JP4579121B2 - 蛍光測定装置 - Google Patents
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Description
例えば、フローサイトメータでは、細胞、DNA、RNA、酵素、蛋白等の生体物質を含む混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒10m以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してフローセルを形成する。このフローセル中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定するものである。
このような蛍光検出装置では、測定対象物の発する蛍光を正確に短時間で計測して識別することが望まれている。
これにより、蛍光を正確に識別して複数の測定対象物の種類を短時間に特定することが可能となるとされている。
レーザ光の光強度を所定の変調周波数で時間変調するための変調信号を生成する発振器と、
レーザ光を、変調信号に従って時間変調して測定対象物に照射するレーザ光出射手段と、
レーザ光の照射により測定対象物から発した蛍光を受光して蛍光の受光信号に変換する受光手段と、
前記受光手段で得られた受光信号の位相情報を保持しながら、前記受光信号の周波数を一定量シフトしたシフト信号を生成し、このシフト信号と前記発振器で生成される前記所定の周波数の変調信号とを加えた合成信号を、レーザ光の変調信号として前記レーザ光出射手段に供給する信号処理手段と、
前記受光手段で得られた受光信号を、前記変調信号を用いて検波することにより、前記受光信号に含まれている位相情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める計測手段と、を有し、
前記計測手段は、前記レーザ光出射手段によるレーザ光の出射、前記受光手段による蛍光の受光、前記信号処理手段によるシフト信号の生成及び合成信号の前記レーザ光出射手段への供給の工程を複数回繰り返した後に得られる受光信号のうち、受光信号に含まれている周波数別の位相情報が合計された位相情報を有する周波数成分を用いて測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求めることを特徴とする蛍光測定装置を提供する。
また、前記信号処理手段は、前記受光信号の周波数が一定量シフトするSSB変調器を有することが好ましい。
装置10では、測定対象物Sにレーザ光を照射し、このときの測定対象物Sが発する蛍光を受光することにより取得される受光信号に含まれる位相情報を用いて、測定対象物Sが発する蛍光の蛍光緩和時定数を算出する装置である。
装置10は、測定対象物が発する蛍光の波長が近い場合でも蛍光の種類によって蛍光緩和時定数が異なることを利用して蛍光緩和時定数の違いから、蛍光の種類を特定することができる装置である。
コンピュータ14は、本体部12から出力される信号を用いてデータ処理を行う他、本体部12の各ユニットの駆動や駆動のタイミングを制御する制御部分でもある。
レーザ光出射ユニット20は、図2(a)に示すように、レーザ光を出射する部分であり、レーザダイオード22と、レーザダイオード22を駆動するレーザドライバ24と、レーザダイオード22に対応して設けられた光学レンズ28とを有する。
ここで周波数は、一定の初期周波数f0の初期変調信号に、後述する周波数f0+(m−1)・Δf(mは自然数)を含むシフト信号を加えた変調信号が順次レーザドライバ24に供給される。例えば、初期周波数f0=600MHzに対してΔf=1kHzである。
受光ユニット30は、図2(b)に示すように、測定対象物Sから到来した蛍光を受光する部分で、レーザ光の光路の上流側から順に、バンドパスフィルタ31、光学レンズ32及び光電変換器38が配置されている。
光学レンズ32は、バンドパスフィルタ31を透過した透過光を光電変換器38に集光するために用いられる。
なお、上記デバイスは用いるレーザ光によって適するデバイスが異なり、例えば近赤外(800〜1200μm)のレーザ光にはアバランシェフォトダイオードが、可視帯域(400μm〜800μm)のレーザ光にはアバランシェフォトダイオード又は光電子倍増管が好適に用いられる。
具体的には、信号処理回路ユニット40は、方向性結合器41、可変増幅器42、増幅器43、方向性結合器44、SSB変調器45、バンドパスフィルタ46及びIQミキサ47を有する。
可変増幅器42は、初期周波数f0の初期変調信号とシフト信号とを加えた合成信号を所定の増幅率で増幅し、レーザ光出射ユニット20に供給する。増幅された合成信号は、レーザ光出射ユニット20にてレーザ光の強度を時間変調する変調信号として用いられる。なお、可変増幅器42を用いるのは、後述するようにバンドパスフィルタ46で規定される信号の通過可能な周波数範囲で、受光信号及びシフト信号が減衰することのないように、増幅率を調整するためである。
増幅器43は、受光ユニット30から供給された受光信号を増幅して方向性結合器44に供給する。
方向性結合器44は、受光信号を分離してIQミキサ47に供給するとともに、SSB変調器45に供給する高周波素子である。
SSB変調器45は、90度ハイブリッド45a、ミキサ45b,45c、90度位相器45d、180度ハイブリッド45eを有して構成される。
90度ハイブリッド45aは、受光信号の位相を0度及び90度に分離するハイブリッドリングを備える高周波素子であり、0度及び90度に分離された受光信号をミキサ45b,45cに供給する。一方、90度位相器45dは、第2発振器63から供給された周波数Δfの信号を位相0度及び90度に変えてミキサ45b,45cに供給する。
180度ハイブリッド45eは、受光信号の位相を0度及び180度に分離するハイブリッドリングを備える高周波素子であり、端子の一方からは、受光信号の位相情報を保持したまま、周波数Δf高周波側にシフトさせたUSB信号を出力し、他方の端子からは、受光信号の位相情報を保持したまま、周波数Δf低周波側にシフトさせたLSB信号を出力する。
SSB変調器45では、USB信号を出力してバンドパスフィルタ46に供給する。
信号処理回路ユニット40は、後述するように、レーザ光の測定対象物が発する蛍光が有する位相情報を保持したまま、周波数をΔfシフトさせたシフト信号を含む信号をレーザ光の変調信号として用いる一方、バンドパスフィルタ46は所定の周波数範囲のシフト信号のみを通過させる。このため、バンドパスフィルタ46から出力され、方向性結合器41に供給されるシフト信号の周波数成分は、バンドパスフィルタ46が規定する所定の周波数範囲の成分である。可変増幅器42は、信号処理回路ユニット40及びレーザ光の照射、蛍光及び受光の系における信号成分のエネルギの散逸に対して減衰せず、また増幅率を過大に設定して信号が発散することのないように適切に調整されて用いられる。このため、初期周波数f0の初期変調信号をレーザ光出射ユニット20に供給した時点から時間が経過して、バンドパスフィルタ46の規定する所定の周波数範囲内の周波数成分で満たされた安定したときの受光信号は、図4に示すように初期周波数f0〜fn-1(=f0+(n−1)・Δf)の周波数範囲内で振幅を有する信号となる。
第1発振器61は、初期周波数f0の信号を発振し、パワースプリッタ62にて信号を分離して方向性結合器41及びIQミキサ47に供給する。
第2発振器63は、受光ユニット30から供給された蛍光の受光信号の周波数をΔfシフトさせるために、周波数Δfの信号を生成し、SSB変調器45に供給する。
制御処理回路ユニット50は、システム制御器51、ローパスフィルタ52、増幅器53及びA/D変換器54を有する。
ローパスフィルタ52は、信号処理回路ユニット40から出力された中間周波数信号(IF信号)と高次成分を含んだ信号をフィルタ処理して高次成分を除去し、蛍光の位相情報を含んだ中間周波数信号とする部分である。中間周波数信号は、増幅器53で増幅された後、A/D変換器54で中間周波数デジタル信号とされ、コンピュータ14に供給される。A/D変換器54は、第2発信器63の発振する周波数Δfと同期したその整数倍のクロック周波数を用いてAD変換を行い、中間周波数デジタル信号を生成する部分である。
コンピュータ14のCPUは、本体部12の各ユニットを駆動、制御する各種信号を制御処理回路ユニット50に作成するように指示し、またソフトウェアを実行することにより後述するデータ処理の演算を行う部分である。
コンピュータ114は、中間周波数デジタル信号に含まれている周波数別の位相情報を得、この周波数別の位相情報から、測定対象物Sの発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める。
このように、測定対象物Sの蛍光緩和時定数τを知ることができるので、この値から、通過した測定対象物Sの蛍光の種類を特定することができる。
12 本体部
14 コンピュータ
20 レーザ光出射ユニット
22 レーザダイオード
24 レーザドライバ
28,32 光学レンズ
30,130 受光ユニット
31 バンドパスフィルタ
38 光電変換器
40 信号処理回路ユニット
41,44 方向性結合器
42 可変増幅器
43,53 増幅器
45 SSB変調器
46 バンドパスフィルタ
47 IQミキサ
50 制御処理回路ユニット
51 システム制御器
52 ローパスフィルタ
54 A/D変換器
61 第1発振器
62 パワースプリッタ
63 第2発振器
Claims (4)
- レーザ光を測定対象物に照射し測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光の蛍光緩和時定数を取得する蛍光測定装置であって、
レーザ光の光強度を所定の変調周波数で時間変調するための変調信号を生成する発振器と、
レーザ光を、変調信号に従って時間変調して測定対象物に照射するレーザ光出射手段と、
レーザ光の照射により測定対象物から発した蛍光を受光して蛍光の受光信号に変換する受光手段と、
前記受光手段で得られた受光信号の位相情報を保持しながら、前記受光信号の周波数を一定量シフトしたシフト信号を生成し、このシフト信号と前記発振器で生成される前記所定の周波数の変調信号とを加えた合成信号を、レーザ光の変調信号として前記レーザ光出射手段に供給する信号処理手段と、
前記受光手段で得られた受光信号を、前記変調信号を用いて検波することにより、前記受光信号に含まれている位相情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める計測手段と、を有し、
前記計測手段は、前記レーザ光出射手段によるレーザ光の出射、前記受光手段による蛍光の受光、前記信号処理手段によるシフト信号の生成及び合成信号の前記レーザ光出射手段への供給の工程を複数回繰り返した後に得られる受光信号のうち、受光信号に含まれている周波数別の位相情報が合計された位相情報を有する周波数成分を用いて測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求めることを特徴とする蛍光測定装置。 - 前記信号処理手段は、前記シフト信号が所定の周波数範囲内に収まるように前記周波数範囲外の信号成分を除去し、前記周波数範囲内の信号成分を透過させるバンドパスフィルタを有する請求項1に記載の蛍光測定装置。
- 前記信号処理手段は、前記受光信号の周波数が一定量シフトするSSB変調器を有する請求項1又は2に記載の蛍光測定装置。
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