JP2019502125A - 電子励起状態の平均寿命時間を測定するための発光寿命時間測定方法及び装置 - Google Patents
電子励起状態の平均寿命時間を測定するための発光寿命時間測定方法及び装置 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明の技術は、以下のように、従来の時間領域(例えばTCSPC)及びゲート増倍カメラの決定と比較されうる。従来のTCSCP法は、高いパルス反復周波数(例えば40MHzを超える)を提供するが、「パイルアップ」なく単一光子検出の必要があるために、取得率がずっと低く(例えば1%)、そのため本方法は低レベル信号に制限される。さらに、点走査(共焦点)システムでは励起デューティサイクルが低く、信号分析は一般に反復曲線フィッティングを必要とする。狭いパルスを有する従来のゲート増倍カメラFLIMは、ゲートウィンドウが狭く、減衰曲線を画定するために時間的に連続的に変位させる必要があるため、発光検出効率が低く、狭く低エネルギーの励起パルスを使用する必要があるため信号強度が低く、信号分析は反復曲線フィッティングを必要とする。従来の方法はまた、可変持続時間で少数の検出ウィンドウで構成可能であるが、複雑な混合物の信頼性の高い寿命時間を提供することができず、狭い励起パルスの使用のため感度に制限がある。
図1は、本発明に従う発光寿命時間測定装置100の好適な実施形態を概略的に示しており、この装置は励起源デバイス10と、検出器デバイス20と、分析デバイス30と、を含む。
本発明の発光寿命時間測定方法を実施するために、顕微鏡19内の試料1が、励起源デバイス10からの少なくとも1つの励起光パルスで照射される。試料1からの発光反応、例えば蛍光反応は、時間的分解能を有して検出される。時間分解検出は、単一の励起パルスまたはサンプリングされた一連の励起パルスで、例えば最大1MHzの繰り返し率で得られる。カメラ21のゲート幅に応じて、収集された時間検出器応答関数は、試料1からの時間依存の発光応答または積分された時間依存応答を含む。収集された時間検出器応答関数に基づいて、試料1の電子励起状態の平均寿命時間が、以下に概説されるように計算される。
rfIRF[t]=(t−t1)・sIRF nrf1=rf1・sIRF/s1
s1=rf1の傾き=0.0016 nrf2=rf2・sIRF/s2
s2=rf2の傾き=0.0024
sIRF=rfIRFの傾き=0.004
(IRF:計器応答関数、すなわち、τ=0での発光反応であり、励起光パルスの上昇区間2に対応する)
τ=t−tIRF=t−t1−nrf[t]/s(計算により、元のrf値及び線形領域におけるそれらの傾きのみが必要になる)。実験的に、t1はIRF曲線から決定される。
t1=t−rfIRF[t]/sIRF
τ1=55−10−0.0688/0.0016=2nsであり、
τ2=55−10−0.096/0.0024=5ns
fr=最終rfi1=4(=amp1・τ1) nrfi1=rfi1/fr
fb=最終rfi2=15(=amp2・τ2) nrfi2=rfi2/fb
firf=最終rfiIRF=5(=ampIRF) nrfiIRF=
rfiIRF/firf
s1=傾きrfi1=0.1(=rf1,max) nsIRF=sIRF/firf
(rfiIRFの規格化された傾き)
s2=傾きrfi2=0.375(=rf2,max)
sIRF=傾きrfiIRF=0.125(=rfIRF,max)
τ=t−tIRF=t−t1−nfr[t]/nsIRF
nsIRF=0.025
τ1=45−10−0.825/0.025=2ns、
τ2=40−10−0.75/0.025=5nsである。
2 線形増大区間
3 一定強度のパルス区間
10 励起源デバイス
11 レーザーダイオード
12 駆動回路
14 ダイクロイックミラー
15 サーキュラライザー
16 拡散器
17 非球面コンデンサ
18 高速フォトダイオードパルスモニター18
19 顕微鏡
20 検出器デバイス
21 カメラ
22 プロセッサ
23 参照光学要素
23.1 線形s偏光子
23.2 広帯域ビームスプリッター
23.3 四分の一波長板
23.4 顕微鏡対物レンズ
23.5 ミラー
23.6 線形p偏光子
23.7 中立密度フィルター
30 分析デバイス
100 発光寿命時間測定装置
Claims (39)
- 発光寿命時間測定方法、特に試料の電子励起状態の平均寿命時間を測定するための方法であって、
少なくとも1つの励起光パルスで試料を照射する段階と、
前記試料からの発光応答を時間分解検出し、時間的な検出器応答関数を形成する段階と、
前記検出器応答関数に基づいて前記電子励起状態の前記平均寿命時間を計算する段階と、を含み、
前記少なくとも1つの励起光パルスが、前記試料が線形増加する、または一定の数の前記電子励起状態を含む平衡励起定常状態を達成するような形状であり、
前記検出器応答関数が一定の傾きを有する線形応答関数区間を有し、
前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)が、前記少なくとも1つの励起光パルスの参照時間に対する前記線形応答関数区間の時間位置及び前記線形応答関数区間の傾きの少なくとも1つに基づいて計算されることを特徴とする、発光寿命時間測定方法。 - 前記少なくとも1つの励起光パルスが線形増大区間(2)を含み、
前記検出器応答関数が、前記線形応答関数区間を含む前記試料からの時間依存発光応答を含む、請求項1に記載の寿命時間測定方法。 - 前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)が、τ=t−rf(t)/srf(t)に基づいて計算され、
tが前記パルスの開始後の時間位置であり、rf(t)が考慮される時間位置における前記発光応答であり、srf(t)が時間tにおける前記線形応答関数区間の傾きである、請求項2に記載の寿命時間測定方法。 - 前記少なくとも1つの励起光パルスが一定強度のパルス区間(3)を含み、
前記検出器応答関数が、前記線形応答関数区間を含む前記試料からの時間積分発光応答を含む、請求項1に記載の寿命時間測定方法。 - 前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)がτ=t−rfi(t)/srfi(t)に基づいて計算され、
tは考慮される時間位置であり、rfi(t)は前記考慮される時間位置における積分された発光応答であり、srfi(t)は時間tにおける前記線形応答関数区間の傾きである、請求項4に記載の寿命時間測定方法。 - 前記試料からの時間積分された発光応答が、一定の強度を有する前記パルス区間(3)の開始後に、少なくとも2つの積分時間間隔で収集される、請求項4または5に記載の寿命時間測定方法。
- 前記試料からの前記時間積分された発光応答が、前記試料からの時間依存する発光応答及び前記時間依存する発光応答の最終的な不変の値の少なくとも1つを収集することによって得られる、請求項4または5に記載の寿命時間測定方法。
- 前記少なくとも励起光パルスが、ある持続時間を有する前記線形増大区間(2)または一定強度を有する前記パルス区間(3)を含み、これが前記試料の前記励起状態の最長寿命時間の少なくとも5倍、特に少なくとも7倍よりも長く、及び/または最大12倍、特に最大10倍である、請求項2から7のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記線形増大区間(2)及び/または一定強度の前記パルス区間(3)の前記持続時間が、10nsから10msの範囲で選択される、請求項8に記載の寿命時間測定方法。
- 前記平均寿命時間(τ)が、参照試料または参照光学要素から得られる較正応答関数を用いて計算される、請求項1から9のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記試料からの前記発光応答が、単一の検出器素子または検出器素子のアレイで検出される、請求項1から10のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記試料からの前記発光応答が、前記試料の平均寿命時間画像を提供する時間ゲートカメラで検出される、請求項1から11のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記試料が、前記少なくとも1つの励起光パルスによって励起される単一電子遷移を含み、
前記平均寿命時間(τ)が前記単一電子遷移の単一の発光寿命時間である、請求項1から12のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。 - 前記試料が前記少なくとも1つの励起光パルスによって励起される複数の電子遷移を含み、
前記平均寿命時間(τ)が前記電子遷移の強度の平均発光寿命時間である、請求項1から12のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。 - 前記検出器応答関数が、1つの単一励起パルスの間に、前記試料からの前記発光応答を検出することによって生成される、請求項1から14のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記検出器応答関数が、一連の励起パルスの間に、前記試料からの前記発光応答を検出することによって生成される、請求項1から14のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記検出器応答関数が、時間相関単一光子計数で前記発光応答を検出することによって生成される、請求項1から16のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。
- 前記試料が、
物質、特に巨大分子、配位子及び小分子の混合物、
微小環境のプローブ、
共振エネルギー遷移を受ける成分、
生物学的物質、特に生物学的細胞、
生物学的物質、特に細胞小器官、
病理生物学的物質、特に沈着物、
アレイ内、特にマルチウェルアッセイプレート内に分布する成分、
流動流体、特にフロー血球計算器内の流動流体、
流路内の物質、特に微小流動流路内の物質、
視覚系の構造、特に眼科学における構造、
皮膚の構造、特に皮膚科学における構造、
歯に関する構造、特に歯科学における構造、
組織、特に生体組織検査における組織、
組織、特に蛍光ガイド外科手術における組織、
組織、特に血管内ロボットによりアクセスされる組織、
自己蛍光物質、特に組織内の自己蛍光物質、
組織、特に小動物画像取得時の組織、
法医学的検査における物質、
固体材料、特に表面、
の少なくとも1つを含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の寿命時間測定方法。 - 特に試料の電子励起状態の平均寿命時間(τ)を測定するための発光寿命時間測定装置(100)であって、
少なくとも1つの励起光パルスを有する前記試料を照射するために配置された励起源デバイス(10)と、
前記試料からの発光応答を時間分解検出し、時間的検出器応答関数を生成するために配置された検出器デバイス(20)と、
前記検出器応答関数に基づいて前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)を計算するために配置された分析デバイス(30)と、を含み、
前記試料が、線形増加するまたは一定数の前記電子励起状態を含む平衡励起定常状態を達成し、前記検出器応答関数が一定の傾きを有する線形応答関数区間を有するように、前記励起源デバイス(10)が前記少なくとも1つの励起光パルスを成形するように適合され、
前記分析デバイス(30)が、前記少なくとも1つの励起光パルスの参照時間に対する前記線形応答関数区間の時間位置及び前記線形応答関数区間の傾きの少なくとも1つに基づいて、前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)を計算するために適合されたことを特徴とする、発光寿命時間測定装置(100)。 - 前記励起源デバイス(10)が、線形増大区間(2)を有する少なくとも1つの励起光パルスを生成するために適合され、
前記検出器デバイス(20)が、前記線形応答関数区間を含む前記試料からの時間依存発光応答を含む前記時間的検出器応答関数を生成するために適合された、請求項19に記載の寿命時間測定装置。 - 前記分析デバイス(30)が、τ=t−ts−rf(t)/sに基づいて前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)を計算するために適合され、
tは考慮される時間位置であり、tsは前記線形増大区間(2)の参照開始時間であり、rf(t)は前記考慮される時間位置における前記発光応答であり、sは前記線形応答関数区間の傾きである、請求項20に記載の寿命時間測定装置。 - 前記励起源デバイス(10)が、一定強度のパルス区間(3)を有する前記少なくとも1つの励起光パルスを生成するために適合され、
前記検出器デバイス(20)が、前記線形応答関数区間を含む前記試料からの前記時間積分された発光応答を含む前記時間的検出器応答関数を生成するために適合された、請求項19に記載の寿命時間測定装置。 - 前記分析デバイス(30)が、τ=t−ts−rfi(t)/sに基づいて、前記電子励起状態の前記平均寿命時間(τ)を計算するように適合され、
tは考慮される時間位置であり、tsは前記一定パルス区間の参照開始時間であり、rfi(t)は前記考慮される時間位置における積分発光応答であり、sは前記線形応答関数区間の傾きである、請求項22に記載の寿命時間測定装置。 - 前記検出器デバイス(20)が、少なくとも2つの積分時間間隔で、一定強度の前記パルス区間(3)の開始後に前記試料から前記時間積分発光応答を収集するように適合された、請求項22または23に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が、前記試料からの少なくとも1つの時間依存発光応答及び、前記励起光パルスの終了後に達成される前記時間依存発光応答の最終値を収集するために適合された、請求項22または23に記載の寿命時間測定装置。
- 前記励起源デバイス(10)が、ある持続時間を有する前記線形増大区間(2)または一定強度の前記パルス区間(3)を含む前記少なくとも1つの励起光パルスを生成するように適合され、これが前記試料の励起状態の最長寿命時間の少なくとも5倍、特に少なくとも7倍よりも長く、及び/または最大12倍、特に最大10倍である、請求項20から25のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記線形増大区間(2)または一定強度の前記パルス区間(3)の持続時間が10nsから10msの範囲で選択されるように、前記励起源デバイス(10)が前記少なくとも1つの励起光パルスを生成するために適合された、請求項20から26のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記励起源デバイス(10)が、レーザーダイオード(11)、LED及びパルスレーザーの少なくとも1つを含む、請求項19から27のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記励起源デバイス(10)が、反復率、強度、トリガリング及び/またはゲート幅制御を提供する駆動回路(12)を含む、請求項19から28のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 較正の目的のために配置された参照光学要素をさらに含む、請求項19から29のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が、
単一の検出器素子、
検出器素子のアレイ、及び
前記試料の平均寿命時間画像を提供する時間ゲートカメラ、の1つを含む、請求項19から30のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。 - 前記検出器デバイス(20)が、単一または複数の固体または真空電子素子並びに、光子計数情報、特に光子数及び到達時間を提供する関連する検出器プロセッサを含む、請求項31に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が、プログラム可能なゲート遅延及び幅を有し、前記励起源デバイスを同期するための信号を提供するゲート増倍カメラ(21)を含む、請求項31に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が、1つの単一の励起パルスの間に、前記試料からの前記発光応答を検出することによって、前記検出器応答関数を生成するために適合された、請求項19から33のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が、一連の励起パルスの間に、前記試料からの前記発光応答を検出することによって、前記検出器応答関数を生成するために適合された、請求項19から33のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が時間相関単一光子計数のために適合された、請求項19から35のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記検出器デバイス(20)が、50ps未満の時間分解能及び/または70ps未満のジッターで、前記試料からの前記発光応答を検出するために適合された、請求項19から36のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記励起源デバイス(10)及び前記検出器デバイス(20)が、顕微鏡(19)、特に超解像能力を有する走査顕微鏡に統合された、請求項19から37のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
- 前記励起源デバイス(10)及び前記検出器デバイス(20)が、光学区画能力を有する広視野顕微鏡に統合された、請求項19から37のいずれか一項に記載の寿命時間測定装置。
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