JP2013200285A - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供する。
【解決手段】測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置であって、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射するレーザ光源部と、レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、蛍光の光信号を増幅する光増幅部と、増幅された蛍光の光信号を受光し、蛍光の電気信号を出力する受光素子とを含む受光部と、変調信号に対するバイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるための位相差変化部と、第１位相差が変化する毎に蛍光の電気信号を取得することで、第１位相差のうち、取得した蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、第２位相差から蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する。
【選択図】図１
【解決手段】測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置であって、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射するレーザ光源部と、レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、蛍光の光信号を増幅する光増幅部と、増幅された蛍光の光信号を受光し、蛍光の電気信号を出力する受光素子とを含む受光部と、変調信号に対するバイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるための位相差変化部と、第１位相差が変化する毎に蛍光の電気信号を取得することで、第１位相差のうち、取得した蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、第２位相差から蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する。
【選択図】図１
Description
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置及び蛍光検出方法に関する。
測定対象物にレーザ光を照射し、測定対象物が発する蛍光を受光して、測定対象物の情報を取得する蛍光検出装置及び蛍光検出方法が知られている。
蛍光検出装置及び蛍光検出方法を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素が蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を検出することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
蛍光検出装置及び蛍光検出方法を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素が蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を検出することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
また、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射し、測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光緩和時間（蛍光寿命）を算出する蛍光検出装置及び蛍光検出方法が知られている（特許文献１）。
従来の蛍光検出装置では、測定対象物が発した蛍光は、光電変換素子に入射されることにより電気信号に変換された後に、増幅及び復調される。光電変換素子としては、増幅率が優れているという点から、光電子増倍管が多く用いられている。ところで、一般的な光電子増倍管は、電子の増幅率が優れている一方で量子効率が低い（例えば、約２５％以下）ため、光電子増倍管に入射する光子の数が少ない場合、電子に変換可能な光子の数がさらに減少する。この場合、電気信号に変換された蛍光の強度が微弱になるため、蛍光の電気信号が他の電気信号に埋もれて抽出が困難となり、またノイズとして除去されるおそれがある。したがって、蛍光の強度が低い場合、蛍光検出装置によって求められた蛍光緩和時間の測定精度が低下する可能性がある。
そこで、本発明は、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置である。
当該蛍光検出装置は、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅する光増幅部と、前記光増幅部によって増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力する受光素子とを含む受光部と、
前記変調信号に対する前記バイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるための位相差変化部と、
前記第１位相差が前記位相差変化部によって変化する毎に前記蛍光の電気信号を前記受光部から取得することで、前記第１位相差のうち、取得した前記蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、前記第２位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する。
当該蛍光検出装置は、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅する光増幅部と、前記光増幅部によって増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力する受光素子とを含む受光部と、
前記変調信号に対する前記バイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるための位相差変化部と、
前記第１位相差が前記位相差変化部によって変化する毎に前記蛍光の電気信号を前記受光部から取得することで、前記第１位相差のうち、取得した前記蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、前記第２位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する。
前記処理部は、前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過する間に、前記第２位相差を求める、ことが好ましい。
前記光増幅器は、前記第２位相差の情報を含む光信号を出力する、ことが好ましい。
前記位相差変化部は、前記第２位相差が前記処理部によって求められると、前記第１位相差を前記第２位相差に設定した後、別の測定対象物を用いて前記レーザ光源部、前記受光部および前記処理部を通して、前記別の測定対象物の蛍光緩和時間をもとめる、ことが好ましい。
本発明の他の態様は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法である。
当該蛍光検出方法は、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するステップと、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力するステップと、
前記変調信号に対する前記バイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるステップと、
前記第１位相差が変化する毎に前記蛍光の電気信号を取得することで、前記第１位相差のうち、取得した前記蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、前記第２位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップと、を有する。
当該蛍光検出方法は、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するステップと、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力するステップと、
前記変調信号に対する前記バイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるステップと、
前記第１位相差が変化する毎に前記蛍光の電気信号を取得することで、前記第１位相差のうち、取得した前記蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、前記第２位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップと、を有する。
前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップでは、前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過する間に、前記第２位相差を求める、ことが好ましい。
上述の蛍光検出装置及び蛍光検出方法によれば、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
以下、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を適用したフローサイトメータについて、詳細に説明する。
＜第１実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、第１実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物１２にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物１２から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物１２の情報を取得することができる。
フローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源部２０と、第１受光部３０と、第２受光部４０と、制御部５０と、分析装置６０と、出力部７０と、を備える。また、フローセル１０の下流には、測定対象物１２を回収するための容器１６が配置される。以下、各構成について詳細に説明する。
＜第１実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、第１実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物１２にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物１２から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物１２の情報を取得することができる。
フローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源部２０と、第１受光部３０と、第２受光部４０と、制御部５０と、分析装置６０と、出力部７０と、を備える。また、フローセル１０の下流には、測定対象物１２を回収するための容器１６が配置される。以下、各構成について詳細に説明する。
細胞、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）、ＲＮＡ（Ribonucleic Acid）、酵素、蛋白等の測定対象物１２は、シース液に囲まれてフローセル１０の内部を流れる。後述するように、レーザ光源部２０が測定対象物１２にレーザ光を照射し、その際に発せられる蛍光から測定対象物１２の情報を取得するため、測定対象物１２には、蛍光色素１４が予め付与されている。蛍光色素１４は、例えば、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）等が用いられる。フローセル１０の内部では、シース液に囲まれた測定対象物１２が、流体力学的絞り込みを受けることにより細い液流となって、フローセル１０の内部を流れる。
レーザ光源部２０は、例えば、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、所定の変調信号を用いて強度変調されたレーザ光を測定対象物１２に照射する。
図２に示すように、レーザ光源部２０は、レーザ光源２１と、レンズ系２２と、レーザドライバ２３とを有している。
レーザ光源２１は、強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光を強度変調して出射する。
レンズ系２２は、レーザ光源２１から出射されたレーザ光を、フローセル１０中の所定の照射位置（測定場）に集束させる。
レーザドライバ２３は、後述する制御部５０と電気的に接続されており、制御部５０から供給された変調信号の周波数（変調周波数）でレーザ光の強度を変調するように構成されている。
なお、レーザ光源部２０は、１つのレーザ光源を用いてもよいし、複数のレーザ光源を用いてもよい。複数のレーザ光源が用いられる場合には、複数のレーザ光源からのレーザ光がダイクロイックミラー等を用いて、１つのレーザ光のビームに合成されることにより、測定場に向けて出射されるレーザ光が形成されることが好ましい。
図２に示すように、レーザ光源部２０は、レーザ光源２１と、レンズ系２２と、レーザドライバ２３とを有している。
レーザ光源２１は、強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光を強度変調して出射する。
レンズ系２２は、レーザ光源２１から出射されたレーザ光を、フローセル１０中の所定の照射位置（測定場）に集束させる。
レーザドライバ２３は、後述する制御部５０と電気的に接続されており、制御部５０から供給された変調信号の周波数（変調周波数）でレーザ光の強度を変調するように構成されている。
なお、レーザ光源部２０は、１つのレーザ光源を用いてもよいし、複数のレーザ光源を用いてもよい。複数のレーザ光源が用いられる場合には、複数のレーザ光源からのレーザ光がダイクロイックミラー等を用いて、１つのレーザ光のビームに合成されることにより、測定場に向けて出射されるレーザ光が形成されることが好ましい。
レーザ光を出射する光源として、例えば、半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ〜１００ｍＷである。また、変調周波数は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長く、例えば、１０ＭＨｚ〜２００ＭＨｚである。
第１受光部３０は、フローセル１０の測定場を基準として、レーザ光源部２０と反対側に配置される。第１受光部３０は、フローセル１０の測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射されたときに、測定対象物１２で散乱するレーザ光の前方散乱光を受光する。
第１受光部３０は、例えば、フォトダイオード等の光電変換器を備える。光電変換器は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第１受光部３０の光電変換器によって変換された電気信号は分析装置６０へ出力され、当該電気信号は、測定対象物１２がフローセル１０の測定場を通過するタイミングを知らせるためのトリガ信号として用いられる。
また、第１受光部３０は、例えば、前方散乱光を光電変換器に集束させるレンズ系（図示省略）と、レーザ光が光電変換器に直接入射しないようにレンズ系の測定対象物１２側前面に設けられた遮蔽板（図示省略）とを有してもよい。
第１受光部３０は、例えば、フォトダイオード等の光電変換器を備える。光電変換器は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第１受光部３０の光電変換器によって変換された電気信号は分析装置６０へ出力され、当該電気信号は、測定対象物１２がフローセル１０の測定場を通過するタイミングを知らせるためのトリガ信号として用いられる。
また、第１受光部３０は、例えば、前方散乱光を光電変換器に集束させるレンズ系（図示省略）と、レーザ光が光電変換器に直接入射しないようにレンズ系の測定対象物１２側前面に設けられた遮蔽板（図示省略）とを有してもよい。
第２受光部４０は、レーザ光源部２０から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、且つ、フローセル１０中の測定対象物１２の移動方向に対して垂直方向に配置されている。第２受光部４０は、フローセル１０の測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射されたときに測定対象物１２から発せられる蛍光を、光増幅器で増幅して受光する。
図３に示すように、第２受光部４０は、レンズ系４１と、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ）４２と、光増幅器４３と、信号処理部４４と、位相シフタ４５と、を有する。
レンズ系４１は、第２受光部４０に入射した光を集光する。
ＢＰＦ４２は、光増幅器４３の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させるフィルタである。なお、透過させる蛍光の波長帯域は、蛍光色素１４が発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。また、ＢＰＦ４２の代わりに、バンドリジェクトフィルタを用いてもよい。
図３に示すように、第２受光部４０は、レンズ系４１と、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ）４２と、光増幅器４３と、信号処理部４４と、位相シフタ４５と、を有する。
レンズ系４１は、第２受光部４０に入射した光を集光する。
ＢＰＦ４２は、光増幅器４３の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させるフィルタである。なお、透過させる蛍光の波長帯域は、蛍光色素１４が発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。また、ＢＰＦ４２の代わりに、バンドリジェクトフィルタを用いてもよい。
光増幅器４３は、例えば半導体光増幅器であり、後述するように、変調信号を誘導放出のためのシフト信号として用いて、入射した蛍光の光信号を増幅する。また、光増幅器４３は、レンズ系４１から入射口までの光の光路長が一定になるように配置されている。これは、後述するように、光増幅器４３が、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、変調信号に対する蛍光の位相差（以下、蛍光の位相差という）の情報を含む光信号を出力するためである。
光増幅器４３は、蛍光の光信号を増幅するために設けられており、位相シフタ４５を介して制御部５０と電気的に接続され、制御部５０から送信された変調信号でバイアスされている。これにより、光増幅器４３を構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号により励起される。そして、蛍光が入射すると、レーザ媒質の原子あるいは分子の誘導放出により、光増幅器４３に入射した蛍光は増幅される。なお、光増幅器４３は、本発明における光増幅部の一例である。
光増幅器４３を用いることにより、蛍光の光信号が電気信号に変換される前に、蛍光の光信号を増幅することができる。
位相シフタ４５は、光増幅器４３と制御部５０との間に設けられ、制御部５０から送信された変調信号を光増幅器４３に供給する。また、位相シフタ４５は、後述する分析装置６０と電気的に接続されている。位相シフタ４５は、分析装置６０によって電圧が制御されることにより、光増幅器４３に供給される信号（バイアス信号）の変調信号に対する位相差（以下、バイアス信号の位相差という）を変化させる。なお、位相シフタ４５は、本発明における位相差変化部の一例である。また、バイアス信号の位相差は、本発明における第１位相差の一例である。
光増幅器４３は、蛍光の光信号を増幅するために設けられており、位相シフタ４５を介して制御部５０と電気的に接続され、制御部５０から送信された変調信号でバイアスされている。これにより、光増幅器４３を構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号により励起される。そして、蛍光が入射すると、レーザ媒質の原子あるいは分子の誘導放出により、光増幅器４３に入射した蛍光は増幅される。なお、光増幅器４３は、本発明における光増幅部の一例である。
光増幅器４３を用いることにより、蛍光の光信号が電気信号に変換される前に、蛍光の光信号を増幅することができる。
位相シフタ４５は、光増幅器４３と制御部５０との間に設けられ、制御部５０から送信された変調信号を光増幅器４３に供給する。また、位相シフタ４５は、後述する分析装置６０と電気的に接続されている。位相シフタ４５は、分析装置６０によって電圧が制御されることにより、光増幅器４３に供給される信号（バイアス信号）の変調信号に対する位相差（以下、バイアス信号の位相差という）を変化させる。なお、位相シフタ４５は、本発明における位相差変化部の一例である。また、バイアス信号の位相差は、本発明における第１位相差の一例である。
次に、光信号の増幅について詳細に説明する。光信号の増幅は、変調信号をバイアス信号として用いて、光増幅器４３に光の誘導放出を行わせることにより、行われる。これにより、蛍光の光信号は、変調信号を参照信号としてミキシングされる。以降では、光増幅器４３を用いて蛍光の光信号を増幅する場合について説明する。
光増幅器４３を構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号のエネルギーを吸収すると、基底状態から励起状態に遷移し、一定時間後に光を放出（自然放出）して、再び基底状態に戻る。また、励起状態の原子あるいは分子は、変調信号と同じ周波数の光信号（蛍光信号）が入射されると、同一方向に向けて連鎖反応的に光を放出（誘導放出）する。レーザ媒質の原子あるいは分子が単位時間あたりに自然放出、吸収または誘導放出する確率は、それぞれＡ、Ｂ１２Ｗ、Ｂ２１Ｗで表される。ここで、Ｗは入射光のエネルギー密度であり、Ａ，Ｂ１２，Ｂ２１は状態が遷移する確率である。また、原子あるいは分子の集団が熱平衡状態にある場合、Ｂ１２＝Ｂ２１であることから、以降ではＢ１２及びＢ２１のそれぞれを単にＢと表す。
基底状態の原子あるいは分子の密度（占位数）をＮ１、励起状態の原子あるいは分子の密度（占位数）をＮ２としたとき、Ｎ１，Ｎ２の時間変化を表す微分方程式（レート方程式）は、以下の式（１）のように示される。下記の式（１）では、励起状態の原子あるいは分子の密度の時間変化（式（１）の左辺）は、励起状態の原子あるいは分子の自然放出の発生頻度（式（１）の右辺第１項）と、誘導放出の発生頻度（式（１）の右辺第２項）に応じて低減することを示している。
光増幅器４３を構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号のエネルギーを吸収すると、基底状態から励起状態に遷移し、一定時間後に光を放出（自然放出）して、再び基底状態に戻る。また、励起状態の原子あるいは分子は、変調信号と同じ周波数の光信号（蛍光信号）が入射されると、同一方向に向けて連鎖反応的に光を放出（誘導放出）する。レーザ媒質の原子あるいは分子が単位時間あたりに自然放出、吸収または誘導放出する確率は、それぞれＡ、Ｂ１２Ｗ、Ｂ２１Ｗで表される。ここで、Ｗは入射光のエネルギー密度であり、Ａ，Ｂ１２，Ｂ２１は状態が遷移する確率である。また、原子あるいは分子の集団が熱平衡状態にある場合、Ｂ１２＝Ｂ２１であることから、以降ではＢ１２及びＢ２１のそれぞれを単にＢと表す。
基底状態の原子あるいは分子の密度（占位数）をＮ１、励起状態の原子あるいは分子の密度（占位数）をＮ２としたとき、Ｎ１，Ｎ２の時間変化を表す微分方程式（レート方程式）は、以下の式（１）のように示される。下記の式（１）では、励起状態の原子あるいは分子の密度の時間変化（式（１）の左辺）は、励起状態の原子あるいは分子の自然放出の発生頻度（式（１）の右辺第１項）と、誘導放出の発生頻度（式（１）の右辺第２項）に応じて低減することを示している。
また、Ｎ１＋Ｎ２＝Ｎとすると、式（１）は、以下の式（２）のように示される。
ここで、光増幅器４３のバイアス信号の電圧を、変調信号と同じ角周波数ωで変化させた場合には、確率Ａ，ＢはそれぞれＡ＝ａｃｏｓωｔ、Ｂ＝ｂｃｏｓωｔで表される。なお、ａ，ｂは確率値であるため、ａ，ｂ≦１である。また、蛍光は変調信号で強度変調されたレーザ光により発するので、光増幅器４３に入射する入射光（蛍光）も角周波数ωで変調されていることから、蛍光の位相差をθとすると、入射光のエネルギー密度Ｗは、Ｗ＝ｗｃｏｓ（ωｔ＋θ）で表される。なお、ｗは入射光の強度である。Ａ、Ｂ及びＷの値を式（２）に代入し、三角関数の加法定理を用いると、式（２）は以下の式（３）のように示される。
式（３）において、ｔは入射光が光増幅器４３を通過する時間である。また、
としたとき、式（３）の一般解は、定数変化法を用いることにより、以下の式（６）のように示される。
なお、式（６）において、∫ｐ（ｔ）ｄｔは、式（４）より以下の式（７）のように示される。
ここで、変調信号の変調周波数は、例えば、１０８Ｈｚ程度であることから、角周波数ω＞＞１となる。また、入射光の強度ｗは、例えば、数ｍＷ〜数十ｍＷ程度である。これにより、（ａ／ω）・ｓｉｎωｔの値と、（ｂｗ／２ω）・ｓｉｎ（２ωｔ＋θ）の値は、極めて小さくなることから、ほぼ影響が無いと考えられる。したがって、式（７）は、以下の式（８）のように近似することができる。
また、式（６）の∫ｄｔ´ｑ（ｔ´）ｅｘｐ（∫ｐ（ｔ）ｄｔ）は、以下の式（９）のように示される。
ここで、入射光が進行する方向の光増幅器４３の長さは、数ｃｍ〜数十ｃｍ程度であることから、ｔ＜＜１とすることができる。したがって、式（９）のｅｘｐ｛（ｂｗｃｏｓθ）ｔ｝は、以下の式（１０）のように近似することができる。
さらに、Ｎの値はアボガドロ数程度の大きさと考えられることから、式（９）は、以下の式（１１）のように近似することができる。
したがって、式（６）の右辺第２項は、以下の式（１２）のように示される。
よって、式（６）は、式（１２）を用いて以下の式（１３）のように示される。
そして、光増幅器４３から出力される蛍光は、Ｎ２の時間微分で表すことができることから、式（１３）を用いて以下の式（１４）のように示される。
式（１４）より、光増幅器４３から出力される蛍光の光信号には、入射光（蛍光）の周波数と変調信号の周波数との加算周波数を成分とする高周波成分と、入射光の周波数と変調信号の周波数との差分周波数を成分とする低周波成分とが含まれていることがわかる。すなわち、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出が行われることにより、光増幅器４３は、入射光すなわち蛍光の光信号と、変調信号とをミキシングした結果を得ることができる。また、蛍光の光信号と、蛍光の光信号と同じ周波数を有する変調信号とをミキシングした結果が得られることによって、レーザ光によって変調された蛍光を復調することができる。さらに、蛍光の光信号は、Ｎｂ／２（＞１）倍に増幅されている。
このようにして、光増幅器４３は、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、蛍光の光信号を増幅することができるとともに、蛍光の光信号と変調信号とをミキシングした結果を得ることができる。なお、光増幅器４３から出力された蛍光の光信号の低周波成分（直流成分）は、後述する信号処理部４４において、蛍光の位相差の情報である実数部成分（Ｒｅ成分）として得られる。なお、直流成分は、０Ｈｚの成分の他に、許容範囲として粒子の通過に起因する交流分（０〜１ＭＨｚ）程度の成分を含んでもよい。
なお、式（１４）は、バイアス信号が変調信号と同相の場合に光増幅器４３から出力される蛍光の光信号を表している。ここで、バイアス信号の位相差が位相シフタ４５によってシフトする場合には、バイアス信号の位相差をφとすると、式（１４）は、以下の式（１５）のように示される。
式（１５）より、蛍光の位相差θと、バイアス信号の位相差φとが等しい場合には、光増幅器４３から出力された蛍光の光信号の直流成分が最大値（ｃｏｓ（０）＝１）となることがわかる。
次に、図４を参照して、信号処理部４４の構成について説明する。図４は、信号処理部４４の構成の一例を示す図である。信号処理部４４は、光増幅器４３から出力された蛍光の光信号を電気信号に変換する。図４に示すように、信号処理部４４は、ＢＰＦ４４１と、光電変換器４４２と、ローパスフィルタ（ＬＰＦ）４４３と、Ａ／Ｄ変換器４４４と、を有している。
ＢＰＦ４４１は、光電変換器４４２の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光の光信号を透過させるフィルタである。これにより、迷光を抑制することができる。なお、ＢＰＦ４４１の代わりに、バンドリジェクトフィルタを用いてもよい。
光電変換器４４２は、例えばフォトダイオードや光電子増倍管等であり、蛍光を受光し、光信号を電気信号に変換して出力する受光素子を有している。ここで、フォトダイオードは、光電子増倍管と比べて、量子効率が優れている一方で、増幅率が劣るという特性を有している。このため、蛍光の光信号を増幅する光電変換器を用いて蛍光を検出する従来技術の構成では、フォトダイオードを光電変換器に用いることが困難であった。一方、本実施形態では、蛍光の光信号が光増幅器４３によって増幅されていることから、光電変換器で蛍光の光信号を増幅させなくてもよい。これにより、本実施形態では、従来技術において光電変換器に用いることが困難であったフォトダイオードを、光電変換器４４２に用いることができる。なお、信号処理部４４の光電変換器４４２に含まれる受光素子は、本発明における受光素子の一例である。
ＬＰＦ４４３は、光電変換器４４２から出力された蛍光の電気信号のうち、変調信号の周波数と蛍光信号の周波数との加算周波数を成分とする高周波成分を除去し、変調信号の周波数と蛍光信号の周波数との差分周波数を成分とする低周波成分、すなわち直流成分を通過させるためのフィルタである。これにより、上記直流成分が、蛍光の電気信号の実数部成分（Ｒｅ成分）として、信号処理部４４のＬＰＦ４４３から出力される。ＬＰＦ４４３から直流成分が出力されることにより、ＬＰＦ４４３以降の信号処理において、高周波回路よりも製作するのが容易な低周波回路を用いてフローサイトメータを構成することができる。
なお、光電変換器４４２に低速な受光素子を用いた場合、電気信号の高周波成分が受光素子において自ずと除去されるので、例えば、光電変換処理後に、電気信号用のフィルタを用いて電気信号の高周波成分を除去する処理を行なくてもよい。これにより、信号処理部４４の部品点数を低減することができるので、結果として、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
信号処理部４４のＡ／Ｄ変換器４４４は、ＬＰＦ４４３から出力された蛍光の電気信号のＲｅ成分をデジタルデータに変換する。変換されたデジタルデータは、分析装置６０に供給される。
光電変換器４４２は、例えばフォトダイオードや光電子増倍管等であり、蛍光を受光し、光信号を電気信号に変換して出力する受光素子を有している。ここで、フォトダイオードは、光電子増倍管と比べて、量子効率が優れている一方で、増幅率が劣るという特性を有している。このため、蛍光の光信号を増幅する光電変換器を用いて蛍光を検出する従来技術の構成では、フォトダイオードを光電変換器に用いることが困難であった。一方、本実施形態では、蛍光の光信号が光増幅器４３によって増幅されていることから、光電変換器で蛍光の光信号を増幅させなくてもよい。これにより、本実施形態では、従来技術において光電変換器に用いることが困難であったフォトダイオードを、光電変換器４４２に用いることができる。なお、信号処理部４４の光電変換器４４２に含まれる受光素子は、本発明における受光素子の一例である。
ＬＰＦ４４３は、光電変換器４４２から出力された蛍光の電気信号のうち、変調信号の周波数と蛍光信号の周波数との加算周波数を成分とする高周波成分を除去し、変調信号の周波数と蛍光信号の周波数との差分周波数を成分とする低周波成分、すなわち直流成分を通過させるためのフィルタである。これにより、上記直流成分が、蛍光の電気信号の実数部成分（Ｒｅ成分）として、信号処理部４４のＬＰＦ４４３から出力される。ＬＰＦ４４３から直流成分が出力されることにより、ＬＰＦ４４３以降の信号処理において、高周波回路よりも製作するのが容易な低周波回路を用いてフローサイトメータを構成することができる。
なお、光電変換器４４２に低速な受光素子を用いた場合、電気信号の高周波成分が受光素子において自ずと除去されるので、例えば、光電変換処理後に、電気信号用のフィルタを用いて電気信号の高周波成分を除去する処理を行なくてもよい。これにより、信号処理部４４の部品点数を低減することができるので、結果として、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
信号処理部４４のＡ／Ｄ変換器４４４は、ＬＰＦ４４３から出力された蛍光の電気信号のＲｅ成分をデジタルデータに変換する。変換されたデジタルデータは、分析装置６０に供給される。
次に、図５を参照して、制御部５０の構成について説明する。図５は、制御部５０の構成の一例を示す図である。制御部５０は、変調信号の変調周波数を制御する。図５に示すように、制御部５０は、発振器５１と、パワースプリッタ５２と、アンプ（ＡＭＰ）５３，５４と、を有している。
発振器５１は、所定の周波数の信号、例えば正弦波信号やパルス信号等を生成し、出力する。発振器５１から出力される信号は変調信号として用いられる。上記信号の周波数は、例えば、１０〜２００ＭＨｚである。
発振器５１から出力された所定の周波数の信号（変調信号）は、パワースプリッタ５２により、２つのアンプ５３，５４に分配される。アンプ５３で増幅された変調信号は、レーザ光源部２０へ出力される。また、アンプ５４で増幅された変調信号は、第２受光部４０へ出力される。アンプ５４で増幅された変調信号を第２受光部４０へ出力するのは、前述したように、変調信号を、第２受光部４０の光増幅器４３のバイアス信号として用いるためである。
発振器５１から出力された所定の周波数の信号（変調信号）は、パワースプリッタ５２により、２つのアンプ５３，５４に分配される。アンプ５３で増幅された変調信号は、レーザ光源部２０へ出力される。また、アンプ５４で増幅された変調信号は、第２受光部４０へ出力される。アンプ５４で増幅された変調信号を第２受光部４０へ出力するのは、前述したように、変調信号を、第２受光部４０の光増幅器４３のバイアス信号として用いるためである。
次に、図６を参照して、分析装置６０の構成について説明する。図６は、分析装置６０の構成の一例を示す図である。分析装置６０は、ＣＰＵを主体として構成されたコンピュータであり、第２受光部４０の信号処理部４４から出力された電気信号を用いて、蛍光の位相差を求める。また、分析装置６０は、蛍光の位相差から蛍光の蛍光緩和時間を求める。分析装置６０は、位相差抽出部６１と、蛍光緩和時間算出部６２とを有している。位相差抽出部６１及び蛍光緩和時間算出部６２は、コンピュータが実行可能なプログラムを実行することで形成されるモジュールである。
なお、分析装置６０は、本発明における処理部の一例である。
なお、分析装置６０は、本発明における処理部の一例である。
位相差抽出部６１は、位相シフタ４５と電気的に接続されている。位相差抽出部６１は、位相シフタ４５の電圧を制御することにより、バイアス信号の位相差を、所定時間（例えば数マイクロ秒）経過する毎に所定値（例えば１°）ずつ増加又は減少するように、あるいは連続的に増加又は減少するように変化させる。また、位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差が位相シフタ４５によって変化する毎に蛍光の電気信号を信号処理部４４から取得することで、バイアス信号の位相差のうち、取得した電気信号の直流成分を最大化するときの位相差である最適位相差を求める。ここで、最適位相差は、本発明における第２位相差の一例である。
また、最適位相差とは、式（１５）で示したように、蛍光の位相差θと等しくなるときのバイアス信号の位相差φである。したがって、最適位相差を求めることにより、蛍光の位相差θを精度良く求めることができる。
さらに、位相差抽出部６１は、測定対象物１２が測定場を通過する間に、最適位相差を求めることが好ましい。これにより、バイアス信号の位相差を蛍光の位相差に合わせることができるので、測定対象物１２の測定中に最大の蛍光強度を得ることが可能になる。このため、測定対象物１２の情報を精度良く取得することができる。
そして、位相差抽出部６１は、求められた位相差θを蛍光緩和時間算出部６２に送信する。
蛍光緩和時間算出部６２は、位相差抽出部６１から受信した位相差θを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝ｔａｎθ／（２πｆ）（ｆは変調信号の周波数の値である）に従って求める。蛍光緩和時間τを、上記式に従って求めることができるのは、蛍光は、略１次遅れの緩和応答に従うからである。
なお、位相シフタ４５は、最適位相差が分析装置６０の位相差抽出部６１によって求められたときに、バイアス信号の位相差φを最適位相差に設定してもよい。つまり、位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差φが最適位相差に設定されるように、位相シフタ４５の電圧を制御してもよい。また、フローサイトメータは、位相シフタ４５がバイアス信号の位相差φを最適位相差に設定した後、別の測定対象物を用いてレーザ光源部２０、第２受光部４０および分析装置６０を通して、当該別の測定対象物の蛍光緩和時間を求めるようにしてもよい。
また、最適位相差とは、式（１５）で示したように、蛍光の位相差θと等しくなるときのバイアス信号の位相差φである。したがって、最適位相差を求めることにより、蛍光の位相差θを精度良く求めることができる。
さらに、位相差抽出部６１は、測定対象物１２が測定場を通過する間に、最適位相差を求めることが好ましい。これにより、バイアス信号の位相差を蛍光の位相差に合わせることができるので、測定対象物１２の測定中に最大の蛍光強度を得ることが可能になる。このため、測定対象物１２の情報を精度良く取得することができる。
そして、位相差抽出部６１は、求められた位相差θを蛍光緩和時間算出部６２に送信する。
蛍光緩和時間算出部６２は、位相差抽出部６１から受信した位相差θを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝ｔａｎθ／（２πｆ）（ｆは変調信号の周波数の値である）に従って求める。蛍光緩和時間τを、上記式に従って求めることができるのは、蛍光は、略１次遅れの緩和応答に従うからである。
なお、位相シフタ４５は、最適位相差が分析装置６０の位相差抽出部６１によって求められたときに、バイアス信号の位相差φを最適位相差に設定してもよい。つまり、位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差φが最適位相差に設定されるように、位相シフタ４５の電圧を制御してもよい。また、フローサイトメータは、位相シフタ４５がバイアス信号の位相差φを最適位相差に設定した後、別の測定対象物を用いてレーザ光源部２０、第２受光部４０および分析装置６０を通して、当該別の測定対象物の蛍光緩和時間を求めるようにしてもよい。
出力部７０は、例えば、表示装置やプリンタ等であり、分析装置６０が算出した結果、具体的には蛍光緩和時間等を出力する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
（蛍光検出方法）
図７は、本実施形態の蛍光検出方法のフローの一例を説明する図である。本実施形態の蛍光検出方法は、測定対象物１２にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物１２から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物１２の情報を取得することができる。
まず、制御部５０の発振器５１は、所定の周波数の信号、例えば正弦波信号やパルス信号等を変調信号として生成し（ステップＳ１）、生成された変調信号をレーザ光源部２０及び第２受光部４０に供給する（ステップＳ２）。
図７は、本実施形態の蛍光検出方法のフローの一例を説明する図である。本実施形態の蛍光検出方法は、測定対象物１２にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物１２から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物１２の情報を取得することができる。
まず、制御部５０の発振器５１は、所定の周波数の信号、例えば正弦波信号やパルス信号等を変調信号として生成し（ステップＳ１）、生成された変調信号をレーザ光源部２０及び第２受光部４０に供給する（ステップＳ２）。
次に、レーザ光源部２０のレーザドライバ２３は、制御部５０から変調信号が供給されると、変調信号の変調周波数でレーザ光の強度を変調する。強度変調されたレーザ光は、レーザ光源２１から出射され、フローセル１０中の測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射される（ステップＳ３）。
一方、第２受光部４０の光増幅器４３には、発振器５１から供給された変調信号がバイアス信号として用いられている。また、分析装置６０の位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差の初期値を０°として、この位相差を変化させるように、位相シフタ４５を制御する。
測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射された際に発せられる蛍光が第２受光部４０に受光されると、バイアス信号の位相差の変化量が所定値（例えば１８０°）以下の間（ステップＳ４）、光増幅器４３は、蛍光の光信号の増幅を行う（ステップＳ５）。これにより、蛍光の位相差の情報であるＲｅ成分を含む光信号が増幅される。光増幅器４３にて増幅された光信号は、信号処理部４４において電気信号に変換され、蛍光の電気信号のＲｅ成分のデジタルデータが、信号処理部４４から出力される（ステップＳ６）。
一方、第２受光部４０の光増幅器４３には、発振器５１から供給された変調信号がバイアス信号として用いられている。また、分析装置６０の位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差の初期値を０°として、この位相差を変化させるように、位相シフタ４５を制御する。
測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射された際に発せられる蛍光が第２受光部４０に受光されると、バイアス信号の位相差の変化量が所定値（例えば１８０°）以下の間（ステップＳ４）、光増幅器４３は、蛍光の光信号の増幅を行う（ステップＳ５）。これにより、蛍光の位相差の情報であるＲｅ成分を含む光信号が増幅される。光増幅器４３にて増幅された光信号は、信号処理部４４において電気信号に変換され、蛍光の電気信号のＲｅ成分のデジタルデータが、信号処理部４４から出力される（ステップＳ６）。
また、位相差抽出部６１は、位相シフタ４５の制御電圧を制御することにより、バイアス信号の位相差を、所定時間（例えば数マイクロ秒）毎に所定値（例えば１°）ずつ増加又は減少するように、あるいは連続的に増加又は減少するように変化させる（ステップＳ７）。これにより、位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差が位相シフタ４５によって変化する毎に、バイアス信号の位相差に応じた蛍光の電気信号を信号処理部４４から取得することが可能となる。
そして、バイアス信号の位相差の変化量が所定値以下の間、ステップＳ５〜ステップＳ７の処理が繰り返し行われる。
そして、バイアス信号の位相差の変化量が所定値よりも大きくなると（ステップＳ４）、位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差のうち蛍光の電気信号の直流成分を最大化する最適位相差を、蛍光の位相差θとして求める（ステップＳ８）。
そして、蛍光緩和時間算出部６２は、位相差算出部６１によって求められた位相差θを用いて、蛍光緩和時間τを求める（ステップＳ９）。
なお、位相シフタ４５は、蛍光の位相差θが求められると、バイアス信号の位相差φを、最適位相差に設定することが好ましい（ステップＳ１０）。
出力部７０は、求められた蛍光緩和時間τ等の情報を出力する。
そして、バイアス信号の位相差の変化量が所定値以下の間、ステップＳ５〜ステップＳ７の処理が繰り返し行われる。
そして、バイアス信号の位相差の変化量が所定値よりも大きくなると（ステップＳ４）、位相差抽出部６１は、バイアス信号の位相差のうち蛍光の電気信号の直流成分を最大化する最適位相差を、蛍光の位相差θとして求める（ステップＳ８）。
そして、蛍光緩和時間算出部６２は、位相差算出部６１によって求められた位相差θを用いて、蛍光緩和時間τを求める（ステップＳ９）。
なお、位相シフタ４５は、蛍光の位相差θが求められると、バイアス信号の位相差φを、最適位相差に設定することが好ましい（ステップＳ１０）。
出力部７０は、求められた蛍光緩和時間τ等の情報を出力する。
このように、本実施形態によれば、光増幅部４３を用いて蛍光の光信号を増幅しているので、蛍光の光信号が電気信号に変換される前に蛍光の光信号を増幅することができる。これにより、入射する蛍光の光子数が少ない場合であっても、蛍光の強度を高めることができるので、蛍光の光信号が電気信号に変換された後に、蛍光の電気信号が他の電気信号に埋もれて抽出困難となる可能性、さらに蛍光の電気信号がノイズとして除去される可能性を低減することができる。したがって、蛍光の強度が低い場合であっても、蛍光を検出することができ、ひいては精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
また、変調信号を用いたバイアス信号でバイアスされた光増幅部４３が、蛍光の光信号を増幅することにより、蛍光の光信号と、バイアス信号とがミキシングされる。このため、例えば、電気信号を混合するためのミキサー等の混合器を設ける必要がない。したがって、光信号を増幅するための装置と、混合器とを個別に設ける必要がないので、部品点数を低減することができ、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
また、変調信号を用いたバイアス信号でバイアスされた光増幅部４３が、蛍光の光信号を増幅することにより、蛍光の光信号と、バイアス信号とがミキシングされる。このため、例えば、電気信号を混合するためのミキサー等の混合器を設ける必要がない。したがって、光信号を増幅するための装置と、混合器とを個別に設ける必要がないので、部品点数を低減することができ、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
また、本実施形態では、１つの光増幅器４３のバイアス信号の位相差を変化させることにより、蛍光の蛍光緩和時間を取得することができるので、蛍光の蛍光緩和時間を取得する従来技術と比較した場合に以下の利点を有している。
例えば、ハーフミラー等を用いて蛍光を２つに分け、一方の蛍光と所定の参照信号とをミキシングすることにより得られたＲｅ成分と、参照信号に対して位相が９０°シフトした信号と他方の蛍光とをミキシングすることにより得られたＩｍ成分とを用いて、ｔａｎ−１（Ｉｍ／Ｒｅ）（ＩｍはＩｍ成分の値、ＲｅはＲｅ成分の値である）を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出する従来技術では、２つの復調回路が必要となるため、受光素子や信号処理回路の数が増大する。このため、この従来技術では、フローサイトメータの製造コストが嵩むおそれがある。一方、本実施形態では、蛍光の復調回路の数が１つであるため、従来技術と比較して復調回路の数を低減することができる。したがって、本実施形態では、従来技術と比較して、フローサイトメータの製造コストを低減することができる、という利点がある。
また、例えば、１つの復調回路に入力される参照信号に位相を所定時間毎に９０°ずつシフトさせてＲｅ成分とＩｍ成分とを時系列的に取得し、ｔａｎ−１（Ｉｍ／Ｒｅ）を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出する従来技術では、時系列的にＲｅ成分とＩｍ成分とを取得するための高速な演算処理が必要となるため、大型の演算処理回路を用いる必要がある。このため、この従来技術では、フローサイトメータのサイズが大型化するおそれがある。一方、本実施形態では、高速な演算処理を要しないため、大型の演算処理回路を設ける必要がない。したがって、本実施形態では、従来技術と比較して、フローサイトメータのサイズを小型化することができる、という利点がある。
例えば、ハーフミラー等を用いて蛍光を２つに分け、一方の蛍光と所定の参照信号とをミキシングすることにより得られたＲｅ成分と、参照信号に対して位相が９０°シフトした信号と他方の蛍光とをミキシングすることにより得られたＩｍ成分とを用いて、ｔａｎ−１（Ｉｍ／Ｒｅ）（ＩｍはＩｍ成分の値、ＲｅはＲｅ成分の値である）を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出する従来技術では、２つの復調回路が必要となるため、受光素子や信号処理回路の数が増大する。このため、この従来技術では、フローサイトメータの製造コストが嵩むおそれがある。一方、本実施形態では、蛍光の復調回路の数が１つであるため、従来技術と比較して復調回路の数を低減することができる。したがって、本実施形態では、従来技術と比較して、フローサイトメータの製造コストを低減することができる、という利点がある。
また、例えば、１つの復調回路に入力される参照信号に位相を所定時間毎に９０°ずつシフトさせてＲｅ成分とＩｍ成分とを時系列的に取得し、ｔａｎ−１（Ｉｍ／Ｒｅ）を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出する従来技術では、時系列的にＲｅ成分とＩｍ成分とを取得するための高速な演算処理が必要となるため、大型の演算処理回路を用いる必要がある。このため、この従来技術では、フローサイトメータのサイズが大型化するおそれがある。一方、本実施形態では、高速な演算処理を要しないため、大型の演算処理回路を設ける必要がない。したがって、本実施形態では、従来技術と比較して、フローサイトメータのサイズを小型化することができる、という利点がある。
以上、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態および変形例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
例えば、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を、蛍光顕微鏡に適用することも可能である。本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を蛍光顕微鏡に適用した場合、測定場における測定対象物の滞在時間を長くすることができるので、例えば、バイアス信号の位相変化の間隔を小さくすることにより、変調信号に対する蛍光の位相差の検出精度を向上させることができ、ひいては、蛍光の蛍光緩和時間の精度を向上させることができる。
例えば、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を、蛍光顕微鏡に適用することも可能である。本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を蛍光顕微鏡に適用した場合、測定場における測定対象物の滞在時間を長くすることができるので、例えば、バイアス信号の位相変化の間隔を小さくすることにより、変調信号に対する蛍光の位相差の検出精度を向上させることができ、ひいては、蛍光の蛍光緩和時間の精度を向上させることができる。
１０ フローセル
１２ 測定対象物
２０ レーザ光源部
３０ 第１受光部
４０ 第２受光部
４３ 光増幅器
４５ 位相シフタ
５０ 制御部
５１ 発振器
６０ 分析装置
６１ 位相差抽出部
６２ 蛍光緩和時間算出部
７０ 出力部
１２ 測定対象物
２０ レーザ光源部
３０ 第１受光部
４０ 第２受光部
４３ 光増幅器
４５ 位相シフタ
５０ 制御部
５１ 発振器
６０ 分析装置
６１ 位相差抽出部
６２ 蛍光緩和時間算出部
７０ 出力部
Claims (6)
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅する光増幅部と、前記光増幅部によって増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力する受光素子とを含む受光部と、
前記変調信号に対する前記バイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるための位相差変化部と、
前記第１位相差が前記位相差変化部によって変化する毎に前記蛍光の電気信号を前記受光部から取得することで、前記第１位相差のうち、取得した前記蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、前記第２位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する、
ことを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記処理部は、前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過する間に、前記第２位相差を求める、請求項１に記載の蛍光検出装置。
- 前記光増幅器は、前記第２位相差の情報を含む光信号を出力する、請求項１又は２に記載の蛍光検出装置。
- 前記位相差変化部は、前記第２位相差が前記処理部によって求められると、前記第１位相差を前記第２位相差に設定した後、別の測定対象物を用いて前記レーザ光源部、前記受光部および前記処理部を通して、前記別の測定対象物の蛍光緩和時間をもとめる、請求項１〜３の何れか１項に記載の蛍光検出装置。
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するステップと、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号をバイアス信号として用いて誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力するステップと、
前記変調信号に対する前記バイアス信号の位相差である第１位相差を変化させるステップと、
前記第１位相差が変化する毎に前記蛍光の電気信号を取得することで、前記第１位相差のうち、取得した前記蛍光の電気信号の直流成分を最大化するときの第２位相差を求め、前記第２位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップと、を有する、
ことを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップでは、前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過する間に、前記第２位相差を求める、請求項５に記載の蛍光検出方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106124468A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-16 | 浙江大学 | 一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08122057A (ja) * | 1994-10-27 | 1996-05-17 | Kubota Corp | 光学式測距装置 |
| JPH09329548A (ja) * | 1996-06-11 | 1997-12-22 | Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk | 蛍光寿命測定装置 |
-
2012
- 2012-03-26 JP JP2012070307A patent/JP2013200285A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08122057A (ja) * | 1994-10-27 | 1996-05-17 | Kubota Corp | 光学式測距装置 |
| JPH09329548A (ja) * | 1996-06-11 | 1997-12-22 | Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk | 蛍光寿命測定装置 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106124468A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-16 | 浙江大学 | 一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置 |
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