KR102430669B1 - 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치 - Google Patents

형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

실시예는, 여기광을 발생하는 광 생성부; 상기 여기광의 경로를 조절하는 조절부; 제1 신호 및 복수의 제2 신호레벨 범위를 갖는 제2 신호를 출력하는 감지부; 및 상기 제1 신호 및 상기 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호가 포화값 이하가 되도록 상기 복수의 제2 신호레벨 범위를 변경하는 신호처리부;를 포함하고, 상기 제1 신호는 상기 여기광을 감지하여 변환된 신호이고, 상기 제2 신호는 상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성된 형광 광자를 감지하여 변환된 신호인 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치를 개시한다.

Description

형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치{APPARATUS AND METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSTIC DEVICE BY MEASURING FLUORESCENCE LIFETIME}
실시예는 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치에 관한 것이다.
분자들은 전자 전이(electronic transition)에 의해 입사된 빛을 흡수하며, 어떤 분자들에서는 여기된 전자가 바닥상태(ground state)로 회복하면서 빛을 발하는 형광 현상을 일으키게 된다. 또한, 각 분자는 고유의 흡수 파장과 형광 방출 파장을 가지며 이들 사이에는 스톡스 천이(Stoke's shift)라고도 불리는 수십 나노미터의 파장의 차이가 있다. 즉, 흡수된 빛의 파장보다 다소 긴 파장의 빛이 형광 현상을 통해 방출되게 된다. 형광 물질은 빛의 흡수 파장과 방출 파장에 의해 특색지어질 수 있으며, 이러한 특성은 고전적인 형광 현미경의 원리가 된다.
형광 현미경에서는, 대상 형광 물질에 흡수될 파장의 여기광(excitation light)을 시료에 조사하고 이러한 여기광보다 긴 파장의 스톡스 천이된 형광신호가 시료의 특정 지점에서 수집되는지를 필름이나 CCD(Charge-coupled device)와 같은 배열 형태의 감지부(photo-detector)를 이용하여 검출하여 이미지를 얻는다.
형광 현미경의 응용에서는 주로 시료 자체가 특정한 형광을 가지는 분자를 내포하고 있거나(자체형광, autofluorescence) 혹은 외부에서 형광체를 주입하고 특정한 부위에 레이블링(labeling)함으로써 이미지를 얻게 되며, 주로 세포와 같은 생물학적 시료의 분자적 분포를 연구할 때 활용된다. 최근에 3차원적 이미지를 얻기 위하여 공초점 현미경, 다광자 여기 형광 현미경(multi-photon excitation fluorescence microscope) 등이 개발되고 있다.
기존의 형광 현미경에서는 형광 물질에서 나오는 형광 빛의 세기에 기초하여 이미지를 구성하는 것에 그쳤는데 반하여, 형광 빛의 세기 이외에 보다 고등적인 분광학적 정보를 수집하여 이미지를 구성하는 방법들이 근래에 들어 개발되고 있다. 특히 형광 물질 고유의 광학적 특성인 형광수명의 정보는 형광 물질이 놓인 환경에 대한 보다 상세한 정보를 제공하기 때문에 중요하다. 형광 분자에서 전자는 여기광에 의해 여기된 후에 여기상태(excited state)에서 일정한 시간 머물다가 확률적으로 바닥상태로 전이하며, 이때 형광 광자를 생성하게 된다. 시간 상에서 전자의 전이 확률, 즉 형광 광자의 생성 확률은 전자의 여기가 이뤄진 시점을 정점으로 하여 지수함수적 감쇠(exponential decay) 곡선을 그리게 된다. 이 지수함수적 감쇠 곡선의 특성 감쇠 시간을 형광수명이라 하며 이는 다수의 형광 광자의 생성　시간을 조사함으로써 측정될 수 있다.
본래에 형광수명은 외부의 간섭이 없다면 각 형광 분자의 특성 값이나, 형광수명은 형광 물질이 놓인 주위 환경에 따라서 변화할 수 있다. 즉, 각 형광 물질의 특성에 따라 특정 이온의 농도나, 산소의 농도, 산도(pH) 등에 의해 그 값이 변화하게 된다. 따라서 이러한 형광수명에 대한 정보를 통해 상기된 변수들의 공간적 분포를 조사하는 방식의 형광수명 이미징 현미경(fluorescence lifetime imaging microscope, 이하 FLIM)이 개발되고 있다. 이러한 형광수명 이미징 현미경은 기존의 형광 현미경을 통해 얻을 수 없거나 부정확했던 환경 정보를 정확하게 얻어낼 수 있는 강점을 가진다. 또한, 공초점 현미경 방식과 결합된 공초점 FLIM은 이러한 형광수명에 기반한 정보를 3차원적 분해능으로 얻어낼 수 있게 되고 소위 "4차원 이미징"을 가능케 한다.
한편, 다광자 여기 형광 현미경을 포함하는 공초점 현미경에서는 매 순간 공간상의 한 지점에 대한 측정이 이뤄지고 측정 지점이 스캔됨으로써 이미지 정보가 순차적으로 획득되게 된다. 공초점 현미경에서 측정은 현미경의 대물 렌즈의 초점(focus)에서 이뤄지게 되는데 이 초점은 대물 렌즈에 입사하는 빔의 방향이나 시료 자체의 움직임에 의해 공간적으로 스캔되게 된다. 그리고 공초점 현미경의 경우 오직 초점으로부터 대물 렌즈로 재입사된 빛만이 감지부에 도착할 수 있도록 핀홀(pinhole)과 같은 공간 필터를 갖는다. 다광자 여기 형광 현미경의 경우에는 다광자 여기 현상이 비선형 광학 현상으로서 오직 높은 광세기를 갖는 초점에서만 효과적으로 일어난다는 점 덕분에 핀홀없이 같은 효과를 얻을 수 있게 된다.
공초점 현미경의 이러한 특성 때문에 공초점 현미경에 기반한 FLIM의 형광수명 측정 기구는 시분해 분광학(time-resolved spectroscopy)의 형광수명 측정 기구와 크게 다르지 않다. 고전적인 시분해 분광학에서 형광수명의 측정은 시간-상관 단일 광자 계수기(time-correlated single photon counting, 이하 TCSPC)나 위상 형광 측정기(phase fluorometer)를 주로 사용한다.
또한, 형광수명의 측정은 같은 형광수명을 갖는 다수의 형광 분자가 생성시킨 다수의 광자나, 하나의 형광 분자가 다수번의 여기에 의해 생성시킨 다수의 광자를 대상으로 이뤄질 수 있다. 개념적으로 이는 시간 축에서 지수 함수적 감쇠 모양을 지닌 형광 파형을 분석하는 과정이다. 만약 무한에 가까운 형광 광자가 수집되었다면 얻어지는 형광 파형은 지수함수적 감쇠 모양을 지닌 형광의 확률분포 함수와 동일해 질 것이다. 매우 짧은 펄스폭을 갖는 여기광 조사가 t=0 시간에 이뤄질 때, 이에 따라 생성되는 형광 빛의 세기 혹은 형광 광자 밀도, IF(t)는 의 분포를 가진다. 이때 I0는 초기값이며, τ는 형광수명을 의미하고, u(t) 함수는 t<0일때 0, t≥0일때 1인 계단 함수를 나타낸다. 즉, 형광수명은 형광 광자의 방출 확률이 초기값에 비해 1/e 만큼 감소하는 시간을 의미한다.
또한, TCSPC는 PMT나 APD(avalanche photo diode)와 같은 높은 신호이득을 갖는 감지부를 이용하여 단일 광자에 의한 응답을 감지해낸다. 단일 광자에 의한 응답 펄스의 모양이 시간축에서 얼마나 긴 폭을 지니는지 여부와는 상관없이 단일 광자의 도착 시간은 정밀하게 측정될 수 있다. 이를 이용하면 0.1 나노초 수준의 형광수명도 측정할 수 있게 된다.
다만, "단일 광자 조건" 때문에 TCSPC에서의 형광수명 측정은 다수의 여기광 펄스가 입사되어 다수번 광자 계수가 이뤄진 후에만 완료되는 시간상의 문제가 존재한다 또한, 여기광 펄스 간의 시간 간격은 측정하고자 하는 형광 물질의 형광수명보다 충분히 길어야 하는 한계가 존재한다. 만약 여기광 펄스 간의 시간 간격이 형광수명과 비슷한 수준이 되면 시간상에서 인접한 두 형광 발광의 파형이 서로 중첩되어 정확한 값을 얻을 수 없게 되는 문제점이 존재하므로, 형광수명의 정확한 측정을 위해서는 여기광의 펄스 주기가 형광수명 τ의 5배 이상이 되어야 하는 한계 조건이 존재한다. 즉, 가장 이상적인 조건에서조차 TCSPC를 이용한 형광수명 측정에 의한 이미지를 얻기 위하여 매우 긴 측정 시간을 요하며 특히 3차원 이미징에서는 거의 한 시간 이상의 시간이 필요하게 된다. 동적인 활동이 있는 살아있는 생물체나 체외에서 특정 물질을 살피고자 할 때에 이러한 처리 시간은 큰 제약이 아닐 수 없다.
나아가, 생물체 또는 시료의 상태, 영역 등에 따라 발생하는 형광 광자가 다양하여 정확한 형광신호 또는 형광 수명 산출이 어려운 문제가 존재한다.
실시예는 시료의 상태, 영역에 따라 다양한 크기로 발생하는 형광 광자로부터 형광신호와 형광수명을 보다 빠른 시간에 정확하게 측정할 수 있는 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치를 제공한다.
또한, 측정된 형광수명의 공간적 분포를 기반으로 정확한 이미지를 구성하는 형광수명 이미징 현미경 등에 적합한 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치를 제공한다.
실시예에서 해결하고자 하는 과제는 이에 한정되는 것은 아니며, 아래에서 설명하는 과제의 해결수단이나 실시 형태로부터 파악될 수 있는 목적이나 효과도 포함된다고 할 것이다.
실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치는 여기광을 발생하는 광 생성부; 상기 여기광의 경로를 조절하는 조절부; 제1 신호 및 복수의 제2 신호레벨 범위를 갖는 제2 신호를 출력하는 감지부; 및 상기 제1 신호 및 상기 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호가 포화값 이하가 되도록 상기 복수의 제2 신호레벨 범위를 변경하는 신호처리부;를 포함하고, 상기 제1 신호는 상기 여기광을 감지하여 변환된 신호이고, 상기 제2 신호는 상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성된 형광 광자를 감지하여 변환된 신호이다.
상기 제1 신호는 복수의 제1 신호레벨 범위를 갖고, 상기 신호처리부는 서로 동일한 상기 제1 신호레벨 범위와 상기 제2 신호레벨 범위를 이용하여 상기 시료의 형광신호를 산출할 수 있다.
상기 시료의 형광신호는 최대값을 갖고, 상기 신호처리부는 상기 최대값과 상기 포화값의 차이가 가장 작도록 상기 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다.
상기 조절부는 상기 여기광을 상이한 경로로 분기된 제1 여기광 및 제2 여기광으로 조절할 수 있다.
상기 제1 신호는 상기 제1 여기광에 의해 생성되고, 상기 제2 신호는 상기 제2 여기광에 의해 생성될 수 있다.
상기 형광 광자를 감지하는 동안 상기 제1 여기광을 차단하는 셔터부;를 더 포함할 수 있다.
상기 셔터부는 상기 제1 여기광을 수신하는 동안 상기 형광 광자를 차단할 수 있다.
상기 신호처리부는 상기 제1 신호의 평균 시간과 상기 제2 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 상기 시료의 형광수명을 산출할 수 있다.
상기 신호처리부는 상기 시료의 영역 별로 상기 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다.
상기 신호처리부는 상기 시료의 영역 별로 상이한 제2 신호레벨 범위의 제2 신호를 이용하여 상기 시료의 형광신호 또는 상기 시료의 형광수명을 산출할 수 있다.
실시예에 따르면, 시료의 상태, 영역에 따라 다양한 크기로 발생하는 형광 광자로부터 형광신호와 형광수명을 보다 빠른 시간에 정확성과 정밀성을 가지면서 측정할 수 있는 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치를 구현할 수 있다.
또한, 형광수명 이미징 현미경 등에 적합한 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치를 구현할 수 있다.
본 발명의 다양하면서도 유익한 장점과 효과는 상술한 내용에 한정되지 않으며, 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하는 과정에서 보다 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치의 블록도이고,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 신호처리부의 동작을 설명하는 도면이고,
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 감지부의 제1 신호와 제2 신호를 설명하는 도면이고,
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 복수의 제1 신호레벨을 갖는 제1 신호를 도시한 도면이고,
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 복수의 제2 신호레벨을 갖는 제2 신호를 도시한 도면이고,
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치에서 제2 신호레벨 범위 변경 전의 도시한 예시도이고,
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치에서 제2 신호레벨 범위 변경 후를 도시한 예시도이고,
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 방법의 순서도이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제2, 제1 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제2 구성요소는 제1 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제1 구성요소도 제2 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치의 블록도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 신호처리부의 동작을 설명하는 도면이고, 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 감지부의 제1 신호와 제2 신호를 설명하는 도면이다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 실시예에 따른 체외진단 장치는 광 생성부(100), 조절부(200), 감지부(300) 및 신호처리부(400) 및 셔터부(500)를 포함할 수 있다.
먼저, 광 생성부(100)는 형광 분자를 포함하는 시료(S)에 조사할 여기광을 발생하는 모듈로서, 펄스 형태의 여기광을 생성하는 여기 광원(110)과 생성된 여기광을 집광하여 시료(S)에 조사하기 위한 제1 렌즈(120)로 이루어진다.
조절부(200)는 광원(110)으로부터 출사된 여기광의 경로를 조절할 수 있다. 예컨대, 조절부(200)는 여기광을 상이한 경로로 분기할 수 있다. 조절부(200)는 여기광을 경로에 따라 제1 여기광과 제2 여기광으로 분기할 수 있다. 제1 여기광은 제1 경로로 이동할 수 있다. 제2 여기광은 제2 경로로 이동할 수 있다.
실시예로, 제1 여기광은 시료(S)를 통과하지 않고 감지부(300)로 제공될 수 있다. 제2 여기광은 시료(S)로 제공될 수 있다. 그리고 제2 여기광에 의해 시료(S)에서는 형광 광자가 발생할 수 있다. 발생된 형광 광자는 감지부(300)로 제공될 수 있다. 다만, 제2 경로는 제2 여기광에 의해 생성된 형광 광자의 이동 경로를 포함한다. 나아가, 제1 여기광에 의해 감지부에서 생성된 전기 신호인 제1 신호도 제1 경로와 대응하게 도시하며, 제2 여기광(또는 형광 광자)에 의해 감지부에서 생성된 전기 신호인 제2 신호도 제2 경로와 대응하게 도시한다.
감지부(300)는 시료(S)에 여기광을 조사하여 생성되는 다수의 형광 광자 및 여기광을 수집할 수 있다.
실시예로, 감지부(300)는 복수 개의 광 검출 소자로 이루어질 수 있다. 감지부(300)로는 예를 들어, PMT(photo-multiplier tube)나 APD(avalanche photo diode)를 사용할 수 있다.
나아가, 감지부(300)는 적어도 하나 이상으로 감지부(300) 및 감지부(300)를 포함할 수도 있다. 이하에서는 하나의 감지부로 설명하며, 이로써 실시예에 따른 체외진단 장치에서 복수 개의 감지부에 의한 고유 응답 함수 변형을 최소화할 수 있다.
감지부(300)는 시료를 통과하지 않은 여기광을 전기 신호인 제1 신호로 변환할 수 있다. 감지부(300)는 제1 신호의 배율을 감지부에 인가된 전력, 전압에 의해 조절할 수 있다.
또한, 제1 신호는 복수 개의 제1 신호레벨 범위를 가질 수 있다. 복수 개의 제1 신호레벨 범위는 제1 신호의 배율 조절로 감지부에 인가된 전력, 전압에 의해 조절될 수 있다. 예컨대, 제1 신호는 전압 레벨 범위로 이루어질 수 있다. 그리고 복수 개의 제1 신호레벨 범위는 0 내지 1[V], 0 내지 3[V], 0 내지 5[V] 등으로 이루어질 수 있다.
제1 신호는 후술하는 제2 신호 출력 전후에 출력될 수 있다. 예컨대, 제1 신호는 감지부(300)에서 제2 신호 출력 전에 복수 개 출력될 수 있다. 서로 다른 제1 신호레벨 범위를 갖는 제1 신호는 광원으로부터 인가된 위상이 다른 또는 타임 시프트된 여기광에 의해 출력될 수 있다.
감지부(300)는 여기광이 시료에 조사됨으로써 생성되는 형광 광자를 수신하고, 수신된 형광 광자를 전기 신호인 제2 신호로 변환할 수 있다.
감지부(300)는 형광 광자 후술하는 소정의 렌즈에서 수집되어 필터(미도시됨)를 통과한 형광 광자를 전기 신호(제2 신호에 대응)로 변환할 수 있다. 이 때, 제2 신호의 배율(예컨대, 증폭)이 인가된 전력에 의해 조절될 수 있다.　
또한, 제2 신호는 복수 개의 제2 신호레벨 범위를 가질 수 있다. 마찬가지로 복수 개의 제2 신호레벨 범위는 제2 신호의 배율 조절로 감지부에 인가된 전력, 전압에 의해 조절될 수 있다. 예컨대, 제2 신호는 전압 레벨 범위로 이루어질 수 있다. 그리고 복수 개의 제2 신호레벨 범위는 0 내지 1[V], 0 내지 3[V], 0 내지 5[V] 등으로 이루어질 수 있다. 또한, 제2 신호레벨 범위는 제1 신호레벨 범위와 동일 또는 상이할 수 있다. 예컨대, 제2 신호레벨 범위는 제1 신호레벨 범위보다 클 수 있다. 이러한 구성에 의하여, 시료의 상태, 영역 등에 따라 상이한 양으로 발생된 형광 광자를 용이하게 측정할 수 있다.
또한, 감지부(300)는 렌즈, 필터 등을 더 포함할 수 있다. 렌즈는 시료(S)로부터의 형광 광자를 모집할 수 있다. 그리고 필터는 여기광을 제거할 수 있다. 이에, 형광 광자를 수집하는데 정확도가 개선될 수 있다.
신호처리부(400)는 감지부(300)에서 변환된 제1 신호 및 제2 신호를 이용하여 형광신호 및 형광수명을 산출할 수 있다. 예컨대, 신호처리부(400)는 감지부(300)에서 출력된 제2 신호를 디지털화 또는 퀀타이즈한뒤 시간에 대한 또는 시간 영역의 그래프로서 형광신호 함수를 산출할 수 있다.
그리고 신호처리부는 제1 신호 및 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호 또는 형광신호 함수가 포화값 이하가 되도록 복수의 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다.
따라서 신호처리부(400)는 제2 신호의 제2 신호레벨 범위를 조절하여 형광광자의 세기에 영향없이 정확한 형광신호 함수를 산출할 수 있다.
나아가, 신호처리부(400)는 감지부(300)에서 출력된 제1 신호를 디지털화 또는 퀀타이즈한뒤 시간에 대한 또는 시간 영역의 그래프로서 장치 응답 함수를 산출할 수 있다. 그리고 신호처리부(400)는 장치 응답 함수와 형광신호 함수를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
또한, 셔터부(500)는 복수 개의 셔터로 이루어질 수 있다. 예컨대, 셔터부(500)는 제1 셔터(510) 및 제2 셔터(520)를 포함할 수 있다. 제2 셔터(520)는 감지부 전단에 위치하고, 제2 셔터(520)는 시료(S) 전단에 위치할 수 있다. 셔터부(500)의 각 셔터는 일부 영역이 on/off 또는 개방/폐쇄되어 광을 차단 또는 통과시킬 수 있다.
이로써, 셔터부(500)는 제1 셔터(510)를 통해 형광 광자를 감지하는 동안 상기 제1 여기광을 차단할 수 있다. 또한, 셔터부(500)는 제2 셔터(520)를 통해 제1 여기광을 수신하는 동안 형광광자를 차단할 수 있다.
추가적으로, 형광수명을 이용한 체외진단 장치는 신호처리부(400)의 전단에 감지부(300) 및 감지부(300)에서 변환된 전기 신호를 측정하는 신호 측정부를 더 포함할 수 있다. 신호 측정부(미도시됨)는 신호처리부(400) 내/외에 위치할 수 있다. 예를 들어, 신호 측정부(미도시됨)로는 예를 들어 오실로스코프를 사용할 수 있다.
신호처리부(400)는 신호 측정부(미도시됨) 등에서 측정된 제1 신호의 평균 시간과, 제2 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산할 수 있다. 이 때, 상술한 디지털화된 제1 신호와 제2 신호를 이용하므로, 신호레벨 범위에 따라 장치 응답 함수와 형광신호 함수의 정확도가 상이할 수 있다. 실시예에 따른 신호처리부(400)는 형광신호 함수의 최대값과 포화값의 차이가 가장 작도록 제2 신호레벨 범위를 변경하므로, 보다 정확한 형광신호 함수를 산출하며, 나아가 정확한 형광 수명을 산출할 수 있다.
이에, 제1 신호는 IM(t)에 해당 또는 대응하고, IM(t)의 평균 시간은 후술하는 평균 지연 시간에 해당하며, 제2 신호는 후술하는 장치 응답 함수 IIRF'(t)에 해당 또는 대응하고 IIRF' (t)의 평균 시간은 후술하는 장치 지연 시간에 해당하게 된다. 이 때, 제1 신호도 IIRF (t)의 장치 지연 시간을 가질 수 있다. 그리고 실시예에 따르면, 감지부(300)는 동일한 구성요소로 응답 특성이 갖는 경로 차에 따른 환경 요소가 달라 일부 응답 특성이 상이할 수 있다. 또는 복수의 감지부로 이루어진 경우에 상이한 구성 요소로서 응답 특성이 상이할 수 있다. 이 때, 장치 응답함수도 상이하다. 다시 말해, 복수 개의 감지부인 경우나 제1 신호의 장치 응답 함수 IIRF(t)와 제2 신호의 장치 응답 함수 IIRF'(t)는 서로 상이하다.
이하, 본 발명에 따른 형광수명의 측정 원리에 대해서 설명한다.
먼저, 실시예에 따른 체외진단 장치는 광 수명을 측정 또는 산출하기 위해 짧은 펄스 형태의 여기광을 시료에 입사시키고 방출되는 형광의 시간 파형을 고속의 감지부를 통해 측정할 수 있다.
이에, 광원(110)은 짧은 펄스폭을 갖는 여기광을 생성할 수 있다. 예컨대, 광원(110)은 펄스형 레이저로 이루어질 수 있다.
형광의 세기와 여기광의 세기가 작아서 감지부(300) 및 감지부(300)는 상대적으로 큰 신호 증폭 능력을 지닌 PMT(photo-multiplier tube)나 APD(avalanche photo diode)로 이루어질 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112021008571187-pat00001
여기서, '"
Figure 112021008571187-pat00002
" 기호는 컨볼루션을 나타내며, IM(t)는 감지부에서 얻어지는 파형(이하 '형광신호 함수' 또는 '형광신호'와 혼용함)으로 특히 제2 여기광에 대한 신호 또는 제2 여기광에 의해 시료로부터 발생된 형광광자에 대한 신호나 파형이고, IE(t)는 여기광(예, 제1 여기광)의 파형으로 제1 여기광에 대한 신호 또는 파형이고, IP(t)는 감지부의 임펄스 응답(impulse response) 파형이고, T0는 여기광이 광원에서 제1 렌즈를 거쳐 감지부에 도착하는데 걸리는 거리에 따른 지연 시간을 나타낸다. 이러한 지연 시간은 형광 현상과 무관한 장치 고유 특성(응답 특성과 혼용) 값으로 사전에 측정될 수 있을 것이다. 본 명세서에서, 형광신호 함수는 디지털화된 제2 함수를 시간 영역 또는 시간에 대한 함수(또는 그래프)로서 아날로그화된 함수이고, 장치 응답 함수는 제1 함수를 시간 영역 또는 시간에 대한 함수(또는 그래프)로서 아날로그화된 함수이다. 본 명세서에서는 제1,2 신호를 디지털화한 후 시간 영역 또는 시간에 대한 함수로서 아날로그화한 함수(예, 형광신호 함수 또는 장치 응답 함수)를 디지털화 및 아날로그화로 도시한다. 나아가, 형광신호 함수가 디스플레이부(미도시됨)로 표시되며, 산출된 형광 수명도 디스플레이부를 통해 시료의 각 영역에 대해 도시되거나 정보 제공될 수 있다.
이때, IE(t)
Figure 112021008571187-pat00003
IP(t)를 장치 응답 함수(instrument response function, 이하 IRF)라 하고, IIRF(t)로 표기하기로 한다. IIRF(t)는 체외진단 장치의 전체 응답 함수를 의미하며 형광 현상과 무관한 장치 고유의 값일 수 있다. 이 때, 제1 여기광과 감지부에 대한 장치 응답 함수는 IIRF(t)로, 제2 여기광과 감지부에 대한 장치 응답 함수는 IIRF'(t)이나 제1 여기광과 감지부에 대한 장치 응답 함수는 IIRF(t)과 일부 차이 또는 동일할 수 있다. 그리고 감지부에서 검출된 파형은 형광 본연의 지수함수 감쇠 함수인 IF(t)와 IIRF(t)의 콘볼루션이고 이것이 T0만큼 지연된 형태로 나타나게 된다.
이를 바탕으로, 실시예에 따른 체외진단 장치는 측정된 또는 산출된 아날로그 파형 또는 산출된 장치 응답 함수에서 IRF 파형의 기여를 제거하기 위해 푸리에 영역 디컨볼루션(Fourier-domain deconvolution)을 이용하여 형광수명을 검출할 수 있다.
즉, 신호처리부(400)는 측정된 아날로그 파형인 IM(t)와 IIRF(t)를 푸리에 변환을 통해 주파수 영역으로 각각 IM(f)와 IIRF(f)로 변환한다. 그리고 IM(f)/IIRF(f)를 계산한 후에 역푸리에 변환을 수행하면 푸리에 변환과 컨볼루션의 수학적 특성에 의해 IF(t)만이 남게 될 것이다. 이는 푸리에 변환된 주파수 영역에서 컨볼루션 관계가 단순한 곱셈 관계로 변환되기 때문이다. 이러한 디컨볼루션 방법을 통해 IRF의 기여를 최소화 할 수 있다.
또한, 신호처리부(400)는 역푸리에 변환을 수행하지 않고 주파수 영역에서 바로 형광수명을 계산할 수 있다. 신호처리부(400)는 주파수 영역에서 형광수명인 IF(f)의 절대값 크기 혹은 위상 성분의 분석을 통해서 형광수명을 산출할 수 있다. 즉, 신호처리부(400)는 시간 영역에서 측정결과를 지수함수 감쇠곡선으로 곡선피팅(curve fitting)하는 것과 같이 주파수 영역에서 지수함수 감쇠곡선의 주파수영역 표현 곡선으로 곡선피팅하여 형광수명을 산출할 수 있다. 다시 말해, 임의의 주파수 f에 대해, 복소함수 IF(f)의 위상성분과 IIRF(f)의 위상성분의 차이를 θ라 하면 형광수명은 아래 수학식 2와 같을 수 있다.
[수학식 2]
Figure 112021008571187-pat00004
여기서, τ는 형광수명을 의미한다.
이에 따라, 유효 주파수 범위 내에서 측정 결과를 위 함수로 곡선피팅하면 정확한 형광수명을 산출할 수 있다. 그리고 이를 통해 측정된 결과를 푸리에 변환을 통해 주파수 영역으로 변환하면 IRF의 기여는 단순한 곱셈(절대값에 대해)이나 덧셈(위상에 대해)과 같은 대수적 관계로 나타나게 되어 IRF의 기여를 쉽게 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 신호처리부(400)는 형광수명 측정의 고속성을 얻기 위해서는 TCSPC에서와 같은 단일 광자에 의한 응답이 아닌 다수의 형광 광자에 의해 야기된 아날로그 형태의 펄스 전기신호를 처리하여 형광수명을 산출할 수도 있다.
상술한 바와 같이 감지부로부터 측정된 펄스전기 신호가 형광 발광 현상 고유의 지수함수 감쇠곡선 (exponential decay curve)과 IRF 파형의 컨볼루션(convolution)일 수 있다.
이 때, 실시예에 따른 신호처리부(400)는 형광수명의 측정을 평균 시간 영역에서 형광수명을 결정하여 디컨볼루션을 빼기(차이값도출) 과정으로 수행할 수 있다. 이에, 실시예에 따른 체외진단 장치는 형광수명이 보다 용이하게 측정할 수 있다.
신호처리부(400)는 무한한 개수의 형광 광자가 만드는 펄스 전기 신호가 그 중 개별적인 하나의 형광 광자에 대해서 펄스 전기 신호 곧, 양자역학적으로 단위 전하량(전자의 전기량)이 후술하는 신호처리부에 도착하는 시간상의 확률분포 함수 (probability distribution function, 이하 PDF)로 풀이할 수 있다. 그리고 랜덤(random) 신호에 대해서 확률분포 함수의 컨볼루션은 각 확률분포 함수에 대응되는 개별 랜덤 변수(random variable)의 합이 되게 된다. 따라서 상술된 수학식 1에 대응하는 하기의 수학식 3이 성립한다.
[수학식 3]
Figure 112021008571187-pat00005
여기서, M, E, F, P는 각각 IM(t), IE(t), IF(t), IP(t)를 PDF로 간주했을 때 각각에 대응되는 시간 랜덤 변수이다. T0는 광경로에 의한 고정적 지연 시간으로 결정된 변수이다. 구체적으로, M은 신호처리부에 도착하는 전자의 도착시간, E는 그 중 형광 광자를 야기시키는 여기광 광자의 도착시간, P는 형광 광자에 의해 광전 변환된(photon-electron conversion) 전자 하나의 도착시간, F는 형광 분자 하나가 형광 광자 하나를 방출하는데 걸리는 시간을 의미한다. 하나의 형광 광자와 이에 의해 야기된 하나의 신호 전자에 대해서 E, F, P는 확률적인 랜덤 변수이거나 또는 그렇게 간주될 수 있다. 랜덤 변수간에 덧셈 관계가 성립한다면 그 랜덤 변수에 대한 기대값(expectation value) 즉, 평균값에 대해서도 덧셈 관계가 성립한다. 즉, E[·]를 평균 연산자라 하면(아래첨자는 감지부에서 대상 여기광을 의미하며 제1 여기광은 1로, 제2 여기광은 2로 나타남), 시간 변수에 대한 평균값, 즉 평균 시간은 적분구간 T에 대해서 다음 수학식 4로 표현된다.
[수학식 3]
Figure 112021008571187-pat00006
여기서, A(t)는 각각의 시간 랜덤 변수에 대한 확률분포 함수를 나타낸다. 그리고 적분구간 T는 이론적으로는 무한대의 값을 가져야만 이상적인 적분값을 구할 있지만, 펄스형 여기광을 사용하여 형광수명을 구하는 시스템에서는 제한된 신호의 주기시간 안에서 적분을 하면 된다. 지수함수적 감쇠곡선에서의 적분은 특정 시상수 τ의 5배, 즉 감쇠곡선 최고치의 e-5의 크기가 되는 시간까지의 적분은 99.3%의 면적을 적분하게 되는 것이다. 따라서 그 이상의 시간에 대해서의 적분과는 큰 차이게 없을 수 있다. 따라서 평균 시간을 구하기 위한 적분구간 T를 예를 들어 5τ까지의 구간으로 정의할 수 있다.
상기 수학식 3에 따라서 평균 시간에 대해서 다음 수학식 5가 성립한다.
[수학식 5]
Figure 112021008571187-pat00007
상기 수학식 5는 후술하는 신호처리부에 도착하는 펄스 전기신호 파형의 평균 지연 시간 E[M]이 여기광 광원과 감지부의 응답 특성으로서의 IRF 지연인 E[E]+E[P]와 광경로에 의한 지연 T0, 그리고 형광 현상에 의한 지연 E[F]의 총합으로 표현됨을 의미한다. 이 중 IRF 지연과 광경로에 의한 지연의 합을 장치 지연 시간이라 하면, 이는 E[E]+E[P]+T0로 나타나게 된다. 그리고 지수함수적 감쇠곡선에서 특성 시상수 τ는 그 곡선의 평균 지연 시간 값과 같으므로(τ=E[F]), 형광수명 τ는 최종적으로 E[M]-{E[E]+E[P]+T0}로 나타나게 된다. 따라서 형광수명은 상술한 바와 같은 평균 지연 시간에서 장치 지연 시간을 뺀 값이 된다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 장치 응답 함수 IIRF(t)의 평균 <t>IRF는 상술한 감지부에 대한 장치 지연 시간을 나타내고, 감지부에서 얻어지는 파형 IM(t)의 평균 <t>M은 상술한 평균 지연 시간을 나타낸다. 이때, 장치 응답 함수와 감지부에서 얻어지는 형광신호 파형의 시작점은 동일 또는 상이할 수 있다. 이하에서는 상이한 것을 기준으로 설명한다. 그리고 도 2에 도시된 바와 같은 두 개의 파형의 평균 시간의 차이를 이용하면 E[F], 즉 형광수명 τ를 산출할 수 있다. 즉, 신호처리부는 상술한 방식으로 형광수명을 산출할 수 있다.
그리고 신호처리부(400)에서 상기 제1 신호의 평균 시간 E1(t)는 다음 수학식 6을 이용하여 계산될 수 있다.
[수학식 6]
여기서, A(t)는 상기 제1 신호 또는 장치 응답 함수를 나타내며, T는 적분 주기로서 형광수명 측정의 정확도에 따라 특정 값으로 설정할 수 있다.
또한, 신호처리부(400)에서 제2 신호의 평균 시간 E2(t)는 다음 수학식 7을 이용하여 계산될 수 있다.
[수학식 7]
여기서, B(t)는 상기 제2 신호 또는 형광신호 함수를 나타내며, T는 상기 수학식에서의 적분 주기와 동일한 값이다.
신호처리부(400)는 제2 신호의 평균 시간에 대한 보상을 수행하고 상술한 바와 같이 제2 신호의 평균 시간과 제1 신호의 평균 시간의 차이(E2(t) - E1(t))를 형광수명으로 산출할 수 있다.
이러한 보상에 의해, 신호처리부(400)는 시료를 통과하지 않은 제1 여기광과 이에 대한 감지부의 응답 특성으로서의 IRF 지연인 E1[E]+E1[P]을 산출할 수 있다 (T0는 상술한 바와 같이 지연 시간으로, 지연 시간은 형광 현상과 무관한 장치 고유 특성(응답 특성과 혼용) 값인바 사전에 측정될 수 있을 것이기에 제외함).
보다 구체적으로, 신호처리부(400)는 감지부의 응답 특성을 나타내는 제1 신호를 감지부의 응답 특성을 나타내는 보상된 제1 신호로 변환하기 위하여, 특정 시료에 대한 고유의 형광수명을 반영하여 저장된 보상값을 이용할 수 있다.
다시 말해, 신호처리부(400)는 보상값을 아래의 수학식 8을 이용하여 계산할 수 있다.
[수학식 8]
CV={(E2[E]+E2[P])}- {E1[E]+E1[P]}
여기서, CV는 보상값이고, E1[E]+E1[P]는 여기광(제1 여기광) 광원과 감지부의 응답 특성이고, E2[E]+E2[P]는 여기광(제2 여기광) 광원과 감지부의 응답 특성이며, E1[E]+E1[P]와 E2[E]+E2[P]는 특정 시료의 고유의 형광수명을 수학식 1에 대입하여 얻어진다. 또는 감지부가 복수 개인 경우, 보상값은 복수 개의 감지부에 대한 제1 여기광의 응답 특성 간의 차이로 산출될 수 있다.
이러한 구성에 의하여, 실시예에 따른 체외진단 장치는 형광 광자에 대한 제2 신호와 여기광이 시료를 통과하지 않은 제1 신호를 시간차 없이 또는 시간차를 최소화한 상태로 얻으면서도 형광수명을 정확하게 산출할 수 있다.
특히, 실시예에 따른 체외진단 장치는 감지부를 통해 측정된 제1 신호의 응답 특성(장치 응답 함수)과 감지부에서 수집한 형광 광자(제2 신호)에 대한 응답 특성(형광신호 함수)의 차이를 제거할 수 있다. 즉, 경로 차이 등의 환경 요소에 따른 오차를 제거할 수 있다. 이에 따라, 실시예에 따른 신호처리부는 감지부를 통해 측정된 응답 특성(형광 신호)와 감지부의 응답 특성(장치 응답 함수)의 차이만을 보상하여, 상술한 바와 같이 감지부에 대한 응답 특성과 형광 광자에 대한 신호를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다. 이러한 구성에 의하여, 경로 차이와 무관하고 형광 광자를 수신하는 시간과 적어도 일부 중첩되는 시간동안 응답 특성을 갖는 여기광을 수신함으로써 중첩되는 시간만큼의 시간절약이 이루어질 수 있다. 이에 따라, 형광수명이 보다 빠르고 정확하게 산출될 수 있다.
나아가, 도 3에서와 같이 실시예에 따른 장치는 감지부를 통해 측정된 제1 신호에 대한 파형(장치 응답 함수)과 감지부에서 수집한 형광 광자에 대한 파형(형광신호 함수) 간의 신호 수신 시간차(Δt)가 존재하더라도 이는 광원에 의한 여기광의 인가 차이(제1 여기광과 제2 여기광의 인가 시간차)에 따른 시간차인 바 미리 구해지는 값으로 이를 제거할 수 있다. 이에 따라, 실시예에 따른 신호처리부는 감지부를 통해 측정된 제1 신호의 응답 특성과 제2 신호의 응답 특성의 차이와 상술한 시간차를 보상하여, 상술한 바와 같이 감지부에 대한 응답 특성과 형광 광자에 대한 신호를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 복수의 제1 신호레벨을 갖는 제1 신호를 도시한 도면이고, 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 복수의 제2 신호레벨을 갖는 제2 신호를 도시한 도면이다.
도 4 및 도 5를 참조하면, 제1 신호(SG1)는 복수의 제1 신호레벨 범위(SSG1 내지 SSG3)를 갖고, 제2 신호는 복수의 제2 신호레벨 범위(SSG4 내지 SSG6)를 가질 수 있다.
먼저, 제1 신호(SG1)는 상술한 바와 같이 복수의 제1 신호레벨 범위(SSG1 내지 SSG3)를 갖는다. 예컨대, 복수의 제1 신호레벨 범위(SSG1 내지 SSG3)는 제1 서브 신호레벨 범위(SSG1), 제2 서브 신호레벨 범위(SSG2) 및 제3 서브 신호레벨 범위(SSG3)를 포함한다.
상술한 바와 같이 제1 신호(SG1)는 제1 여기광이 변환된 신호이다. 즉, 제1 신호(SG1)는 제1 여기광의 변환된 전기 신호이다. 제1 신호(SG1)는 전기 신호로, 예컨대 전압일 수 있다.
이 때, 제1 신호(SG1)는 감지부에 인가되는 전력 조절에 의해 상술한 다양한 제1 신호레벨 범위를 가질 수 있다. 복수의 제1 신호레벨 범위는 서로 상이한 전기 신호 범위로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 서브 신호레벨 범위(SSG1)는 0레벨 내지 제1 레벨(A0)로 이루어질 수 있다. 또한, 제2 서브 신호레벨 범위(SSG2)는 0레벨 내지 제2 레벨(A1)의 범위로 이루어질 수 있다. 그리고 제3 서브 신호레벨 범위(SSG3)는 0레벨 내지 제3 레벨(A2)의 범위로 이루어질 수 있다. 여기서, 제1 레벨(A0)은 제2 레벨(A1)보다 작고, 제2 레벨(A1)은 제3 레벨(A2)보다 작을 수 있다.
이에 따라, 감지부에서 변환된 제1 신호(SG1)는 복수의 제1 신호레벨 범위에 따라 상술한 장치 응답 함수(IIRF(t))도 상이하게 나타날 수 있다. 즉, 특정 제1 신호레벨 범위를 갖는 제1 신호(SG1)를 기반으로 디지털화(digitizing) 또는 퀀타이즈(quantize)될 수 있다. 상기 디지털화 또는 퀀타이즈는 신호처리부에서 예컨대, 복수의 비트로 이루어질 수 있다. 그리고 디지털화된 제1 신호(SG1)를 이용하여 장치 응답 함수(IIRF(t))가 산출되고, 시간 영역 또는 시간에 대한 그래프로 도시된 바와 같이 표시될 수 있다.
따라서 동일한 체외진단 장치에서 장치 자체의 응답 함수 또는 고유 함수는 동일하더라도 디지털화 또는 퀀타이즈에 의해 산출되는 장치 응답 함수(IIRF(t))는 일부가 상이할 수 있다.
제1 서브 신호레벨 범위(SSG1)를 갖는 제1 신호는 제1 장치 응답 함수(IIRF1(t))로 산출 또는 표시될 수 있다. 또한, 제2 서브 신호레벨 범위(SSG2)를 갖는 제1 신호는 제2 장치 응답 함수(IIRF2(t))로 산출 또는 표시될 수 있다. 또한, 제3 서브 신호레벨 범위(SSG3)를 갖는 제1 신호는 제3 장치 응답 함수(IIRF3(t))로 산출 또는 표시될 수 있다.
제1 장치 응답 함수(IIRF3(t)) 내지 제3 장치 응답 함수(IIRF3(t))는 동일 또는 적어도 일부가 상이할 수 있다. 예컨대, 디지털화 또는 퀀타이즈화에 의해 일부 오차가 발생할 수 있다.
그리고 제1 서브 신호레벨 범위(SSG1) 내지 제3 서브 신호레벨 범위(SSG3)는 서로 간의 최대 레벨의 차이(제1 레벨 내지 제3 레벨 간의 차이)가 존재한다. 또한, 이러한 복수의 제1 신호레벨 범위를 갖는 제1 신호(SG1)는 제2 신호(SG2)의 출력 전 또는 후에 출력될 수 있다. 나아가, 복수의 제1 신호레벨 범위의 개수에 대응하여 순차로 여기광이 인가된다.
제2 신호(SG2)는 복수의 제2 신호레벨 범위(SSG4 내지 SSG6)를 갖는다. 예컨대, 복수의 제2 신호레벨 범위(SSG4 내지 SSG6)는 제4 서브 신호레벨 범위(SSG4), 제5 서브 신호레벨 범위(SSG5) 및 제6 서브 신호레벨 범위(SSG6)를 포함한다.
상술한 바와 같이 제2 신호(SG2)는 제2 여기광이 변환된 신호이다. 즉, 제2 신호(SG2)는 제2 여기광의 변환된 전기 신호이다. 제2 여기광은 여기광이 시료로 조사된 이후에 발생한 형광 광자이다. 또한, 제2 신호(SG2)는 전기 신호로, 예컨대 전압일 수 있다.
이 때, 제2 신호(SG2)는 감지부에 인가되는 전력 조절에 의해 상술한 다양한 제2 신호레벨 범위를 가질 수 있다. 복수의 제2 신호레벨 범위는 서로 상이한 전기 신호 범위로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제4 서브 신호레벨 범위(SSG4)는 0레벨 내지 제4 레벨(A3)로 이루어질 수 있다. 또한, 제5 서브 신호레벨 범위(SSG5)는 0레벨 내지 제5 레벨(A4)의 범위로 이루어질 수 있다. 그리고 제6 서브 신호레벨 범위(SSG6)는 0레벨 내지 제6 레벨(A5)의 범위로 이루어질 수 있다. 여기서, 제4 레벨(A3)은 제5 레벨(A4)보다 작고, 제4 레벨(A4)은 제6 레벨(A5)보다 작을 수 있다.
이에 따라, 감지부에서 변환된 제2 신호(SG2)는 복수의 제1 신호레벨 범위에 따라 상술한 형광신호 함수(IM(t))도 상이하게 나타날 수 있다. 즉, 제1 신호와 같이 특정 제2 신호레벨 범위를 갖는 제2 신호(SG2)를 기반으로 디지털화(digitizing) 또는 퀀타이즈(quantize)될 수 있다. 상기 디지털화 또는 퀀타이즈는 신호처리부에서 예컨대, 복수의 비트로 이루어질 수 있다. 그리고 디지털화된 제2 신호(SG2)를 이용하여 형광신호 함수(IM(t))가 산출되고, 시간 영역 또는 시간에 대한 그래프로 도시된 바와 같이 표시될 수 있다.
따라서, 여기광에 의해 시료로부터 발생한 형광신호가 동일하더라도 제2 신호레벨 범위에 따라 디지털화 또는 퀀타이즈에 의해 산출되는 형광신호 함수(IM(t))가 다를 수 있다.
나아가, 동일한 체외진단 장치에 의해 여기광에 의해 시료에서 발생한 형광신호는 시료의 상태 등에 따라 영역 별로 크기가 다양할 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
그리고 제4 서브 신호레벨 범위(SSG4)를 갖는 제2 신호는 제1 형광신호 함수(IM1(t))로 산출 또는 표시될 수 있다. 또한, 제5 서브 신호레벨 범위(SSG5)를 갖는 제2 형광신호 함수(IM2(t))로 산출 또는 표시될 수 있다. 또한, 제6 서브 신호레벨 범위(SSG6)를 갖는 제2 신호는 제3 형광신호 함수(IM3(t))로 산출 또는 표시될 수 있다.
제1 형광신호 함수(IM1(t)) 내지 제3 형광신호 함수(IM3(t))는 적어도 일부가 상이할 수 있다. 예컨대, 디지털화 또는 퀀타이즈화에 의해 일부 오차가 발생할 수 있다.
그리고 제4 서브 신호레벨 범위(SSG4) 내지 제6 서브 신호레벨 범위(SSG6)는 서로 간의 최대 레벨의 차이(제1 레벨 내지 제3 레벨 간의 차이)가 존재한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치에서 제2 신호레벨 범위 변경 전의 도시한 예시도이고, 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치에서 제2 신호레벨 범위 변경 후를 도시한 예시도이다.
도 6을 참조하면, 동일한 체외진단 장치에 의해 여기광에 의해 시료에서 발생한 형광신호는 시료의 상태 등에 따라 영역 별로 크기가 다양할 수 있다. 그리고 신호처리부는 시료의 영역 별로 제2 신호레벨 범위를 변경하여 형광신호 함수, 형광수명을 산출할 수 있다. 이러한 구성에 의하여, 시료의 상태, 위치 또는 형광의 정도에 따라 감지부에서 측정된 레벨이 상이하더라도 정확한 형광신호 함수, 형광수명을 산출할 수 있다. 나아가, 정확한 형광신호 함수, 형광수명을 산출함에 있어서 전력 소모도 줄일 수 있다.
실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치에서 복수의 제2 신호레벨 범위 중 하나를 갖는 제2 신호를 기반으로 형광신호 함수(IM(t))를 산출 또는 표시될 수 있다.
예컨대, 복수의 제2 신호레벨 범위 중 제5 서브 신호레벨 범위를 갖는 제2 신호를 기반으로 각 영역 별 형광신호 함수(IM(t))(상기 제2 형광신호 함수에 대응)가 산출 또는 표시될 수 있다. 또한, 각 형광신호 함수는 최대값을 가질 수 있다.
제1 영역(K1)에서는 제2-1 형광신호 함수(IMK1(t))가 산출 또는 표시될 수 있다. 제2-1 형광신호 함수(IMK1(t))는 제1 최대값(VM1--)을 가질 수 있다. 그리고 제2 영역(K2)에서는 제2-2 형광신호 함수(IMK2(t))가 산출 또는 표시될 수 있다. 제2-2 형광신호 함수(IMK2(t))는 제2 최대값(VM2--)을 가질 수 있다. 또한, 제3 영역(K3)에서는 제2-3 형광신호 함수(IMK3(t))가 산출 또는 표시될 수 있다. 제2-3 형광신호 함수(IMK3(t))는 제3 최대값(VM3'--)을 가질 수 있다.
이 때, 신호처리부는 형광신호 함수의 최대값과 포화값의 차이가 가장 작도록 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다. 여기서, 포화값은 감지부의 최대 레벨이 디지털화된 값일 수 있다. 즉, 최대전력이 인가된 감지부에서 출력된 최대 레벨의 전기 신호가 디지털화된 값일 수 있다. 예컨대, 제2 신호가 0 내지 5[V] 의 값이고, 제2 신호는 8비트로 디지털화될 수 있다. 이 때, 255레벨의 신호(예로, 전압 등)가 포화값일 수 있다.
제1 영역(K1)에서는 제2-1 형광신호 함수(IMK1(t))가 온전히 산출 또는 표시될 수 있다. 도 7을 더 참조하면, 제1 영역(K1)에서는 제2-1 형광신호 함수(IMK1(t))가 유지되어 산출 또는 표시될 수 있다.
이와 달리, 제2 영역(K2)에서는 제2-2 형광신호 함수(IMK2(t))가 불연속하게 산출 또는 표시될 수 있다. 예컨대, 제2-2 형광신호 함수(IMK2(t))의 제2 최대값(VM2--)이 복수 개일 수 있다. 나아가, 제2-2 형광신호 함수(IMK2(t))의 제2 최대값(VM2--)이 시간 상에서 서로 이격될 수 있다. 이 때, 신호처리부는 형광신호 함수의 최대값과 포화값의 차이가 가장 작도록 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다.
도 7을 더 참조하면, 제2 영역(K2)에서는 변형된 제2-2 형광신호 함수(IMK2'(t))가 산출 또는 표시될 수 있다. 이에, 포화값보다 큰 값을 갖는 형광신호 함수의 값에 대해서도 제2 신호레벨 범위의 변경으로 정확한 산출이 이루어질 수 있다. 이에, 제2 신호레벨 범위의 변경 전 대비 보다 정확한 형광신호 함수가 산출 또는 표시될 수 있다. 나아가, 산출 또는 표시된 형광신호 함수와 제1 신호에 의한 장치 응답 함수를 이용하여 정확한 형광수명이 산출될 수 있다.
그리고 제3 영역(K3)에서는 제2-3 형광신호 함수(IMK2(t))가 온전히 산출 또는 표시될 수 있다. 다만, 제3 최대값(VM3-)은 포화값의 소정의 비율보다 작을 수 있다. 예컨대, 제3 최대값(VM3-)은 포화값의 50%이하일 수 있다. 이 때, 신호처리부는 형광신호 함수의 최대값과 포화값의 차이가 가장 작도록 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다.
도 7을 더 참조하면, 제3 영역(K3)에서는 변형된 제2-3 형광신호 함수(IMK3'(t))가 산출 또는 표시될 수 있다. 따라서 매우 작은 형광신호 함수의 값에 대해 디지털화의 오류를 줄일 수 있다. 다시 말해, 제2 신호레벨 범위의 변경 전 대비 보다 정확한 형광신호 함수가 산출 또는 표시될 수 있다. 이에 따라, 산출 또는 표시된 형광신호 함수와 제1 신호에 의한 장치 응답 함수를 이용하여 정확한 형광수명이 산출될 수 있다.
나아가, 전술한 복수의 제1 신호레벨 범위를 갖는 제1 신호를 이용하여 제2 신호에 대한 형광신호 함수를 정확하게 산출할 수 있다. 예컨대, 신호처리부는 서로 동일한 신호레벨 범위를 갖는 상기 제1 신호레벨 범위와 상기 제2 신호레벨 범위를 이용하여 시료의 형광신호 또는 형광신호 함수를 산출할 수 있다. 이에, 오차가 감소된 정확한 형광수명이 신호처리부에 의해 산출될 수 있다.
또한, 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 장치는 시료에 대해 여기광을 일정 영역(시료 측정 범위에 대응)에 라인스캐닝으로 조사할 수 있다.
이에, 신호처리부는 상술한 바와 같이 시료의 영역 별로 상이한 제2 신호레벨 범위의 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호 또는 상기 시료의 형광수명을 산출할 수 있다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 방법의 순서도이다.
도 8을 참조하면, 이하 생략된 내용이라 하더라도 도 1 내지 도 7에 도시된 체외진단 장치에 관하여 이상에서 기술된 내용은 본 실시예에 따른 형광수명 측정 방법에도 적용됨을 이해해야 한다.
형광수명 측정 방법은 여기광을 시료에 조사하는 단계(S1010), 제1 신호와 제2 신호를 수신하는 단계(S1020), 제1 신호와 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호가 포화값 이하가 되도록 제2신호레벨 범위를 변경하는 단계(S1030) 및 형광수명을 산출하는 단계(S1040)를 포함할 수 있다.
먼저, 여기광을 시료에 조사하는 단계(S1010)에서, 체외진단 장치는 광원에서 여기광을 발생시킬 수 있다. 이에, 여기광은 상술한 2경로에 따라 시료로 조사되고 시료에서 발생한 형광 광자들이 감지부로 이동할 수 있다. 또한, 여기광은 상술한 1경로에 따라 시료를 통과하지 않고 감지부로 이동할 수 있다. 이 때, 셔터부에 의해 감지부로 여기광과 형광 광자가 수신되는데 서로 간의 영향이 억제할 수 있다.
제1 신호와 제2 신호를 수신하는 단계(S1020)에서, 감지부는 제1 신호와 제2 신호를 생성할 수 있다.
구체적으로, 그리고 제1 신호는 시료를 통과하지 않은 여기광(제1 여기광)이 변환된 전기 신호이다. 상술한 시료를 통과하지 않은 여기광은 감지부에서 수집될 수 있다. 제2 신호는 형광 분자를 포함하는 시료(S)에 조사할 여기광에 의해 생성된 형광 광자가 변환된 전기 신호이다. 상술한 형광 광자는 감지부에서 수집될 수 있다.
제1 신호와 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호가 포화값 이하가 되도록 제2 신호레벨 범위를 변경하는 단계(S1030)에서 신호처리부는 감지부에서 생성된 제2 신호의 디지털화 또는 퀀타이즈하고, 예컨대 디지털화된 제2 신호를 형광신호 함수로 그리고 디지털화된 제1 신호를 장치 응답 함수로 산출하고 표시할 수 있다.
이 때, 상술한 바와 같이 신호처리부는 시료의 영역 별로 상이한 제2 신호레벨 범위의 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호 또는 상기 시료의 형광수명을 산출할 수 있다.
그리고 신호처리부는 형광신호 함수의 최대값과 포화값의 차이가 가장 작도록 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다. 또한, 신호처리부는 형광신호 함수의 최대값과 포화값의 차이가 가장 작도록 제2 신호레벨 범위를 변경할 수 있다. 나아가, 신호처리부는 서로 동일한 신호레벨 범위를 갖는 상기 제1 신호레벨 범위와 상기 제2 신호레벨 범위를 이용하여 시료의 형광신호 또는 형광신호 함수를 산출할 수 있다. 이 때, 복수의 제1 신호레벨 범위를 갖는 제1 신호는 미리 측정되어 데이터 베이스 등에 저장될 수 있다.
그리고 최종적으로 제1 신호와 제2 신호를 이용하여 형광수명을 산출하는 단계(S1040)를 포함할 수 있다. 다시 말해, 제2 신호레벨 범위의 변경으로 얻는 제2 신호에 대한 형광신호 함수를 산출할 수 있다. 그리고 동일한 신호레벨 범위를 갖는 제1 신호레벨 범위에 대한 제1 신호와 제2 신호레벨 범위의 변경으로 얻는 제2 신호에 대한 형광신호 함수를 이용하여 보다 정확하고 오차가 적은 형광수명을 산출할 수 있다.
예컨대, 상술한 바와 같이 제1 신호 또는 제1 신호를 기반으로 하는 장치 응답 함수의 평균 시간과 제2 신호 또는 제2 신호레벨 범위의 변경으로 얻는 제2 신호에 대한 형광신호 함수의 평균 시간 간의 차이를 이용하여 형광수명을 산출할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치는 평균 지연시간과 장치 지연 시간의 측정, 그리고 용이한 계산을 통하여 매우 짧은 시간에 장치 응답 함수의 기여를 제거하면서 정확성과 정밀성을 가지고 형광수명을 측정할 수 있다.
그리고 처리 속도가 향상된 본 발명에 따른 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치를 형광수명 이미징 현미경에 적용할 경우, 광표백 효과(photo-bleaching effect)로 인한 열화를 최소화할 수 있으며, 실시간으로 3차원 이미지를 획득하는 것을 가능케 한다.
한편, 상술한 본 발명의 실시예들은 컴퓨터에서 실행될 수 있는 프로그램으로 작성가능하고, 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 이용하여 상기 프로그램을 동작시키는 범용 디지털 컴퓨터에서 구현될 수 있다. 상기 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체는 마그네틱 저장매체(예를 들면, 롬, 플로피 디스크, 하드 디스크 등), 광학적 판독 매체(예를 들면, 시디롬, 디브이디 등) 및 캐리어 웨이브(예를 들면, 인터넷을 통한 전송)와 같은 저장매체를 포함한다.
본 실시예에서 사용되는 '~부'라는 용어는 소프트웨어 또는 FPGA(field-programmable gate array) 또는 ASIC과 같은 하드웨어 구성요소를 의미하며, '~부'는 어떤 역할들을 수행한다. 그렇지만 '~부'는 소프트웨어 또는 하드웨어에 한정되는 의미는 아니다. '~부'는 어드레싱할 수 있는 저장 매체에 있도록 구성될 수도 있고 하나 또는 그 이상의 프로세서들을 재생시키도록 구성될 수도 있다. 따라서, 일 예로서 '~부'는 소프트웨어 구성요소들, 객체지향 소프트웨어 구성요소들, 클래스 구성요소들 및 태스크 구성요소들과 같은 구성요소들과, 프로세스들, 함수들, 속성들, 프로시저들, 서브루틴들, 프로그램 코드의 세그먼트들, 드라이버들, 펌웨어, 마이크로코드, 회로, 데이터, 데이터베이스, 데이터 구조들, 테이블들, 어레이들, 및 변수들을 포함한다. 구성요소들과 '~부'들 안에서 제공되는 기능은 더 작은 수의 구성요소들 및 '~부'들로 결합되거나 추가적인 구성요소들과 '~부'들로 더 분리될 수 있다. 뿐만 아니라, 구성요소들 및 '~부'들은 디바이스 또는 보안 멀티미디어카드 내의 하나 또는 그 이상의 CPU들을 재생시키도록 구현될 수도 있다.
이상에서 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 여기광을 발생하는 광 생성부;
    상기 여기광의 경로를 조절하는 조절부;
    제1 신호 및 복수의 제2 신호레벨 범위를 갖는 제2 신호를 출력하는 감지부; 및
    상기 제1 신호 및 상기 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호가 포화값 이하가 되도록 상기 복수의 제2 신호레벨 범위를 변경하는 신호처리부;를 포함하고,
    상기 제1 신호는 상기 여기광을 감지하여 변환된 신호이고,
    상기 제2 신호는 상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성된 형광 광자를 감지하여 변환된 신호이고,
    상기 시료의 형광신호는 최대값을 갖고,
    상기 신호처리부는 상기 최대값과 상기 포화값의 차이가 가장 작도록 상기 제2 신호레벨 범위를 변경하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 신호는 복수의 제1 신호레벨 범위를 갖고,
    상기 신호처리부는 서로 동일한 상기 제1 신호레벨 범위와 상기 제2 신호레벨 범위를 이용하여 상기 시료의 형광신호를 산출하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조절부는 상기 여기광을 상이한 경로로 분기된 제1 여기광 및 제2 여기광으로 조절하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 신호는 상기 제1 여기광에 의해 생성되고,
    상기 제2 신호는 상기 제2 여기광에 의해 생성되는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 형광 광자를 감지하는 동안 상기 제1 여기광을 차단하는 셔터부;를 더 포함하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 셔터부는 상기 제1 여기광을 수신하는 동안 상기 형광 광자를 차단하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 신호처리부는 상기 제1 신호의 평균 시간과 상기 제2 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 상기 시료의 형광수명을 산출하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  9. 여기광을 발생하는 광 생성부;
    상기 여기광의 경로를 조절하는 조절부;
    제1 신호 및 복수의 제2 신호레벨 범위를 갖는 제2 신호를 출력하는 감지부; 및
    상기 제1 신호 및 상기 제2 신호를 이용하여 시료의 형광신호가 포화값 이하가 되도록 상기 복수의 제2 신호레벨 범위를 변경하는 신호처리부;를 포함하고,
    상기 제1 신호는 상기 여기광을 감지하여 변환된 신호이고,
    상기 제2 신호는 상기 여기광이 상기 시료에 조사되어 생성된 형광 광자를 감지하여 변환된 신호이고,
    상기 신호처리부는 상기 시료의 영역 별로 상기 제2 신호레벨 범위를 변경하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 신호처리부는 상기 시료의 영역 별로 상이한 제2 신호레벨 범위의 제2 신호를 이용하여 상기 시료의 형광신호 또는 상기 시료의 형광수명을 산출하는 형광수명을 이용한 체외진단 장치.
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