CN110462381B - 用于高速分析多指数衰减函数类型实验数据的荧光寿命测量装置及其测量方法 - Google Patents

用于高速分析多指数衰减函数类型实验数据的荧光寿命测量装置及其测量方法 Download PDF

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Abstract

根据本发明实施例的荧光寿命测量装置包括：照射光发生单元，其用于产生照射光；荧光光子检测单元，其用于收集通过用照射光照射包含荧光分子的至少一个样本而产生的荧光光子；转换单元，其用于放大荧光光子，以将荧光光子转换成荧光信号；以及测量单元，其用于通过使用由模拟函数乘以荧光信号的函数的积分值而获得的函数来分析所述荧光信号的函数的数据。

Description

用于高速分析多指数衰减函数类型实验数据的荧光寿命测量 装置及其测量方法
技术领域
以下描述涉及一种用于测量荧光寿命的荧光寿命测量装置和荧光寿命测量方法，并且更具体地涉及一种可以以最短时间独立地测量两个或更多个混合样本的荧光寿命的荧光寿命测量装置和荧光寿命测量方法。
背景技术
显微镜分为第一代光学显微镜、第二代电子显微镜和第三代扫描探针显微镜，并且广泛应用于诸如医学、分子生物学、新药开发和材料工程等应用。
然而，荧光寿命成像显微镜现在正成为显微镜研究中的关键技术。荧光寿命成像显微镜是最准确地测量荧光共振能量转移(FRET)的设备(FLIM-FRET)。FRET是这样的现象：当两个荧光分子位于10nm或更近的近距离处时，能量从一个荧光分子转移到另一个荧光分子，而没有发射或吸收光。通过使用FRET，可以观察到在几纳米范围内发生并且因此用光学显微镜无法看到的现象，使得在诸如细胞膜、DNA、RNA、蛋白质-蛋白质相互作用等许多生命科学领域中需求迅速增加。
特别地，用作荧光寿命成像显微镜的TCSPC通过使用具有高信号增益的光电检测器(例如PMT或雪崩光电二极管(APD))来检测单光子的响应。不管由单光子产生的响应脉冲的形状在时间轴上是否具有长的宽度，都可以精确地测量单光子的到达时间。以这种方式，也可以测量0.1纳秒的荧光寿命。在每次测量中仅检测到单光子的情况下，可以通过检测所测量的单光子响应的上升沿的到达时间来测量单光子的到达时间。到达时间测量的准确性原则上与光电检测器的输出脉冲宽度无关。然而，高增益光电检测器在操作原理方面具有渡越时间离散(TTS)的问题。与TCSPC中的模拟脉冲响应脉冲宽度相比，PMT在时间测量中表现出高约5倍的精度。以这种方式计数的单光子的到达时间被用于通过数字方法产生时间轴直方图；并且在计数进行了数百次至数千次之后，通过对指数衰减函数进行拟合，将直方图看作荧光光子发射的概率分布函数(PDF)，可以计算荧光寿命。
作为一种具有高灵敏度和稳定性的测量方法，TCSPC广泛用于时间分辨光谱学和荧光寿命成像显微镜(FILM)领域的各种应用。然而，TCSPC在单光子计数方法中基本上限制了测量时间。在TCSPC中，在每个测量周期仅一个光子被计数。即使当通过激发光脉冲从多个荧光分子产生多个荧光光子时，也需要有意地降低由计数器计数的光子的强度，从而每个脉冲仅应产生一个光子。如果计数器在测量周期内检测到两个或多个光子，特别是如果两个光子的到达时间太接近而不能分成两个脉冲，则计数器仅对首先到达的光子的值进行计数，使得发生信号损失，导致比实际值更短的荧光寿命。
此外，即使在单光子中，如果混合具有两种或更多种不同荧光寿命的多个样本，则在独立地测量荧光寿命时可能存在更多的问题。
也就是说，对于具有两个或更多个指数衰减函数的混合的数据，通过计算每个指数衰减函数的衰减常数和特定指数衰减函数在总数据中的比例，可以分析待测量对象的成分。这种计算一般可以通过非线性最小二乘曲线拟合来进行，其中建立指数衰减函数的数学模型，并通过调整数学模型的参数与实验数据进行比较，以获得其间具有最大差异的参数。然而，非线性最小二乘曲线拟合方法使用重复算法，该重复算法通过重复调整参数直到模型函数和测量数据之间的差异变为最小，来将模型函数与测量数据进行比较。如果模型函数和测量数据之间的差异小于给定的容差条件，则非线性最小二乘曲线拟合方法终止计算，因此存在这样的缺点：该方法可能仅获得参数的近似值。此外，该算法是重复计算直到满足容差条件的算法，因此导致用于获得期望值的大量计算。在用于图像构造的MRI或FILM设备的情况下，需要分析构成二维或三维图像的数十万到数百万像素的多个荧光信号，因此存在这样的缺点：完成整个图像的计算时间非常长。
发明内容
技术问题
根据本发明的实施例，提供了这样的荧光寿命测量装置和荧光寿命测量方法：它们即使在混合了具有不同荧光寿命的两个或更多个荧光样本时也可以快速独立地测量荧光寿命。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种荧光寿命测量装置，包括：照射光发生器，其构造为产生照射光；荧光光子检测器，其构造为用所述照射光照射包含荧光分子的至少一个或多个样本，并收集由照射产生的荧光光子；转换器，其构造为放大所述荧光光子，并将放大的荧光光子转换成荧光信号；以及测量器，其构造为通过使用由一个值乘以模拟函数而获得的函数来分析所述荧光信号的函数的数据，所述一个值通过对所述荧光信号的函数进行积分而获得。
根据本发明的另一方面，提供一种荧光寿命测量方法，包括：产生照射光；用所述照射光照射至少一个或多个样本，并收集由照射产生的荧光光子；将所述荧光光子转换成荧光信号；以及通过使用由一个值乘以模拟函数而获得的函数来分析所述荧光信号的函数的数据进行测量，所述一个值通过对所述荧光信号的函数进行积分而获得。
有益效果
根据本发明的实施例，即使当混合例如具有不同荧光寿命的两个或更多个样本时，也可以更快速地计算样本的荧光寿命值。
附图说明
图1是示出根据本发明实施例的荧光寿命测量装置的框图。
图2是示出根据本发明实施例的荧光寿命测量方法的流程图。
具体实施方式
通过参考示例性实施例的以下详细描述和附图，可以更容易地理解本发明的优点和特征以及实现它们的方法。然而，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了使本公开彻底和完整，并且将本发明的构思完全传达给本领域技术人员，本发明将仅由所附权利要求限定。
除非另外限定，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。将进一步理解，诸如在常用词典中定义的那些术语应被解释为具有与其在相关领域和本公开的上下文中的含义一致的含义，并且除非在此明确地如此定义，否则不应当以理想化或过于正式的意义来解释。
在下文中，将参考附图描述根据本发明实施例的荧光寿命测量装置100。
图1是示出根据本发明实施例的荧光寿命测量装置100的框图。参考图1，照射光发生器110可以产生照射光以激发样本S。照射光以相对于时间的脉冲形式平行入射到准直器112上。
入射照射光通过短通滤波器(SPF)113并从二向色滤光器320反射，以通过物镜131入射到样本S中。入射照射光允许从样本S产生荧光光子。
产生的荧光光子通过物镜131被收集到共焦扫描仪120中，以通过二向色滤光器132。
然后，荧光光子被转换器140放大以转换成荧光信号，并且放大的荧光信号被传输到测量器150。
测量器150基于接收到的荧光信号计算荧光光子的荧光寿命。
照射光发生器110包括照射光源111，照射光源111作为用于产生照射到含有荧光分子的样本S的照射光的结构。
照射光的脉冲宽度为100psec或更小，照射光的波长为300nm至700nm。根据本发明实施例的照射光源111包括半导体激光器。
此外，半导体激光器可包括脉冲宽度为300ps或更小的电脉冲信号发生器、用于产生稳定触发信号的脉冲时钟发生器、具有400nm波长的半导体脉冲激光头。
照射光发生器110还可包括用于收集照射光的准直器112和SPF113。
共焦扫描仪120允许三维成像，使得可以三维地测量样本S随光时或随波长的变化。
根据本发明实施例的共焦扫描仪120包括水平扫描仪和竖直扫描仪。水平扫描仪包括检流计镜，并且可以使用检流计镜以超高速二维扫描。竖直扫描器包括电机驱动装置或压电驱动装置(PZT)。电机驱动装置和压电驱动装置都可以通过开环系统或闭环系统来控制。
荧光光子检测器130是用于利用照射光照射一个或多个样本S并收集由照射产生的多个荧光光子的模块。荧光光子检测器130包括荧光光子聚光透镜131和用于防止照射光被稍后将描述的转换器140接收的二向色滤光器132。
荧光光子聚光透镜131是用于收集从样本S产生的多个荧光光子的透镜。荧光光子聚光透镜131可以用作物镜。
二向色滤光器132是根据波长选择性地使入射照射光通过的滤光器。根据本发明实施例的二向色滤光器132具有反射对应于照射光的波段并使对应于荧光光子的波段通过的特性。然而，可以根据需要调整由二向色滤光器132反射或通过的波段。
此外，从中除去照射光的荧光光子通过低通滤波器(loss-passfilter，LPF)，由荧光光子检测器的准直器(未示出)收集。
转换器140是这样的模块：其用于放大已经通过二向色滤光器132的荧光光子，并且将放大的荧光光子转换成荧光信号。转换器140包括光电检测器、放大器和数字转换器。
根据本发明实施例的光电检测器和放大器包括光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管(APD)和/或LPF以及AMP。
光电检测器将收集到的荧光光子转换成荧光信号。通过转换获得的荧光信号被传输到LPF。
LPF是用于使低频信号通过的滤波器，并且可以暂时放大时钟信号。根据本发明实施例的LPF包括电子高斯低通滤波器(GLPF)。
GLPF去除高频分量，以便于转换后的时钟信号的数据处理。GLPF是对称的，没有振铃的发生。GLPF减小时钟信号的带宽，以对应于数字转换器的带宽。
数字转换器通过考虑具有小脉冲宽度的照射光来恢复信号。具体地，数字转换器收集时钟信号，并且用作AMD测量器150的一部分，AMD测量器150基于收集到的时钟信号计算荧光寿命。
测量器150是用于计算从至少一个或多个样本收集的荧光光子的荧光寿命的模块。测量器150可以基于以下原理测量荧光寿命。
测量器150可以测量至少一个或多个样本的荧光寿命，其中一个或多个样本的测量可通过以下方法进行。
测量荧光寿命的最直观方法包括通过使用高速光电检测器测量荧光的时间波形，该荧光是在具有短脉冲宽度的激发光入射到样本上之后发射的。使用脉冲型激光作为具有短脉冲宽度的激发光。
在这种情况下，通过将每个样本的数据定义为I(t)，I(t)可以由n个指数衰减函数之和来描述，其可以由以下等式来表示。
[等式1]
Figure BDA0002214260400000061
这里，是τi第i个指数衰减常数，并且ci是表示总函数中第i个指数衰减函数的混合比例的常数。通过将对I(t)进行归一化使得I(t)的积分值变为1而获得的函数定义为f(t)，f(t)可以由以下等式表示。
[等式2]
Figure BDA0002214260400000062
这里，A具有以下等式。
[等式3]
Figure BDA0002214260400000063
这里，I(t)是测量数据，f(t)是通过对I(t)进行归一化使得I(t)的积分值变为1而获得的函数。也就是说，通过对函数f(t)进行积分，
Figure BDA0002214260400000071
也就是说，f(t)相对于时间轴具有1的积分值，使得f(t)可以是时间变量的概率分布函数的类型。在等式1中的测量数据由n个指数衰减函数的混合组成的情况下，需要2n个联立方程以获得n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn。在这种情况下，在函数的混合比例之和必须等于1的条件下，可以获得以下等式。
[等式4]
Figure BDA0002214260400000072
除了上述等式之外，还需要一个等式，它可以表示与指数衰减常数τ1τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n-1个联立方程。
这里，模拟函数可以是指数函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如
Figure BDA0002214260400000073
表示。
在这种情况下，通过对函数
Figure BDA0002214260400000074
(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式5]
Figure BDA0002214260400000075
通过使用上面的等式5，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式5并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数
Figure BDA0002214260400000076
相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
此外，在另一实例中，模拟函数可以是根(radical root)函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如
Figure BDA0002214260400000077
表示。
在这种情况下，通过对函数
Figure BDA0002214260400000081
(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式6]
Figure BDA0002214260400000082
通过使用上面的等式6，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式6并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
另外，在又一实例中，模拟函数可以是正弦函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如gk(t)≡sin(t/ak)表示。
在这种情况下，通过对函数gk(t)≡sin(t/ak)(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式7]
Figure BDA0002214260400000083
通过使用上面的等式7，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式7并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
此外，在又一实例中，模拟函数可以是余弦函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如gk(t)≡cos(t/ak)表示。
在这种情况下，通过对函数gk(t)≡cos(t/ak)(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式8]
Figure BDA0002214260400000091
通过使用上面的等式8，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式8并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
此外，在又一实例中，模拟函数可以是超正弦函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如gk(t)≡sinh(t/ak)表示。
在这种情况下，通过对函数gk(t)≡sinh(t/ak)(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式9]
Figure BDA0002214260400000092
通过使用上面的等式9，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式9并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，C2，…，cn相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
此外，在又一实例中，模拟函数可以是超余弦函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如gk(f)≡cosh(t/ak)表示。
在这种情况下，通过对函数gk(t)≡cosh(t/ak)(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式10]
Figure BDA0002214260400000101
通过使用上面的等式10，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式10并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
另外，在又一实例中，模拟函数可以是贝塞尔函数形式的等式。也就是说，模拟函数g(t)可以由例如gmk(t)≡Jm(t/ak)表示。
在这种情况下，通过对函数gmk(t)≡Jm(t/ak)(其通过将荧光信号的函数I(t)乘以模拟函数而获得)进行积分而获得的值可以由以下等式表示，由此可以计算每个样本的荧光寿命。
[等式11]
Figure BDA0002214260400000102
通过使用上面的等式11，可以形成与c和τ相关的联立方程。也就是说，在测量的实验数据由n个指数衰减函数之和组成的情况下，可以通过使用等式11并且通过一起使用等式4获得2n-1个联立方程，可以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程。通过获得2n个联立方程的解，可以非常准确且快速地计算实验数据的建模函数，而无需大量的重复计算。
现有的平均时延方法只能通过计算等式得到两个荧光寿命的平均值，使得该方法不能通过基于荧光寿命分离混合样本来独立地获得荧光寿命值。相反，本发明的上述方法可以独立地计算混合样本的荧光寿命。
此外，通过使用本发明的上述方法，可以分别获得多于三个荧光样本的荧光寿命值。
另外，在使用荧光寿命成像显微镜(FLIM)的设备中，荧光寿命测量装置100可以用于使用时间相关单光子计数(TC-SPC)方法的测量设备。然而，荧光寿命测量装置100不限于此，并且还可以用于使用模拟平均时延(AMD)方法的测量设备。
在上文描述了根据本发明实施例的荧光寿命测量装置100的构造。下面将描述根据本发明实施例的荧光寿命测量方法200。荧光寿命测量方法200包括由图1所示的荧光寿命测量装置100执行的过程。因此，将省略与上面给出的描述重复的描述，并且省略部分的描述也适用于根据本发明实施例的荧光寿命测量方法200。
图2是示出根据本发明实施例的荧光寿命测量方法200的流程图。
210中的光的产生包括：为荧光寿命测量装置100提供具有不同荧光寿命的至少一个或多个样本S；并产生照射到样本S的照射光。
220中的照射包括：用照射光照射样本S。在这种情况下，荧光光子收集器检测从样本S产生的荧光光子。
230中的转换包括：放大收集到的荧光光子，并将放大的荧光光子转换成荧光信号。
240中的测量包括：通过使用由一个值(其通过对荧光信号的函数进行积分而获得)乘以模拟函数而获得的函数来分析荧光信号的函数的数据。荧光信号的函数、通过对荧光信号的函数进行积分而获得的值、模拟函数基于上述原理。

Claims (6)

1.一种荧光寿命测量装置，包括：
照射光发生器，其构造为产生照射光；
荧光光子检测器，其构造为用所述照射光照射包含荧光分子的两个或更多个样本，并收集由照射产生的荧光光子；
转换器，其构造为放大所述荧光光子，并将放大的荧光光子转换成荧光信号；以及
测量器，其构造为以如下方式独立地测量两个或更多个混合样本的荧光寿命：通过使用由一个值乘以模拟函数而获得的函数来分析逼近所述荧光信号的函数的数据，以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程的解，所述一个值通过对所述荧光信号的函数进行积分而获得，
其中，通过将逼近所述荧光信号的函数定义为I(t)，使用以下等式计算I(t)：
Figure FDA0003551361550000011
其中，τi是第i个指数衰减常数，并且ci是表示总函数中第i个指数衰减函数的混合比例的常数，
I(t)是测量数据并且f(t)是通过将对I(t)进行归一化使得I(t)的积分值变为1而获得的函数，并且f(t)是时间变量的概率分布函数的类型，
所述模拟函数被定义为g(t)，通过定义所述模拟函数g(t)来获得对与所述n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示所述指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的所述2n个联立方程进行求解而得到的解，并且
所述模拟函数g(t)是根函数、正弦函数、余弦函数、超正弦函数、超余弦函数和贝塞尔函数中的一者。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，将通过对I(t)进行积分得到的值定义为f(t)，f(t)被归一化为1，使用以下等式计算：
Figure FDA0003551361550000021
其中，
Figure FDA0003551361550000022
3.根据权利要求2所述的装置，其中，通过将所述模拟函数定义为根函数g(t)，并且通过将对I(t)进行积分获得的值乘以所述模拟函数g(t)而获得的值由以下等式表示：
Figure FDA0003551361550000023
4.一种荧光寿命测量方法，包括：
产生照射光；
用所述照射光照射两个或更多个样本，并收集由照射产生的荧光光子；
将所述荧光光子转换成荧光信号；以及
以如下方式独立地测量两个或更多个混合样本的荧光寿命：通过使用由一个值乘以模拟函数而获得的函数来分析逼近所述荧光信号的函数I(t)的数据，以获得与n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的2n个联立方程的解，所述一个值通过对逼近所述荧光信号的函数I(t)进行积分而获得，
其中，使用以下等式计算所述荧光信号的函数I(t)：
Figure FDA0003551361550000024
其中，τi是第i个指数衰减常数，并且ci是表示总函数中第i个指数衰减函数的混合比例的常数，
I(t)是测量数据并且f(t)是通过将对I(t)进行归一化使得I(t)的积分值变为1而获得的函数，并且f(t)是时间变量的概率分布函数的类型，
所述模拟函数被定义为g(t)，通过定义所述模拟函数g(t)来获得对与所述n个指数衰减常数τ1，τ2，…，τn和表示所述指数衰减函数的混合比例的n个常数c1，c2，…，cn相关的所述2n个联立方程进行求解而得到的解，并且
所述模拟函数g(t)是根函数、正弦函数、余弦函数、超正弦函数、超余弦函数和贝塞尔函数中的一者。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，将通过对I(t)进行积分得到的值定义为f(t)，f(t)被归一化为1，使用以下等式计算：
Figure FDA0003551361550000031
其中，
Figure FDA0003551361550000032
6.根据权利要求5所述的方法，其中，通过将所述模拟函数定义为根函数g(t)，并且通过将对I(t)进行积分获得的值乘以所述模拟函数g(t)而获得的值由以下等式表示：
Figure FDA0003551361550000033
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