도 및 위상 지연에 관한 정보를 추출하는 부분이다. 신호 처리부(42)는 광전 변환기(27a, 27b, 27c)로부터 출력되는 형광 신호를 증폭하는 제6 내지 제8 앰프(54a, 54b, 54c), 증폭된 형광 신호의 각각을 신호 생성부(40)로부터 공급된 정현파 신호인 변조 신호를 참조 신호로서 형광 신호와 합성하는 IQ 믹서(58a, 58b, 58c), 로우 패스 필터(low pass filter)(62)를 가지고 구성된다.
IQ 믹서(58a, 58b, 58c)는 광전 변환기(27a, 27b, 27c)로부터 공급되는 형광 신호를, 신호 생성부(40)로부터 공급되는 변조 신호를 참조 신호로서 믹싱하는 장치이다. 구체적으로는, IQ 믹서(58a, 58b, 58c)의 각각은 참조 신호를 형광 신호(RF(Radio Frequency)신호)와 곱하여, 형광 신호의 변조 신호와 동상의 성분을 포함하는 신호 및 형광 신호의 변조 신호에 대하여 90도 위상을 시프트한 성분을 포함하는 신호를 생성한다. 동상의 성분을 포함하는 신호는 변조 신호와 형광 신호를 믹싱함으로써 생성되고, 90도 위상을 시프트한 성분을 포함하는 신호는 변조 신호에 대하여 90도 위상을 시프트한 신호와 형광 신호를 믹싱함으로써 생성된다.
로우 패스 필터(62)는 IQ 믹서(58a, 58b, 58c)에서 생성된 신호의 저주파 신호를 꺼내는 부분이다. 이 꺼내어짐에 의해, 형광 신호의 변조 신호와 동상의 성분(Re성분) 및 형광 신호의 변조 신호에 대하여 90도 위상을 시프트한 성분(Im성분)이 형광 데이터로서 꺼내어진다. 꺼내어진 각 성분은 신호 제어부(44)에 보내진다. Re성분 및 Im성분은 광전 변환기(27a, 27b, 27c)에 설정된 파장 대역 R1, 파장 대역 R2 및 파장 대역 R3마다 얻어지므로, 파장 대역 R1의 Re성분 및 Im성분의 세트, 파장 대역 R2의 Re성분 및 Im성분의 세트, 파장 대역 R3의 Re성분 및 Im성분의 세트가 신호 제어부(44)에 보내진다. 이후에는, IQ 믹서(58a, 58b, 58c)에 의한 믹싱 처리와 로우 패스 필터(62)에 의한 필터링 처리를 포함하는 처리를 주파수 다운 변환 처리라 하고, 이 처리에 의해 얻어지는 데이터를 형광 데이터라 한다.
신호 제어부(44)는 신호 처리부(42)로부터 보내진 형광 신호의 Re성분 및 Im성분을 증폭하고, AD변환을 행하는 부분이다.
구체적으로는, 신호 제어부(44)는 각 부분의 동작 제어를 위한 지시를 부여하고 플로 사이트 미터(10)의 전 동작을 관리하는 시스템 컨트롤러(60), 신호 처리부(42)에서 생성된 Re성분 및 Im성분을 증폭하는 제9 앰프(64), 증폭된 Re성분 및 Im성분을 샘플링하는 A/D 변환기(66)를 가진다.
분석 장치(80)는 신호 제어부(44)에 의해 AD 변환되어 얻어지는 Re성분, Im성분으로부터, 형광 색소가 발하는 형광의 형광 강도를 구한다. 또한, 분석 장치(80)는 레이저광의 강도 변조에 대한 형광의 위상 지연각도를 구하고, 또한 이 위상 지연각도로부터 형광 완화 시정수(형광 완화 시간) 및 형광 강도를 구한다. 도 5는 분석 장치(80)의 개략의 구성을 나타낸 도면이다.
분석 장치(80)는 CPU(82) 및 메모리(84)를 구비하는 컴퓨터로 구성되며, 또한 형광 강도 산출부(90), 위상 지연 산출부(92), 형광 완화 시간 산출부(94), 시료 분석부(96)를 가진다. 이들 각 부분은 컴퓨터 상에서 프로그램을 기동시킴으로써 기능을 발휘하는 소프트 웨어 모듈이다. 물론, 이들 부분을 전용 회로로 구성할 수도 있다.
형광 강도 산출부(90)는 A/D 변환기(66)로부터 공급된 형광 데이터에 대하여, 복소수의 절대값을 구함으로써 형광 강도를 산출한다.
위상 지연 산출부(92)는 A/D 변환기(66)로부터 공급된 형광 데이터에 대하여, Re성분을 실수부으로 하고 Im성분을 허수부으로 한 복소수의 편각(tan-1(형광 데이터의 Im성분/형광 데이터의 Re성분)을 위상 지연 θ로서 산출한다.
형광 완화 시간 산출부(94)는 위상 지연 산출부(92)에서 산출된 θ를 사용하여, 형광 완화 시간 τ를 τ=1/(2πf)?tan(θ)의 식에 따라 산출하는 부분이다. 여기서, f는 레이저광 L1 또는 L2의 강도 변조에 사용한 주파수이다. 형광 완화 시간 τ를 τ=1/(2πf)?tan(θ)의 식에 따라 산출할 수 있는 것은, 형광 현상이 1차의 완화과정에 따른 변화를 나타내기 때문이다.
시료 분석부(96)는 산출된 형광 강도, 형광 완화 시간 τ를 사용하여 생체 물질(13)이 어느 종류의 형광 비즈(12)에 결합하는지를 분석한다. 시료 분석부(96)는 분석 결과 및 분석을 위해 작성한 데이터나 그래프를 프린터나 디스플레이 등의 출력 장치에 출력한다.
구체적으로는, 시료 분석부(96)는 형광 비즈(12)가 발하는 형광을 형광 강도, 형광 완화 시간 및 형광 파장 대역에 따라 식별하고, 또한 생체 물질(13)이 발하는 형광을 식별한다. 그때, 시료 분석부(96)는 식별한 형광에 의해 형광 비즈의 종류를 식별한 경우, 생체 물질(13)이 발하는 형광을 동시에 수광하였는지 아닌지를 판정한다. 시료 분석부(96)는 또한 생체 물질(13)이 발하는 형광을 수광한 경우, 어느 종류의 형광 비즈(12)가 발하는 형광을 동시에 수광하였는지를 판정한다.
이로써, 생체 물질(13)이 어느 종류의 형광 비즈(12)에 결합했는지를 알 수 있고, 생체 물질(13)의 특성을 분석할 수 있다.
도 6a는 파장 대역 R1에서 측정된 형광의 형광 강도의 히스토그램과 형광 완화 시간의 히스토그램의 일례를 나타낸 도면이다. 도 6b는 파장 대역 R2에서 측정된 형광의 형광 강도의 히스토그램과 형광 완화 시간의 히스토그램의 일례를 나타낸 도면이다.
파장 대역 R1에서는 형광 비즈(12)가 발하는 4종류의 형광 a~d를 측정하고 있다. 형광 비즈(12)는 기본 형광 색소 A, D가 함유하는 비율과 절대 함유량이 상이한 것으로 복수개의 종류를 구비하고, 복수개의 종류마다 상이한 형광을 발한다. 형광 a~d는 파장 대역 R1에서 형광 강도 및 형광 완화 시간이 상이하고, 도 6a에 나타난 히스토그램으로부터 4종류의 형광을 식별할 수 있다. 도 6a 중의 형광 a, d의 형광 완화 시간이 근접하고 있는 경우라도, 형광 강도의 히스토그램에서는 형광 a, d의 분포는 충분히 이격되어 있으므로, 형광 a, d를 분리하여 식별할 수 있다.
파장 대역 R2에서도, 형광 비즈(12)가 발하는 4종류의 형광α~δ를 측정하고 있다. 형광α~δ는, 파장 대역 R2에서 형광 강도 및 형광 완화 시간이 상이하다. 그러므로, 도 6b에 나타난 히스토그램으로부터 4종류의 형광을 식별할 수 있다. 도 6b 중의 형광β, γ의 형광 완화 시간이 근접하고 있는 경우라도, 형광 강도의 히스토그램에서는 형광β, γ의 분포는 충분히 이격되어 있으므로, 형광β, γ를 분리하여 식별할 수 있다.
파장 대역 R3에서는 생체 물질(13)이 발하는 형광을 측정하고 있다. 도 6c에 나타난 히스토그램으로부터 형광을 식별할 수 있다.
도 6d는 파장 대역 R1의 형광 강도 P와 파장 대역 R3의 형광 강도 P와의 대응을 보기 위해 형광 강도 P의 데이터를 플롯(plot)한 분포도이다. 도 6e는 파장 대역 R1의 형광 완화 시간 τ와 파장 대역 R3의 형광 완화 시간 τ와의 대응을 보기 위해 형광 완화 시간 τ의 데이터를 플롯한 분포도이다.
도 6d에서는 파장 대역 R1에서 형광 강도 Pc의 형광 데이터가 얻어지는 때, 파장 대역 R3에서 형광 강도 Px의 형광 데이터가 동시에 얻어지는 것을 나타내고 있다. 도 6e에서는 파장 대역 R1에서 형광 완화 시간 τc의 형광 데이터가 얻어지는 때, 파장 대역 R3에서 형광 완화 시간 τx의 형광 데이터가 동시에 얻어지는 것을 나타내고 있다.
따라서, 본 실시예는 형광 비즈(12)가 발하는 형광을 계측할 때 파장 대역 R3에서 형광 완화 시간 τx의 형광 데이터가 동시에 얻어지는지 여부를 조사함으로써, 형광 비즈(12) 중 어느 종류의 형광 비즈(12)에 생체 물질(13)이 결합하기 쉬운가를 특정할 수 있다.
이와 같이, 본 실시예에서는, 도 6a에 나타난 바와 같이 파장 대역 R1, R2, 형광 강도, 형광 완화 시간의 3개의 식별 인자로, 서로 상이한 종류의 형광을 발하는 형광 비즈(12)를 실현할 수 있다. 이와 같은 복수 종류의 형광 비즈(12)는 예를 들어 형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 2종류의 기본 형광 색소 A, B의 비율과 기본 형광 색소 A, B의 절대 함유량을 서로 상이하게 한 3종류 이상의 합성 형광 색소로 라벨화하는 것으로 실현할 수 있다.
본 실시예에서는 2종류의 기본 형광 색소 A, B를 사용하였지만, 3종류 이상의 기본 형광 색소를 사용할 수도 있다.
예를 들어 형광 비즈(12)의 파장 대역에 관하여 2종류(파장 대역 1, 파장 대역 2)로 하고, 형광 비즈(12)가 발하는 복수개의 형광을 파장 영역 1 및 파장 영역 2에서 수광하여 각 형광의 형광 강도와 형광 완화 시간을 구하는 경우, 형광 완화 시간에 관하여 파장 대역 1에서 5종류로 하고, 파장 대역 2에 있어서도 5종류로 하고, 형광 강도에 관하여 파장 대역 1에서 5종류로 하고, 파장 대역 2에서도 5종류로 되도록 형광 비즈(12)의 종류를 설정했을 때, 플로 사이트 미터(10)로 식별 가능한 형광 비즈(12)의 합계의 종류는 625종류(=5×5×5×5)로 된다. 즉, 형광 비즈(12)에 파장 대역 1에서의 기본 형광 색소와 파장 대역 2에서의 기본 형광 색소를 포함하게 하여, 형광 비즈(12)는 파장 대역 1 및 파장 대역 2의 양쪽의 계측 결과를 사용하여 식별될 수 있다. 이 경우, 파장 대역 1 및 파장 대역 2는 450~500nm의 단파장 대역 및 600~650nm의 장파장 대역과 같이 형광의 파장 대역이 이격되어 있는 것이 바람직하다.
그리고, 기본 형광 색소가 2종류인 경우, 기본 형광 색소의 각각의 형광 강도를 F1 및 F2로 하고, 형광 완화 시간을 τ1 및 τ2로 하고, 기본 형광 색소의 비율을 x(x는 1 미만의 정수(正數)) 및 (1-x)로 하고, 절대 함유량에 의해 정해지는 정수(전 지수 인자)를 α1 및 α2로 했을 때,
제작되는 3종류 이상의 형광 비즈는, 하기 수식 (1)에서 정해지는 형광 강도 F 및 하기 수식 (2)에서 정해지는 형광 완화 시간 τ가 서로 상이하도록 상기 비율과 상기 절대 함유량이 설정되어 있는 것이 바람직하다.
수식 (1)
F=α1×τ1×x＋α2×τ2×(1-x)
수식 (2)
τ=｛α1×τ1 2×x＋α2×τ2 2×(1-x)}/F
정수(定數) α1, α2는 절대 함유량에 의해 정해지는 값이며, 절대 함유량이 커지게 되는 만큼 값이 커지는 정수이다. 따라서, 절대 함유량을 크게 함으로써 합성 형광 색소가 발하는 형광의 형광 강도를 크게 할 수 있다. 한편, 형광 완화 시간은 정수 α1, α2가 커져도, 비율 x, (1-x)에 따라 변화한다. 그러므로, 형광 강도와 형광 완화 시간을 독립적으로 설정할 수 있다.
그리고, 형광 비즈(12)는 예를 들어 다음과 같이 하여 제작된다. 즉, 형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 2종류의 기본 형광 색소의 절대 함유량이 설정되는 경우, 상기 비율 및 상기 절대 함유량에 따라 얻어지는 합성 형광 색소의 형광 강도 및 형광 완화 시간이 기본 형광 색소의 형광 강도 및 형광 완화 시간과 모두 상이하고, 다른 합성 형광 색소의 형광 강도 및 형광 완화 시간과도 서로 상이하도록, 비율 및 절대 함유량이 설정된다. 이후, 설정한 상기 비율 및 상기 절대 함유량을 사용하여 얻어진 합성 형광 색소로 형광 비즈(12)가 라벨화된다. 예를 들어 형광 비즈(12)의 표면에 합성 형광 색소가 도포된다. 또는, 형광 비즈(12)의 재료 자체에 합성 형광 색소를 함유시켜, 이 재료가 구(球)형상으로 성형(成形)된다.
기본 형광 색소가 2종류인 경우, 기본 형광 색소의 각각의 형광 강도를 F1 및 F2로 하고, 형광 완화 시간을 τ1 및τ2로 하고, 기본 형광 색소의 비율을 x(x는 1 미만의 정수(正數)) 및 (1-x)로 하고, 절대 함유량에 의해 정해지는 정수(定數)를 α1 및α2로 했을 때, 합성 형광 색소의 형광 강도 F 및 형광 완화 시간 τ는 상기 수식 (1) 및 (2)에 따라 정해진다.
이상, 본 발명의 형광 검출 장치, 형광 검출 방법 및 형광 신호를 신호 처리하는 방법에 대하여 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위에서 각종 개량이나 변경을 해도 되는 것은 물론이다.
10: 플로 사이트 미터
12: 형광 비즈
20: 신호 처리 장치
22: 레이저 광원부
22a, 22b: 제1 및 제2 광원
23a, 26b: 다이크로익 미러
23b, 26a: 제1 및 제2 렌즈계
24, 26: 제1 및 제2 수광부
26c1, 26c2, 26c3: 밴드 패스 필터
27a, 27b, 27c: 광전 변환기
28: 제어 처리부
30: 관로
32: 회수 용기
34a, 34b: 제1 및 제2 레이저 드라이버
48a, 48b: 파워 스플리터
40: 신호 생성부
42: 신호 처리부
44: 신호 제어부
46a, 46b: 제1 및 제2 발진기
50a, 50b, 52a, 52b, 52c, 54a, 54b, 54c, 64: 제1 내지 제9 앰프
58a, 58b, 58c: IQ 믹서
60: 시스템 컨트롤러
62: 로우 패스 필터
66: A/D 변환기
80: 분석 장치
82: CPU
84: 메모리
90: 형광 강도 산출부
92: 위상 지연 산출부
94: 형광 완화 시간 산출부
96: 시료 분석부
12: 형광 비즈
20: 신호 처리 장치
22: 레이저 광원부
22a, 22b: 제1 및 제2 광원
23a, 26b: 다이크로익 미러
23b, 26a: 제1 및 제2 렌즈계
24, 26: 제1 및 제2 수광부
26c1, 26c2, 26c3: 밴드 패스 필터
27a, 27b, 27c: 광전 변환기
28: 제어 처리부
30: 관로
32: 회수 용기
34a, 34b: 제1 및 제2 레이저 드라이버
48a, 48b: 파워 스플리터
40: 신호 생성부
42: 신호 처리부
44: 신호 제어부
46a, 46b: 제1 및 제2 발진기
50a, 50b, 52a, 52b, 52c, 54a, 54b, 54c, 64: 제1 내지 제9 앰프
58a, 58b, 58c: IQ 믹서
60: 시스템 컨트롤러
62: 로우 패스 필터
66: A/D 변환기
80: 분석 장치
82: CPU
84: 메모리
90: 형광 강도 산출부
92: 위상 지연 산출부
94: 형광 완화 시간 산출부
96: 시료 분석부
Claims (11)
- 형광 색소로 라벨화된 형광 비즈(beads)가 발하는 형광을 사용하여 형광 비즈의 종류를 식별하는 형광 검출 방법에 있어서,
형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 복수 종류의 기본 형광 색소의 비율과 상기 기본 형광 색소의 절대 함유량을 서로 상이하게 한 복수 종류의 합성 형광 색소로 라벨화된 복수 종류의 형광 비즈를 사용하여, 복수개의 파장 대역마다 형광 강도와 형광 완화 시간을 계측하는 단계; 및
계측된 상기 형광 강도, 상기 형광 완화 시간 및 상기 파장 대역의 정보를 사용하여 계측한 형광 비즈의 종류를 식별하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 형광 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 기본 형광 색소가 2종류이며, 상기 기본 형광 색소의 각각의 형광 강도를 F1 및 F2로 하고, 형광 완화 시간을 τ1 및 τ2로 하고, 상기 기본 형광 색소의 비율을 x(x는 1 미만의 정수(正數)) 및 (1-x)로 하고, 상기 절대 함유량에 의해 정해지는 정수(正數)를 α1 및 α2로 했을 때, 상기 복수 종류의 합성 형광 색소는 하기 식 1에서 정해지는 합성 형광 강도 F 및 하기 식 2에서 정해지는 합성 형광 완화 시간 τ가 서로 상이하도록 상기 비율과 상기 절대 함유량이 설정되어 있는, 형광 검출 방법.
식 1: F=α1×τ1×x＋α2×τ2×(1-x)
식 2: τ=｛α1×τ1 2×x＋α2×τ2 2×(1-x)}/F - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 형광 완화 시간의 계측은, 소정의 주파수로 강도 변조한 레이저광을 상기 형광 비즈에 조사했을 때 상기 형광 비즈가 발하는 형광을 수광함으로써, 레이저광의 강도 변조에 대한 수광한 형광의 위상 지연 각도를 구함으로써 행해지는, 형광 검출 방법. - 제3항에 있어서,
상기 형광 비즈에 조사하는 레이저광은 파장이 상이한 복수개의 레이저광의 합성 광이며,
상기 복수 종류의 기본 형광 색소의 광 흡수 파장 대역의 각각에는, 상기 복수개의 레이저광의 파장 중 어느 하나가 포함되는, 형광 검출 방법. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 형광 비즈의 각각은 특정한 물질과 결합하는 프로브(probe)를 구비하고,
상기 특정한 물질은 상기 레이저광의 조사에 의해 특정한 파장에서 형광하는 형광 색소를 포함하고,
상기 형광 강도와 상기 형광 완화 시간의 계측을 행할 때, 상기 특정한 물질이 발하는 형광은 상기 형광 비즈가 발하는 형광에 대하여 상이한 파장 대역의 광으로서 수광되고, 형광 강도와 형광 완화 시간이 구해지는 것에 의해 상기 특정한 물질이 식별되는, 형광 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 형광 비즈의 종류를 식별할 때, 상기 특정한 물질이 발하는 형광의 형광 강도와 상기 형광 비즈가 발하는 형광의 형광 강도 사이의 형광 강도에 관한 분포도를 상기 복수개의 파장 대역마다 구하고, 또한 상기 특정한 물질이 발하는 형광의 형광 완화 시간과 상기 형광 비즈가 발하는 형광의 형광 완화 시간 사이의 형광 완화 시간에 관한 분포도를 상기 복수개의 파장 대역마다 구하고, 상기 형광 강도에 관한 분포도와 상기 형광 완화 시간에 관한 분포도를 사용하여, 상기 특정한 물질이 결합하는 형광 비즈의 종류를 특정하는, 형광 검출 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 비즈의 각각은, 레이저광이 수속하는 측정점을 차례로 1개씩 통과하도록 유로에 따라 흐르고,
상기 형광 비즈가 상기 측정점을 통과하는 때에, 상기 형광 강도와 상기 형광 완화 시간의 계측이 행해지는, 형광 검출 방법. - 형광 색소로 라벨화된 복수 종류의 형광 비즈(beads)를 제작하는 방법에 있어서,
형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 상기 기본 형광 색소의 절대 함유량이, 다른 종류의 형광 비즈 사이에서 서로 상이하도록 상기 비율 및 상기 절대 함유량을 설정하는 단계; 및
설정한 상기 비율 및 상기 절대 함유량을 사용하여 얻어진 합성 형광 색소로 형광 비즈를 라벨화하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 비즈의 제작 방법. - 제8항에 있어서,
상기 기본 형광 색소가 2종류이며, 상기 기본 형광 색소의 각각의 형광 강도를 F1 및 F2로 하고, 형광 완화 시간을 τ1 및 τ2로 하고, 상기 기본 형광 색소의 비율을 x(x는 1 미만의 정수(正數)) 및 (1-x)로 하고, 상기 절대 함유량에 의해 정해지는 정수(正數)를 α1 및 α2로 했을 때, 상기 합성 형광 색소의 형광 강도 F 및 형광 완화 시간 τ는 하기 식 3 및 식 3에 따라 정해지는, 형광 비즈의 제작 방법.
식 3: F=α1×τ1×x＋α2×τ2×(1-x)
식 4: τ=｛α1×τ1 2×x＋α2×τ2 2×(1-x)}/F - 형광 색소로 라벨화된 복수 종류의 형광 비즈(beads)에 있어서,
형광 강도, 형광 파장 및 형광 완화 시간이 서로 상이한 적어도 2종류의 기본 형광 색소를 포함하고, 상기 적어도 2종류의 기본 형광 색소의 비율과 상기 기본 형광 색소의 절대 함유량이, 다른 종류의 형광 비즈 사이에서 서로 상이하도록 상기 비율 및 상기 절대 함유량이 설정되어 있는 것을 특징으로 하는, 형광 비즈. - 제10항에 있어서,
상기 복수 종류의 형광 비즈에는, 상기 형광 비즈의 종류에 따라 상이한 물질과 결합하는 프로브(probe)가 구비되어 있는, 형광 비즈.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010010713 | 2010-01-21 | ||
| JPJP-P-2010-010713 | 2010-01-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120112489A true KR20120112489A (ko) | 2012-10-11 |
Family
ID=44306700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020127016502A KR20120112489A (ko) | 2010-01-21 | 2011-01-19 | 형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120295278A1 (ko) |
| EP (1) | EP2527819A1 (ko) |
| JP (1) | JP4918178B2 (ko) |
| KR (1) | KR20120112489A (ko) |
| CN (1) | CN102713576A (ko) |
| WO (1) | WO2011089897A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190006164A (ko) * | 2016-05-12 | 2019-01-17 | 비디 바이오사이언시스 | 개선된 이미지 해상도를 갖는 형광 이미징 유세포 분석법 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103788942B (zh) * | 2014-02-24 | 2015-09-23 | 苏州大学 | 掺杂Eu3+和罗丹明6G的高分子荧光编码微球及制备方法 |
| CN110307929B (zh) * | 2019-07-08 | 2020-08-25 | 上海交通大学 | 一种基于压力敏感薄膜的流体压力测量系统及方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003083894A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-03-19 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 蛍光値補正方法、蛍光値補正装置、蛍光値補正プログラム及び前記蛍光値補正プログラムを記録した記録媒体 |
| CN1362623A (zh) * | 2002-01-21 | 2002-08-07 | 陕西超英生物医学研究开发有限公司 | 一种多元免疫微球、该多元免疫微球的制备技术以及对该多元免疫微球进行检测的方法 |
| CN100442052C (zh) * | 2002-08-15 | 2008-12-10 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 磁性荧光微球及其制备方法和采用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法 |
| EP2369326B1 (en) * | 2005-02-15 | 2013-09-04 | Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. | Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method |
| JP4540579B2 (ja) * | 2005-09-29 | 2010-09-08 | 三井造船株式会社 | 蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置 |
| JP2006266905A (ja) * | 2005-03-24 | 2006-10-05 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | クロロフィル分析装置及びクロロフィルの分析方法 |
| JP4300366B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2009-07-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 蛍光検出方法、蛍光検出用ビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズ |
| JP4652868B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-03-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 蛍光分析方法 |
| JP4399575B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2010-01-20 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 遺伝子断片中のヌクレオチドの種類の特定方法 |
| JP4365380B2 (ja) * | 2006-03-10 | 2009-11-18 | 三井造船株式会社 | Ｆｒｅｔ検出方法および装置 |
| WO2008042565A2 (en) * | 2006-09-29 | 2008-04-10 | Glaxo Group Limited | Method and system for rapid phase luminescense spectroscopy analysis |
| JP4365439B2 (ja) * | 2008-03-04 | 2009-11-18 | 三井造船株式会社 | 蛍光検出方法及び蛍光検出装置 |
-
2011
- 2011-01-19 US US13/574,087 patent/US20120295278A1/en not_active Abandoned
- 2011-01-19 KR KR1020127016502A patent/KR20120112489A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-01-19 WO PCT/JP2011/000258 patent/WO2011089897A1/ja active Application Filing
- 2011-01-19 EP EP11734504A patent/EP2527819A1/en not_active Withdrawn
- 2011-01-19 CN CN201180006463.3A patent/CN102713576A/zh active Pending
- 2011-01-19 JP JP2011502584A patent/JP4918178B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190006164A (ko) * | 2016-05-12 | 2019-01-17 | 비디 바이오사이언시스 | 개선된 이미지 해상도를 갖는 형광 이미징 유세포 분석법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102713576A (zh) | 2012-10-03 |
| EP2527819A1 (en) | 2012-11-28 |
| JP4918178B2 (ja) | 2012-04-18 |
| US20120295278A1 (en) | 2012-11-22 |
| WO2011089897A1 (ja) | 2011-07-28 |
| JPWO2011089897A1 (ja) | 2013-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101224976B1 (ko) | 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 | |
| KR101200397B1 (ko) | 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 | |
| EP1855102B1 (en) | Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method | |
| JP4384064B2 (ja) | 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置 | |
| KR101137681B1 (ko) | 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치 | |
| JP4500887B2 (ja) | 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置および蛍光検出方法 | |
| JP4540751B1 (ja) | 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 | |
| KR101152614B1 (ko) | 형광 공명 에너지 이동 검출 방법 및 장치 | |
| KR20120112489A (ko) | 형광 검출 방법, 형광 비즈의 제작 방법 및 형광 비즈 | |
| JP5443404B2 (ja) | 蛍光検出装置、蛍光検出装置の診断方法、および蛍光検出方法 | |
| WO2010092752A1 (ja) | 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 | |
| JP4300366B2 (ja) | 蛍光検出方法、蛍光検出用ビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |