JP4980490B2 - 蛍光測定装置及び蛍光測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置、蛍光測定方法に関する。
測定対象物にレーザ光を照射し、測定対象物が発する蛍光を受光して、測定対象物の情報を取得する蛍光測定装置が知られている。
蛍光測定装置を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素は蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を測定することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
蛍光測定装置を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素は蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を測定することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
また、レーザ光を測定対象物に照射し測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光緩和時定数を取得する蛍光測定装置が知られている（特許文献１）。
測定対象物が発する蛍光を受光する蛍光測定装置が、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する場合、測定される蛍光のデータには、ある程度の分散がある。蛍光緩和時間などをより高い精度で測定するために、測定される蛍光のデータの分散を低減することができる蛍光測定装置が求められている。
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光の測定精度を従来よりも高めることができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供することを目的とする。
本発明の蛍光測定装置は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、所定の周波数で強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの散乱光を受光する第１受光部と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する第２受光部と、第１受光部が受光した前記散乱光の強度の時間変化に応じて、第２受光部が受光した前記蛍光の信号の時間変化に対して重み付けを行い、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、蛍光寿命を求める信号処理部と、を備え、前記信号処理部で重み付けされる前記蛍光の信号は、前記蛍光のうち前記変調信号と同相の成分を含む同相信号と、前記蛍光のうち前記変調信号に対して９０度位相シフトした成分を含む９０度位相シフト信号とを含み、前記重み付けは、前記散乱光の強度が大きい程、大きな重みが前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号に付されるように行われ、重み付けされた前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号を１つの組としたとき、複数の組を用いて前記位相差が１つ求められる、ことを特徴とする。
また、前記信号処理部は、第１受光部が受光した前記散乱光の強度の時間変化を規格化し、規格化された前記散乱光の強度の時間変化を、第２受光部が受光した前記蛍光の信号の時間変化に乗じることが好ましい。
本発明の蛍光測定方法は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、所定の周波数で強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの散乱光を受光する第１受光工程と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する第２受光工程と、第１受光工程で受光された前記散乱光の強度の時間変化に応じて、第２受光工程で受光された前記蛍光の信号の時間変化に対して重み付けを行い、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、を有し、前記信号処理工程で重み付けされる前記蛍光の信号は、前記蛍光のうち前記変調信号と同相の成分を含む同相信号と、前記蛍光のうち前記変調信号に対して９０度位相シフトした成分を含む９０度位相シフト信号とを含み、前記重み付けは、前記散乱光の強度が大きい程、大きな重みが前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号に付されるように行われ、重み付けされた前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号を１つの組としたとき、複数の組を用いて前記位相差が１つ求められる、ことを特徴とする。
また、前記信号処理工程は、第１受光工程で受光された前記散乱光の強度の時間変化を規格化し、規格化された前記散乱光の強度の時間変化を、第２受光工程で受光された前記蛍光の信号の時間変化に乗じることが好ましい。
本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法によれば、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光の測定精度を従来よりも高めることができる。
以下、本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法を適用したフローサイトメータについて、実施形態に基づいて説明する。
＜実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
図１に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源２０と、第１受光部３０と、第２受光部３２と、制御部４０と、信号処理部５０と、出力部７０と、を備える。以下、各構成について詳細に説明する。
＜実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
図１に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源２０と、第１受光部３０と、第２受光部３２と、制御部４０と、信号処理部５０と、出力部７０と、を備える。以下、各構成について詳細に説明する。
細胞１２などの測定対象物は、シース液に囲まれてフローセル１０の内部を流れる。後述するように、レーザ光源２０が測定対象物にレーザ光を照射し、その際に発せられる蛍光から測定対象物の情報を取得するため、細胞１２には、予め蛍光色素１４が付与されている。蛍光色素１４は、例えば、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）などが用いられる。フローセル１０の内部では、シース液に囲まれた測定対象物は流体力学的絞り込みを受け、細い液流となってフローセル１０の内部を流れる。
レーザ光源２０は、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射する。レーザ光源２０は、例えば、半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力は、例えば、５〜１００ｍＷである。レーザ光の波長は、例えば、３５０ｎｍ〜８００ｎｍである。
レーザ光源２０が照射するレーザ光の強度は、後述する制御部４０から出力される変調信号によって変調される。
レーザ光源２０が照射するレーザ光の強度は、後述する制御部４０から出力される変調信号によって変調される。
第１受光部３０は、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光源２０と反対側に配置される。第１受光部３０は、測定対象物にレーザ光が照射されたときに生じる前方散乱光を受光する。第１受光部３０は、例えば、フォトダイオードなどの光電変換器を備える。第１受光部３０は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第１受光部３０によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
第１受光部３０によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
第２受光部３２は、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光源２０からレーザ光が照射される方向とフローセル１０内を測定対象物が流れる方向の相互に垂直な方向に配置される。第２受光部３２は、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を受光する。第２受光部３２は、例えば、光電子倍増管などの光電変換器を備える。第２受光部３２は、受光した蛍光を電気信号（蛍光信号）に変換する。
第２受光部３２によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を通過する測定対象物の情報として用いられる。
第２受光部３２によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を通過する測定対象物の情報として用いられる。
次に、制御部４０について説明する。制御部４０は、レーザ光源２０が照射するレーザ光の変調周波数を制御する。ここで、図２を参照して、制御部４０の構成について説明する。図２は、制御部４０の一例を示す図である。図２に示されるように、制御部４０は、発振器４２と、パワースプリッタ４４と、アンプ４６，４８と、を備える。
発振器４２は、所定の周波数の正弦波信号を出力する。発振器４２から出力される正弦波信号は、レーザ光源２０から出力されるレーザ光の強度を変調するための変調信号として用いられる。正弦波信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚである。
発振器４２から出力された所定の周波数の正弦波信号（変調信号）は、パワースプリッタ４４により、２つのアンプ４６，４８に分配される。アンプ４６で増幅された変調信号は、レーザ光源２０へ出力される。また、アンプ４８で増幅された変調信号は、信号処理部５０へ出力される。アンプ４８で増幅された変調信号を信号処理部５０へ出力するのは、後述するように、第２受光部３２から出力される信号を検波するための参照信号として用いるためである。
発振器４２から出力された所定の周波数の正弦波信号（変調信号）は、パワースプリッタ４４により、２つのアンプ４６，４８に分配される。アンプ４６で増幅された変調信号は、レーザ光源２０へ出力される。また、アンプ４８で増幅された変調信号は、信号処理部５０へ出力される。アンプ４８で増幅された変調信号を信号処理部５０へ出力するのは、後述するように、第２受光部３２から出力される信号を検波するための参照信号として用いるためである。
次に、信号処理部５０について説明する。信号処理部５０は、第１受光部３０が受光した前方散乱光の強度に応じて、第２受光部３２が受光した蛍光の信号に重み付けを行う。また、信号処理部５０は、レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光部３２が受光した蛍光の信号との位相差に基づいて、蛍光寿命を求める。ここで、図３を参照して、信号処理部５０の構成について説明する。図３は、信号処理部５０の一例を示す図である。図３に示されるように、信号処理部５０は、ＩＱミキサ５２と、アンプ５４と、ローパスフィルタ５６と、Ａ／Ｄ変換器５８と、演算部６０と、を備える。
ＩＱミキサ５２は、アンプ５４によって増幅された、第２受光部３２から出力された蛍光信号の入力を受ける。また、ＩＱミキサ５２は、制御部４０のアンプ４８から出力された参照信号の入力を受ける。
ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。また、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。この信号に基づいて、変調信号（参照信号）と蛍光信号との位相差を求めることができる。
ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。また、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。この信号に基づいて、変調信号（参照信号）と蛍光信号との位相差を求めることができる。
ＩＱミキサ５２によって生成された信号の高周波成分は、ローパスフィルタ５６によって除去される。ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された信号は、Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号（後述するｃｏｓθ、ｓｉｎθ）に変換される。また、第１受光部３０から出力された前方散乱光の信号は、Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号に変換される。
Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号に変換された信号は、演算部６０へ出力される。
Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号に変換された信号は、演算部６０へ出力される。
演算部６０は、第１受光部３０が受光した前方散乱光の強度に応じて、第２受光部３２が受光した蛍光の信号（蛍光信号）に重み付けを行う。また、演算部６０は、第１受光部３０が受光した前方散乱光の強度を規格化し、規格化された前方散乱光の強度を蛍光信号に乗じる。また、演算部６０は、Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号に変換された信号を用いて、蛍光寿命を求める。演算部６０が行う詳細な処理については、後述する。演算部６０が演算した結果は、出力部７０へ出力される。
図１に戻り、出力部７０は、信号処理部５０によって求められた情報を出力する。出力部７０は、例えば、表示装置やプリンタである。出力部７０は、例えば、信号処理部５０によって求められた蛍光寿命を出力する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
（信号処理の流れ）
次に、信号処理部５０による信号処理の流れを説明する。
まず、レーザ光の強度を変調するための変調信号が、制御部４０から信号処理部５０へ参照信号として出力される。信号処理部５０に入力される参照信号の時間変化の一例を図４（ａ）に示す。図４（ａ）に示される例の参照信号は、所定の周波数の正弦波信号である。
次に、信号処理部５０による信号処理の流れを説明する。
まず、レーザ光の強度を変調するための変調信号が、制御部４０から信号処理部５０へ参照信号として出力される。信号処理部５０に入力される参照信号の時間変化の一例を図４（ａ）に示す。図４（ａ）に示される例の参照信号は、所定の周波数の正弦波信号である。
また、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を第２受光部３２が受光する。第２受光部３２から出力される蛍光信号の時間変化の一例を図４（ｂ）に示す。参照信号に対して蛍光信号には位相差θが生じる。ここで、変調信号の角周波数をω、測定対象物の蛍光寿命をτとすると、以下の式（１）により、位相差θから蛍光寿命τを求めることができる。
また、図４（ｂ）に示されるように、蛍光信号の振幅は一定ではない。蛍光信号の振幅が変化することについて、図５を参照して説明する。図５は、フローセル１０にレーザ光が照射される領域を細胞１２などの測定対象物が通過する様子を示す図である。図５（ａ）は、レーザ光が照射される領域に測定対象物が入り始める瞬間を示す図である。図５（ｂ）は、測定対象物が完全にレーザ光に照射される瞬間を示す図である。図５（ｃ）は、レーザ光が照射される領域から測定対象物が出始める瞬間を示す図である。
図５（ａ）〜（ｃ）のいずれの瞬間においても、測定対象物にレーザ光が照射されることにより蛍光が発せられるが、その蛍光の強度は一定ではない。具体的には、図５（ｂ）の瞬間に発せられる蛍光の強度は、図５（ａ），（ｃ）の瞬間に発せられる蛍光の強度よりも強い。そのため、図４（ｂ）に示されるように、蛍光信号の振幅は時間的に変化する。
図５（ａ）〜（ｃ）のいずれの瞬間においても、測定対象物にレーザ光が照射されることにより蛍光が発せられるが、その蛍光の強度は一定ではない。具体的には、図５（ｂ）の瞬間に発せられる蛍光の強度は、図５（ａ），（ｃ）の瞬間に発せられる蛍光の強度よりも強い。そのため、図４（ｂ）に示されるように、蛍光信号の振幅は時間的に変化する。
また、測定対象物にレーザ光が照射されたときに生じる前方散乱光を第１受光部３０が受光する。第１受光部３０が受光する前方散乱光の強度の時間変化の一例を図６に示す。フローセル１０にレーザ光が照射される領域を測定対象物が１つ通過すると、前方散乱光のピークが１つ測定される。前方散乱光の強度が最大となる瞬間は、前述した図５（ｂ）の瞬間に相当する。前方散乱光の信号はＡ／Ｄ変換器５８でデジタル信号に変換され、演算部６０に入力される。
なお、上述したように、正弦波信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚである。また、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するのに要する時間は、２０μ秒程度である。そのため、図４に示される信号には、実際には１つの測定対象物が通過する間に、２０〜１０００周期程度の信号が含まれる。図４においては、説明の便宜上、実際よりも低い周波数の信号を用いて説明を行っている。
ＩＱミキサ５２は、図４（ｂ）に示される蛍光信号と図４（ａ）に示される参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された蛍光信号のｃｏｓ成分の一例を図７（ａ）に示す。
また、ＩＱミキサ５２は、図４（ｂ）に示される蛍光信号と、図４（ａ）に示される参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された蛍光信号のｓｉｎ成分の一例を図７（ｂ）に示す。
また、ＩＱミキサ５２は、図４（ｂ）に示される蛍光信号と、図４（ａ）に示される参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された蛍光信号のｓｉｎ成分の一例を図７（ｂ）に示す。
本実施形態の演算部６０は、図６に示される前方散乱光の強度に応じて、図７（ａ），（ｂ）に示される蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の各々の信号に重み付けを行う。具体的には、演算部６０は、図６に示される前方散乱光の強度の最大値が１となるように前方散乱光の強度を規格化し、規格化された前方散乱光の強度を図７（ａ），（ｂ）に示される蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の各々の信号に乗じる。規格化された前方散乱光の強度を、図７（ａ），（ｂ）に示される蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に乗じた結果を、図８（ａ），（ｂ）に示す。図８（ａ），（ｂ）に示されるように、前方散乱光の強度が小さい部分の蛍光信号の値は、図７（ａ），（ｂ）に示される値よりも小さくなる。
図５（ｂ）のように蛍光の強度が強い瞬間に発せられる蛍光には、図５（ａ），（ｃ）のように蛍光の強度が弱い瞬間に発せられる蛍光よりも精度の高い情報が含まれているためである。そのため、規格化された前方散乱光の強度を蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に乗じることにより、精度の高い情報を用いて、位相差θを求めることができる。
図５（ｂ）のように蛍光の強度が強い瞬間に発せられる蛍光には、図５（ａ），（ｃ）のように蛍光の強度が弱い瞬間に発せられる蛍光よりも精度の高い情報が含まれているためである。そのため、規格化された前方散乱光の強度を蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に乗じることにより、精度の高い情報を用いて、位相差θを求めることができる。
その後、演算部６０は、図８（ａ），（ｂ）に示される蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分のそれぞれの時間平均を算出する。時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図９に示される図にプロットされる。１つの測定対象物に対して上述した信号処理を行うことにより、図９に示される図のプロットが１つなされる。
演算部６０は、複数の測定対象物に対して、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分をプロットする。また、演算部６０は、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の複数のプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差を求める。例えば、図９に示される複数のプロットを、原点を通る直線で近似した直線の傾きから、演算部６０は参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求めることができる。
演算部６０は、複数の測定対象物に対して、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分をプロットする。また、演算部６０は、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の複数のプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差を求める。例えば、図９に示される複数のプロットを、原点を通る直線で近似した直線の傾きから、演算部６０は参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求めることができる。
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定装置、蛍光測定方法では、前方散乱光の強度に応じて、精度の高い情報が含まれている蛍光信号により大きな重み付けを行うように、蛍光信号に重み付けを行う。そのため、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光の測定精度を高めることができる。
特に、本実施形態の蛍光測定装置、蛍光測定方法では、測定対象物の各々に対して、前方散乱光の強度に応じて、蛍光信号に重み付けを行う。そのため、測定対象物の大きさが一定でないような場合であっても、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光の測定精度を高めることができる。
特に、本実施形態の蛍光測定装置、蛍光測定方法では、測定対象物の各々に対して、前方散乱光の強度に応じて、蛍光信号に重み付けを行う。そのため、測定対象物の大きさが一定でないような場合であっても、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光の測定精度を高めることができる。
（比較例）
以下、上述した実施形態の効果を示すため、比較例について説明する。
本比較例のフローサイトメータの構成は、上述した実施形態とほぼ同様である。本比較例のフローサイトメータは、信号処理部５０の構成が実施形態とは異なる。以下、本比較例の信号処理部５０について説明する。
図１０は、本比較例の信号処理部５０の一例を示す図である。図１０に示されるように、本比較例の信号処理部５０は、ＩＱミキサ５２と、アンプ５４と、ローパスフィルタ５６と、Ａ／Ｄ変換器５８と、演算部６０と、を備える。
以下、上述した実施形態の効果を示すため、比較例について説明する。
本比較例のフローサイトメータの構成は、上述した実施形態とほぼ同様である。本比較例のフローサイトメータは、信号処理部５０の構成が実施形態とは異なる。以下、本比較例の信号処理部５０について説明する。
図１０は、本比較例の信号処理部５０の一例を示す図である。図１０に示されるように、本比較例の信号処理部５０は、ＩＱミキサ５２と、アンプ５４と、ローパスフィルタ５６と、Ａ／Ｄ変換器５８と、演算部６０と、を備える。
ＩＱミキサ５２、アンプ５４、ローパスフィルタ５６、Ａ／Ｄ変換器５８の構成は上述した実施形態と同様であるため、説明を省略する。本比較例では、第１受光部３０から出力された前方散乱光の信号が信号処理部５０に入力されない点が、実施形態と異なる。
以下、本比較例の信号処理部５０による信号処理の流れを説明する。
以下、本比較例の信号処理部５０による信号処理の流れを説明する。
図４（ａ）を参照して説明したように、レーザ光の強度を変調するための変調信号が、制御部４０から信号処理部５０へ参照信号として出力される。また、図４（ｂ）を参照して説明したように、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を第２受光部３２が受光する。
ＩＱミキサ５２は、図４（ｂ）に示される蛍光信号と図４（ａ）に示される参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、図７（ａ）を参照して説明したように、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された蛍光信号のｃｏｓ成分が得られる。
また、ＩＱミキサ５２は、図４（ｂ）に示される蛍光信号と、図４（ａ）に示される参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、図７（ｂ）を参照して説明したように、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された蛍光信号のｓｉｎ成分が得られる。
また、ＩＱミキサ５２は、図４（ｂ）に示される蛍光信号と、図４（ａ）に示される参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、図７（ｂ）を参照して説明したように、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された蛍光信号のｓｉｎ成分が得られる。
本比較例の演算部６０は、図７（ａ），（ｂ）に示される蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分のそれぞれの時間平均を算出する。時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図１１に示される図にプロットされる。また、演算部６０は、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の複数のプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差を求める。
上述した実施形態から得られる図９と本比較例から得られる図１１とを比較すれば明らかなように、実施形態のプロットは本比較例のプロットと比較して、分散が小さい。例えば、図９に示されるプロットの位相差θの分散から求めた標準偏差は０．７１［ｒａｄ］であるのに対し、図１１に示されるプロットの位相差θの分散から求めた標準偏差は０．７９［ｒａｄ］である。これは、実施形態の蛍光測定装置、蛍光測定方法では、前方散乱光の強度に応じて、精度の高い情報が含まれている蛍光信号により大きな重み付けを行うように、蛍光信号に重み付けを行ったためである。そのため、実施形態の蛍光測定装置、蛍光測定方法によれば、蛍光寿命をより高い精度で測定することができる。
以上、本発明の蛍光測定装置及び蛍光測定方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。また、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
１０ フローセル
１２ 細胞
１４ 蛍光色素
１６ 容器
２０ レーザ光源
３０ 第１受光部
３２ 第２受光部
４０ 制御部
４２ 発振器
４４ パワースプリッタ
４６，４８ アンプ
５０ 信号処理部
５２ ＩＱミキサ
５４ アンプ
５６ ローパスフィルタ
５８ Ａ／Ｄ変換器
６０ 演算部
７０ 出力部
１２ 細胞
１４ 蛍光色素
１６ 容器
２０ レーザ光源
３０ 第１受光部
３２ 第２受光部
４０ 制御部
４２ 発振器
４４ パワースプリッタ
４６，４８ アンプ
５０ 信号処理部
５２ ＩＱミキサ
５４ アンプ
５６ ローパスフィルタ
５８ Ａ／Ｄ変換器
６０ 演算部
７０ 出力部
Claims (4)
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、
所定の周波数で強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの散乱光を受光する第１受光部と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する第２受光部と、
第１受光部が受光した前記散乱光の強度の時間変化に応じて、第２受光部が受光した前記蛍光の信号の時間変化に対して重み付けを行い、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、蛍光寿命を求める信号処理部と、を備え、
前記信号処理部で重み付けされる前記蛍光の信号は、前記蛍光のうち前記変調信号と同相の成分を含む同相信号と、前記蛍光のうち前記変調信号に対して９０度位相シフトした成分を含む９０度位相シフト信号とを含み、前記重み付けは、前記散乱光の強度が大きい程、大きな重みが前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号に付されるように行われ、重み付けされた前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号を１つの組としたとき、複数の組を用いて前記位相差が１つ求められる、
ことを特徴とする蛍光測定装置。 - 前記信号処理部は、第１受光部が受光した前記散乱光の強度の時間変化を規格化し、規格化された前記散乱光の強度の時間変化を、第２受光部が受光した前記蛍光の信号の時間変化に乗じる、請求項１に記載の蛍光測定装置。
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、
所定の周波数で強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの散乱光を受光する第１受光工程と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する第２受光工程と、
第１受光工程で受光された前記散乱光の強度の時間変化に応じて、第２受光工程で受光された前記蛍光の信号の時間変化に対して重み付けを行い、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、を有し、
前記信号処理工程で重み付けされる前記蛍光の信号は、前記蛍光のうち前記変調信号と同相の成分を含む同相信号と、前記蛍光のうち前記変調信号に対して９０度位相シフトした成分を含む９０度位相シフト信号とを含み、前記重み付けは、前記散乱光の強度が大きい程、大きな重みが前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号に付されるように行われ、重み付けされた前記同相信号及び前記９０度位相シフト信号を１つの組としたとき、複数の組を用いて前記位相差が１つ求められる、
ことを特徴とする蛍光測定方法。 - 前記信号処理工程は、
第１受光工程で受光された前記散乱光の強度の時間変化を規格化し、
規格化された前記散乱光の強度の時間変化を、第２受光工程で受光された前記蛍光の信号の時間変化に乗じる、請求項３に記載の蛍光測定方法。
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