JP4918178B2 - 蛍光検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、蛍光色素でラベル化された蛍光ビーズが発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する蛍光検出方法、蛍光色素でラベル化された蛍光ビーズを作製する方法、および蛍光色素でラベル化された蛍光ビーズに関する。
医療、生物分野で用いられるフローサイトメータでは、蛍光ビーズにレーザ光を照射することにより、生体物質が結合した蛍光ビーズの発する蛍光を検出し、この蛍光により、その生体物質が結合する蛍光ビーズのプローブの種類を識別することが行われている。ここで、蛍光ビーズには、プローブ（相補的な配列を持つ遺伝子の断片や特定のタンパク質に結合する抗体などの選択的結合機能を有する物質）が表面に設けられている。
フローサイトメータは、具体的には、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質が、所定の蛍光色素でラベル化された状態で含まれる懸濁液に、識別可能な蛍光色素で染色されてラベル化された蛍光ビーズを蛍光試薬として混ぜた後、圧力を与えて毎秒１０ｍ程度の速度で管路内を流れるシース液に蛍光ビーズを流してフローセルを形成する。このフローセル中の蛍光ビーズにレーザ光を照射することにより、蛍光ビーズが発する蛍光と、この蛍光ビーズに結合した生体物質が発する蛍光とを受光する。そして、これらの蛍光から蛍光ビーズの蛍光をラベルとして識別することで、その生体物質が結合するプローブの種類を特定することができる。
特に、蛍光ビーズ毎に異なる種類のプローブを設け、プローブの種類毎に異なる蛍光色素で識別可能なように蛍光ビーズを染色することで、生体物質がどのようなプローブに結合するかを調べることができる。このような場合、種々のプローブを備える多数の蛍光ビーズを、生体物質を含む懸濁液に混ぜて、フローサイトメータで短時間に一度に分析することが望まれている。
なお、従来の蛍光検出方法として、蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられたビーズが発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する方法が知られている（特許文献１）。この方法では、予め、蛍光緩和時間の異なる２種類の蛍光色素を混合したものでビーズが染色され、このビーズを用いて蛍光検出が行われるとき、ビーズの蛍光を検出して蛍光緩和時間を計測することにより、ビーズの種類を識別する。
上記方法により、１回の計測で数１００種類のビーズを識別可能にすることが可能になると考えられる。しかし、蛍光緩和時間の１回の計測で、数１００種類のビーズを必ずしも精度高く識別することはできない。
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、従来に比べて、１回の計測でより多数の種類のビーズを精度高く識別することができる蛍光検出方法、蛍光ビーズの作製方法および蛍光ビーズを提供することを目的とする。
本発明の一態様は、蛍光色素でラベル化された蛍光ビーズが発する蛍光を用いて、蛍光ビーズの種類を識別する蛍光検出方法であって、
蛍光強度、蛍光波長および蛍光緩和時間がお互いに異なる２種類の基本蛍光色素の比率と前記基本蛍光色素の絶対含有量とをお互いに異ならせた複数種類の合成蛍光色素でラベル化された複数種類の蛍光ビーズを用いて、複数の波長帯域毎に、蛍光強度と蛍光緩和時間を計測するステップと、
計測された前記蛍光強度、前記蛍光緩和時間および前記波長帯域の情報を用いて、計測した蛍光ビーズの種類を識別するステップと、を有する。
前記基本蛍光色素のそれぞれの蛍光強度をＦ 1 およびＦ 2 とし、前記基本蛍光色素のそれぞれの蛍光緩和時間をτ 1 およびτ 2 とし、前記基本蛍光色素のそれぞれの比率をｘ（ｘは１未満の正数）および（１−ｘ）とし、前記絶対含有量によって定まる定数をα １ およびα 2 としたとき、
前記複数種類の合成蛍光色素は、下記式（１）で定まる合成蛍光強度Ｆ、および下記式（２）で定まる合成蛍光緩和時間τがお互いに異なるように、前記比率と前記絶対含有量とが設定されている。
Ｆ ＝ α １ ×τ 1 ×ｘ＋α 2 ×τ 2 ×（１−ｘ） （１）
τ ＝ ｛α １ ×τ 1 2 ×ｘ＋α 2 ×τ 2 2 ×（１−ｘ）}／Ｆ （２）
蛍光強度、蛍光波長および蛍光緩和時間がお互いに異なる２種類の基本蛍光色素の比率と前記基本蛍光色素の絶対含有量とをお互いに異ならせた複数種類の合成蛍光色素でラベル化された複数種類の蛍光ビーズを用いて、複数の波長帯域毎に、蛍光強度と蛍光緩和時間を計測するステップと、
計測された前記蛍光強度、前記蛍光緩和時間および前記波長帯域の情報を用いて、計測した蛍光ビーズの種類を識別するステップと、を有する。
前記基本蛍光色素のそれぞれの蛍光強度をＦ 1 およびＦ 2 とし、前記基本蛍光色素のそれぞれの蛍光緩和時間をτ 1 およびτ 2 とし、前記基本蛍光色素のそれぞれの比率をｘ（ｘは１未満の正数）および（１−ｘ）とし、前記絶対含有量によって定まる定数をα １ およびα 2 としたとき、
前記複数種類の合成蛍光色素は、下記式（１）で定まる合成蛍光強度Ｆ、および下記式（２）で定まる合成蛍光緩和時間τがお互いに異なるように、前記比率と前記絶対含有量とが設定されている。
Ｆ ＝ α １ ×τ 1 ×ｘ＋α 2 ×τ 2 ×（１−ｘ） （１）
τ ＝ ｛α １ ×τ 1 2 ×ｘ＋α 2 ×τ 2 2 ×（１−ｘ）}／Ｆ （２）
上記態様の蛍光検出方法、蛍光ビーズの作製方法および蛍光ビーズを用いることにより、１回の計測でより多数の種類のビーズを精度高く識別することができることができる。
以下、本発明の蛍光検出方法、蛍光ビーズの作製方法および蛍光ビーズを詳細に説明する。
図１は、本発明の蛍光検出方法を実施するフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、蛍光ビーズ１２および生体物質１３を含む試料Ｓをシース液とともに流し、所定の周波数で強度変調したレーザ光を、測定点を通過する試料Ｓに照射し、このとき試料Ｓが発する蛍光を受光して蛍光を検出する。
図１は、本発明の蛍光検出方法を実施するフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、蛍光ビーズ１２および生体物質１３を含む試料Ｓをシース液とともに流し、所定の周波数で強度変調したレーザ光を、測定点を通過する試料Ｓに照射し、このとき試料Ｓが発する蛍光を受光して蛍光を検出する。
蛍光ビーズ１２は、数μｍ程度の直径を有する球体であり、合成蛍光色素を含有する。蛍光ビーズ１２は、その表面に、合成蛍光色素の種類に応じて異なるプローブを備えている。合成蛍光色素は、合成蛍光色素の種類に応じて、蛍光強度及び蛍光緩和時間がお互いに異なっている。すなわち、蛍光ビーズ１２は、プローブ毎に合成蛍光色素によりラベル化されている。合成蛍光色素は、蛍光強度、蛍光波長および蛍光緩和時間が互いに異なる基本蛍光色素Ａ〜Ｄの比率を互いに異ならせ、さらに、基本蛍光色素Ａ〜Ｄの絶対含有量を互いに異ならせて作製された色素である。
一方、生体物質１３は、蛍光蛋白等の蛍光色素を含み、ラベル化されている。
一方、生体物質１３は、蛍光蛋白等の蛍光色素を含み、ラベル化されている。
フローサイトメータ１０は、信号処理装置（蛍光検出装置）２０と分析装置８０とを有する。
信号処理装置２０は、レーザ光を、フローセルを形成する試料Ｓに照射し、試料Ｓ中の蛍光ビーズ１２の蛍光色素が発する蛍光と、蛍光ビーズ１２のプローブに結合した生体物質１３の蛍光色素が発する蛍光を受光することにより光電変換器から出力した蛍光信号の信号処理をする。
分析装置８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光ビーズ１２のプローブに結合する生体物質の分析を行なう。
なお、本実施形態では、プローブとして、ＤＮＡ、抗体等の生体物質と結合する性質を持つもの（特異的な結合をするもの）を用いるが、本発明においては、この他にpHや酸化還元電位等の測定環境の状況に対して広く反応する物質を用いることもでき、又これらに限定されるものではない。
信号処理装置２０は、レーザ光を、フローセルを形成する試料Ｓに照射し、試料Ｓ中の蛍光ビーズ１２の蛍光色素が発する蛍光と、蛍光ビーズ１２のプローブに結合した生体物質１３の蛍光色素が発する蛍光を受光することにより光電変換器から出力した蛍光信号の信号処理をする。
分析装置８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光ビーズ１２のプローブに結合する生体物質の分析を行なう。
なお、本実施形態では、プローブとして、ＤＮＡ、抗体等の生体物質と結合する性質を持つもの（特異的な結合をするもの）を用いるが、本発明においては、この他にpHや酸化還元電位等の測定環境の状況に対して広く反応する物質を用いることもでき、又これらに限定されるものではない。
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を有する。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料Ｓからの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料Ｓを流してフローセルを形成する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料Ｓ中の蛍光ビーズ１２に結合した生体物質１３を、他の生体物質１３あるいは蛍光ビーズ１２から分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料Ｓからの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料Ｓを流してフローセルを形成する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料Ｓ中の蛍光ビーズ１２に結合した生体物質１３を、他の生体物質１３あるいは蛍光ビーズ１２から分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
レーザ光源部２２は、波長の異なる２つのレーザ光を出射する。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料Ｓを測定する測定点が形成される。
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、所定の周波数で強度変調したレーザ光を出射する。
レーザ光源部２２は、光源２２ａと光源２２ｂを有する。光源２２ａは、基本蛍光色素Ａおよび基本蛍光色素Ｂの光吸収波長帯域および生体物質１３の蛍光色素の光吸収波長帯域に波長を有するレーザ光を照射する。このため、基本蛍光色素Ａおよび基本蛍光色素Ｂを用いて作製された合成蛍光色素、および生体物質１３に付着した蛍光色素は、所定の波長帯域で、所定の蛍光強度及び所定の蛍光緩和時間で蛍光を発する。
光源２２ｂは、基本蛍光色素Ｃおよび基本蛍光色素Ｄの光吸収波長帯域に波長を有するレーザ光を照射する。このため、基本蛍光色素Ｃおよび基本蛍光色素Ｄを用いて作製された合成蛍光色素は、所定の波長帯域で、所定の蛍光強度及び所定の蛍光緩和時間で蛍光を発する。
レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、所定の周波数で強度変調したレーザ光を出射する。
レーザ光源部２２は、光源２２ａと光源２２ｂを有する。光源２２ａは、基本蛍光色素Ａおよび基本蛍光色素Ｂの光吸収波長帯域および生体物質１３の蛍光色素の光吸収波長帯域に波長を有するレーザ光を照射する。このため、基本蛍光色素Ａおよび基本蛍光色素Ｂを用いて作製された合成蛍光色素、および生体物質１３に付着した蛍光色素は、所定の波長帯域で、所定の蛍光強度及び所定の蛍光緩和時間で蛍光を発する。
光源２２ｂは、基本蛍光色素Ｃおよび基本蛍光色素Ｄの光吸収波長帯域に波長を有するレーザ光を照射する。このため、基本蛍光色素Ｃおよび基本蛍光色素Ｄを用いて作製された合成蛍光色素は、所定の波長帯域で、所定の蛍光強度及び所定の蛍光緩和時間で蛍光を発する。
さらに、レーザ光源部２２は、ダイクロイックミラー２３ａと、レンズ系２３ｂと、レーザドライバ３４ａおよび３４ｂと、を有する。なお、ダイクロイックミラー２３ａの替わりにハーフミラーを用いることもできる。
ダイクロイックミラー２３ａは、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。レンズ系２３ｂは、レーザ光Ｌ1およびＬ2からなるレーザ光Ｌ1＋Ｌ2を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ａおよび３４ｂは、光源２２ａおよび光源２２ｂそれぞれを駆動する。
ダイクロイックミラー２３ａは、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。レンズ系２３ｂは、レーザ光Ｌ1およびＬ2からなるレーザ光Ｌ1＋Ｌ2を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ａおよび３４ｂは、光源２２ａおよび光源２２ｂそれぞれを駆動する。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。
一方、レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調に用いる周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調の周波数は異なる。これは、レーザ光で励起された試料Ｓが発する蛍光の周波数も互いに異なる周波数とすることにより、どのレーザ光で励起した蛍光かを知り、蛍光の情報を分離するためである。
ダイクロイックミラー２３ａは、レーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光Ｌ2を反射するミラーである。この構成によりレーザ光Ｌ1およびＬ2が合成されて、測定点の試料１２を照射する１つの照射光となる。
一方、レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調に用いる周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調の周波数は異なる。これは、レーザ光で励起された試料Ｓが発する蛍光の周波数も互いに異なる周波数とすることにより、どのレーザ光で励起した蛍光かを知り、蛍光の情報を分離するためである。
ダイクロイックミラー２３ａは、レーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光Ｌ2を反射するミラーである。この構成によりレーザ光Ｌ1およびＬ2が合成されて、測定点の試料１２を照射する１つの照射光となる。
光源２２ａ，２２ｂは、レーザ光Ｌ1，Ｌ2が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌ1，Ｌ2によって励起される試料１２は管路３０の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射を受けて所定の波長で、蛍光ビーズ１２および／または生体物質１３が蛍光を発する。
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料Ｓによってレーザ光が前方散乱することにより、試料Ｓが測定点を通過することを示す信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８および分析装置８０に供給され、試料Ｓが管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、処理開始のＯＮ信号、ＯＦＦ信号として用いられる。
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料Ｓの移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料Ｓが発する蛍光を受光する複数の光電変換器を備える。図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
図３に示す受光部２６は、試料Ｓからの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2と、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3と、光電子増倍管等の光電変換器（受光素子）２７ａ,２７ｂ，２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2の反射波長帯域およびバンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3の透過波長帯域が設定されている。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2の反射波長帯域およびバンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3の透過波長帯域が設定されている。
バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3は、各光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、基本蛍光色素Ａ〜Ｄが発する蛍光と生体物質１３の蛍光色素が発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。具体的には、波長帯域に関して、光源２２ａから出射したレーザ光Ｌ1の照射によって蛍光ビーズ１２の蛍光色素が発する蛍光を主に受光するための波長帯域Ｒ1と、光源２２ｂから出射したレーザ光Ｌ2の照射によって蛍光ビーズ１２の蛍光色素が発する蛍光を主に受光するための波長帯域Ｒ2と、光源２２ａから出射したレーザ光Ｌ1の照射によって生体物質１３の蛍光色素が発する蛍光を主に受光するための波長帯域Ｒ3と、が設定される。波長帯域Ｒ1は、レーザ光Ｌ1で照射された試料Ｓのうち、基本蛍光色素Ａおよび基本蛍光色素Ｂを含んで作製された合成蛍光色素が発する蛍光の波長を含む。波長帯域Ｒ2は、レーザ光Ｌ2で照射された試料Ｓのうち、基本蛍光色素Ｃおよび基本蛍光色素Ｄを含んで作製された合成蛍光色素が発する蛍光の波長を含む。
光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃは、例えば光電子増倍管等のセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換する受光素子である。ここで、受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光の励起により基づくものなので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給される。
制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、信号制御部４４と、を有して構成される。
信号生成部４０は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度を所定の周波数で変調するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６ａ，４６ｂ、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂ及びアンプ５０ａ，５０ｂ，５２ａ，５２ｂ，５２ｃを有する。信号生成部４０は、生成される各変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、ＤＣ成分に所定の周波数の正弦波信号が載った信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。発振器４６ａと発振器４６ｂは、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を発振し、異なる周波数の変調信号を生成する。なお、本実施形態では、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を変調信号として用いるが、測定しようとする蛍光が、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3で十分に分離可能であれば、周波数ｆ1，ｆ2は異ならせることなく、一致させてもよい。
さらに、発振器４６ａ，４６ｂは、周波数ｆ1，ｆ2を自在に変更することができるように構成してもよい。また、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3についても、用いる蛍光ビーズ１２の種類に合わせて透過波長帯域を変えることのできる可変フィルタを用いてもよい。
信号生成部４０は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度を所定の周波数で変調するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６ａ，４６ｂ、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂ及びアンプ５０ａ，５０ｂ，５２ａ，５２ｂ，５２ｃを有する。信号生成部４０は、生成される各変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、ＤＣ成分に所定の周波数の正弦波信号が載った信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。発振器４６ａと発振器４６ｂは、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を発振し、異なる周波数の変調信号を生成する。なお、本実施形態では、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を変調信号として用いるが、測定しようとする蛍光が、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3で十分に分離可能であれば、周波数ｆ1，ｆ2は異ならせることなく、一致させてもよい。
さらに、発振器４６ａ，４６ｂは、周波数ｆ1，ｆ2を自在に変更することができるように構成してもよい。また、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3についても、用いる蛍光ビーズ１２の種類に合わせて透過波長帯域を変えることのできる可変フィルタを用いてもよい。
信号処理部４２は、光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により発する蛍光の蛍光強度及び位相遅れに関する情報を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ，５４ｂ，５４ｃと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を参照信号として、蛍光信号と合成するＩＱミキサ５８ａ，５８ｂ，５８ｃと、ローパスフィルタ６２と、を有して構成される。
ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂ，５８ｃは、光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号としてミキシングする装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂ，５８ｃのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号の、変調信号と同相の成分を含む信号と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分を含む信号とを生成する。同相の成分を含む信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、９０度位相のシフトした成分を含む信号は、変調信号に対して９０度位相のシフトした信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。
ローパスフィルタ６２は、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂ，５８ｃで生成された信号の低周波信号をろ過する部分である。このろ過により、蛍光信号の、変調信号と同相の成分（Ｒｅ成分）と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分（Ｉｍ成分）が、蛍光データとして取り出される。取り出された各成分は、信号制御部４４に送られる。Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、光電変換器２７ａ，２７ｂ，２７ｃに設定された波長帯域Ｒ1、波長帯域Ｒ2、および波長帯域Ｒ3毎に得られるので、波長帯域Ｒ1のＲｅ成分およびＩｍ成分の組と、波長帯域Ｒ2のＲｅ成分およびＩｍ成分の組と、波長帯域Ｒ3のＲｅ成分およびＩｍ成分の組とが信号制御部４４に送られる。以降では、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂ，５８ｃによるミキシング処理とローパスフィルタ６２によるフィルタリング処理を含む処理を周波数ダウン変換処理といい、この処理により得られるデータを蛍光データという。
信号制御部４４は、信号処理部４２から送られた蛍光信号のＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅し、ＡＤ変換を行う部分である。
具体的には、信号制御部４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステムコントローラ６０と、信号処理部４２で生成されたＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅するアンプ６４と、増幅されたＲｅ成分およびＩｍ成分をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
具体的には、信号制御部４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステムコントローラ６０と、信号処理部４２で生成されたＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅するアンプ６４と、増幅されたＲｅ成分およびＩｍ成分をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
分析装置８０は、信号制御部４４にてＡＤ変換されて得られるＲｅ成分、Ｉｍ成分から、蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度を求める。さらに、分析装置８０は、レーザ光の強度変調に対する蛍光の位相遅れ角度を求め、さらに、この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）及び蛍光強度を求める。図５は、分析装置８０の概略の構成を示す図である。
分析装置８０は、ＣＰＵ８２およびメモリ８４を備えるコンピュータで構成され、さらに、蛍光強度算出部９０と、位相遅れ算出部９２と、蛍光緩和時間算出部９４と、試料分析部９６と、を有する。これらの各部分は、コンピュータ上でプログラムを起動させることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
分析装置８０は、ＣＰＵ８２およびメモリ８４を備えるコンピュータで構成され、さらに、蛍光強度算出部９０と、位相遅れ算出部９２と、蛍光緩和時間算出部９４と、試料分析部９６と、を有する。これらの各部分は、コンピュータ上でプログラムを起動させることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
蛍光強度算出部９０は、Ａ／Ｄ変換器６６から供給された蛍光データについて、複素数の絶対値を求めることで、蛍光強度を算出する。
位相遅れ算出部９２は、Ａ／Ｄ変換器６６から供給された蛍光データについて、Ｒｅ成分を実数部とし、Ｉｍ成分を虚数部とした複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相遅れθとして算出する。
蛍光緩和時間算出部９４は、位相遅れ算出部９２で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出する部分である。ここで、ｆは、レーザ光Ｌ1あるいはＬ2の強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
試料分析部９６は、算出された蛍光強度、蛍光緩和時間τを用いて、生体物質１３がどの種類の蛍光ビーズ１２に結合するかを分析する。試料分析部９６は、分析結果および分析のために作成したデータやグラフを、プリンタやディスプレイ等の出力装置へ出力する。
位相遅れ算出部９２は、Ａ／Ｄ変換器６６から供給された蛍光データについて、Ｒｅ成分を実数部とし、Ｉｍ成分を虚数部とした複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相遅れθとして算出する。
蛍光緩和時間算出部９４は、位相遅れ算出部９２で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出する部分である。ここで、ｆは、レーザ光Ｌ1あるいはＬ2の強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
試料分析部９６は、算出された蛍光強度、蛍光緩和時間τを用いて、生体物質１３がどの種類の蛍光ビーズ１２に結合するかを分析する。試料分析部９６は、分析結果および分析のために作成したデータやグラフを、プリンタやディスプレイ等の出力装置へ出力する。
具体的には、試料分析部９６は、蛍光ビーズ１２が発する蛍光を、蛍光強度、蛍光緩和時間および蛍光波長帯域に基づいて識別し、さらに、生体物質１３が発する蛍光を識別する。その際、試料分析部９６は、識別した蛍光により蛍光ビーズの種類を識別したとき、生体物質１３の発する蛍光を同時に受光したか否かを判定する。試料分析部９６は、さらに、生体物質１３の発する蛍光を受光したとき、どの種類の蛍光ビーズ１２が発する蛍光を同時に受光したかを判定する。
これにより、生体物質１３がどの種類の蛍光ビーズ１２に結合したかを知ることができ、生体物質１３の特性を分析することができる。
これにより、生体物質１３がどの種類の蛍光ビーズ１２に結合したかを知ることができ、生体物質１３の特性を分析することができる。
図６（ａ）は、波長帯域Ｒ1において測定された蛍光の蛍光強度のヒストグラムと蛍光緩和時間のヒストグラムの一例を示す図である。図６（ｂ）は、波長帯域Ｒ2において測定された蛍光の蛍光強度のヒストグラムと蛍光緩和時間のヒストグラムの一例を示す図である。
波長帯域Ｒ1では、蛍光ビーズ１２が発する４種類の蛍光ａ〜ｄを測定している。蛍光ビーズ１２は、基本蛍光色素Ａ，Ｄの含有する比率と絶対含有量が異なることで複数の種類を備え、複数の種類毎に、異なる蛍光を発する。蛍光ａ〜ｄは、波長帯域Ｒ1において、蛍光強度及び蛍光緩和時間が異なり、図６（ａ）に示すヒストグラムから４種類の蛍光を識別することができる。図６（ａ）中の蛍光ａ，ｄの蛍光緩和時間が近接している場合でも、蛍光強度のヒストグラムでは、蛍光ａ，ｄの分布は十分離れているので、蛍光ａ，ｄを分離して識別することができる。
波長帯域Ｒ2でも、蛍光ビーズ１２が発する４種類の蛍光α〜δを測定している。蛍光α〜δは、波長帯域Ｒ2において、蛍光強度及び蛍光緩和時間が異なる。このため、図６（ｂ）に示すヒストグラムから４種類の蛍光を識別することができる。図６（ｂ）中の蛍光β，γの蛍光緩和時間が近接している場合でも、蛍光強度のヒストグラムでは、蛍光β，γの分布は十分離れているので、蛍光β，γを分離して識別することができる。
波長帯域Ｒ3では、生体物質１３が発する蛍光を測定している。図６（ｃ）に示すヒストグラムから蛍光を識別することができる。
波長帯域Ｒ1では、蛍光ビーズ１２が発する４種類の蛍光ａ〜ｄを測定している。蛍光ビーズ１２は、基本蛍光色素Ａ，Ｄの含有する比率と絶対含有量が異なることで複数の種類を備え、複数の種類毎に、異なる蛍光を発する。蛍光ａ〜ｄは、波長帯域Ｒ1において、蛍光強度及び蛍光緩和時間が異なり、図６（ａ）に示すヒストグラムから４種類の蛍光を識別することができる。図６（ａ）中の蛍光ａ，ｄの蛍光緩和時間が近接している場合でも、蛍光強度のヒストグラムでは、蛍光ａ，ｄの分布は十分離れているので、蛍光ａ，ｄを分離して識別することができる。
波長帯域Ｒ2でも、蛍光ビーズ１２が発する４種類の蛍光α〜δを測定している。蛍光α〜δは、波長帯域Ｒ2において、蛍光強度及び蛍光緩和時間が異なる。このため、図６（ｂ）に示すヒストグラムから４種類の蛍光を識別することができる。図６（ｂ）中の蛍光β，γの蛍光緩和時間が近接している場合でも、蛍光強度のヒストグラムでは、蛍光β，γの分布は十分離れているので、蛍光β，γを分離して識別することができる。
波長帯域Ｒ3では、生体物質１３が発する蛍光を測定している。図６（ｃ）に示すヒストグラムから蛍光を識別することができる。
図６（ｄ）は、波長帯域Ｒ1の蛍光強度Ｐと、波長帯域Ｒ3の蛍光強度Ｐとの対応を見るために、蛍光強度Ｐのデータをプロットした散布図である。図６（ｅ）は、波長帯域Ｒ1の蛍光緩和時間τと、波長帯域Ｒ3の蛍光緩和時間τとの対応を見るために、蛍光緩和時間τのデータをプロットした散布図である。
図６（ｄ）では、波長帯域Ｒ1において蛍光強度Ｐcの蛍光データが得られるとき、波長帯域Ｒ3において蛍光強度Ｐxの蛍光データが同時に得られることを示している。図６（ｅ）では、波長帯域Ｒ1において蛍光緩和時間τcの蛍光データが得られるとき、波長帯域Ｒ3において蛍光緩和時間τxの蛍光データが同時に得られることを示している。
したがって、本実施形態は、蛍光ビーズ１２の発する蛍光を計測するとき波長帯域Ｒ3において蛍光緩和時間τxの蛍光データが同時に得られるか否かを調べることにより、蛍光ビーズ１２のうちどの種類の蛍光ビーズ１２に生体物質１３が結合し易いかを特定することができる。
図６（ｄ）では、波長帯域Ｒ1において蛍光強度Ｐcの蛍光データが得られるとき、波長帯域Ｒ3において蛍光強度Ｐxの蛍光データが同時に得られることを示している。図６（ｅ）では、波長帯域Ｒ1において蛍光緩和時間τcの蛍光データが得られるとき、波長帯域Ｒ3において蛍光緩和時間τxの蛍光データが同時に得られることを示している。
したがって、本実施形態は、蛍光ビーズ１２の発する蛍光を計測するとき波長帯域Ｒ3において蛍光緩和時間τxの蛍光データが同時に得られるか否かを調べることにより、蛍光ビーズ１２のうちどの種類の蛍光ビーズ１２に生体物質１３が結合し易いかを特定することができる。
このように、本実施形態では、図６（ａ）に示すように、波長帯域Ｒ1，Ｒ2と、蛍光強度と、蛍光緩和時間の３つの識別因子で、互いに異なる種類の蛍光を発する蛍光ビーズ１２を実現することができる。このような複数種類の蛍光ビーズ１２は、例えば、蛍光強度、蛍光波長および蛍光緩和時間が互いに異なる２種類の基本蛍光色素Ａ，Ｂの比率と基本蛍光色素Ａ，Ｂの絶対含有量とをお互いに異ならせた３種類以上の合成蛍光色素でラベル化することにより実現することができる。本実施形態では、２種類の基本蛍光色素Ａ，Ｂを用いたが、３種類以上の基本蛍光色素を用いることもできる。
例えば、蛍光ビーズ１２の波長帯域に関して２種類（波長帯域１、波長帯域２）とし、蛍光ビーズ１２が発する複数の蛍光を波長領域１及び波長領域２で受光して、各蛍光の蛍光強度と蛍光緩和時間を求める場合、蛍光緩和時間に関して波長帯域１において５種類とし、波長帯域２においても５種類とし、蛍光強度に関して波長帯域１において５種類とし、波長帯域２においても５種類となるように蛍光ビーズ１２の種類を設定したとき、フローサイトメータ１０で識別可能な蛍光ビーズ１２の合計の種類は６２５種類（＝５×５×５×５）となる。すなわち、蛍光ビーズ１２に、波長帯域１における基本蛍光色素と、波長帯域２における基本蛍光色素とを含ませることにより、蛍光ビーズ１２は、波長帯域１および波長帯域２の双方の計測結果を用いて識別され得る。この場合、波長帯域１および波長帯域２は、４５０〜５００ｎｍの短波長帯域および６００〜６５０ｎｍの長波長帯域のように蛍光の波長帯域が離れていることが好ましい。
なお、基本蛍光色素が２種類である場合、基本蛍光色素のそれぞれの蛍光強度をＦ1およびＦ2とし、蛍光緩和時間がτ1およびτ2とし、基本蛍光色素の比率をｘ（ｘは１未満の正数）および（１−ｘ）とし、絶対含有量によって定まる定数（前指数因子）をα１およびα2としたとき、
作製される３種類以上の蛍光ビーズは、下記式（１）で定まる蛍光強度Ｆ、および下記式（２）で定まる蛍光緩和時間τが互いに異なるように、上記比率と上記絶対含有量とが設定されていることが好ましい。
作製される３種類以上の蛍光ビーズは、下記式（１）で定まる蛍光強度Ｆ、および下記式（２）で定まる蛍光緩和時間τが互いに異なるように、上記比率と上記絶対含有量とが設定されていることが好ましい。
Ｆ ＝ α１×τ1×ｘ＋α2×τ2×（１−ｘ） （１）
τ ＝ ｛α１×τ1 2×ｘ＋α2×τ2 2×（１−ｘ）}／Ｆ （２）
τ ＝ ｛α１×τ1 2×ｘ＋α2×τ2 2×（１−ｘ）}／Ｆ （２）
定数α１，α2は、絶対含有量によって定まる値であり、絶対含有量が大きくなるほど値が大きくなる定数である。したがって、絶対含有量を大きくすることにより、合成蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度を大きくすることができる。一方、蛍光緩和時間は、定数α１，α2が大きくなっても、比率ｘ，（１−ｘ）に応じて変化する。このため、蛍光強度と蛍光緩和時間を独立して設定することができる。
なお、蛍光ビーズ１２は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、蛍光強度、蛍光波長および蛍光緩和時間が互いに異なる少なくとも２種類の基本蛍光色素の比率と２種類の基本蛍光色素の絶対含有量とが設定されるとき、前記比率および前記絶対含有量に基づいて得られる合成蛍光色素の蛍光強度および蛍光緩和時間が、基本蛍光色素の蛍光強度および蛍光緩和時間といずれも異なり、他の合成蛍光色素の蛍光強度および蛍光緩和時間とも互いに異なるように、比率および絶対含有量が設定される。この後、設定した前記比率および前記絶対含有量を用いて得られた合成蛍光色素で蛍光ビーズ１２がラベル化される。例えば、蛍光ビーズ１２の表面に合成蛍光色素が塗布される。あるいは、蛍光ビーズ１２の材料自体に合成蛍光色素を含有させ、この材料が球形状に成形される。
基本蛍光色素が２種類である場合、基本蛍光色素のそれぞれの蛍光強度をＦ1およびＦ2とし、蛍光緩和時間をτ1およびτ2とし、基本蛍光色素の比率をｘ（ｘは１未満の正数）および（１−ｘ）とし、絶対含有量によって定まる定数をα１およびα2としたとき、合成蛍光色素の蛍光強度Ｆおよび蛍光緩和時間τは、上記式（１）および（２）にしたがって定められる。
基本蛍光色素が２種類である場合、基本蛍光色素のそれぞれの蛍光強度をＦ1およびＦ2とし、蛍光緩和時間をτ1およびτ2とし、基本蛍光色素の比率をｘ（ｘは１未満の正数）および（１−ｘ）とし、絶対含有量によって定まる定数をα１およびα2としたとき、合成蛍光色素の蛍光強度Ｆおよび蛍光緩和時間τは、上記式（１）および（２）にしたがって定められる。
以上、本発明の蛍光検出装置、蛍光検出方法および蛍光信号を信号処理する方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
１０ フローサイトメータ
１２ 蛍光ビーズ
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２２ａ，２２ｂ 光源
２３ａ，２６ｂ ダイクロイックミラー
２３ｂ，２６ａ レンズ系
２４，２６ 受光部
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3 バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ，２７ｃ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ａ，３４ｂ レーザドライバ
４８ａ，４８ｂ パワースプリッタ
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ 信号制御部
４６ａ，４６ｂ 発振器
５０ａ，５０ｂ，５２ａ，５２ｂ，５２ｃ，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４ アンプ
５８ａ，５８ｂ，５８ｃ ＩＱミキサ
６０ システムコントローラ
６２ ローパスフィルタ
６６ Ａ／Ｄ変換器
８０ 分析装置
８２ ＣＰＵ
８４ メモリ
９０ 蛍光強度算出部
９２ 位相遅れ算出部
９４ 蛍光緩和時間算出部
９６ 試料分析部９６
１２ 蛍光ビーズ
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２２ａ，２２ｂ 光源
２３ａ，２６ｂ ダイクロイックミラー
２３ｂ，２６ａ レンズ系
２４，２６ 受光部
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ3 バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ，２７ｃ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ａ，３４ｂ レーザドライバ
４８ａ，４８ｂ パワースプリッタ
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ 信号制御部
４６ａ，４６ｂ 発振器
５０ａ，５０ｂ，５２ａ，５２ｂ，５２ｃ，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４ アンプ
５８ａ，５８ｂ，５８ｃ ＩＱミキサ
６０ システムコントローラ
６２ ローパスフィルタ
６６ Ａ／Ｄ変換器
８０ 分析装置
８２ ＣＰＵ
８４ メモリ
９０ 蛍光強度算出部
９２ 位相遅れ算出部
９４ 蛍光緩和時間算出部
９６ 試料分析部９６
Claims (6)
- 蛍光色素でラベル化された蛍光ビーズが発する蛍光を用いて、蛍光ビーズの種類を識別する蛍光検出方法であって、
蛍光強度、蛍光波長および蛍光緩和時間がお互いに異なる２種類の基本蛍光色素の比率と前記基本蛍光色素の絶対含有量とをお互いに異ならせた複数種類の合成蛍光色素でラベル化された複数種類の蛍光ビーズを用いて、複数の波長帯域毎に、蛍光強度と蛍光緩和時間を計測するステップと、
計測された前記蛍光強度、前記蛍光緩和時間および前記波長帯域の情報を用いて、計測した蛍光ビーズの種類を識別するステップと、を有し、
前記基本蛍光色素のそれぞれの蛍光強度をＦ 1 およびＦ 2 とし、前記基本蛍光色素のそれぞれの蛍光緩和時間をτ 1 およびτ 2 とし、前記基本蛍光色素のそれぞれの比率をｘ（ｘは１未満の正数）および（１−ｘ）とし、前記絶対含有量によって定まる定数をα １ およびα 2 としたとき、
前記複数種類の合成蛍光色素は、下記式（１）で定まる合成蛍光強度Ｆ、および下記式（２）で定まる合成蛍光緩和時間τがお互いに異なるように、前記比率と前記絶対含有量とが設定されている、ことを特徴とする蛍光検出方法。
Ｆ ＝ α １ ×τ 1 ×ｘ＋α 2 ×τ 2 ×（１−ｘ） （１）
τ ＝ ｛α １ ×τ 1 2 ×ｘ＋α 2 ×τ 2 2 ×（１−ｘ）}／Ｆ （２） - 前記蛍光緩和時間の計測は、所定の周波数で強度変調したレーザ光を前記蛍光ビーズに照射したとき前記蛍光ビーズが発する蛍光を受光することにより、レーザ光の強度変調に対する受光した蛍光の位相遅れ角度を求めることにより、行われる、請求項１に記載の蛍光検出方法。
- 前記蛍光ビーズに照射するレーザ光は、波長の異なる複数のレーザ光の合成光であり、
前記基本蛍光色素の光吸収波長帯域のそれぞれには、前記レーザ光の波長のいずれか１つが含まれる、請求項２に記載の蛍光検出方法。 - 前記蛍光ビーズのそれぞれは、特定の物質と結合するプローブを備え、
前記特定の物質は、前記レーザ光の照射により特定の波長で蛍光する蛍光色素を含み、
前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間の計測を行うとき、前記特定の物質が発する蛍光は、前記蛍光ビーズが発する蛍光に対して異なる波長帯域の光として受光され、前記蛍光物質の蛍光強度と蛍光緩和時間が求められることにより、前記特定の物質が識別される、請求項２または３に記載の蛍光検出方法。 - 前記蛍光ビーズの種類を識別するとき、前記特定の物質の発する蛍光の蛍光強度と、前記蛍光ビーズが発する蛍光の蛍光強度との間の蛍光強度に関する散布図を、前記複数の波長帯域毎に求め、さらに、前記特定の物質の発する蛍光の蛍光緩和時間と、前記蛍光ビーズが発する蛍光の蛍光緩和時間との間の蛍光緩和時間に関する散布図を、前記複数の波長帯域毎に求め、前記蛍光強度に関する散布図と前記蛍光緩和時間に関する散布図を用いて、前記特定の物質が結合する蛍光ビーズの種類を特定する、請求項４に記載の蛍光検出方法。
- 前記蛍光ビーズのそれぞれは、レーザ光が収束する測定点を順次１つずつ通過するように流路に沿って流れ、
前記蛍光ビーズが前記測定点を通過するとき、前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間の計測が行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
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