WO2023033198A1 - 형광수명 측정 장치 및 방법 - Google Patents

형광수명 측정 장치 및 방법 Download PDF

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WO2023033198A1
WO2023033198A1 PCT/KR2021/011658 KR2021011658W WO2023033198A1 WO 2023033198 A1 WO2023033198 A1 WO 2023033198A1 KR 2021011658 W KR2021011658 W KR 2021011658W WO 2023033198 A1 WO2023033198 A1 WO 2023033198A1
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WO
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signal
fluorescence lifetime
excitation light
fluorescence
time
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/011658
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English (en)
French (fr)
Inventor
원영재
김민아
Original Assignee
주식회사 인텍메디
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes

Definitions

  • the embodiment relates to a device and method for measuring fluorescence lifetime.
  • Molecules absorb incident light by electronic transition, and in some molecules, excited electrons recover to the ground state, causing a fluorescence phenomenon that emits light.
  • each molecule has a unique absorption wavelength and fluorescence emission wavelength, and there is a difference in wavelength of several tens of nanometers, also called Stoke's shift, between them. That is, light having a slightly longer wavelength than the wavelength of the absorbed light is emitted through the fluorescence phenomenon.
  • Fluorescent materials can be characterized by absorption and emission wavelengths of light, and these characteristics are the principles of classical fluorescence microscopy.
  • excitation light of a wavelength to be absorbed by a target fluorescent substance is irradiated to a sample, and a film or CCD (Charge- An image is obtained by detecting using a first detector (photo-detector) in an array form such as a coupled device.
  • a first detector photo-detector
  • images are obtained mainly by either the sample itself contains molecules with specific fluorescence (autofluorescence) or by injecting a phosphor from the outside and labeling a specific area, mainly biological samples such as cells. It is used when studying the molecular distribution of Recently, a confocal microscope, a multi-photon excitation fluorescence microscope, and the like are being developed to obtain a three-dimensional image.
  • the transition probability of electrons in time that is, the generation probability of fluorescent photons, draws an exponential decay curve with the point at which electron excitation takes place.
  • the fluorescence lifetime is a characteristic value of each fluorescent molecule if there is no external interference, but the fluorescence lifetime may change depending on the surrounding environment in which the fluorescent material is placed. That is, the value is changed by the concentration of a specific ion, the concentration of oxygen, acidity (pH), etc. according to the characteristics of each fluorescent substance. Therefore, a fluorescence lifetime imaging microscope (hereinafter referred to as FLIM) is being developed to investigate the spatial distribution of the above variables through information on the fluorescence lifetime.
  • FLIM fluorescence lifetime imaging microscope
  • This fluorescence lifetime imaging microscope has the strength of being able to accurately obtain environmental information that could not be obtained or was inaccurate through conventional fluorescence microscopes.
  • confocal FLIM combined with a confocal microscopy method can obtain information based on the fluorescence lifetime with a three-dimensional resolution, enabling so-called “four-dimensional imaging”.
  • a measurement is performed at a point in space every moment, and image information is sequentially obtained by scanning the measurement point.
  • measurements are made at the focus of the objective lens of the microscope, which is spatially scanned by the direction of the beam incident on the objective lens or the movement of the sample itself.
  • a spatial filter such as a pinhole is provided so that only light re-incident from the focal point to the objective lens reaches the first sensing unit.
  • multiphoton excitation fluorescence microscopy the same effect can be obtained without a pinhole, thanks to the fact that multiphoton excitation is a nonlinear optical phenomenon and effectively occurs only at the focal point with high light intensity.
  • FLIM's fluorescence lifetime measuring instrument based on confocal microscopy is not very different from the fluorescence lifetime measuring instrument of time-resolved spectroscopy.
  • fluorescence lifetime measurement mainly uses time-correlated single photon counting (TCSPC) or phase fluorometer.
  • the measurement of the fluorescence lifetime may be performed on a plurality of photons generated by a plurality of fluorescent molecules having the same fluorescence lifetime or a plurality of photons generated by a plurality of excitations of a single fluorescent molecule.
  • this is the process of analyzing a fluorescence waveform with an exponential decay shape on the time axis. If near-infinite fluorescence photons are collected, the resulting fluorescence waveform will be identical to the probability distribution function of fluorescence with an exponential decay shape.
  • I0 is an initial value
  • ⁇ means fluorescence lifetime
  • u(t) function represents a step function that is 0 when t ⁇ 0 and 1 when t ⁇ 0. That is, the fluorescence lifetime means a time during which the emission probability of a fluorescence photon decreases by 1/e compared to an initial value.
  • the TCSPC detects a response by a single photon using a first detector having a high signal gain such as a PMT or an avalanche photo diode (APD).
  • a first detector having a high signal gain such as a PMT or an avalanche photo diode (APD).
  • the arrival time of a single photon can be precisely measured regardless of how long the shape of the response pulse by the single photon is on the time axis. Using this, it is possible to measure the fluorescence lifetime at the level of 0.1 nanoseconds.
  • the embodiment provides a fluorescence lifetime measuring device and method capable of accurately measuring fluorescence lifetime, which is an inherent optical characteristic of a fluorescent material, in a faster time.
  • a fluorescence lifetime measuring device and method suitable for a fluorescence lifetime imaging microscope that constructs an image based on the spatial distribution of the measured fluorescence lifetime is provided.
  • a fluorescence lifetime measuring device includes a light generating unit generating excitation light irradiated on a sample; a collection unit including a first detector configured to receive fluorescence photons generated by irradiation of the excitation light on the sample and converting them into a first signal; and a second detector configured to receive and convert the fluorescent photons into a second signal by receiving the excitation light; and a signal processing unit configured to calculate a fluorescence lifetime using the first signal and the second signal, wherein the signal processing unit compensates for a response characteristic of the first sensing unit and a response characteristic of the second sensing unit to determine the fluorescence lifetime.
  • the signal processing unit may convert a time difference between a response characteristic of the first sensing unit and a response characteristic of the second sensing unit into a predetermined value.
  • the signal processing unit may be performed by Equation 1 below.
  • CV is a compensation value
  • E 1 [E] + E 1 [P] is the response characteristics of the excitation light source and the first sensing unit
  • E 2 [E] + E 2 [P] is the excitation light source and the second sensor. It is the response characteristic of the sensing part
  • E 1 [E] + E 1 [P] and E 2 [E] + E 2 [P] are obtained by substituting the unique fluorescence lifetime of a specific sample.
  • the signal processing unit may calculate the fluorescence lifetime using a difference between an average time of the first signal and an average time of the second signal.
  • the signal processing unit may calculate the fluorescence lifetime using a phase of the first signal in the frequency domain and a phase of the second signal in the frequency domain.
  • It may further include a signal measurer for measuring the first signal and the second signal.
  • the signal measurer may measure the first signal and the second signal at the same timing.
  • the singi second signal may not pass through the sample.
  • the light generating unit may include a light source generating the excitation light; and a first lens condensing the generated excitation light to irradiate the sample.
  • the collecting unit may include a splitter dividing a path of the excitation light; a second lens that collects the fluorescence photons; and a filter preventing the excitation light from moving to the first detector.
  • a fluorescence lifetime measurement device and method suitable for a fluorescence lifetime imaging microscope or the like can be implemented.
  • FIG. 1 is a block diagram of a fluorescence lifetime measuring device according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph explaining the measurement of fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the function of a signal processing unit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating received signals of a first detection unit and a second detection unit according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a diagram illustrating received signals of a first detection unit and a second detection unit according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of a fluorescence lifetime measuring device according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a flowchart of a method for measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a flowchart of a fluorescence lifetime measurement method according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a block diagram of a fluorescence lifetime measuring device according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a graph illustrating measurement of fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a signal according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram for explaining the function of the processing unit
  • Figure 4 is a diagram explaining the received signal of the first detection unit and the second detection unit according to an embodiment of the present invention
  • Figure 5 is a first detection according to another embodiment of the present invention It is a diagram explaining the received signal of the unit and the second sensing unit.
  • an apparatus for measuring fluorescence lifetime may include a light generating unit 100 , a collecting unit 200 , a signal processing unit 300 and a signal measuring unit 400 .
  • the light generating unit 100 is a module that generates excitation light to be irradiated to the sample S containing fluorescent molecules, and collects the excitation light source 110 that generates excitation light in the form of a pulse and collects the generated excitation light. It consists of a first lens 120 for irradiating the sample (S).
  • the collection unit 200 may collect a plurality of fluorescence photons and excitation light generated by radiating excitation light to the sample S.
  • the collection unit 200 may include a first detection unit 210 and a second detection unit 220 .
  • the first detector 210 may receive fluorescence photons generated by irradiating excitation light onto a sample and convert the received fluorescence photons into a first signal, which is an electrical signal.
  • the first detector 210 may convert fluorescence photons collected by the second lens 230 to be described later and passed through the filter 240 into electrical signals (corresponding to the first signal). At this time, the magnification (eg, amplification) of the signal may be adjusted.
  • a photo-multiplier tube (PMT) or an avalanche photo diode (APD) may be used as the first detector 210 .
  • the second detector 220 may convert the excitation light that has not passed through the sample into a second signal that is an electrical signal. Like the first detector 210, the second detector 220 may adjust the magnification of the signal. And, the second detector 220 may be formed of, for example, a photo-multiplier tube (PMT) or an avalanche photo diode (APD).
  • PMT photo-multiplier tube
  • APD avalanche photo diode
  • the collection unit 200 may further include a second lens 230, a filter 240, and a splitter SP.
  • the second lens 230 may collect fluorescence photons from the sample S.
  • the filter 240 may remove the excitation light.
  • the splitter SP may include a mirror and may split an optical path of the excitation light into a first path and a second path.
  • the signal processing unit 300 may calculate the fluorescence lifetime using the first and second signals converted by the first sensing unit 210 and the second sensing unit 220 .
  • the fluorescence lifetime measuring device may further include a signal measuring unit 400 that measures electrical signals converted by the first sensing unit 210 and the second sensing unit 220 at a front end of the signal processing unit 300.
  • the signal measurement unit 400 may be located inside/outside the signal processing unit 300 .
  • an oscilloscope may be used as the signal measurer 400 .
  • the signal processing unit 300 may calculate the fluorescence lifetime using a difference between the average time of the first signal and the average time of the second signal measured by the signal measurement unit 400 .
  • the first signal corresponds to I M (t)
  • the average time of I M (t) corresponds to the average delay time described below
  • the second signal corresponds to the device response function I IRF '(t) described below and I
  • the average time of IRF '(t) corresponds to the device delay time described later.
  • the first signal may also have a device delay time of I IRF (t).
  • since the first sensing unit 210 and the second sensing unit 220 are different components and have different response characteristics, device response functions are also different. In other words, the device response function I IRF (t) of the first sensing unit 210 and the device response function I IRF '(t) of the second sensing unit 220 are different from each other.
  • a short pulse-type excitation light is incident on a sample and a time waveform of emitted fluorescence is measured through a high-speed first detector to measure or calculate the light lifetime.
  • the light source 110 may generate excitation light having a short pulse width.
  • the light source 110 may be formed of a pulsed laser.
  • the first sensing unit 210 and the second sensing unit 220 may be formed of a photo-multiplier tube (PMT) or an avalanche photo diode (APD) having a relatively large signal amplification capability. there is.
  • PMT photo-multiplier tube
  • APD avalanche photo diode
  • I M (t) is a waveform obtained from the first sensing unit
  • I E (t) is a waveform of excitation light
  • I P (t) is an impulse response waveform of the first sensing unit
  • T 0 represents the delay time according to the distance required for the excitation light to arrive at the first sensing unit from the light source through the first lens This delay time is a device-specific characteristic (mixed with response characteristic) value unrelated to the fluorescence phenomenon, and is preliminarily can be measured on
  • I E (t) I P (t) is referred to as an instrument response function (hereinafter referred to as IRF), and will be denoted as I IRF (t).
  • I IRF (t) means the overall response function of the fluorescence lifetime measurement device and may be a device-specific value unrelated to the fluorescence phenomenon.
  • the device response function for the excitation light and the first detector is I IRF (t)
  • the device response function for the excitation light and the second detector is I IRF '(t)
  • the waveform detected by the first detector is the convolution of I F (t) and I IRF (t), which are the natural exponential decay function of fluorescence, and it appears in a delayed form by T0.
  • the fluorescence lifetime measuring device may detect the fluorescence lifetime using Fourier-domain deconvolution to remove the contribution of the IRF waveform from the measured analog waveform.
  • the signal processing unit 300 transforms the measured analog waveform I M (t) and the IRF waveform I IRF (t) into frequency domain I M (f) and I IRF (f), respectively, through Fourier transform.
  • I M (f)/I IRF (f) is calculated and then inverse Fourier transform is performed, only I F (t) will remain due to the mathematical characteristics of the Fourier transform and convolution. This is because the convolutional relation is converted into a simple multiplication relation in the Fourier-transformed frequency domain. Through this deconvolution method, the contribution of IRF can be minimized.
  • the signal processing unit 300 may directly calculate the fluorescence lifetime in the frequency domain without performing inverse Fourier transform.
  • the signal processing unit 300 may calculate the fluorescence lifetime through analysis of the absolute value magnitude or phase component of I F (f), which is the fluorescence lifetime, in the frequency domain. That is, the signal processing unit 300 can calculate the fluorescence lifetime by curve fitting the measurement result with an exponential decay curve in the time domain with a frequency domain expression curve of the exponential decay curve in the frequency domain. there is.
  • the fluorescence lifetime can be expressed as Equation 2 below.
  • ⁇ means the fluorescence lifetime
  • an accurate fluorescence lifetime can be calculated by curve-fitting the measurement result with the above function within the effective frequency range. And if the result measured through this is transformed into the frequency domain through Fourier transform, the contribution of IRF can be easily eliminated because the contribution of IRF appears in an algebraic relationship such as simple multiplication (for absolute value) or addition (for phase). there is.
  • the signal processing unit 300 uses an analog pulse electrical signal caused by a plurality of fluorescence photons instead of a single photon response as in TCSPC in order to obtain high-speed fluorescence lifetime measurement. It is also possible to calculate the fluorescence lifetime by processing.
  • the pulse electric signal measured from the first sensing unit is convolved with an exponential decay curve inherent in the fluorescence phenomenon and an IRF waveform.
  • the signal processing unit 300 may determine the fluorescence lifetime in the average time domain and perform deconvolution as a subtraction process.
  • the fluorescence lifetime measuring device according to the embodiment can measure the fluorescence lifetime more easily.
  • the pulse electrical signal generated by an infinite number of fluorescence photons is a pulse electrical signal for an individual fluorescence photon among them, that is, quantum mechanically unit charge (electrical amount of electrons) arrives at the signal processing unit described later.
  • PDF probability distribution function
  • M, E, F, and P are temporal random variables corresponding to I M (t), I E (t), I F (t), and I P (t), respectively, as PDFs.
  • T 0 is a variable determined as a fixed delay time by an optical path.
  • M is the arrival time of electrons arriving at the signal processing unit
  • E is the arrival time of excitation light photons that cause fluorescence photons
  • P is the arrival of one photon-electron conversion electron by the fluorescence photons.
  • the time, F is the time required for one fluorescent molecule to emit one fluorescent photon.
  • E, F, and P are stochastic random variables or can be regarded as such.
  • an additive relationship is also established with respect to an expected value of the random variable, that is, an average value. That is, if E[ ⁇ ] is an average operator (the subscript means the object of the sensing unit (e.g., the first sensing unit is 1, the second sensing unit is 2)), the average value for the time variable, that is, the average time, is the integral interval For T, it is expressed by Equation 4 below.
  • A(t) represents a probability distribution function for each temporal random variable.
  • the integration interval T should theoretically have an infinite value to obtain an ideal integral value.
  • the integration in the exponential decay curve is 5 times the specific time constant ⁇ , that is, the integration up to the time when the size of e -5 of the highest value of the decay curve is 99.3% of the area. Therefore, there may not be much difference from the integral for more time. Therefore, the integration interval T for obtaining the average time can be defined as an interval up to 5 ⁇ , for example.
  • Equation 5 the following Equation 5 is established for the average time.
  • Equation 5 shows that the average delay time E[M] of the pulse electrical signal waveform arriving at the signal processing unit described later is the IRF delay E[E]+E[P] as the response characteristics of the excitation light source and the first sensing unit and the light It means that it is expressed as the sum of the delay T0 due to the furnace and the delay E[F] due to the fluorescence phenomenon. Among them, if the sum of the IRF delay and the delay due to the optical path is the device delay time, it is expressed as E[E] + E[P] + T0.
  • the fluorescence lifetime ⁇ is the value obtained by subtracting the device delay time from the average delay time as described above.
  • the average ⁇ t> IRF of the device response function I IRF (t) represents the above-described device delay time for the first sensing unit, and the waveform obtained by the first sensing unit I M (t)
  • the average of ⁇ t> M represents the above average delay time.
  • E[F] that is, fluorescence lifetime ⁇
  • the signal processing unit may calculate the fluorescence lifetime in the above-described manner.
  • the average time E 1 (t) of the first signal may be calculated using Equation 6 below.
  • A(t) represents the first signal
  • T is an integration period, which may be set to a specific value according to the accuracy of fluorescence lifetime measurement.
  • the average time E 2 (t) of the second signal in the signal processing unit 300 may be calculated using Equation 7 below.
  • B(t) represents the second signal
  • T is the same value as the integration period in the above equation.
  • the signal processing unit 300 compensates for the average time of the second signal, and as described above, the difference between the average time of the first signal and the compensated average time of the second signal (E 1 (t) - E 2 '( t)) can be calculated as fluorescence lifetime.
  • an average time for the second signal received without passing through the sample through the second detector may be compensated.
  • the signal processing unit 300 calculates the IRF delay, E 1 [E] + E 1 [P], as response characteristics of the excitation light that does not pass through the sample and the first detector. It can be calculated (T 0 is the delay time as described above, and the delay time is a device-specific characteristic (mixed with response characteristic) value unrelated to the fluorescence phenomenon, so it can be measured in advance, so it is excluded).
  • the signal processor 300 reflects the unique fluorescence lifetime of a specific sample in order to convert the second signal representing the response characteristics of the second detector into a compensated second signal representing the response characteristics of the first detector.
  • the stored compensation value can be used.
  • the signal processing unit 300 may calculate the compensation value using Equation 8 below.
  • CV is a compensation value
  • E 1 [E] + E 1 [P] is the response characteristics of the excitation light source and the first sensing unit
  • E 2 [E] + E 2 [P] is the excitation light source and the second sensor.
  • Response characteristics of the sensing unit, E 1 [E] + E 1 [P] and E 2 [E] + E 2 [P] are obtained by substituting the unique fluorescence lifetime of a specific sample into Equation 1.
  • the fluorescence lifetime measuring device accurately calculates the fluorescence lifetime while obtaining the first signal by the fluorescence photon and the second signal in which the excitation light does not pass through the sample without a time difference or with a minimized time difference. can do.
  • the fluorescence lifetime measuring device can eliminate the signal reception time difference between the response characteristics of the second detector measured through the second detector and the signal for the fluorescence photons collected by the first detector.
  • the signal processing unit compensates only for the difference between the response characteristics of the second sensing unit and the response characteristics of the first sensing unit measured through the second sensing unit, and as described above, the response characteristics of the first sensing unit and the fluorescence The fluorescence lifetime can be calculated using the photon signal.
  • the fluorescence lifetime measurement device even if there is a difference between the response characteristics of the second detector measured through the second detector and the signal reception time of the signal for the fluorescence photons collected by the first detector. This is the time difference according to the path difference between the first path and the second path in FIG. 1, and thus can be removed with a value obtained in advance. Accordingly, the signal processing unit according to the embodiment compensates for the difference between the response characteristics of the second sensing unit and the response characteristics of the first sensing unit measured through the second sensing unit and the above-mentioned time difference, and as described above, for the first sensing unit
  • the fluorescence lifetime can be calculated using the response characteristic and the signal for the fluorescence photon. With this configuration, the fluorescence lifetime can be calculated more quickly because the first path and the second path are not continuous but simply have a time difference.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of a fluorescence lifetime measurement device according to another embodiment of the present invention.
  • a pulse signal synchronized with the light source 110 is transmitted to the first channel of the signal measurer 400 ( Ch1) and second channel Ch2.
  • the remaining components (AB) in the fluorescence lifetime measurement device according to the embodiment are composed of the same components as the fluorescence lifetime measurement device of FIG. 1 except for the details described below.
  • an additional filter unit may further exist so that sampling for signal restoration is applied identically to the first channel Ch1 and the second channel Ch2.
  • the filter unit may be a low pass filter or a band pass filter that removes a predetermined band.
  • the filter unit may use a device having a 3dB bandwidth of, for example, 17 MHz and may be used to restore the trigger signal Trig to a low frequency. In this way, the smoothed trigger signal can be digitized at a sampling rate of 100 MS/s.
  • I E (t) and I IRF (t) represent the fluorescence photon and the IRF signal or amplified signal of the system, respectively, and I trig (t) represents the trigger signal or the amplified trigger signal.
  • I E (t) and I IRF (t) may be simultaneously collected by the first channel Ch1 and the second channel Ch2. At this time, even if signal collection is instructed with a signal corresponding to I trig (t), actual signal collection may start after a predetermined time delay ( ⁇ t1) from the I trig (t) signal due to time delay jitter. there is.
  • the fluorescence lifetime measurement device matches the collection timing of the first signal and the second signal in the signal measurement unit, and the measurement errors due to mismatch or the sampling interval between the trigger signal and the first signal / second signal The temporal discrepancy between them can be eliminated. Accordingly, a more accurate fluorescence lifetime can be measured.
  • FIG. 7 is a flowchart of a method for measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 8 is a flowchart of a method for measuring fluorescence lifetime according to another embodiment of the present invention.
  • the fluorescence lifetime measurement method includes irradiating excitation light to a sample (S1010), receiving a first signal and a second signal (S1020), compensating the response characteristics of the first and second detectors ( S1030) and calculating the fluorescence lifetime using the first signal and the second signal (S1040).
  • the fluorescence lifetime measuring device may generate excitation light from a light source. Accordingly, the excitation light may be irradiated to the sample according to the first path described above, and fluorescence photons generated from the sample may move to the first sensing unit. In addition, the excitation light may move to the second sensing unit without passing through the sample according to the above two paths.
  • the first detection unit 210 may generate a first signal and the second detection unit may generate a second signal.
  • the first signal is an electrical signal obtained by converting a fluorescence photon generated by excitation light to be irradiated to the sample S including a fluorescence molecule.
  • the aforementioned fluorescence photons may be collected by the first detector.
  • the first signal may be in an amplified form.
  • the second signal is an electrical signal obtained by converting the excitation light that has not passed through the sample.
  • Excitation light that does not pass through the above-described sample may be collected by the second detector.
  • the second signal may be in an amplified form.
  • the signal processing unit may calculate the response characteristics of the first detection unit by compensating for the second signal generated by the second detection unit. .
  • a step of calculating the fluorescence lifetime using the first signal and the second signal may be included.
  • the fluorescence lifetime may be calculated using a response characteristic of the first sensor obtained by compensating for the second signal and an average time difference for the first signal.
  • a fluorescence lifetime measurement method includes irradiating excitation light to a sample (S2010), receiving and simultaneously measuring a first signal and a second signal (S2020), and a first sensing unit. It may include compensating the response characteristics and the response characteristics of the second sensor (S2030) and calculating the fluorescence lifetime using the first signal and the second signal (S2040). It should be understood that even if the content is omitted below, the information described above with respect to the fluorescence lifetime measurement device and method shown in FIGS. 1 to 6 and 7 is also applied to the fluorescence lifetime measurement method according to the present embodiment.
  • the fluorescence lifetime measuring device may generate excitation light from a light source. Accordingly, the excitation light may be irradiated to the sample according to the first path described above, and fluorescence photons generated from the sample may move to the first sensing unit. In addition, the excitation light may move to the second sensing unit without passing through the sample according to the above two paths.
  • the first detector 210 may generate a first signal and the second detector may generate a second signal. At this time, as described above, it is possible to take the collection timing of the first signal and the second signal at the same sampling interval with respect to the trigger signal. Accordingly, an error due to a mismatch between collection timings of the first signal and the second signal can be minimized.
  • the first signal is an electrical signal obtained by converting a fluorescence photon generated by excitation light to be irradiated to the sample S including a fluorescence molecule.
  • the aforementioned fluorescence photons may be collected by the first detector.
  • the first signal may be in an amplified form.
  • the second signal is an electrical signal obtained by converting the excitation light that has not passed through the sample.
  • Excitation light that does not pass through the above-described sample may be collected by the second detector.
  • the second signal may be in an amplified form.
  • the signal processing unit may calculate the response characteristics of the first detection unit by compensating for the second signal generated by the second detection unit. .
  • a step of calculating the fluorescence lifetime using the first signal and the second signal may be included.
  • the fluorescence lifetime may be calculated using a response characteristic of the first sensor obtained by compensating for the second signal and an average time difference for the first signal.
  • the device and method for measuring fluorescence lifetime measure the average delay time and device delay time, and easily calculate the fluorescence lifetime with accuracy and precision while removing the contribution of the device response function in a very short time. life can be measured.
  • the above-described embodiments of the present invention can be written as a program that can be executed on a computer, and can be implemented in a general-purpose digital computer that operates the program using a computer-readable recording medium.
  • the computer-readable recording medium includes a magnetic storage medium (eg, ROM, floppy disk, hard disk, etc.), an optical reading medium (eg, CD-ROM, DVD, etc.), and a carrier wave (eg, Internet transmission through) and the same storage medium.
  • ' ⁇ unit' used in this embodiment means software or a hardware component such as a field-programmable gate array (FPGA) or ASIC, and ' ⁇ unit' performs certain roles.
  • ' ⁇ part' is not limited to software or hardware.
  • ' ⁇ bu' may be configured to be in an addressable storage medium and may be configured to reproduce one or more processors. Therefore, as an example, ' ⁇ unit' refers to components such as software components, object-oriented software components, class components, and task components, processes, functions, properties, and procedures. , subroutines, segments of program code, drivers, firmware, microcode, circuitry, data, databases, data structures, tables, arrays, and variables.
  • components and ' ⁇ units' may be combined into smaller numbers of components and ' ⁇ units' or further separated into additional components and ' ⁇ units'.
  • components and ' ⁇ units' may be implemented to play one or more CPUs in a device or a secure multimedia card.

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Abstract

실시예는 시료에 조사하는 여기광을 발생하는 광 생성부; 상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성되는 형광 광자를 수신하여 제1 신호로 변환하는 제1 감지부 및 상기 여기광을 수신하여 제2 신호로 변환하는 제2 감지부를 포함하는 수집부; 및 상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 신호 처리부;을 포함하고, 상기 신호 처리부는 상기 제1 감지부의 응답 특성과 상기 제2 감지부의 응답 특성을 보상하여 상기 형광수명을 산출하는 형광수명 측정 장치를 개시한다.

Description

형광수명 측정 장치 및 방법
실시예는 형광수명 측정 장치 및 방법에 관한 것이다.
분자들은 전자 전이(electronic transition)에 의해 입사된 빛을 흡수하며, 어떤 분자들에서는 여기된 전자가 바닥상태(ground state)로 회복하면서 빛을 발하는 형광 현상을 일으키게 된다. 또한, 각 분자는 고유의 흡수 파장과 형광 방출 파장을 가지며 이들 사이에는 스톡스 천이(Stoke's shift)라고도 불리는 수십 나노미터의 파장의 차이가 있다. 즉, 흡수된 빛의 파장보다 다소 긴 파장의 빛이 형광 현상을 통해 방출되게 된다. 형광 물질은 빛의 흡수 파장과 방출 파장에 의해 특색지어질 수 있으며, 이러한 특성은 고전적인 형광 현미경의 원리가 된다.
형광 현미경에서는, 대상 형광 물질에 흡수될 파장의 여기광(excitation light)을 시료에 조사하고 이 여기광보다 긴 파장의 스톡스 천이된 형광 신호가 시료의 특정 지점에서 수집되는지를 필름이나 CCD(Charge-coupled device)와 같은 배열 형태의 제1 감지부(photo-detector)를 이용하여 검출하여 이미지를 얻는다.
형광 현미경의 응용에서는 주로 시료 자체가 특정한 형광을 가지는 분자를 내포하고 있거나(자체형광, autofluorescence) 혹은 외부에서 형광체를 주입하고 특정한 부위에 레이블링(labeling)함으로써 이미지를 얻게 되며, 주로 세포와 같은 생물학적 시료의 분자적 분포를 연구할 때 활용된다. 최근에 3차원적 이미지를 얻기 위하여 공초점 현미경, 다광자 여기 형광 현미경(multi-photon excitation fluorescence microscope) 등이 개발되고 있다.
기존의 형광 현미경에서는 형광 물질에서 나오는 형광 빛의 세기에 기초하여 이미지를 구성하는 것에 그쳤는데 반하여, 형광 빛의 세기 이외에 보다 고등적인 분광학적 정보를 수집하여 이미지를 구성하는 방법들이 근래에 들어 개발되고 있다. 특히 형광 물질 고유의 광학적 특성인 형광수명의 정보는 형광 물질이 놓인 환경에 대한 보다 상세한 정보를 제공하기 때문에 중요하다. 형광 분자에서 전자는 여기광에 의해 여기된 후에 여기상태(excited state)에서 일정한 시간 머물다가 확률적으로 바닥상태로 전이하며, 이때 형광 광자를 생성하게 된다. 시간 상에서 전자의 전이 확률, 즉 형광 광자의 생성 확률은 전자의 여기가 이뤄진 시점을 정점으로 하여 지수함수적 감쇠(exponential decay) 곡선을 그리게 된다. 이 지수함수적 감쇠 곡선의 특성 감쇠 시간을 형광수명이라 하며 이는 다수의 형광 광자의 생성　시간을 조사함으로써 측정될 수 있다.
본래에 형광수명은 외부의 간섭이 없다면 각 형광 분자의 특성 값이나, 형광수명은 형광 물질이 놓인 주위 환경에 따라서 변화할 수 있다. 즉, 각 형광 물질의 특성에 따라 특정 이온의 농도나, 산소의 농도, 산도(pH) 등에 의해 그 값이 변화하게 된다. 따라서 이러한 형광수명에 대한 정보를 통해 상기된 변수들의 공간적 분포를 조사하는 방식의 형광수명 이미징 현미경(fluorescence lifetime imaging microscope, 이하 FLIM)이 개발되고 있다. 이러한 형광수명 이미징 현미경은 기존의 형광 현미경을 통해 얻을 수 없거나 부정확했던 환경 정보를 정확하게 얻어낼 수 있는 강점을 가진다. 또한, 공초점 현미경 방식과 결합된 공초점 FLIM은 이러한 형광수명에 기반한 정보를 3차원적 분해능으로 얻어낼 수 있게 되고 소위 "4차원 이미징"을 가능케 한다.
한편, 다광자 여기 형광 현미경을 포함하는 공초점 현미경에서는 매 순간 공간상의 한 지점에 대한 측정이 이뤄지고 측정 지점이 스캔됨으로써 이미지 정보가 순차적으로 획득되게 된다. 공초점 현미경에서 측정은 현미경의 대물 렌즈의 초점(focus)에서 이뤄지게 되는데 이 초점은 대물 렌즈에 입사하는 빔의 방향이나 시료 자체의 움직임에 의해 공간적으로 스캔되게 된다. 그리고 공초점 현미경의 경우 오직 초점으로부터 대물 렌즈로 재입사된 빛만이 제1 감지부에 도착할 수 있도록 핀홀(pinhole)과 같은 공간 필터를 갖는다. 다광자 여기 형광 현미경의 경우에는 다광자 여기 현상이 비선형 광학 현상으로서 오직 높은 광세기를 갖는 초점에서만 효과적으로 일어난다는 점 덕분에 핀홀없이 같은 효과를 얻을 수 있게 된다.
공초점 현미경의 이러한 특성 때문에 공초점 현미경에 기반한 FLIM의 형광수명 측정 기구는 시분해 분광학(time-resolved spectroscopy)의 형광수명 측정 기구와 크게 다르지 않다. 고전적인 시분해 분광학에서 형광수명의 측정은 시간-상관 단일 광자 계수기(time-correlated single photon counting, 이하 TCSPC)나 위상 형광 측정기(phase fluorometer)를 주로 사용한다.
또한, 형광수명의 측정은 같은 형광수명을 갖는 다수의 형광 분자가 생성시킨 다수의 광자나, 하나의 형광 분자가 다수번의 여기에 의해 생성시킨 다수의 광자를 대상으로 이뤄질 수 있다. 개념적으로 이는 시간 축에서 지수 함수적 감쇠 모양을 지닌 형광 파형을 분석하는 과정이다. 만약 무한에 가까운 형광 광자가 수집되었다면 얻어지는 형광 파형은 지수함수적 감쇠 모양을 지닌 형광의 확률분포 함수와 동일해 질 것이다. 매우 짧은 펄스폭을 갖는 여기광 조사가 t=0 시간에 이뤄질 때, 이에 따라 생성되는 형광 빛의 세기 혹은 형광 광자 밀도, IF(t)는 의 분포를 가진다. 이때 I0는 초기값이며, τ는 형광수명을 의미하고, u(t) 함수는 t<0일때 0, t≥0일때 1인 계단 함수를 나타낸다. 즉, 형광수명은 형광 광자의 방출 확률이 초기값에 비해 1/e 만큼 감소하는 시간을 의미한다.
TCSPC는 PMT나 APD(avalanche photo diode)와 같은 높은 신호이득을 갖는 제1 감지부를 이용하여 단일 광자에 의한 응답을 감지해낸다. 단일 광자에 의한 응답 펄스의 모양이 시간축에서 얼마나 긴 폭을 지니는가와는 상관없이 단일 광자의 도착 시간은 정밀하게 측정될 수 있다. 이를 이용하면 0.1 나노초 수준의 형광수명도 측정할 수 있게 된다.
다만, "단일 광자 조건" 때문에 TCSPC에서의 형광수명 측정은 다수의 여기광 펄스가 입사되어 다수번 광자 계수가 이뤄진 후에야만 완료되는 시간상의 문제가 존재한다 또한, 여기광 펄스 간의 시간 간격은 측정하고자 하는 형광 물질의 형광수명보다 충분히 길어야하는 한계가 존재한다. 만약 여기광 펄스 간의 시간 간격이 형광수명과 비슷한 수준이 되면 시간상에서 인접한 두 형광 발광의 파형이 서로 중첩되어 정확한 값을 얻을 수 없게 되는 문제점이 존재하므로, 형광수명의 정확한 측정을 위해서는 여기광의 펄스 주기가 형광수명 τ의 5배 이상이 되어야 하는 한계 조건이 존재한다. 즉, 가장 이상적인 조건에서조차 TCSPC를 이용한 형광수명 측정에 의한 이미지를 얻기 위하여 매우 긴 측정 시간을 요하며 특히 3차원 이미징에서는 거의 한 시간 이상의 시간이 필요하게 된다. 동적인 활동이 있는 살아있는 생물체를 살피고자 할 때에 이러한 처리 시간은 큰 제약이 아닐 수 없다.
실시예는 형광 물질 고유의 광학적 특성인 형광수명을 보다 빠른 시간에 정확하게 측정할 수 있는 형광수명 측정 장치 및 방법을 제공한다.
또한, 측정된 형광수명의 공간적 분포를 기반으로 이미지를 구성하는 형광수명 이미징 현미경 등에 적합한 형광수명 측정 장치 및 방법을 제공한다.
실시예에서 해결하고자 하는 과제는 이에 한정되는 것은 아니며, 아래에서 설명하는 과제의 해결수단이나 실시 형태로부터 파악될 수 있는 목적이나 효과도 포함된다고 할 것이다.
실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 시료에 조사하는 여기광을 발생하는 광 생성부; 상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성되는 형광 광자를 수신하여 제1 신호로 변환하는 제1 감지부 및 상기 여기광을 수신하여 제2 신호로 변환하는 제2 감지부를 포함하는 수집부; 및 상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 신호 처리부;을 포함하고, 상기 신호 처리부는 상기 제1 감지부의 응답 특성과 상기 제2 감지부의 응답 특성을 보상하여 상기 형광수명을 산출한다.
상기 신호 처리부는 상기 제1 감지부의 응답 특성과 상기 제2 감지부의 응답 특성 간의 시간 차를 기설정된 값으로 변환할 수 있다.
상기 신호 처리부는 하기의 식 1에 의해 수행할 수 있다.
[식 1]
CV={E1[E]+E1[P]}-{(E2[E]+E2[P])
여기서, CV는 보상값이고, E1[E]+E1[P]는 여기광 광원과 제1 감지부의 응답 특성이고, E2[E]+E2[P]는 여기광 광원과 제2 감지부의 응답 특성이며, E1[E]+E1[P]와 E2[E]+E2[P]는 특정 시료의 고유의 형광수명을 대입하여 얻어진다
상기 신호 처리부는 상기 제1 신호의 평균 시간과 상기 제2 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
상기 신호 처리부는 상기 제1 신호의 주파수 영역의 위상과 상기 제2 신호의 주파수 영역 상의 위상을 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 측정하는 신호 측정부;를 더 포함할 수 있다.
상기 신호 측정부는 상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 동일한 타이밍에 측정할 수 있다.
싱기 제2 신호는 상기 시료를 통과하지 않을 수 있다.
상기 광 생성부는, 상기 여기광을 생성하는 광원; 및 상기 시료에 조사하기 위하여 상기 생성된 여기광을 집광하는 제1 렌즈;를 포함할 수 있다.
상기 수집부는, 상기 여기광의 경로를 분할하는 스플리터; 상기 형광 광자를 수집하는 제2 렌즈; 및 상기 여기광이 제1 감지부로 이동하는 것을 방지하는 필터;를 포함할 수 있다.
실시예에 따르면, 형광수명을 보다 빠른 시간에 정확성과 정밀성을 가지면서 측정할 수 있는 형광수명 측정 장치 및 방법을 구현할 수 있다.
또한, 형광수명 이미징 현미경 등에 적합한 형광수명 측정 장치 및 방법을 구현할 수 있다.
본 발명의 다양하면서도 유익한 장점과 효과는 상술한 내용에 한정되지 않으며, 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하는 과정에서 보다 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명 측정 장치의 블록도이고,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 형광수명의 측정을 설명하는 그래프이고,
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 신호 처리부의 기능을 설명하는 도면이고,
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 제1 감지부와 제2 감지부의 수신 신호를 설명하는 도면이고,
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 제1 감지부와 제2 감지부의 수신 신호를 설명하는 도면이고,
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정 장치의 개념도이고,
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명 측정 방법의 순서도이고,
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정 방법의 순서도이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제2, 제1 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제2 구성요소는 제1 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제1 구성요소도 제2 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명 측정 장치의 블록도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 형광수명의 측정을 설명하는 그래프이고, 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 신호 처리부의 기능을 설명하는 도면이고, 도 4는 본 발명의 실시예에 따른 제1 감지부와 제2 감지부의 수신 신호를 설명하는 도면이고, 도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 제1 감지부와 제2 감지부의 수신 신호를 설명하는 도면이다.
도 1을 참조하면, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 광 생성부(100), 수집부(200), 신호 처리부(300) 및 신호 측정부(400)를 포함할 수 있다.
먼저, 광 생성부(100)는 형광 분자를 포함하는 시료(S)에 조사할 여기광을 발생하는 모듈로서, 펄스 형태의 여기광을 생성하는 여기 광원(110)과 생성된 여기광을 집광하여 시료(S)에 조사하기 위한 제1 렌즈(120)로 이루어진다.
수집부(200)는 시료(S)에 여기광을 조사하여 생성되는 다수의 형광 광자 및 여기광을 수집할 수 있다.
실시예로, 수집부(200)는 제1 감지부(210) 및 제2 감지부(220)를 포함할 수 있다. 제1 감지부(210)는 여기광이 시료에 조사됨으로써 생성되는 형광 광자를 수신하고, 수신된 형광 광자를 전기 신호인 제1 신호로 변환할 수 있다.
제1 감지부(210)는 형광광자 후술하는 제2 렌즈(230)에서 수집되어 필터(240)를 통과한 형광 광자를 전기 신호(제1 신호에 대응)로 변환할 수 있다. 이 때, 신호의 배율(예컨대, 증폭)이 조절될 수 있다.　제1 감지부(210)로는 예를 들어, PMT(photo-multiplier tube)나 APD(avalanche photo diode)를 사용할 수 있다.
제2 감지부(220)는 시료를 통과하지 않은 여기광을 전기 신호인 제2 신호로 변환할 수 있다. 제2 감지부(220)는 제1 감지부(210)와 마찬가지로 신호의 배율을 조절할 수 있다. 그리고 제2 감지부(220)는 예를 들어, PMT(photo-multiplier tube)나 APD(avalanche photo diode)로 이루어질 수 있다.
또한, 수집부(200)는 제2 렌즈(230), 필터(240) 및 스플리터(SP)를 더 포함할 수 있다. 제2 렌즈(230)는 시료(S)로부터의 형광 광자를 모집할 수 있다. 그리고 필터(240)는 여기광을 제거할 수 있다. 이에, 형광 광자를 수집하는데 정확도가 개선될 수 있다. 스플리터(SP)는 미러를 포함할 수 있으며, 1경로와 2경로로 여기광의 광 경로를 분할할 수 있다.
신호 처리부(300)는 제1 감지부(210) 및 제2 감지부(220)에서 변환된 제1 신호 및 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
추가적으로, 형광수명 측정 장치는 신호 처리부(300)의 전단에 제1 감지부(210) 및 제2 감지부(220)에서 변환된 전기 신호를 측정하는 신호 측정부(400)를 더 포함할 수 있다. 신호 측정부(400)는 신호 처리부(300) 내/외에 위치할 수 있다. 예를 들어, 신호 측정부(400)로는 예를 들어 오실로스코프를 사용할 수 있다.
신호 처리부(300)는 신호 측정부(400)에서 측정된 제1 신호의 평균 시간과, 제2 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산할 수 있다. 제1 신호는 IM(t)에 해당하고, IM(t)의 평균 시간은 후술하는 평균 지연 시간에 해당하며, 제2 신호는 후술하는 장치 응답 함수 IIRF'(t)에 해당하고 IIRF' (t)의 평균 시간은 후술하는 장치 지연 시간에 해당하게 된다. 이 때, 제1 신호도 IIRF (t)의 장치 지연 시간을 가질 수 있다. 그리고 실시예에 따르면, 제1 감지부(210)와 제2 감지부(220)는 상이한 구성 요소로 응답 특성이 상이하므로, 장치 응답함수도 상이하다. 다시 말해, 제1 감지부(210)의 장치 응답 함수 IIRF(t)와 제2 감지부(220)의 장치 응답 함수 IIRF'(t)는 서로 상이하다.
이하, 본 발명에 따른 형광수명의 측정 원리에 대해서 설명한다.
먼저, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 광 수명을 측정 또는 산출하기 위해 짧은 펄스 형태의 여기광을 시료에 입사시키고 방출되는 형광의 시간 파형을 고속의 제1 감지부를 통해 측정할 수 있다.
이에, 광원(110)은 짧은 펄스폭을 갖는 여기광을 생성할 수 있다. 예컨대, 광원(110)은 펄스형 레이저로 이루어질 수 있다.
형광의 세기와 여기광의 세기가 작아서 제1 감지부(210) 및 제2 감지부(220)는 상대적으로 큰 신호 증폭 능력을 지닌 PMT(photo-multiplier tube)나 APD(avalanche photo diode)로 이루어질 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2021011658-appb-img-000001
여기서, "
Figure PCTKR2021011658-appb-img-000002
" 기호는 컨볼루션을 나타내며, IM(t)는 제1 감지부에서 얻어지는 파형, IE(t)는 여기광의 파형, IP(t)는 제1 감지부의 임펄스 응답(impulse response) 파형, T0는 여기광이 광원에서 제1 렌즈를 거쳐 제1 감지부에 도착하는데 걸리는 거리에 따른 지연 시간을 나타낸다. 이러한 지연 시간은 형광 현상과 무관한 장치 고유 특성(응답 특성과 혼용) 값으로 사전에 측정될 수 있을 것이다.
이때, IE(t)
Figure PCTKR2021011658-appb-img-000003
IP(t)를 장치 응답 함수(instrument response function, 이하 IRF)라 하고, IIRF(t)로 표기하기로 한다. IIRF(t)는 형광수명 측정 장치의 전체 응답 함수를 의미하며 형광 현상과 무관한 장치 고유의 값일 수 있다. 이 때, 여기광과 제1 감지기에 대한 장치 응답 함수는 IIRF(t)로, 여기광과 제2 감지기에 대한 장치 응답 함수는 IIRF'(t)이며, 이를 기준으로 설명한다. 그리고 제1 감지부에서 검출된 파형은 형광 본연의 지수함수 감쇠 함수인 IF(t)와 IIRF(t)의 콘볼루션이고 이것이 T0만큼 지연된 형태로 나타나게 된다.
이를 바탕으로, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 측정된 아날로그 파형에서 IRF 파형의 기여를 제거하기 위해 푸리에 영역 디컨볼루션(Fourier-domain deconvolution)을 이용하여 형광수명을 검출할 수 있다.
즉, 신호 처리부(300)는 측정된 아날로그 파형 IM(t)와 IRF 파형 IIRF(t)를 푸리에 변환을 통해 주파수 영역으로 각각 IM(f)와 IIRF(f)로 변환한다. 그리고 IM(f)/IIRF(f)를 계산한 후에 역푸리에 변환을 수행하면 푸리에 변환과 컨볼루션의 수학적 특성에 의해 IF(t)만이 남게 될 것이다. 이는 푸리에 변환된 주파수 영역에서 컨볼루션 관계가 단순한 곱셈 관계로 변환되기 때문이다. 이러한 디컨볼루션 방법을 통해 IRF의 기여를 최소화 할 수 있다.
또한, 신호 처리부(300)는 역푸리에 변환을 수행하지 않고 주파수 영역에서 바로 형광수명을 계산할 수 있다. 신호 처리부(300)는 주파수 영역에서 형광수명인 IF(f)의 절대값 크기 혹은 위상 성분의 분석을 통해서 형광수명을 산출할 수 있다. 즉, 신호 처리부(300)는 시간 영역에서 측정결과를 지수함수 감쇠곡선으로 곡선피팅(curve fitting)하는 것과 같이 주파수 영역에서 지수함수 감쇠곡선의 주파수영역 표현 곡선으로 곡선피팅하여 형광수명을 산출할 수 있다. 다시 말해, 임의의 주파수 f에 대해, 복소함수 IF(f)의 위상성분과 IIRF(f)의 위상성분의 차이를 θ라하면 형광수명은 아래 수학식 2와 같을 수 있다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2021011658-appb-img-000004
여기서, τ는 형광수명을 의미한다.
이에 따라, 유효 주파수 범위 내에서 측정 결과를 위 함수로 곡선피팅하면 정확한 형광수명을 산출할 수 있다. 그리고 이를 통해 측정된 결과를 푸리에 변환을 통해 주파수 영역으로 변환하면 IRF의 기여는 단순한 곱셈(절대값에 대해)이나 덧셈(위상에 대해)과 같은 대수적 관계로 나타나게 되어 IRF의 기여를 쉽게 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 신호 처리부(300)는 형광수명 측정의 고속성을 얻기 위해서는 TCSPC에서와 같은 단일 광자에 의한 응답이 아닌 다수의 형광 광자에 의해 야기된 아날로그 형태의 펄스 전기신호를 처리하여 형광수명을 산출할 수도 있다.
상술한 바와 같이 제1 감지부로부터 측정된 펄스전기 신호가 형광 발광 현상 고유의 지수함수 감쇠곡선 (exponential decay curve)과 IRF 파형이 컨볼루션(convolution)이루어져 있다.
이 때, 실시예에 따른 신호 처리부(300)는 형광수명의 측정을 평균 시간 영역에서 형광수명을 결정하여 디컨볼루션을 빼기 과정으로 수행할 수 있다. 이에, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 형광수명이 보다 용이하게 측정할 수 있다.
신호 처리부(300)는 무한한 개수의 형광 광자가 만드는 펄스 전기 신호가 그 중 개별적인 하나의 형광 광자에 대해서 펄스 전기 신호 곧, 양자역학적으로 단위 전하량(전자의 전기량)이 후술하는 신호 처리부에 도착하는 시간상의 확률분포 함수 (probability distribution function, 이하 PDF)로 풀이할 수 있다. 그리고 랜덤(random) 신호에 대해서 확률분포 함수의 컨볼루션은 각 확률분포 함수에 대응되는 개별 랜덤 변수(random variable)의 합이 되게 된다. 따라서 상술된 수학식 1에 대응하는 하기의 수학식 3이 성립한다.
[수학식 3]
Figure PCTKR2021011658-appb-img-000005
여기서, M, E, F, P는 각각 IM(t), IE(t), IF(t), IP(t)를 PDF로 간주했을 때 각각에 대응되는 시간 랜덤 변수이다. T0는 광경로에 의한 고정적 지연 시간으로 결정된 변수이다. 구체적으로, M은 신호 처리부에 도착하는 전자의 도착시간, E는 그 중 형광 광자를 야기시키는 여기광 광자의 도착시간, P는 형광 광자에 의해 광전 변환된(photon-electron conversion) 전자 하나의 도착시간, F는 형광 분자 하나가 형광 광자 하나를 방출하는데 걸리는 시간을 의미한다. 하나의 형광 광자와 이에 의해 야기된 하나의 신호 전자에 대해서 E, F, P는 확률적인 랜덤 변수이거나 또는 그렇게 간주될 수 있다. 랜덤 변수간에 덧셈 관계가 성립한다면 그 랜덤 변수에 대한 기대값(expectation value) 즉, 평균값에 대해서도 덧셈 관계가 성립한다. 즉, E[·]를 평균 연산자라 하면(아래첨자는 감지부의 대상을 의미함(예컨대, 제1 감지부는 1, 제2 감지부는 2)), 시간 변수에 대한 평균값, 즉 평균 시간은 적분구간 T에 대해서 다음 수학식 4로 표현된다.
[수학식 4]
[규칙 제91조에 의한 정정 28.09.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-4
여기서, A(t)는 각각의 시간 랜덤 변수에 대한 확률분포 함수를 나타낸다. 그리고 적분구간 T는 이론적으로는 무한대의 값을 가져야만 이상적인 적분값을 구할 있지만, 펄스형 여기광을 사용하여 형광수명을 구하는 시스템에서는 제한된 신호의 주기시간 안에서 적분을 하면 된다. 지수함수적 감쇠곡선에서의 적분은 특정 시상수 τ의 5배, 즉 감쇠곡선 최고치의 e-5의 크기가 되는 시간까지의 적분은 99.3%의 면적을 적분하게 되는 것이다. 따라서 그 이상의 시간에 대해서의 적분과는 큰 차이게 없을 수 있다. 따라서 평균 시간을 구하기 위한 적분구간 T를 예를 들어 5τ까지의 구간으로 정의할 수 있다.
상기 수학식 3에 따라서 평균 시간에 대해서 다음 수학식 5가 성립한다.
[수학식 5]
Figure PCTKR2021011658-appb-img-000007
상기 수학식 5는 후술하는 신호 처리부에 도착하는 펄스 전기신호 파형의 평균 지연 시간 E[M]이 여기광 광원과 제1 감지부의 응답 특성으로서의 IRF 지연인 E[E]+E[P]와 광경로에 의한 지연 T0, 그리고 형광 현상에 의한 지연 E[F]의 총합으로 표현됨을 의미한다. 이 중 IRF 지연과 광경로에 의한 지연의 합을 장치 지연 시간이라 하면, 이는 E[E]+E[P]+T0로 나타나게 된다. 그리고 지수함수적 감쇠곡선에서 특성 시상수 τ는 그 곡선의 평균 지연 시간 값과 같으므로(τ=E[F]), 형광수명 τ는 최종적으로 E[M]-{E[E]+E[P]+T0}로 나타나게 된다. 따라서 형광수명은 상술한 바와 같은 평균 지연 시간에서 장치 지연 시간을 뺀 값이 된다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 장치 응답 함수 IIRF(t)의 평균 <t>IRF는 상술한 제1 감지부에 대한 장치 지연 시간을 나타내고, 제1 감지부에서 얻어지는 파형 IM(t)의 평균 <t>M은 상술한 평균 지연 시간을 나타낸다. 이때, 장치 응답 함수와 제1 감지부에서 얻어지는 파형의 시작점은 동일하여야 한다. 그리고 도 2에 도시된 바와 같은 두 개의 파형의 평균 시간의 차이를 이용하면 E[F], 즉 형광수명 τ를 산출할 수 있다. 즉, 신호 처리부는 상술한 방식으로 형광수명을 산출할 수 있다.
그리고 신호 처리부(300)에서 상기 제1 신호의 평균 시간 E1(t)는 다음 수학식 6을 이용하여 계산될 수 있다.
[수학식 6]
[규칙 제91조에 의한 정정 28.09.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-mat6
여기서, A(t)는 상기 제1 신호를 나타내며, T는 적분 주기로서 형광수명 측정의 정확도에 따라 특정 값으로 설정할 수 있다.
또한, 신호 처리부(300)에서 제2 신호의 평균 시간 E2(t)는 다음 수학식 7을 이용하여 계산될 수 있다.
[수학식 7]
[규칙 제91조에 의한 정정 28.09.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-7
여기서, B(t)는 상기 제2 신호를 나타내며, T는 상기 수학식에서의 적분 주기와 동일한 값이다.
신호 처리부(300)는 제2 신호의 평균 시간에 대한 보상을 수행하고 상술한 바와 같이 제1 신호의 평균 시간과 보상된 제2 신호의 평균 시간의 차이(E1(t) - E2'(t))를 형광수명으로 산출할 수 있다.
실시예에 따르면, 제1 감지부와 제2 감지부는 상술한 바와 같이 응답특성이 상이한 바, 제2 감지부를 통해 시료를 통과하지 않고 수신한 제2 신호에 대한 평균 시간을 보상할 수 있다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 이러한 보상에 의해, 신호 처리부(300)는 시료를 통과하지 않은 여기광과 제1 감지부의 응답 특성으로서의 IRF 지연인 E1[E]+E1[P]을 산출할 수 있다 (T0는 상술한 바와 같이 지연 시간으로, 지연 시간은 형광 현상과 무관한 장치 고유 특성(응답 특성과 혼용) 값인바 사전에 측정될 수 있을 것이기에 제외함).
보다 구체적으로, 신호 처리부(300)는 제2 감지부의 응답 특성을 나타내는 제2 신호를 제1 감지부의 응답 특성을 나타내는 보상된 제2 신호로 변환하기 위하여, 특정 시료에 대한 고유의 형광수명을 반영하여 저장된 보상값을 이용할 수 있다.
다시 말해, 신호 처리부(300)는 보상값을 아래의 수학식 8을 이용하여 계산할 수 있다.
[수학식 8]
CV={E1[E]+E1[P]}-{(E2[E]+E2[P])
여기서, CV는 보상값이고, E1[E]+E1[P]는 여기광 광원과 제1 감지부의 응답 특성이고, E2[E]+E2[P]는 여기광 광원과 제2 감지부의 응답 특성이며, E1[E]+E1[P]와 E2[E]+E2[P]는 특정 시료의 고유의 형광수명을 수학식 1에 대입하여 얻어진다.
이러한 구성에 의하여, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 형광 광자에 의한 제1 신호와 여기광이 시료를 통과하지 않은 제2 신호를 시간차 없이 또는 시간차를 최소화한 상태로 얻으면서도 형광수명을 정확하게 산출할 수 있다.
특히, 도 4와 같이, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 제2 감지부를 통해 측정된 제2 감지부의 응답 특성과 제1 감지부에서 수집한 형광 광자에 대한 신호의 신호 수신 시간차를 제거할 수 있다. 이에 따라, 실시예에 따른 신호 처리부는 제2 감지부를 통해 측정된 제2 감지부의 응답 특성과 제1 감지부의 응답 특성의 차이만을 보상하여, 상술한 바와 같이 제1 감지부에 대한 응답 특성과 형광 광자에 대한 신호를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다. 이러한 구성에 의하여, 경로 차이와 무관하고 형광 광자를 수신하는 시간과 적어도 일부 중첩되는 시간동안 응답 특성을 갖는 여기광을 수신함으로써 중첩되는 시간만큼의 시간절약이 이루어질 수 있다. 이에 따라, 형광수명이 보다 빠르고 정확하게 산출될 수 있다.
또한, 도 5와 같이, 다른 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 제2 감지부를 통해 측정된 제2 감지부의 응답 특성과 제1 감지부에서 수집한 형광 광자에 대한 신호의 신호 수신 시간차가 존재하더라도 이는 도 1에서 1경로와 2경로 간의 경로 차이에 따른 시간차인 바 미리 구해지는 값으로 이를 제거할 수 있다. 이에 따라, 실시예에 따른 신호 처리부는 제2 감지부를 통해 측정된 제2 감지부의 응답 특성과 제1 감지부의 응답 특성의 차이와 상술한 시간차를 보상하여, 상술한 바와 같이 제1 감지부에 대한 응답 특성과 형광 광자에 대한 신호를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다. 이러한 구성에 의하여, 1경로와 2경로가 연속되지 않고 단순히 시간차를 가지므로 보다 빠르게 형광수명이 산출될 수 있다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정 장치의 개념도이다.
도 6을 참조하면, 신호 측정부(400)의 데이터 수집 시작 시점의 변동에 의한 형광수명 측정 오차를 줄이기 위해, 광원(110)과 동기화된 펄스 신호를 신호 측정부(400)의 제1 채널(Ch1) 및 제2 채널(Ch2)로 수집될 수 있다.
먼저, 실시예에 따른 형광수명 측정 장치에서 나머지 구성요소들(AB)이 도 1의 형광수명 측정 장치와 이하 설명하는 내용을 제외하고 동일한 구성요소들로 이루어진 것으로 이해해야 한다.
또한, 추가적으로 신호 복원을 위한 샘플링이 제1 채널(Ch1) 및 제2 채널(Ch2)과 동일하게 적용되도록 하기 위한 추가적인 필터부가 더 존재할 수 있다. 필터부는 소정의 대역을 제거하는 로우패스필터 또는 밴드패스필터 등일 수 있다. 예컨대, 필터부는 예를 들어, 17MHz의 3dB 대역폭을 갖는 기기를 사용할 수 있고, 트리거 신호(Trig)를 낮은 주파수로 복원하기 위해 사용할 수 있다. 이로써, 평활하게 된 트리거 신호는 100MS/s의 샘플링 속도로 디지털화될 수 있다.
여기서,　IE(t)와　IIRF(t)는 각각 형광광자 및 시스템의 IRF 신호 또는 증폭된 신호를 나타내고,　Itrig(t)는 트리거 신호 또는 증폭된 트리거 신호를 나타낸다.
1차적으로, IE(t)와　IIRF(t) 가 제1 채널(Ch1)과 제2 채널(Ch2)에 의해 동시에 수집될 수 있다. 이 때, Itrig(t)에 대응하는 신호로 신호 수집이 지시되더라도, 실제 신호 수집은 시간 지연 지터에 의해　Itrig(t)　신호로부터　소정의 시간 지연(△t1) 이후에 신호 수집이 시작될 수 있다.
다만, 본 실시예에 따른 형광수명 측정 장치는 신호 측정부에서 제1 신호와 제2 신호의 수집 타이밍을 일치하여, 불일치에 따른 측정 오차들 또는 트리거 신호와 제1 신호/제2 신호의 샘플링 간격 사이의 시간적 불일치를 제거할 수 있다. 이에 따라, 보다 정확한 형광수명이 측정될 수 있다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명 측정 방법의 순서도이고, 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정 방법의 순서도이다.
도 7을 참조하면, 이하 생략된 내용이라 하더라도 도 1 내지 도 6에 도시된 형광수명 측정 장치에 관하여 이상에서 기술된 내용은 본 실시예에 따른 형광수명 측정 방법에도 적용됨을 이해해야 한다.
형광수명 측정 방법은 여기광을 시료에 조사하는 단계(S1010), 제1 신호와 제2 신호를 수신하는 단계(S1020), 제1 감지부의 응답 특성과 제2 감지부의 응답 특성을 보상하는 단계(S1030) 및 제1 신호와 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 단계(S1040)를 포함할 수 있다.
먼저, 여기광을 시료에 조사하는 단계(S1010)에서, 형광수명 측정 장치는 광원에서 여기광을 발생시킬 수 있다. 이에, 여기광은 상술한 1경로에 따라 시료로 조사되고 시료에서 발생한 형광 광자들이 제1 감지부로 이동할 수 있다. 또한, 여기광은 상술한 2경로에 따라 시료를 통과하지 않고 제2 감지부로 이동할 수 있다.
제1 신호와 제2 신호를 수신하는 단계(S1020)에서, 제1 감지부(210)는 제1 신호를 생성하고 제2 감지부는 제2 신호를 생성할 수 있다.
구체적으로, 제1 신호는 형광 분자를 포함하는 시료(S)에 조사할 여기광에 의해 생성된 형광 광자가 변환된 전기 신호이다. 상술한 형광 광자는 제1 감지부에서 수집될 수 있다. 또한, 제1 신호는 증폭된 형태일 수 있다.
그리고 제2 신호는 시료를 통과하지 않은 여기광이 변환된 전기 신호이다. 상술한 시료를 통과하지 않은 여기광은 제2 감지부에서 수집될 수 있다. 또한, 제2 신호는 증폭된 형태일 수 있다.
그리고 제1 감지부의 응답 특성과 제2 감지부의 응답 특성을 보상하는 단계(S1030)에서, 신호 처리부는 제2 감지부에서 생성된 제2 신호를 보상하여 제1 감지부의 응답 특성을 산출할 수 있다.
그리고 최종적으로 제1 신호와 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 단계(S1040)를 포함할 수 있다. 다시 말해, 제2 신호를 보상하여 얻은 제1 감지부의 응답 특성과 제1 신호에 대한 평균 시간 차이를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
도 8을 참조하면, 다른 실시예에 따른 형광수명 측정 방법은 여기광을 시료에 조사하는 단계(S2010), 제1 신호와 제2 신호를 수신하고 동시에 측정하는 단계(S2020), 제1 감지부의 응답 특성과 제2 감지부의 응답 특성을 보상하는 단계(S2030) 및 제1 신호와 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 단계(S2040)를 포함할 수 있다. 이하 생략된 내용이라 하더라도 도 1 내지 도 6 및 도 7에 도시된 형광수명 측정 장치 및 방법에 관하여 이상에서 기술된 내용은 본 실시예에 따른 형광수명 측정 방법에도 적용됨을 이해해야 한다.
먼저, 여기광을 시료에 조사하는 단계(S2010)에서, 형광수명 측정 장치는 광원에서 여기광을 발생시킬 수 있다. 이에, 여기광은 상술한 1경로에 따라 시료로 조사되고 시료에서 발생한 형광 광자들이 제1 감지부로 이동할 수 있다. 또한, 여기광은 상술한 2경로에 따라 시료를 통과하지 않고 제2 감지부로 이동할 수 있다.
제1 신호와 제2 신호를 수신하고 동시에 측정하는 단계(S2020)에서, 제1 감지부(210)는 제1 신호를 생성하고 제2 감지부는 제2 신호를 생성할 수 있다. 이 때, 상술한 바와 같이 트리거 신호에 대해 동일한 샘플링 간격으로 동시에 제1 신호와 제2 신호의 수집 타이밍을 가져갈 수 있다. 이에, 제1 신호와 제2 신호의 수집 타이밍의 불일치에 따른 오차를 최소화할 수 있다.
상술한 바와 같이 제1 신호는 형광 분자를 포함하는 시료(S)에 조사할 여기광에 의해 생성된 형광 광자가 변환된 전기 신호이다. 상술한 형광 광자는 제1 감지부에서 수집될 수 있다. 또한, 제1 신호는 증폭된 형태일 수 있다.
그리고 제2 신호는 시료를 통과하지 않은 여기광이 변환된 전기 신호이다. 상술한 시료를 통과하지 않은 여기광은 제2 감지부에서 수집될 수 있다. 또한, 제2 신호는 증폭된 형태일 수 있다.
그리고 제1 감지부의 응답 특성과 제2 감지부의 응답 특성을 보상하는 단계(S2030)에서, 신호 처리부는 제2 감지부에서 생성된 제2 신호를 보상하여 제1 감지부의 응답 특성을 산출할 수 있다.
그리고 최종적으로 제1 신호와 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 단계(S2040)를 포함할 수 있다. 다시 말해, 제2 신호를 보상하여 얻은 제1 감지부의 응답 특성과 제1 신호에 대한 평균 시간 차이를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 형광수명 측정 장치 및 방법은 평균 지연시간과 장치 지연 시간의 측정, 그리고 용이한 계산을 통하여 매우 짧은 시간에 장치 응답 함수의 기여를 제거하면서 정확성과 정밀성을 가지고 형광수명을 측정할 수 있다.
그리고 처리 속도가 향상된 본 발명에 따른 형광수명 측정 장치 및 방법을 형광수명 이미징 현미경에 적용할 경우, 광표백 효과(photo-bleaching effect)로 인한 열화를 최소화할 수 있으며, 실시간으로 3차원 이미지를 획득하는 것을 가능케 한다.
한편, 상술한 본 발명의 실시예들은 컴퓨터에서 실행될 수 있는 프로그램으로 작성가능하고, 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 이용하여 상기 프로그램을 동작시키는 범용 디지털 컴퓨터에서 구현될 수 있다. 상기 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체는 마그네틱 저장매체(예를 들면, 롬, 플로피 디스크, 하드 디스크 등), 광학적 판독 매체(예를 들면, 시디롬, 디브이디 등) 및 캐리어 웨이브(예를 들면, 인터넷을 통한 전송)와 같은 저장매체를 포함한다.
본 실시예에서 사용되는 '~부'라는 용어는 소프트웨어 또는 FPGA(field-programmable gate array) 또는 ASIC과 같은 하드웨어 구성요소를 의미하며, '~부'는 어떤 역할들을 수행한다. 그렇지만 '~부'는 소프트웨어 또는 하드웨어에 한정되는 의미는 아니다. '~부'는 어드레싱할 수 있는 저장 매체에 있도록 구성될 수도 있고 하나 또는 그 이상의 프로세서들을 재생시키도록 구성될 수도 있다. 따라서, 일 예로서 '~부'는 소프트웨어 구성요소들, 객체지향 소프트웨어 구성요소들, 클래스 구성요소들 및 태스크 구성요소들과 같은 구성요소들과, 프로세스들, 함수들, 속성들, 프로시저들, 서브루틴들, 프로그램 코드의 세그먼트들, 드라이버들, 펌웨어, 마이크로코드, 회로, 데이터, 데이터베이스, 데이터 구조들, 테이블들, 어레이들, 및 변수들을 포함한다. 구성요소들과 '~부'들 안에서 제공되는 기능은 더 작은 수의 구성요소들 및 '~부'들로 결합되거나 추가적인 구성요소들과 '~부'들로 더 분리될 수 있다. 뿐만 아니라, 구성요소들 및 '~부'들은 디바이스 또는 보안 멀티미디어카드 내의 하나 또는 그 이상의 CPU들을 재생시키도록 구현될 수도 있다.
이상에서 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 시료에 조사하는 여기광을 발생하는 광 생성부;
    상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성되는 형광 광자를 수신하여 제1 신호로 변환하는 제1 감지부 및 상기 여기광을 수신하여 제2 신호로 변환하는 제2 감지부를 포함하는 수집부; 및
    상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 신호 처리부;을 포함하고,
    상기 신호 처리부는 상기 제1 감지부의 응답 특성과 상기 제2 감지부의 응답 특성을 보상하여 상기 형광수명을 산출하고,
    상기 제1 감지부에서 상기 형광 광자를 수신하는 시간은 상기 제2 감지부에서 상기 응답 특성을 갖는 여기광을 수신하는 시간과 적어도 일부 중첩되는 형광수명 측정 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신호 처리부는 상기 제1 감지부의 응답 특성과 상기 제2 감지부의 응답 특성 간의 시간 차를 기설정된 값으로 변환하는 형광수명 측정 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 신호 처리부는 하기의 식 1에 의해 수행하는 형광수명 측정 장치.
    [식 1]
    CV={E1[E]+E1[P]}-{(E2[E]+E2[P])
    여기서, CV는 보상값이고, E1[E]+E1[P]는 여기광 광원과 제1 감지부의 응답 특성이고, E2[E]+E2[P]는 여기광 광원과 제2 감지부의 응답 특성이며, E1[E]+E1[P]와 E2[E]+E2[P]는 특정 시료의 고유의 형광수명을 대입하여 얻어진다
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신호 처리부는 상기 제1 신호의 평균 시간과 상기 제2 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 산출하는 형광수명 측정 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 신호 처리부는 상기 제1 신호의 주파수 영역의 위상과 상기 제2 신호의 주파수 영역 상의 위상을 이용하여 형광수명을 산출하는 형광수명 측정 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 측정하는 신호 측정부;를 더 포함하는 형광수명 측정 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 신호 측정부는 상기 제1 신호와 상기 제2 신호를 동일한 타이밍에 측정하는 형광수명 측정 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    싱기 제2 신호는 상기 시료를 통과하지 않은 형광수명 측정 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 광 생성부는,
    상기 여기광을 생성하는 광원; 및
    상기 시료에 조사하기 위하여 상기 생성된 여기광을 집광하는 제1 렌즈;를 포함하는 형광수명 측정 장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 수집부는,
    상기 여기광의 경로를 분할하는 스플리터;
    상기 형광 광자를 수집하는 제2 렌즈; 및
    상기 여기광이 제1 감지부로 이동하는 것을 방지하는 필터;를 포함하는 형광수명 측정 장치.
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