CN214952923U - 一种基于emccd和afm的检测成像系统 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，包括载物台、荧光成像模块和AFM成像模块；荧光成像模块包括第一物镜、激发光源、过滤组块和第一EMCCD探测器；AFM成像模块包括第一激光器、第二激光器、相机、第二EMCCD探测器和会聚透镜、第一偏振分光棱镜、四分之一波片、低通二向色镜、高通二向色镜、第二偏振分光棱镜、第二物镜等。与现有技术相比，本实用新型改进了荧光成像模块和AFM成像模块的结构，降低了成本和系统复杂度，可以根据样品对激发光的大小和能量的要求不同，调节照射到样品上的激发光，通过第一激光的反射光确定样品的表面轮廓，通过增设第二激光和相机，可以直观观察到第一激光落在微悬臂梁上的位置，更方便进行激光的调节和探针的移动。
Description
技术领域
本实用新型涉及光学显微成像和原子力扫描成像技术，尤其是涉及一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统。
背景技术
随着生命科学的迅速发展，人们对生命现象的研究已深入到单细胞、单分子层次，在活细胞体系上检测单个生物分子的信号，实现其结构特征、动态行为及相互作用的定量表征，成为生命分析的前沿领域。对于复杂的活细胞体系，其内部的生物分子具有高度的非均一性(如生物大分子构象的多元性、生化反应的非同步性、所处微环境的多样性)，而传统的生化分析方法是针对大量分子或分子聚集体系的测量，得到的平均性质常掩盖了单个生物分子的特性，许多传统的分析方法与手段面临极大的挑战。
单分子检测是近十年来迅速发展起来的一种超灵敏的检测技术，为分析化学工作者打开了一扇新的大门，而这其中显微成像技术的发展推动了对生命活动及其规律在微观层次上的研究，特别是在分子水平上对细胞及细胞内生物分子的结构和功能的探究。现在，人们不仅可以在溶液中对单个分子进行检测和成像，而且可以通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，特别是能对生物大分子进行探测并提供分子结构与功能之间的信息。原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM)是目前应用最为广泛的活细胞单分子分析检测的工具之一。 AFM作为扫描探针显微镜家族的一员，是一种重要的表面分析技术，通过检测探针与样品间的微弱相互作用力，实现对样品表面形貌的成像，具有纳米级的空间分辨率；同时AFM单分子力谱尤为适合测定单对生物分子间的非共价键相互作用力，具有皮牛(pN)级的测力灵敏度，其工作原理是将微弱力敏感的微悬臂一端固定，通过另一端的纳米级探针在样品表面进行逐点扫描，当探针接近样品并产生相互作用力时，微悬臂发生形变，使得照射在微悬臂背面激光束的反射光偏移，引起检测器电压信号的变化，反馈系统通过检测该信号调整探针和样品的距离，从而获得样品表面的相应形貌。
中国专利CN201610014189.9公开了一种超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性获取方法与装置，将结构光照明显微术SIM和原子力显微术AFM有机融合，可以实现超衍射极限细胞膜微结构生物物理特性的信息获取，首先SIM成像，利用激光激发样品，采集样品的反射光成像，再根据获得的图像确定样品所在位置，进行AFM成像，基于探针和样品之间的作用力得到样品表面的相应形貌。但是，该装置结构较为复杂，由于不同样品对激发光斑的大小和能量的要求不同，调节激发光斑的步骤较为繁琐，而且，在AFM成像时，是通过倒置的光学显微镜从底部的方向向上观察探针的，无法直观的观察到探针和样品的位置，使用不方便。
实用新型内容
本实用新型的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，改进了荧光成像模块和AFM成像模块的结构，降低了成本和系统复杂度，可以根据样品对激发光的大小和能量的要求不同，调节照射到样品上的激发光，通过第一激光的反射光确定样品的表面轮廓，通过增设第二激光和相机，可以直观的观察到第一激光落在微悬臂梁上的位置，更方便进行激光的调节和探针的移动。
本实用新型的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，包括载物台、荧光成像模块和 AFM成像模块；
所述载物台用于放置待检测的样品，所述样品为染色样品；
所述荧光成像模块包括第一物镜、激发光源、过滤组块和第一EMCCD探测器，所述第一物镜设于载物台的下方，所述激发光源用于发射激发光，所述过滤组块设于第一物镜下方，包括激发滤光片、二向色镜和发射滤光片，所述二向色镜与激发滤光片之间的夹角等于二向色镜与发射滤光片之间的夹角，且激发滤光片和发射滤光片互不平行；所述激发滤光片设于激发光源的发射光路上，用于过滤激发光，所述发射滤光片设于二向色镜的下方，用于过滤样品的发射光；
所述AFM成像模块包括第一激光器、第二激光器，所述第一激光器输出第一激光，第一激光的出射光路上包括依次设置的会聚透镜、第一偏振分光棱镜，所述第一偏振分光棱镜的反射光路上包括第二EMCCD探测器，所述第一偏振分光棱镜的透射光路上包括依次设置的四分之一波片和低通二向色镜，所述低通二向色镜的反射光路上包括高通二向色镜，所述高通二向色镜的透射光路上包括第二偏振分光棱镜，所述第二偏振分光棱镜的反射光路上包括相机，所述第二偏振分光棱镜的透射光路上包括依次设置的第二物镜和微悬臂梁；所述第二激光器输出第二激光，第二激光的出射光路上包括高通二向色镜，所述高通二向色镜的反射光路上包括依次设置的第二偏振分光棱镜、第二物镜和微悬臂梁；
所述微悬臂梁设于载物台的上方，微悬臂梁上设有探针，所述探针和样品被配置为在一定距离内相互作用并使微悬臂梁发生形变。
进一步的，所述激发光源为汞泵光源。
进一步的，所述激发滤光片用于将激发光过滤为样品激发光，所述样品激发光的波长与染色样品的染料的吸收峰相匹配。
更进一步的，染料的吸收峰为490～495nm，激发光的波长为490nm，样品的发射光为525～530nm，二向色镜被配置为反射波长500nm以下的光、透射波长 500nm以上的光，所述发射滤光片被配置为截止波长520nm以下的光、透射波长 520nm以上的光。
进一步的，二向色镜与激发滤光片之间的夹角为45°，二向色镜与发射滤光片之间的夹角为45°。
进一步的，所述荧光成像模块和AFM成像模块的光路上设有挡板。
进一步的，所述载物台为微纳米位移载物台。
进一步的，所述微悬臂梁为长100～500μm、厚500nm～5μm的硅片或氮化硅片。
更进一步的，所述微悬臂梁的长度、厚度是根据样品和AFM成像模块的工作方式决定的。
进一步的，所述低通二向色镜与四分之一波片之间的夹角为45°，低通二向色镜和高通二向色镜相互平行。
与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
(1)改进了荧光成像模块和AFM成像模块的结构，降低了成本和系统复杂度，可以根据样品对激发光的大小和能量的要求不同，调节照射到样品上的激发光，通过第一激光的反射光确定样品的表面轮廓，通过增设第二激光和相机，可以直观的观察到第一激光落在微悬臂梁上的位置，更方便进行激光的调节和探针的移动。
(2)使用EMCCD探测器，EMCCD量子效率高、对微光图像的探测能力强，是全固态电子倍增器件，其制造成本低、寿命长、稳定性高，倍增增益可调的特性使得它可以满足全天候、大动态范围的应用需求。
(3)荧光成像模块的激发光源为汞泵光源，可针对高敏感的样本，实现在低强度激光光照下，高速分子荧光、单分子荧光及活体细胞显微成像等对极微弱荧光信号快速动态成像。
附图说明
图1为本实用新型的结构示意图；
附图标记：1、载物台，21、第一物镜，22、激发光源，231、激发滤光片， 232、二向色镜，233、发射滤光片，24、第一EMCCD探测器，31、第一激光器， 32、会聚透镜，33、第一偏振分光棱镜，34、四分之一波片，35、第二EMCCD 探测器，41、低通二向色镜，42、高通二向色镜，43、第二偏振分光棱镜，44、第二物镜，45、微悬臂梁，46、探针，5、相机，6、第二激光器。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本实用新型进行详细说明。本实施例以本实用新型技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实用新型的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
相比于扫描电子显微镜，AFM可以提供三维表面图，AFM不需要对样品的任何特殊处理，如镀铜或碳(这种处理对样品会造成不可逆转的伤害)，电子显微镜需要运行在高真空条件下，原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作，这样可以用来研究生物宏观分子，甚至活的生物组织；非破坏性，探针与样品表面相互作用力为10～8N以下，远比以往触针式粗糙度仪压力小，因此不会损伤样品，也不存在扫描电子显微镜的电子束损伤问题。另外扫描电子显微镜要求对不导电的样品进行镀膜处理，而原子力显微镜则不需要。
EMCCD与普通的CCD探测器的主要区别在于其读出(转移)寄存器后又接续有一串“增益寄存器”，电子传输到增益寄存器中，寄存器中产生的电场其强度足以使电子在转移过程中产生“撞击离子化”效应，产生了新的电子，即所谓的倍增；每次转移的倍增倍率非常小，最多大约只有×1.01～×1.015倍，但是当如此过程重复相当多次，信号就会实现可观的增益——可达1000倍以上，从而实现信号的放大。使得在低扫描速率下，荧光信号的强度水平仍可能微弱到与读出噪声相当甚至更低而无法被检测出来，EMCCD的增益可显著地改善这种极微弱信号的信噪比，由此在大吞吐量的分析研究中可实现更快的采样和更短的曝光时间。随着EMCCD的快速发展，已经成为微光成像领域的核心之一，被广泛应用到军事、天文等领域。 EMCCD量子效率高、对微光图像的探测能力强。EMCCD是全固态电子倍增器件，其制造成本低、寿命长、稳定性高。倍增增益可调的特性使得它可以满足全天候、大动态范围的应用需求。
一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，包括载物台1、荧光成像模块和 AFM成像模块；
载物台1用于放置待检测的样品101，样品101为染色样品；
荧光成像模块包括第一物镜21、激发光源22、过滤组块和第一EMCCD探测器24，第一物镜21设于载物台1的下方，激发光源22用于发射激发光，过滤组块设于第一物镜21下方，包括激发滤光片231、二向色镜232和发射滤光片233，二向色镜232与激发滤光片231之间的夹角等于二向色镜232与发射滤光片233 之间的夹角，且激发滤光片231和发射滤光片233互不平行；激发滤光片231设于激发光源22的发射光路上，用于过滤激发光，发射滤光片233设于二向色镜232 的下方，用于过滤样品101的发射光；
AFM成像模块包括第一激光器31、第二激光器6，第一激光器31输出第一激光，第一激光的出射光路上包括依次设置的会聚透镜32、第一偏振分光棱镜33，第一偏振分光棱镜33的反射光路上包括第二EMCCD探测器35，第一偏振分光棱镜33的透射光路上包括依次设置的四分之一波片34和低通二向色镜41，低通二向色镜41的反射光路上包括高通二向色镜42，高通二向色镜42的透射光路上包括第二偏振分光棱镜43，第二偏振分光棱镜43的反射光路上包括相机5，第二偏振分光棱镜43的透射光路上包括依次设置的第二物镜44和微悬臂梁45；第二激光器6输出第二激光，第二激光的出射光路上包括高通二向色镜42，高通二向色镜42的反射光路上包括依次设置的第二偏振分光棱镜43、第二物镜44和微悬臂梁45；
微悬臂梁45设于载物台1的上方，微悬臂梁45上设有探针46，探针46和样品101被配置为在一定距离内相互作用并使微悬臂梁45发生形变。
本实施例中，激发光源22为汞泵光源，可针对高敏感的样本101，实现在低强度激光光照下，高速分子荧光、单分子荧光及活体细胞显微成像等对极微弱荧光信号快速动态成像。
激发滤光片231用于将激发光过滤为样品激发光，样品激发光的波长与染色样品的染料的吸收峰相匹配。
二向色镜232与激发滤光片231之间的夹角为45°，二向色镜232与发射滤光片233之间的夹角为45°。
所述荧光成像模块和AFM成像模块的光路上设有挡板。
载物台1为微纳米位移载物台。
微悬臂梁45为长100～500μm、厚500nm～5μm的硅片或氮化硅片。微悬臂梁 45的长度、厚度是根据样品101和AFM成像模块的工作方式决定的。
低通二向色镜41与四分之一波片34之间的夹角为45°，低通二向色镜41和高通二向色镜42相互平行。
本申请改进了荧光成像模块，在荧光成像模块，根据染色样品的染料的吸收峰选择合适的过滤组块，通过激发光将染色样品激发，发出荧光，即发射光，发射光透过二向色镜232达到发射滤光片233，发射滤光片233筛选合适波长的光源进入第一EMCCD探测器24。可以针对不同样品对激发光斑大小和能量的差异化要求，最终激发样品的光斑大小及能量可以调节，结构简单，成本较低。
本实施例中，染料的吸收峰为490～495nm，激发光的波长为490nm，样品101 的发射光为525～530nm，二向色镜232被配置为反射波长500nm以下的光、透射波长500nm以上的光，发射滤光片233被配置为截止波长520nm以下的光、透射波长520nm以上的光。
在使用时，先进行荧光成像。首先由探针46发出490nm的激发光，激发载物台1上的样品101，样品101经过激发后，产生的发射光525～530nm透过二向色镜232(500nm以下反射，500nm以上透过)。发射滤光片233(520nm以下截止， 520nm以上透过)将二向色镜232透过的波长525～530nm的发射光通过，然后经过第一EMCCD探测器24检测和成像，激发光490nm的光经二向色镜反射出去，不被检测。之后，可以通过激发光源22发出激发光，继续激发载物台1上的样品 101，激发光透过激发滤光片231，过滤为相应波长，与染色样品的染料的吸收峰相匹配，如果激发滤光片231的参数与染料的吸收峰不匹配，或者偏离，会影响激发的效率，二向色镜232(500nm以下反射，500nm以上透过)将过滤后的激发光反射到染色样品上，激发样品101，样品101的发射光透过二向色镜232，再次被反射的激发光被二向色镜232反射出去，不进入第一EMCCD探测器24。如果二向色镜232对应的波长与发射光的波长不匹配，会影响激发效率，甚至有可能让激发光串到发射光中。发射滤光片233的功能是挡掉激发光，透过发射光。它将二向色镜232透过的相应波长的发射光通过，然后经过第一EMCCD探测器24进行检测和成像。
在AFM成像模块，第一激光器31发射的第一激光包括p光和s光，经过会聚透镜32会聚，p光自第一偏振分光棱镜33透过，经过一次四分之一波片34，被低通二向色镜41反射，再透过高通二向色镜42和第二偏振分光棱镜43，打在微悬臂梁45的上梁面。第一激光自微悬臂梁45上反射，依次透射第二偏振分光棱镜43、高通二向色镜42，再被低通二向色镜41反射，又一次经过四分之一波片34， p光变为s光，被第一偏振分光棱镜33反射，进入第二EMCCD探测器35。当探针46和样品101靠近时，会产生相互作用力，导致微悬臂梁45发生形变，使得照射在微悬臂梁45上梁面的第一激光的反射光发生偏移，引起第二EMCCD探测器35的电信号变化，从而可以据此确定样品的外貌轮廓。
第二激光器6发射的第二激光被高通二向色镜42反射至第二偏振分光棱镜43，透过第二偏振分光棱镜43打在微悬臂梁45的上梁面，之后，发生反射，第一激光和第二激光的部分在第二偏振分光棱镜43上发生反射，打入相机5，相机5根据接收到的光线观察落在微悬臂梁45上的光点信息。
以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，包括载物台(1)、荧光成像模块和AFM成像模块；
所述载物台(1)用于放置待检测的样品(101)，所述样品(101)为染色样品；
所述荧光成像模块包括第一物镜(21)、激发光源(22)、过滤组块和第一EMCCD探测器(24)，所述第一物镜(21)设于载物台(1)的下方，所述激发光源(22)用于发射激发光，所述过滤组块设于第一物镜(21)下方，包括激发滤光片(231)、二向色镜(232)和发射滤光片(233)，所述二向色镜(232)与激发滤光片(231)之间的夹角等于二向色镜(232)与发射滤光片(233)之间的夹角，且激发滤光片(231)和发射滤光片(233)互不平行；所述激发滤光片(231)设于激发光源(22)的发射光路上，用于过滤激发光，所述发射滤光片(233)设于二向色镜(232)的下方，用于过滤样品(101)的发射光；
所述AFM成像模块包括第一激光器(31)、第二激光器(6)，所述第一激光器(31)输出第一激光，第一激光的出射光路上包括依次设置的会聚透镜(32)、第一偏振分光棱镜(33)，所述第一偏振分光棱镜(33)的反射光路上包括第二EMCCD探测器(35)，所述第一偏振分光棱镜(33)的透射光路上包括依次设置的四分之一波片(34)和低通二向色镜(41)，所述低通二向色镜(41)的反射光路上包括高通二向色镜(42)，所述高通二向色镜(42)的透射光路上包括第二偏振分光棱镜(43)，所述第二偏振分光棱镜(43)的反射光路上包括相机(5)，所述第二偏振分光棱镜(43)的透射光路上包括依次设置的第二物镜(44)和微悬臂梁(45)；所述第二激光器(6)输出第二激光，第二激光的出射光路上包括高通二向色镜(42)，所述高通二向色镜(42)的反射光路上包括依次设置的第二偏振分光棱镜(43)、第二物镜(44)和微悬臂梁(45)；
所述微悬臂梁(45)设于载物台(1)的上方，微悬臂梁(45)上设有探针(46)，所述探针(46)和样品(101)被配置为在一定距离内相互作用并使微悬臂梁(45)发生形变。
2.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述激发光源(22)为汞泵光源。
3.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述激发滤光片(231)用于将激发光过滤为样品激发光，所述样品激发光的波长与染色样品的染料的吸收峰相匹配。
4.根据权利要求3所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，染料的吸收峰为490～495nm，激发光的波长为490nm，样品的发射光为525～530nm，二向色镜被配置为反射波长500nm以下的光、透射波长500nm以上的光，所述发射滤光片被配置为截止波长520nm以下的光、透射波长520nm以上的光。
5.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，二向色镜(232)与激发滤光片(231)之间的夹角为45°，二向色镜(232)与发射滤光片(233)之间的夹角为45°。
6.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述荧光成像模块和AFM成像模块的光路上设有挡板。
7.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述载物台(1)为微纳米位移载物台。
8.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述微悬臂梁(45)为长100～500μm、厚500nm～5μm的硅片或氮化硅片。
9.根据权利要求8所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述微悬臂梁(45)的长度、厚度是根据样品(101)和AFM成像模块的工作方式决定的。
10.根据权利要求1所述的一种基于EMCCD和AFM的检测成像系统，其特征在于，所述低通二向色镜(41)与四分之一波片(34)之间的夹角为45°，低通二向色镜(41)和高通二向色镜(42)相互平行。
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