JP4606518B2 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置に関する。また、本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法に関する。特に、医療、生物分野で用いられるフローサイトメータ等のような細胞やＤＮＡやＲＮＡ等の測定対象物の識別を蛍光色素の発する蛍光を用いて行なって測定対象物の分析等を行なう分析装置に適用される蛍光検出装置に関する。

医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。

具体的には、フローサイトメータは、混濁液中の細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流す。これにより、ラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定するものである。

このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、所定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。

例えば、ＤＮＡ等の生体物質をフローサイトメータで分析する場合、この生体物質に予め蛍光試薬により蛍光色素が付着される。そして、この生体物質は、後述するマイクロビーズに付着された蛍光色素と異なる蛍光色素でラベル化され、表面にカルボキシル基等の特異な構造体の設けられた、直径５〜２０μｍのマイクロビーズを含む液体に混ぜられる。上記カルボキシル基等の構造体は、ある既知の構造の生体物質に作用して結合（カップリング）する。したがって、マイクロビーズからの蛍光と生体物質の蛍光とを同時に検出した場合、生体物質は、マイクロビーズの構造体と結合していることがわかる。これにより、生体物質の特性を分析することができる。多種多様なカップリング用の構造体を備える多種のマイクロビーズを用意して生体物質の特性を短時間に分析するには、極めて多種類の蛍光色素が必要となる。

特許文献１には、マイクロビーズ等を測定対象物とし、この測定対象物に所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光の蛍光緩和時間を求めることが記載されている。この蛍光緩和時間は、蛍光色素の種類によって異なるため、この蛍光緩和時間を用いて、蛍光の種類、さらには測定対象物の種類を識別することができる。

特開２００６−２２６６９８号公報

上記特許文献１では、蛍光緩和時間に基づいて短時間に効率よく蛍光を識別することはできるが、蛍光緩和時間の測定精度は必ずしも高いものではなかった。例えば、蛍光緩和時間が２０ｎ秒を超えるような、蛍光緩和時間が比較的長いマイクロビーズ等を測定対象物に含む場合に、測定精度が低下していた。

本発明は、蛍光緩和時間の測定精度を向上させる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。

本発明者が鋭意検討したところ、レーザ光を強度変調させる周波数が異なれば、その周波数により精度よく測定することができる測定対象物の蛍光緩和時間の範囲も異なることを見出した。すなわち、測定対象物の蛍光緩和時間が広範囲に及ぶ場合、１つの周波数でレーザ光を強度変調させるのではなく、複数の周波数でレーザ光を強度変調させることで、測定精度を向上させることができる。

そこで、本発明の蛍光検出装置は、測定対象物にレーザ光を照射することにより前記測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、前記測定対象物にレーザ光を照射するレーザ光源部と、前記レーザ光を照射された前記測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記レーザ光源部から出射されるレーザ光の強度を時間変調させる変調信号であって、少なくとも２つの周波数の信号を合成した信号である変調信号を生成する光源制御部と、前記受光部から出力された蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有し、前記処理部は、前記少なくとも２つの周波数成分における、前記変調信号に対する前記蛍光信号の位相遅れを求め、前記位相遅れを用いて各周波数成分における蛍光緩和時間を求め、前記蛍光緩和時間に対する前記位相遅れの変化量が大きいほど値が大きくなる重み係数を用いて、前記蛍光緩和時間の重み付け平均を行って平均蛍光緩和時間を求めることを特徴とする。

また、本発明の蛍光検出方法は、測定対象物にレーザ光を照射することにより前記測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、前記測定対象物にレーザ光を照射する工程と、前記レーザ光を照射された前記測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を出力する工程と、前記レーザ光の強度を時間変調させる変調信号であって、少なくとも２つの周波数の信号を合成した信号である変調信号を生成する工程と、前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める工程と、を有し、前記蛍光緩和時間を求める工程は、前記少なくとも２つの周波数成分における、前記変調信号に対する前記蛍光信号の位相遅れを求める工程と、前記位相遅れを用いて各周波数における蛍光緩和時間を求める工程と、前記蛍光緩和時間に対する前記位相遅れの変化量が大きいほど値が大きくなる重み係数を用いて、前記蛍光緩和時間の重み付け平均を行って平均蛍光緩和時間を求める工程と、を有することを特徴とする。

本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法によれば、蛍光緩和時間の測定精度を向上させることができる。

強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる分析装置の一例を示す概略構成図である。 蛍光緩和時間に対する位相遅れの変化量を示す図である。

以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータについて、実施形態に基づいて説明する。

＜第１の実施形態＞
（フローサイトメータの全体構成）
まず、図１を参照して、本実施形態のフローサイトメータの全体構成について説明する。図１は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の一例を示す概略構成図である。

フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置（コンピュータ）８０と、を備える。信号処理装置２０は、測定対象物であるマイクロビーズや細胞等の試料１２にレーザ光が照射される際に、試料１２中に付与された蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理を行う。分析装置（コンピュータ）８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から、試料１２中の測定対象物の分析を行なう。

後述するように、信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２５、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を備える。
制御・処理部２８は、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を含む。信号生成部４０は、レーザ光源部２２からのレーザ光を強度変調させる。また、信号処理部４２は、試料１２からの蛍光信号を識別する。また、コントローラ４４は、フローサイトメータ１０の全動作を管理する。
管路３０は、高速流を形成するシース液に試料１２を含ませて流し、ラミナーシースフローを形成する。このフローは、例えば、流路径が１００μｍであり、流速が１〜１０ｍ／秒である。また、試料１２としてマイクロビーズを用いる場合、マイクロビーズの球径は数μｍ〜３０μｍである。管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。
フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して、別々の回収容器に分離することもできる。
レーザ光源部２２は、所定の周波数で強度変調したレーザ光を出射する。レーザ光源部２２には、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられる。レーザ光が集束する位置（測定点）において、試料１２が測定される。

（レーザ光源部）
次に、図２を参照して、レーザ光源部２２について説明する。図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す概略構成図である。

レーザ光源部２２は、光源２３と、レンズ系２４ａと、レーザドライバ３４と、を備える。光源２３は、強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光を出射し、かつ、このＣＷレーザ光の強度を変調してレーザ光を出射する。レンズ系２４ａは、光源２３から出射されたレーザ光を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４は、光源２３を駆動する。

レーザ光を出射する光源２３は、例えば、半導体レーザである。レーザ光の出力は、例えば、５〜１００ｍＷ程度である。レーザ光の波長は、例えば、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域である。

レーザドライバ３４は、制御・処理部２８に接続されている。また、レーザドライバ３４は、少なくとも２つの周波数で構成された変調信号を用いて、レーザ光を強度変調するための駆動信号を生成し、その駆動信号を光源２３に供給する。

レーザ光によって励起される蛍光色素は、生体物質やマイクロビーズ等の試料１２（測定対象物）に付着されている。試料１２が管路３０を通過する数μ秒〜数１０μ秒の間に、試料１２は、測定点でレーザ光の照射を受けて蛍光を発する。その際、レーザ光は２つの周波数で強度変調されて出射される。

（受光部）
図１に戻り、受光部２５は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されている。受光部２５は、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱されることにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備えている。受光部２５から出力される信号は、制御・処理部２８に供給される。受光部２５から出力される信号は、制御・処理部２８において、試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ、管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されている。受光部２６は、測定点にてレーザ光を照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備えている。

ここで、図３を参照して、受光部２６の概略構成について説明する。図３は、受光部２６の一例を示す概略構成図である。図３に示されるように、受光部２６は、レンズ系２４ｂと、光電変換器２７と、を備える。レンズ系２４ｂは、試料１２からの蛍光信号を集束させる。また、レンズ系２４ｂは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７の受光面に集束させるように構成されている。

光電変換器２７は、例えば、光電子増倍管を備え、光電面で受光した光を電気信号に変換する。光電変換器２７によって変換された電気信号（蛍光信号）は、制御・処理部２８に供給される。

（制御・処理部）
次に、図４を参照して、制御・処理部２８の概略構成について説明する。図４は、制御・処理部２８の一例を示す概略構成図である。制御・処理部２８は、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を備える。レーザ光の強度を変調させる変調信号を生成する光源制御部は、信号生成部４０及びコントローラ４４によって形成される。

信号生成部４０は、発振器４６ａ，４６ｂ、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂ、パワーデバイダ４８ｃ，及び，アンプ５０ａ，５０ｂ，５０ｃを備える。信号生成部４０は、変調信号を生成し、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４に変調信号を供給するとともに、信号処理部４２に変調信号を供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７から出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。

発振器４６ａ，４６ｂは、それぞれ異なる周波数の正弦波信号を出力する。正弦波信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚの範囲で設定される。発振器４６ａから出力された周波数ｆ_１（角周波数ω_１）の正弦波信号は、パワースプリッタ４８ａにより、パワーデバイダ４８ｃとアンプ５０ａに分配される。発振器４６ｂから出力された周波数ｆ_２（角周波数ω_２）の正弦波信号は、パワースプリッタ４８ｂにより、パワーデバイダ４８ｃとアンプ５０ｂに分配される。パワースプリッタ４８ａ，４８ｂからパワーデバイダ４８ｃに分配された正弦波信号は、パワーデバイダ４８ｃで合成され、変調信号が生成される。パワーデバイダ４８ｃで生成された変調信号は、アンプ５０ｃで増幅された後、レーザドライバ３４に供給される。

信号処理部４２は、光電変換器２７から出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射によりマイクロビーズ等の測定対象物が発する蛍光の位相遅れに関する情報を抽出する。信号処理部４２は、パワースプリッタ４８ｄ、アンプ５４，５５、及び、ＩＱミキサ５８，５９を備える。

パワースプリッタ４８ｄは、光電変換器２７から出力される蛍光信号をアンプ５４，５５に分配する。アンプ５４，５５は、パワースプリッタ４８ｄから分配された蛍光信号を増幅して、ＩＱミキサ５８，５９にそれぞれ供給する。ＩＱミキサ５８には、アンプ５０ａから供給された周波数ｆ_１の正弦波信号が参照信号として供給される。また、ＩＱミキサ５９には、アンプ５０ｂから供給された周波数ｆ_２の正弦波信号が参照信号として供給される。

ＩＱミキサ５８，５９は、光電変換器２７から供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される周波数ｆ_１、ｆ_２の正弦波信号を参照信号として合成する装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８，５９のそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分を含む処理信号を算出する。また、ＩＱミキサ５８，５９のそれぞれは、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。
コントローラ４４は、システム制御器６０と、ローパスフィルタ６２と、アンプ６４と、Ａ／Ｄ変換器６６を備えている。

システム制御器６０は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理する。また、システム制御器６０は、信号生成部４０の発振器４６ａ，４６ｂに所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御する。

ローパスフィルタ６２は、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除き、２つの周波数ｆ_１，ｆ_２のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を得る。アンプ６４は、ｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅する。Ａ／Ｄ変換器６６は、増幅された処理信号をサンプリングする。

（分析装置）
次に、図５を参照して、分析装置（コンピュータ）８０の概略構成について説明する。図５は、分析装置（コンピュータ）８０の一例を示す概略構成図である。分析装置８０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される。分析装置８０は、ＣＰＵ８２、メモリ８４、入出力ポート９４の他に、ソフトウェアを起動することによって形成される位相遅れ取得ユニット８６、蛍光緩和時間取得ユニット８８、重み係数取得ユニット９０、平均蛍光緩和時間取得ユニット９２、を備える。また、分析装置８０には、ディスプレイ１００が接続されている。

ＣＰＵ８２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサである。ＣＰＵ８２は、位相遅れ取得ユニット８６、蛍光緩和時間取得ユニット８８、重み係数取得ユニット９０、平均蛍光緩和時間取得ユニット９２の各種計算を実質的に実行する。

メモリ８４は、コンピュータ上で実行することにより、位相遅れ取得ユニット８６、蛍光緩和時間取得ユニット８８、重み係数取得ユニット９０、平均蛍光緩和時間取得ユニット９２を形成するプログラムを格納したハードディスクやＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力ポート９４から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備える。

入出力ポート９４は、コントローラ４４から供給される、少なくとも２つの周波数成分ｆ_１，ｆ_２のそれぞれに対応するｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の検出値の入力を受け入れる。また、入出力ポート９４は、各ユニットで作成された処理結果の情報をディスプレイ１００に出力する。ディスプレイ１００は、各ユニットで求められた、蛍光の位相遅れの情報、位相緩和時間、重み係数、平均蛍光緩和時間などの処理結果の値を表示する。

位相遅れ取得ユニット８６は、コントローラ４４から供給された、少なくとも２つの周波数成分ｆ_１，ｆ_２のそれぞれに対応するｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の検出値から、周波数成分ｆ_１（角周波数ω_１）についての位相遅れθ_ω１、周波数成分ｆ_２（角周波数ω_２）についての位相遅れθ_ω２を求める。

蛍光緩和時間取得ユニット８８は、位相遅れ取得ユニット８６が求めた位相遅れθ_ω１、θ_ω２に基づいて、蛍光緩和時間τ（θ_ω１）、τ（θ_ω２）をそれぞれ求める。

重み係数取得ユニット９０は、蛍光緩和時間取得ユニット８８が求めた蛍光緩和時間τ（θ_ω１）、τ（θ_ω２）のそれぞれに対して重み付けを行う重み係数ｍ（θ_ω１）、ｍ（θ_ω２）を求める。重み係数は０以上１以下の値である。

平均蛍光緩和時間取得ユニット９２は、蛍光緩和時間取得ユニット８８が求めた蛍光緩和時間τ（θ_ω１）、τ（θ_ω２）、重み係数取得ユニット９０が求めた重み係数ｍ（θ_ω１）、ｍ（θ_ω２）に基づいて、平均蛍光緩和時間τ_aveを求める。

このように、少なくとも２つの周波数成分ｆ_１，ｆ_２のそれぞれに対応する蛍光信号の検出値を用いることで、測定精度の高い蛍光緩和時間（上述した平均蛍光緩和時間τ_ave）を求めることができる。そして、この平均蛍光緩和時間τ_aveを用いて蛍光色素を識別することにより、試料１２の種類を特定する。以下、本発明により測定精度が向上することについて、より詳細に説明する。

一般に、レーザ光の強度を変調する変調信号に対する蛍光信号の位相遅れθは、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時間に依存する。例えば、１次緩和過程で表した場合、ｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分は、下記式（１），（２）で表される。

ここで、ωはレーザ光の変調角周波数、τは蛍光緩和時間である。蛍光緩和時間τは、初期蛍光強度をＩ₀とすると、この時点から蛍光強度がＩ₀／ｅ（ｅは自然対数の底、ｅ≒２．７１８２８）となる時点までの時間をいう。

蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分との比ｔａｎ（θ）から位相遅れθを求め、この位相遅れθを用いて、上記式（１）、（２）から、蛍光緩和時間τを求めることができる。
上記式（１）、（２）より、ｔａｎθは下記式（３）で表される。

上記式（３）より、位相遅れθは下記式（４）で表される。

上記式（４）より、蛍光緩和時間τに対する位相遅れθの変化量（δθ／δτ）は、下記式（５）で表される。

本来、正確に位相遅れθを求めることができれば、精度の高い蛍光緩和時間を求めることができるが、位相遅れに誤差があると精度の高い蛍光緩和時間を求めることができない。しかし、位相遅れの誤差に対して蛍光緩和時間の変動が鈍ければ、精度の高い安定した蛍光緩和時間を求めることができる。フローサイトメータ１０は、この位相遅れの変動に対する蛍光緩和時間の変動が小さい、すなわち、δθ／δτが大きくなるような変調周波数を効率よく用いることで、精度の高い蛍光緩和時間（平均蛍光緩和時間τ_ave）を求めることができる。

図６は、蛍光緩和時間τに対する位相遅れθの変化量（δθ／δτ）を示す図である。変調周波数ｆを７．５ＭＨｚ、１５ＭＨｚ、３０ＭＨｚとしたときの、位相遅れθの変化量（δθ／δτ）を示している。変調周波数が３０ＭＨｚの曲線と１５ＭＨｚの曲線とは、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒の点で交わっている。また、変調周波数が１５ＭＨｚの曲線と７．５ＭＨｚの曲線とは、蛍光緩和時間τが１５ｎ秒の点で交わっている。

図６から明らかなように、蛍光緩和時間τが０〜７．５ｎ秒では、変調周波数ｆを３０ＭＨｚとした場合に、変化量（δθ／δτ）が最も大きくなる。蛍光緩和時間τが７．５〜１５ｎ秒では、変調周波数ｆを１５ＭＨｚとした場合に、変化量（δθ／δτ）が最も大きくなる。蛍光緩和時間τが１５ｎ秒以上では、変調周波数ｆを７．５ＭＨｚとした場合に、変化量（δθ／δτ）が最も大きくなる。

位相遅れθの変化量（δθ／δτ）が大きいほどＳ／Ｎ比が高くなるため、測定精度が向上する。そのため、測定対象物の蛍光緩和時間が広範囲に及ぶ場合、例えば、３０ＭＨｚのみでレーザ光を強度変調したのでは、蛍光緩和時間が２０ｎ秒を超えるような範囲においてＳ／Ｎ比が低くなり、十分な測定精度を得ることが困難になる。

本実施形態では、上述したように、各周波数に対する蛍光緩和時間に重み付けを行うことにより、蛍光緩和時間の平均値を求める。すなわち、発振器４６ａで発振する周波数ｆ_１を３０ＭＨｚ，発振器４６ｂで発振する周波数ｆ_２を１５ＭＨｚとし、周波数ｆ_１、ｆ_２のそれぞれに対する位相遅れθ_ω１，θ_ω２を求める。

次に、平均蛍光緩和時間取得ユニット９２は、下記式（６）に示すように、τ（θ_ω１）、τ（θ_ω２）のそれぞれに重み係数ｍ（θ_ωｉ）を乗じて平均蛍光緩和時間τ_aveを求める。ここでＮは２以上の整数であり、異なる周波数成分の数を示すものである。本実施形態ではＮ＝２である。ある蛍光緩和時間τにおいて、位相遅れθの変化量（δθ／δτ）が大きいほど、重み係数ｍ（θ_ωｉ）が大きくなるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数ｍ（θ_ωｉ）を定める。

ここで、変調周波数が３０ＭＨｚの曲線と１５ＭＨｚの曲線とが交わる点の蛍光緩和時間τ（７．５ｎ秒）は、位相遅れθ_ω１では０．９５５５［ｒａｄ］に、位相遅れθ_ω２では０．６１５３［ｒａｄ］に相当する。したがって、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒よりも短い時間（位相遅れθ_ω１が０≦θ_ω１＜０．９５５５［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω１）＞ｍ（θ_ω２）となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。また、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒以上の時間（位相遅れθ_ω２が０．６１５３［ｒａｄ］≦θ_ω２＜π／２［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω１）＜ｍ（θ_ω２）となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。このような重み係数の大小関係が逆転する位相遅れの値は、使用する変調周波数ｆ_１、ｆ_２に応じて定まる。そのため、上述したような重み係数の大小関係を満たすように、重み係数が予めメモリ８４に記憶されている。

この平均蛍光緩和時間τ_aveを用いて蛍光色素を識別することにより、より精度よく試料１２の種類を特定することが可能となる。

＜第２の実施形態＞
第１の実施形態においては、発振器を２つ設け、それぞれの周波数が異なる構成としたが、発振器を３つ以上設け、それぞれの周波数が異なるような構成としてもよい。本実施形態では発振器を３つ設け、周波数はｆ_１を３０ＭＨｚ、ｆ_２を１５ＭＨｚ、ｆ_３を７．５ＭＨｚとする。位相遅れ取得ユニット８６は、周波数ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３のそれぞれに対する位相遅れθ_ω１、θ_ω２、θ_ω３を求める。

次に、平均蛍光緩和時間取得ユニット９２は、上記式（６）に示すように、τ（θ_ω１）、τ（θ_ω２）、τ（θ_ω３）のそれぞれに重み係数ｍ（θ_ωｉ）を乗じて平均蛍光緩和時間τ_aveを求める。本実施形態ではＮ＝３である。ある蛍光緩和時間τにおいて、位相遅れθの変化量（δθ／δτ）が大きいほど、重み係数ｍ（θ_ωｉ）が大きくなるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数ｍ（θ_ωｉ）を定める。

ここで、変調周波数が３０ＭＨｚの曲線と１５ＭＨｚの曲線とが交わる点の蛍光緩和時間τ（７．５ｎ秒）は、位相遅れθ_ω１では０．９５５５［ｒａｄ］に、位相遅れθ_ω２では０．６１５３［ｒａｄ］に相当する。また、変調周波数が１５ＭＨｚの曲線と７．５ＭＨｚの曲線とが交わる点の蛍光緩和時間τ（１５ｎ秒）は、位相遅れθ_ω２では０．９５５５［ｒａｄ］に、位相遅れθ_ω３では０．６１５３［ｒａｄ］に相当する。

したがって、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒よりも短い時間（位相遅れθ_ω１が０≦θ_ω１＜０．９５５５［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω１）＞ｍ（θ_ω２）、ｍ（θ_ω３）となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。また、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒以上で１５ｎ秒よりも短い時間（位相遅れθ_ω２が０．６１５３［ｒａｄ］≦θ_ω２＜０．９５５５［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω２）＞ｍ（θ_ω１）、ｍ（θ_ω３）となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。また、蛍光緩和時間τが１５ｎ秒以上の時間（位相遅れθ_ω３が０．６１５３［ｒａｄ］≦θ_ω３＜π／２［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω３）＞ｍ（θ_ω１）、ｍ（θ_ω２）となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。

この平均蛍光緩和時間τ_aveを用いて蛍光色素を識別することにより、より精度よく試料１２の種類を特定することが可能となる。

＜第３の実施形態＞
上記式（５）から明らかなように、蛍光緩和時間τが小さい領域では、変調角周波数ωが大きいほど位相遅れθの変化量（δθ／δτ）が大きくなる。一方、蛍光緩和時間τが大きい領域では、変調角周波数ωが小さいほど位相遅れθの変化量（δθ／δτ）が大きくなる。

従って、複数の発振器の周波数としては、比較的近い複数の周波数とするよりも、周波数の違いが大きい複数の周波数とすることが好ましい。例えば、少なくとも２つの周波数のうち１つの周波数の値は、他の周波数の値の２倍以上であることが好ましい。

このように、少なくとも２つの周波数のうち１つの周波数の値は、他の周波数の値の２倍以上とすることで、より精度よく試料１２の種類を特定することが可能となる。

＜第４の実施形態＞
第２の実施形態においては、蛍光緩和時間τに応じて、重み係数ｍ（θ_ω１）、ｍ（θ_ω２）、ｍ（θ_ω３）の大小関係を規定したが、本実施形態では重み係数ｍ（θ_ω１）、ｍ（θ_ω２）、ｍ（θ_ω３）の値として０又は１のみを用いた点が第２の実施形態と異なる。その他の構成については、第２の実施形態と同様である。

具体的には、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒よりも短い時間（位相遅れθ_ω１が０≦θ_ω１＜０．９５５５［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω１）＝１、ｍ（θ_ω２）＝ｍ（θ_ω３）＝０となるように、重み係数を定める。また、蛍光緩和時間τが７．５ｎ秒以上で１５ｎ秒よりも短い時間（位相遅れθ_ω２が０．６１５３［ｒａｄ］≦θ_ω２＜０．９５５５［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω２）＝１、ｍ（θ_ω１）＝ｍ（θ_ω３）＝０となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。また、蛍光緩和時間τが１５ｎ秒以上の時間（位相遅れθ_ω３が０．６１５３［ｒａｄ］≦θ_ω３＜π／２［ｒａｄ］）において、ｍ（θ_ω３）＝１、ｍ（θ_ω１）＝ｍ（θ_ω２）＝０となるように、重み係数取得ユニット９０は、重み係数を定める。

この平均蛍光緩和時間τ_aveを用いて蛍光色素を識別することにより、より精度よく試料１２の種類を特定することが可能となる。

１０ フローサイトメータ
１２ 試料
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２３ 光源
２４ａ，２４ｂ レンズ系
２５，２６ 受光部
２７ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ レーザドライバ
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６ａ，４６ｂ 発振器
４８ａ，４８ｂ，４８ｄ パワースプリッタ
４８ｃ パワーデバイダ
５０ａ，５０ｂ，５０ｃ，５４，５５，６４ アンプ
５８，５９ ＩＱミキサ
６０ システム制御器
６２ ローパスフィルタ
６６ Ａ／Ｄ変換器
８０ 分析装置
８２ ＣＰＵ
８４ メモリ
８６ 位相遅れ取得ユニット
８８ 蛍光緩和時間取得ユニット
９０ 重み係数取得ユニット
９２ 平均蛍光緩和時間取得ユニット
９４ 入出力ポート
１００ ディスプレイ

Claims (4)

1. 測定対象物にレーザ光を照射することにより前記測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
   前記測定対象物にレーザ光を照射するレーザ光源部と、
   前記レーザ光を照射された前記測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
   前記レーザ光源部から出射されるレーザ光の強度を時間変調させる変調信号であって、少なくとも２つの周波数の信号を合成した信号である変調信号を生成する光源制御部と、
   前記受光部から出力された蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有し、
   前記処理部は、前記少なくとも２つの周波数成分における、前記変調信号に対する前記蛍光信号の位相遅れを求め、前記位相遅れを用いて各周波数成分における蛍光緩和時間を求め、前記蛍光緩和時間に対する前記位相遅れの変化量が大きいほど値が大きくなる重み係数を用いて、前記蛍光緩和時間の重み付け平均を行って平均蛍光緩和時間を求めることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記少なくとも２つの周波数のうち１つの周波数の値は、他の周波数の値の２倍以上である、請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 測定対象物にレーザ光を照射することにより前記測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
   前記測定対象物にレーザ光を照射する工程と、
   前記レーザ光を照射された前記測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を出力する工程と、
   前記レーザ光の強度を時間変調させる変調信号であって、少なくとも２つの周波数の信号を合成した信号である変調信号を生成する工程と、
   前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める工程と、を有し、
   前記蛍光緩和時間を求める工程は、
   前記少なくとも２つの周波数成分における、前記変調信号に対する前記蛍光信号の位相遅れを求める工程と、
   前記位相遅れを用いて各周波数における蛍光緩和時間を求める工程と、
   前記蛍光緩和時間に対する前記位相遅れの変化量が大きいほど値が大きくなる重み係数を用いて、前記蛍光緩和時間の重み付け平均を行って平均蛍光緩和時間を求める工程と、
   を有することを特徴とする蛍光検出方法。
4. 前記少なくとも２つの周波数のうち１つの周波数の値は、他の周波数の値の２倍以上である、請求項３に記載の蛍光検出方法。

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