JP2004506192A

JP2004506192A - 検出器の分光学的および空間分解能を増大させるための方法

Info

Publication number: JP2004506192A
Application number: JP2002517498A
Authority: JP
Inventors: ラルフ　ヴォレシェンスキー; グンター　メーラー; ヴォルカー　ゲルストナー
Original assignee: カール　ツァイス　イエナ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2001-08-04
Publication date: 2004-02-26
Also published as: ATE444483T1; JP2006153891A; EP1264169A1; DE50115136D1; DE10038528A1; EP1264169B1; JP4783931B2; WO2002012864A1

Abstract

【課題】照明された試料の特徴的な大きさを光学的に把握するための方法
【解決手段】照明された試料から撒き散らされた、反射したおよび／または蛍光化したおよび／または発射された信号が、試料から来る放射が検出器上に結像されることによって、空間分解能を有する検出器ＤＥを用いて検出され、測定された放射の位置が検出器に相対的に変移し、検出器の空間分解能を高めるために、さまざまな変移によって測定された信号から、アルゴリズムを介して中間値が求められ、変移のステップ量が検出器の空間分解能の網目量以下の方向に行われ、および／または結像素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で行われ、および／または反射素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で行われ、および／または分散素子ＤＩの変移または旋回が少なくとも１つの軸内で行われ、スペクトル分解能を有するスペクトル測定が検出器に前置された分散素子を通じて行われる方法

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主として生物学の試料、プレパラートおよびそれに属する構成要素を検査するための、蛍光顕微鏡法、特にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関顕微鏡法および走査型近視野顕微鏡法における方法および配置に関する。そのほかに含まれているのは、蛍光検出に基づく作用物質スクリーニングのための方法（ハイ・スループット・スクリーニング）である。
【０００２】
少数の幅広いスペクトルにわたる色素周波数帯を検出することから同時に全スペクトルを受け入れるように移行することによって、多くの分析的または機能的試料特性の確認、分離および分類における新たな可能性が、空間的部分構造または動力学的過程へと開けてくる。試料を多重発蛍光団と共に同時に検査することが、これによって、部分的に重なるスペクトルの場合、厚い試料の空間構造にも可能となる。本配置によって検出ユニットの分光学的および空間分解能が増大する。
【０００３】
【従来の技術】
生物学プレパラートを検査するための古典的な光学顕微鏡法利用分野が、蛍光顕微鏡法（文献：ポーリー「生物学共焦点顕微鏡法ハンドブック」；プレーナム・プレス１９５５）である。ここでは特定の色素が細胞部分を固有に標識付けするために使用される。
【０００４】
特定のエネルギーを持つ入射光子は色素分子を、光子を吸収することによって基底状態から励起状態へと励起する。この励起は多くの場合一光子吸収と名づけられる（図１ａ）。このようにして励起された色素は、さまざまな方法で基底状態へ戻ることができる。蛍光顕微鏡法においては、蛍光光子送出の下での移行が最も重要である。放出される光子の波長は、ストークス変位に基づいて、励起光に比較して一般に赤に移動しており、すなわちより長い波長を有する。ストークス変位は蛍光を励起光から分離することを可能とする。
【０００５】
蛍光は、ブロックフィルタと結合した好適なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起光から分割され、別々に観察される。これによって個々の、さまざまな色素によって染められた細胞部分の表示が可能である。しかし根本的には、１枚のプレパラートでいくつかの部分を同時にさまざまな、固有に付加された色素によって染めることもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、やはり特別なダイクロイック・ビームスプリッタが使用される。
【０００６】
色素分子を高エネルギー光子で励起すること（一光子吸収）と並んで、いくつかのより少ないエネルギーの光子で励起することも可能である（図１ｂ）。この場合個々の光子エネルギーの総和は、高エネルギー光子のざっと数倍に相当する。この種の色素励起は多光子吸収と名づける（文献：コリー、キノ；「共焦点走査型光学顕微鏡法および関連画像システム」；アカデミック・プレス１９９６）。
【０００７】
しかし色素放射は、この種の励起によって影響を受けず、すなわち放射スペクトルは多光子吸収の場合負のストークス変位を与えられ、つまり励起光に比較してより短い波長を有する。励起光を放射光から分離するのは、一光子吸収の場合と同種の方法によって行われる。
技術の状況は以下に規範的に共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）に基づき説明することとする（図２）。
【０００８】
ＬＳＭを本質的に４モジュールに区分する：光源、スキャンモジュール、検出ユニットおよび顕微鏡である。これらのモジュールは以下により詳しく記述する。加えて、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１を参照のこと。
１枚のプレパラート内で種々の色素を固有に励起するため、ＬＳＭ内で種々の波長を有するレーザを使用する。励起波長の選択は検査すべき色素の吸収特性に従う。励起光は光源モジュール内で作り出される。ここで使用されるのは種々のレーザ（アルゴン、アルゴンクリプトン、ＴｉＳａレーザ）である。
さらに、光源モジュール内では波長の選択および必要な励起波長の強度の調節が、たとえば音響光学結晶を使用することにより行われる。
【０００９】
続いて、レーザ光はファイバまたは適切なミラー配置を通じてスキャンモジュール内へ達する。光源内で作り出されたレーザ光は、対物レンズ（２）を介して回折を抑えられながらスキャナ、スキャン光学系および円筒レンズを通じてプレパラート内へ焦点を結ぶ。焦点は点の形で試料をｘ−ｙ方向に走査する。試料上をスキャンする際のピクセル保持時間は、多くは１マイクロ秒未満から数秒までの範囲内にある。
【００１０】
蛍光を共焦点検出（デスキャン検出）する際、焦平面（試料）からおよびその上下の平面から放出される光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に到達する。このビームスプリッタは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役な平面内に存在する絞り（共焦点絞り／ピンホール）上に焦点を結ぶ。これによって焦点の外部からの蛍光成分が抑制される。絞りの寸法を変化させることによって、顕微鏡の光学的分解能は調節することができる。絞りの背後に別の、再度励起光を抑制するブロックフィルタ（ＥＦ）が存在する。ブロックフィルタ通過後蛍光は点像検出器（ＰＭＴ）を介して測定される。
【００１１】
多光子吸収を利用する際、色素蛍光の励起は、励起強度が特に強い小ボリューム内で行われる。この領域は共焦点配置を利用する際の検出領域に比べてわずかばかり大きい。したがって共焦点絞りの使用は解消することができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（非デスキャン検出）。
【００１２】
さらに別の、多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための配置では、デスキャン検出が行われるが、しかし今度は対物レンズの瞳孔は検出ユニット内に結像される（非共焦点デスキャン検出）。
【００１３】
３次元照出された像について、対応する一光子もしくは多光子吸収と結合する２つの検出配置によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。ｘ−ｙ平面内のさまざまな深さｚにおける試料の何枚かの光学的断面を記録することによって、引き続いて計算機に保持して試料の３次元像を発生させることができる。
【００１４】
したがってＬＳＭは厚いプレパラートを検査するために好適である。励起波長は使用される色素によってその固有の吸収特性で決定される。色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタが、それぞれの色素から送出された蛍光のみが点像検出器によって測定されることを保証する。
【００１５】
生化学応用において今日、さまざまな細胞領域がさまざまな色素によって同時に標識付けされている（多重蛍光）。個々の色素は、技術の現状ではさまざまな吸収特性または放射特性（スペクトル）に基づいて別々に立証することができる（図３ａ）。規範的に並んでいるのは、波長に依存するさまざまな色素（１−４）についての放射信号である。別々に立証するために、付加的にいくつかの色素の蛍光を副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）によって分割し、別々に個々の色素放射をさまざまな点像検出器（ＰＭＴｘ）内で検出する。
【００１６】
相応の新しい色素特性で検出および励起することについて利用者側の柔軟な対応が、上記の配置を用いては可能でない。その代わりに、どの（新しい）色素についても新しいダイクロイック・ビームスプリッタおよびブロックフィルタを創造しなければならない。
ＷＯ９５０７４４７に従う配置では、蛍光はプリズムを介してスペクトル分割される。この方法が上記のダイクロイック・フィルタを有する配置と異なるのは、使用されるフィルタがその特性曲線を調節できることのみである。しかしさらに、点像検出器ごとに主として色素の放射領域が記録される。
【００１７】
放射領域の調節はダイクロイック・フィルタの、もしくは絞りの機械的な動きに基づき、したがって最大スペクトル分解能は５ｎｍより少し大きい程度に制限されているから、放射スペクトルの迅速な局所的測定が２つの配置で制限付きに可能なのみである。
たとえば放射スペクトルが図３ｂに示されるように重なり合っている場合に、高いスペクトル分解能が必要である。
【００１８】
図３ｂは、２つの天然に存在する色素ＣＦＰおよびＧＦＰの、そのような特性を示している。これらの色素は、検査すべき試料に有毒作用を及ぼさないから、生体プレパラートを検査するために特に好適である。
使用されている色素の放射スペクトルの状況が不明であるか、または周囲に依存する放射スペクトルの変移（図３ｃ）が現れているならば、色素蛍光の高分解能検出が必要である。波長変移は数１０ｎｍにもなり得る。
【００１９】
試料内の放射スペクトルを測定するために、今日分光計がＬＳＭと結合した形でも使用される。この場合点像検出器の代わりに在来の多くの高分解能分光計が使用される（特許ディクソン他ＵＳ　５，１９２，９８０）。これらはしかしただいくつかの点に限ってか、またはある領域を通じて平均されて放射スペクトルを記録することができる。すなわち分光学の方法の問題である。加えて大部分は弱い、試料の蛍光信号は、分光計内の多数の個別チャンネル（ふつう５１２または１０２４個別チャンネル）に配分され、スペクトル分解能に対応して狭い蛍光帯域が検出される。それゆえ個別チャンネル当たりの信号は極度に小さく、場合によってはもはや検出不能である。
【００２０】
ポイントスキャナの代りに、技術の現状によればいわゆるラインスキャナが使用される（文献：コリー、キノ；「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連像システム」；アカデミック・プレス１９９６）。主要な構成は本質的に図２に従うＬＳＭに対応している。しかし点焦点の代わりに線が焦点に結像され、検査すべき試料はあと１方向に走査されるのみである。共焦点絞りとしてはこのような構成の中で、孔絞りの代わりにスリット絞りが役立つ。
【００２１】
多光子吸収利用の際の非デスキャン検出をこの配置でも行うことができる。そのためにここでも共焦点絞りは不要となる。検出のためには、多くは１０２４またはそれ以上の像点を有するＣＣＤ列が使用される。点の代わりに線を走査することにより、像受け入れ率は非常に増大させることができる。したがって、この走査法は速く進行する過程をリアルタイムで観察するのために使用することができる。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本方法で不利な点は技術の現状によれば、ライン検出器は通例逐次的に読み出されなければならず、これによって読み出し率が速い時には、読み出し雑音が高くなり得ることである。
【００２３】
本発明の課題はしたがって、効率的であり分光的および空間的に高分解能で蛍光色素を検出するための新しい方法である。これらの方法は像作成によっても解析によっても顕微鏡検査システムに使用することのできるものでなければならない。顕微鏡システムは、２００ｎｍまでの光学的、空間分解能を有する生物学プレパラートを３次元検査するためのレーザ走査型顕微鏡、１０ｎｍまでの分解能を有する高分解能で表面を検査するための走査型近視野顕微鏡、分子濃度を定量的に決定するためおよび分子拡散を測定するための蛍光相関顕微鏡のような、像形成システムである。さらに蛍光検出器に基づく色素スクリーニングのための方法が含まれる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
上記システムすべてにおいて、蛍光色素がプレパラートを固有に標識付けするために使用される。上記課題は独立特許請求項に従う方法および配置によって解決される。
好適な他の構成は、従属請求項の対象である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
分光学的なおよび空間的な検出器分解能を増大させるための２つの方法を、以下に個々に説明する。
本発明に従う方法の背景は、スペクトル分割された蛍光検出である。そのため、放射光はスキャンモジュール内または顕微鏡内で（多光子吸収の場合）、７３４６ＤＥまたは７３２３ＤＥに従う主ビームスプリッタ（ＭＤＢ）またはＡＯＴＦのような、励起光を検出光から分離するための素子を介して、励起光から分割される。透過光配置の場合、そのような素子が完全にないこともあり得る。
【００２６】
以下に述べる検出器ユニットのブロック接続図が図５に示されている。試料の光Ｌは結像光学系ＰＯを介して、共焦点検出の場合、絞り（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって焦点外に生じる蛍光が抑制される。非デスキャン検出の場合、しぼりはない。光は分散素子ＤＩを介してそのスペクトル成分に分解する。分散素子としては、プリズム、格子およびたとえば音響光学素子があげられる。
【００２７】
分散素子によってそのスペクトル成分に分割された光は、続いて光検出器ＤＥ上に結像される。この光検出器ＤＥは、すなわち放射信号Ｓを波長の関数として測定し、これを電気信号に変換する。本発明に従う、以下により詳しく説明する波長スキャナＷＳを介して、蛍光スペクトルの位置は、光検出器に相対的に定義され、図６で道程ｄｌだけＰＭＴの変移によってか、または格子またはミラーの旋回によって回転角ｐｈｉだけ（図６他）変移する。加えて検出器ユニットは、励起波長を抑制するために、さらに１基のラインフィルタを直列接続することができる。
【００２８】
図５にブロック接続図の形で示した検出ユニットの、可能な光路の実施例が図６に示されている。構成は本質的にサーニー・ターナー構成を表している。共焦点検出の場合、試料の光Ｌはピンホール光学系ＰＯによって共焦点絞りＰＨを通るところに焦点を結ぶ。非デスキャン検出で多光子吸収の場合、この絞りはなくすることができる。第１の結像鏡Ｍ２は蛍光を視準する。続いて光はライン格子Ｇ、たとえばミリメートル当たり線数６５１線を有する格子に当たる。格子は光をその波長に対応してさまざまな方向に偏向させる。
【００２９】
第２の結像鏡Ｍ１は個々のスペクトル分割された波長成分を、ライン検出器ＤＥの対応チャンネル上に焦点を結ばせる。特に有利なのは、ハママツ商会のライン２次電子増倍管Ｈ７２６０の使用である。この検出器は３２チャンネルで高感度を有する。上記実施例の自由になるスペクトル領域は約３５０ｎｍある。自由スペクトル領域はこの配置においてライン検出器の３２チャンネル上に一様に配分され、それによって光学的分解能約１０ｎｍが得られる。それゆえこの配置は条件付きでのみ分光学に適用できる。
【００３０】
しかしこれの使用は、検出チャンネル当たりの信号が相対的に広い検出スペクトル帯域に基づき相対的になお強いから、像作成システムにおいて有利である。蛍光スペクトルの変移がたとえば格子をＭ１，Ｍ２から角ｐｈｉだけ捩ることによって、および／またはライン受信機を波長分割の方向にｄｌだけ変移させることによって行われる（図参照）。これは上記波長スキャナＷＳの有利な実施に対応するものである。
【００３１】
別の可能な実施例は、マトリクス検出器（たとえばＣＣＤマトリクス）使用である。この場合、分散素子Ｇを通る座標で図の面内でさまざまな波長成分に分割される。図の面に垂直な方向には、マトリクス検出器上で走査像の列（または分割）全体が結像される。この実施例は特にラインスキャナの構成の場合有利である。主構成は本質的に図２に従うＬＳＭの構成に相当する。しかし点焦点の代わりに、破線で示したような線が、たとえば円筒レンズＺＬによって焦点内に結像され、検査すべき試料は１方向にしか走査されない。共焦点絞りとしては、このような構成の中で孔絞りの代りにスリット絞りが役立つ。
非デスキャン検出を、特に多光子吸収利用の場合、図２に示されたようなこの配置によっても行うことができる。さらに、スリット絞りは多光子吸収の場合なくすることができる。
【００３２】
空間的検出分解能を高めるための方法の背景は、特にリアルタイムで像作成する方法の場合、試料のライン励起および検出（ラインスキャナ）である。放射光はスキャン・モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収の場合）でたとえば主ビームスプリッタ（ＭＤＢ）を介して励起光から分割される。
【００３３】
これに続く検出器ユニットのブロック接続図が図７に示されている。試料の光は結像光学系ＰＯを介して共焦点検出の場合スリット絞りＰＨ１を通るところで焦点を結び、これによって焦点外に生じる蛍光が抑制される。非デスキャン検出の場合絞りはなくすることができる。
【００３４】
光は、走査鏡にｘ／ｙ光学的共役平面（光学的照明配置の瞳孔）内に存在する、図８に示したミラーＳＰを介して、ライン検出器ＤＥ上に結像することもできる。ここでは分散的な分割は行われず、広帯域の蛍光把握が検出ユニットを介して行われ、そこでスキャンラインに沿った位置分解能が検出器を介して実現される。
ミラーＳＰを介して、蛍光ラインの位置はライン検出器に相対的に定義どおりｄｌだけ変移させることができる（位置スキャナＷＳ）。
【００３５】
このライン検出器ＤＥはすなわち放射信号を、試料内で励起が行われる位置の関数として測定し、これを電気信号に変換する。加えて、検出ユニットにまた１つの、励起波長を抑制するための（示されていない）ラインフィルタが直列接続されるのが有利である。さらに、技術の現状に従う相応のダイクロイック・フィルタによるさまざまな色素の蛍光信号の分割、および本発明のさまざまな検出設備部分による分離された蛍光信号の検出がある。
【００３６】
図７にブロック接続図の形で示した検出器ユニットの、可能な光路の実施例が図８に示されている。共焦点検出器の場合、試料の光Ｌはピンホール光学系ＰＯによって共焦点スリット絞りＰＨＳを通るところで焦点を結ぶ。非デスキャン検出で多光子吸収の場合、この絞りはなくすることができる。第１の結像鏡Ｍ２は蛍光を視準する。
【００３７】
続いて、光は別の平面鏡ＳＰ上に当たる。ミラーＳＰは光学的照明設備の瞳孔内に存在し、回転可能に支持されている。第２の結像鏡Ｍ１はスキャンラインを、ライン検出器ＤＥの対応するチャンネル上に焦点を結ばせる。特に有利なのは、ハママツ商会のライン２次電子増倍管Ｈ７２６０の使用である。この検出器は３２チャンネルで、高感度を有する。
【００３８】
さらに、検出チャンネル当たりの信号は、相対的に広く検出されるライン部分に基づき、なお相対的に大きい。スキャンラインの変移が、たとえばミラーＳＰをＰＭＴでのｙ座標に沿いミラー平面に平行なスキャンラインに垂直な軸のまわりに、Ｍ１、Ｍ２からｐｈｉだけ捩ることによって、および／またはライン受信機をｄｌだけ変移させることによって行うことができる。これは上記の位置スキャナＷＳに対応している。特に多光子吸収を利用する非デスキャン検出を、図２に示したようなこの配置によっても行うことができる。さらに、多光子吸収の場合スリット絞りはなくすることができる。
【００３９】
スキャンラインがたとえばｘ軸に沿っているならば、スキャナは位置スキャナＷＳをｄｌだけ受け取ることができる。この場合なら図８のミラーＳＰは固定している。ここではスキャンラインはＷＳを介して検出器に相対的にではなく、むしろスキャンラインは試料の中でｘ軸に沿って動く。両方の動きは原則的に同じである。ｙスキャナはこの場合ラインをプレパラート上のｙ軸に沿って動かす。ｘもしくはｙ軸は交換することもできる。
【００４０】
後者の変形の長所は、スペクトル高分解能を有する点スキャンＬＳＭ（図５および６に従う分散的分割）とスペクトル低分解能ではあるが高スキャン速度を有するラインスキャンＬＳＭ（図７および８に従う）との間で行ったり来たり接続できることにあり、ここでどちらの場合でも同一の検出に手をつけることができる。このため、たとえばミラーもしくは格子の代りに、両方の光学素子が存在する接続素子を取付けるのが有利である。ポイントスキャナからラインスキャナに切替えると、スキャン・モジュール内のＭＤＢとレーザ結合との間の光路内に図２の円筒レンズＺＬを、スキャンラインを作るために持ち込み、ピンホールをスリット絞りに変えるかまたは交換し、ミラーＳＰをねじ込む。
【００４１】
図９は接続素子Ｇ／ＳＰを形成するためのさまざまな配置を示す。図９ａ）は、前側にミラー、後ろ側に格子が存在する回転可能な素子を示す。図９ｂ）は格子２基およびミラー１基を有する回転可能な配置を示す。数基の格子を使用することによって、検出ユニットのスペクトル分解能の可能性は変化させることができる。図９ｃ）はＧ／ＳＰが鉛直に（または９０°回転させた配置により水平に）推し動かされた配置であり、上部に格子で、下部にミラーで張られたものである。図９に示した配置を結合させることが本発明の無条件な部分である。
【００４２】
別の可能な実施例として、マトリクス検出器（たとえばハママツ製ＣＣＤまたは８×８　ＰＭＴマトリクス　Ｈ７５４６）使用のものとすることができる。この実施例は特に高スペクトル分解能のリアルタイムラインスキャナを構成するのに有利である。このため、ここでも図８のミラーＳＰの代りに、蛍光を格子線に垂直に図の面内にスペクトル分割し、マトリクス検出器の座標に沿って結像する格子を使用するのが有利である。マトリクス検出器上でこれに垂直な方向に、走査された像の全列（または行）が結像される。スキャンラインはこのとき格子線に平行に向いている。
【００４３】
格子の回転は、検出器のスペクトル分解能を高めるため、鉛直軸のまわり、すなわち図の面に垂直に行うことができる。付加の、格子平面内にあって格子線に垂直になっている水平軸のまわりの回転が、格子の旋回を介してスキャンラインが検出器の上を動くことによって、検出器の空間分解能を高めるのに役立つことができる。
【００４４】
スキャンラインがたとえばｘ軸に沿っていると、ｘスキャナは位置スキャンＷＳをｄｌだけ受取ることができる。この場合なら図８の格子はその水平の傾きで主として固定しておく。ｙスキャナはこの場合スキャンラインをプレパラート上のｙ軸に沿って動かす。別の実施例では、格子はその水平および鉛直の傾きにおいて固定しておくこともできる。空間分解能を高めるための位置スキャンはさらに、ｘスキャナによって行う。検出器のスペクトル分解能を高めることは、この場合実行できない。ｘもしくはｙ軸の作用は交換することもできる。スペクトル分解能もしくは空間分解能は、上に示した光学配置では、個別チャンネルの寸法と数によって決定している。
【００４５】
上記の実施例においては、個別チャンネルそれぞれが、放射スペクトルのスペクトル帯域をスペクトル幅約１０ｎｍで検出する。これに反して、可能性のある分光計配置のスペクトル分解能（Δλ）は、使用した格子に基づき１．５ｎｍとなる。上記の配置をラインスキャナ内で利用する場合、個別チャンネルそれぞれが、要求されている画素分解能たとえば５１２画素の場合、合計５１２／３２＝１６個別像ポイントを検出する。
検出ユニットのスペクトル分解能もしくは空間分解能を因子ｎだけ高めるためには、蛍光スペクトルもしくはスキャンラインが、Ｌが個別チャンネルの幅に相当するとして、ｎ歩ごとにＬ／ｎの何倍かずつ変移する。
【００４６】
図１０は１列ごとに、その個々の信号Ｎ個がＣに相当するライン検出器のさまざまな個別チャンネルを図示する。上に挙げたライン検出器Ｈ７２６０についてはＮ＝３２である。ｄｌ軸の方向に、検出された信号（放射スペクトルもしくはスキャンライン）のさまざまな位置が、上記の波長スキャナもしくは位置スキャナの作用として示されている。蛍光スペクトルもしくはスキャンラインの変移（ＷＳに相当する）を、上にすでに挙げたように、格子もしくはミラーを角ｐｈｉだけ回転させるか、検出器をｄｌだけ変移させることによって行わせることができる。
【００４７】
測定された個別チャンネルの信号はｃ_ｋ，ｊ（図１０にブロックで示す）で表す。ここでｋ＝１、Ｎはチャンネル番号、ｊ＝０，ｎ−１は変移Ｌ／ｎの何倍かの数である。信号が検出器の縁から脱落していなければ、図１０に灰色で示したように、検出器の最後の個別チャンネルは、Ｌ／ｎの幅のみ測定のために自由に使えるよう、覆いを外されている（絞りを外れている）。これは計算の際に人工産物を避けるために必要である。
【００４８】
Ｎ×ｎ個のスペクトル値Ｓ_ｍを計算するために、いま個別チャンネルを通じての総和からの差を、以下のアルゴリズムに従って作る：
【式１】

【式２】

【００４９】
このようにして計算されたスペクトル値もしくは位置値Ｓ（中間値）は、続いて、指示されている像の上でグラフィックに、たとえばスペクトル・スキャンの間に示される。
図１１ａ）は検出器分解能の、上記分光計配置に基づく変移数ｎへの依存性を示す。ｎ＝１については、検出ユニットのスペクトル分解能は個別チャンネルのスペクトル分解能（Ｌ）に等しく、すなわち約１０ｎｍである。５回のＬ／５だけの波長変移については、検出ユニットのスペクトル分解能は２ｎｍとなる。
【００５０】
最大に達成可能なスペクトル分解能は、使用されている格子の線数によって決定される。この最大スペクトル分解能（Δλ）は、検出器分解能が分光計装置の可能な分解能（Δλ）の半値に等しいとき、ナイキストの標本化定理に対応して正確に得られる。これはある数に相当する：
ｎ_ｍａｘ＝２×Ｌ／（Δλ）
この場合ｎ_ｍａｘ＝１３となる。変移数がｎ_ｍａｘより大きければ、スペクトル成分は頻繁に読み取られすぎ、さらに分解能を良くする利益は得られない。ｎがｎ_ｍａｘより小さければ、スペクトル成分が読み取られるのが少なすぎ、検出ユニットの分解能は検出器によって固定される。
【００５１】
図１１ｂ）は、検出器の空間分解能の変移数への依存性を示す。ラインスキャナおよび３２チャンネルの検出器において１６回の位置変移をする場合、５１２像ポイントを有するライン検出器を使用するのと同一の分解能が得られることが知られている。この場合像受入れ率は、同一の像サイズおよび一定の像ポイント当たり積分時間の点スキャナに比較して、ファクタ３２だけ増大した。
【００５２】
個別チャンネルｃ_ｋ，ｊを、格子もしくはミラーの回転角ｐｈｉの関数として読み出すための配置が、図１２に図示されている。この場合、ＰＭＴの＋極を流れている電流は、それぞれ第１の増幅器Ａ（電流電圧変換器として接続されている）によって電圧に変換され、増幅される。電圧は、積分器Ｉに導かれ、これが相応の時間（たとえば画素保持時間）の間信号を積分する。
【００５３】
迅速に評価するために、積分器Ｉには比較器Ｋを後置することができ、これは簡易な比較器としてあるスイッチング閾値を有し、これを超えたときデジタル出力信号を作り出すか、または窓比較器として形成され、入力信号が上限と下限とのスイッチング閾値の間に存在するか、または入力信号がスイッチング閾値の外側（下または上）にあるとき、デジタル出力信号を作る。比較器もしくは窓比較器の配置は、積分器の前でも後でもよい。
【００５４】
積分器なしの回路配置（いわゆる増幅器モード）が同様に考えられる。増幅器モードにおける配置の際、比較器Ｋはさらに相応のレベル適合の後で使用される。比較器Ｋの出力は、直接アクティブなチャンネルに接続する（オンライン）スイッチレジスタＲｅｇ用の制御信号として役立つか、または状況がコンピュータに、アクティブ・チャンネルの個別の選択をする（オフライン）よう付加の結合Ｖを通じて伝える。
【００５５】
積分器Ｉの選択信号は、後置されているＡ／Ｄ変換器ＡＤ用にレベル適合するために、直接別の増幅器Ａ１に導かれる。ＡＤ変換された値は、適合したデータ伝送を通じて、計算機（ＰＣまたはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）に伝送される。回転角ｐｈｉもしくは変移ｄｌの変更を、像ごとに受け入れ後行うか、または１つの像ポイントもしくは１つの像並び／像の行をスキャンする間に行うことができる。
【００５６】
波長スキャナもしくは位置スキャナ（ＷＳ）のスキャン速度に対する機械的な要求は、回転角調節の方法に依存する。たとえば像ポイントごとに検出器のスペクトル分解能または空間分解能を高める場合、スキャンはこの像ポイントについての積分時間の中で行わなければならない（すなわち数マイクロ秒で）。検出器分解能を像ごとに高める場合、スキャンは数ミリ秒ないし数秒の中で行わなければならない。
【００５７】
回転角調節の順序は、たとえば５回の変移のときｊ＝　０，２，４，３，１の順序で行うことができる。この場合、ｊ＊Ｌ／５（出発位置をｊ＝０として）だけ変移させる。この順序は、中間値をすでに個別チャンネル受け入れ後ｊ＝０，２，４について計算し、表示することができるという利点を持つ。続いて残りの個別チャンネルがｊ＝１，３について測定され、残りの中間値が計算され、それによってその分解能測定曲線がさらに１歩精密化される。
【００５８】
図１２に従う別の配置において、個別チャンネル入力信号の手操作もしくは歪みが以下のことによって行われる：（Ａ）による増幅の変更、（Ｉ）による積分時間の変更、積分器の前で付加のオフセットを供給することによる、および／または光子カウンタ配置によりカウンタされた光子のデジタルの影響による。
上記の配置においては、積分器回路が個別チャンネル信号を検出するために使用されている。しかし無条件に、個別チャンネル内で光子カウンタも行うことができる。
【００５９】
上記のハママツ製ライン検出器もしくはマトリクス検出器は、隣り合う個別チャンネルの間に幅０．２ｍｍのブリッジを有する。これらのブリッジは、計算アルゴリズムおよび検出装置の効率に、ネガティブの作用を及ぼす。この効果を避けるためには、場合によっては、ライン検出器もしくはマトリクス検出器の前にマイクロレンズアレーを技術の現状に従って配置することができる。このレンズアレーは付加的に入射光を、ライン検出器もしくはマトリクス検出器のアクティブな領域（個別チャンネル）に焦点を結ばせる。さらに、隣接する個別チャンネルの間の重ね書きを最小にする。
【００６０】
図１３には本発明に従う方法の２つの利用が示されている。
図１３ａ１）は、検出器分解能を高めるための方法を使用しない、分光計配置を有する蛍光スペクトル受入れを示し、図１３ａ２）は、同じ色素のスペクトルであるが、今度は本発明を使用したときのものを示す。明らかに、蛍光からレーザ線を分離することにおいてスペクトル分解能を高めていることが認められる。
図１３ｂ１）では、３２チャンネル検出器を有する線格子の像が測定されている。格子の構造は、検出器の小さい空間分解能に基づいて、おぼろげにしかわからない。図１３ｂ２）は同じ像カットであるが、今度は検出器の空間分解能を高めるための本方法によって受け入れたものを示す。構造は良好に識別可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）一光子吸収、ｂ）多光子吸収
【図２】ＬＳＭ構築（技術の現状）
【図３】典型的なスペクトル、ａ）色素、ｂ）蛍光蛋白質、ｃ）環境に依存の波長の変移
【図４】比率測定のための典型的なスペクトル、ａ）１色素と放射率、ｂ）２色素とイオンに依存する信号
【図５】検出器ユニット／光学系の構築ブロック接続図
【図６】検出器ユニット／光学系の構築例
【図７】ラインスキャナ用検出器ユニット／光学系の構築ブロック接続図
【図８】ラインスキャナ用検出器ユニット／光学系の構築例
【図９】スイッチング素子
【図１０】ピクセル変移アルゴリズム（上）と計算されたサブピクセル（下）
【図１１】ａ）検出器分解能の、上記分光計配置に基づく変移数ｎへの依存性、ｂ）検出器の空間分解能の変移数への依存性
【図１２】エレクトロニクス構築例
【図１３】ａ１）検出器分解能を高めるための、分光計配置を有する蛍光スペクトル受入れ、ａ２）同じ色素のスペクトルについて本発明を使用したとき、ｂ１）３２チャンネル検出器を有する線格子の像、ｂ２）同じ像カットで、本発明によって受け入れたもの
【符号の説明】
ＰＯ　　結像光学系
ＰＨ　　絞り（ピンホール）
ＤＩ　　分散素子
ＤＥ　　光検出器
Ｓ　　放射信号
ＷＳ　　波長スキャナ
ＰＯ　　ピンホール光学系
Ｇ　　格子
ＺＬ　　円筒レンズ
ＳＰ　　ミラー
Ｍ１　　結像鏡
ＷＳ　　位置スキャナ
Ａ　　増幅器
Ｉ　　積分器
Ｋ　　比較器

Claims

照明された試料の特徴的な大きさを光学的に把握するための方法であって、試料から撒き散らされた、反射したおよび／または蛍光化したおよび／または発射された信号が、試料から来る放射が検出器上に結像されることによって、空間分解能を有する検出器を用いて検出され、空間分解能をもって測定された放射の位置が検出器に相対的に変移し、検出器の空間分解能を高める目的のために、さまざまな変移によって測定された信号から、アルゴリズムを介して中間値が求められる方法。
変移のステップ量が前記検出器の空間分解能の網目量以下である、請求項１に記載の方法。
前記検出器の変移が、その空間分解能の方向で、および／または結像素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で、および／または反射素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で、および／または分散素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で行われる、先行請求項の１項に記載の方法。
スペクトル分解能を有するスペクトル測定が、前記検出器に前置された前記分散素子を通じて行われる、先行請求項の１項に記載の方法。
前記分散素子が少なくとも１つの軸のまわりに旋回可能な、先行請求項の１項に記載の方法。
固定された前記分散素子によって、少なくとも１つのその旋回軸内で、空間的に変化する旋回の作用が、この軸内でスキャン・ユニットおよび／または前記検出器の変移によって行われる、先行請求項の１項に記載の方法。
リアルタイム顕微鏡法のためのラインスキャナによって、変移が、少なくとも１つの軸のまわりに旋回可能なミラー、および／または前記検出器の変移、および／または走査鏡配置のミラーによって行われる、先行請求項の１項に記載の方法。
固定されたミラーによって、少なくとも１つの旋回軸内で空間的に変化するその軸内の旋回作用が、前記スキャン・ユニットおよび／または前記検出器の変移によって行われる、先行請求項の１項に記載の方法。
ラインスキャンと分散分割との間で切り換え接続される、先行請求項の１項に記載の方法。
前記分散素子がスペクトル分解能を高めるために旋回され、さらに、前記検出器および／または前記スキャン・ユニットの付加的な動きが行われる、先行請求項の１項に記載の方法。
照明された試料の波長に依存する特性、特に放射および／または吸収の特性、主として蛍光および／またはルミネセンスおよび／または燐光および／または酵素活性化放射光および／または酵素活性化蛍光の特徴的な大きさを光学的に把握するための、先行請求項の１項に記載の方法。
さまざまな色素を区別するための、および／または数種の色素を同時に使用する際に像ポイントの局所的色素構成を決定するための、および／または色素が結合している局所的環境に依存して放射スペクトルの局所的変移を決定するための、および／またはイオン濃度を決定するために放射率色素を測定するための、先行請求項の１項に記載の方法。
さまざまな色素を区別するための、および／または数種の色素を同時に使用する際に像ポイントの局所的色素構成を決定するための、および／または色素が結合している局所的環境に依存して吸収スペクトルの局所的変移を決定するための、および／またはイオン濃度を決定するために吸収率を測定するための、先行請求項の１項に記載の方法。
試料の放射光が前記分散素子によって分割され、少なくとも１つの方向で空間分解能をもって検出される、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
検出チャンネルからの信号が変換され、デジタルで読み出され、アルゴリズムの計算がデジタルで計算機内で行われる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
前記検出チャンネルからの信号が、入力信号の非線型の歪みによって影響を受ける、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
積分パラメタが影響を受ける、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
増幅器の特性曲線が影響を受ける、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
像を生成するために、計算された中間値および／または検出された信号が使用される、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
ステップごとに測定曲線を精密化するために中間値を計算する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
色コード化された蛍光像が造出される、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
別々の像が重なり合う、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
前記検出チャンネル内の比較器を通じて、測定された信号が参照信号と比較され、参照信号を下で超えおよび／または上で超えた場合に、検出チャンネルの運用法を変化させる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
それぞれの検出チャンネルの接断および／または無視が行われる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
関心のあるスペクトル領域が狭められる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
前記検出チャンネルの信号が、それぞれ少なくとも１つの積分回路を介して発生する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
前記検出チャンネルの信号が、光子カウントおよびそれに続くデジタル／アナログ変換を介して発生する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
光子カウンタが時間相関される、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
一光子蛍光および／または多光子蛍光および／またはもつれた光子によって励起される蛍光を把握するための、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
主として作用物質スクリーニングにおける平行な照明および検出を有する方法であって、試料が主として微滴定板である、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
ラインごとの検出を有する、請求項３０に記載の方法。
顕微鏡内の、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
走査型近視野顕微鏡内で検出するための、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
蛍光相関分光計内で一光子色素蛍光および／または多光子色素蛍光を検出するための、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
共焦点検出による、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
走査する配置を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
照明内にＸ／Ｙスキャナを有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
Ｘ／Ｙスキャンテーブルを有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
非共焦点検出による、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
デスキャン検出を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
明視野結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
点結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
デスキャンでない検出を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
明視野結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
走査型でないか、共焦点型か、または非共焦点型かの検出および点結像または明視野結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
Ｘ／Ｙスキャンテーブルを有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
照明された試料の特徴的な大きさを光学的に把握するための配置であって、試料から撒き散らされた、反射したおよび／または蛍光化したおよび／または発射された信号が、試料から来る放射が検出器上に結像されることによって、空間分解能を有する検出器を用いて検出され、空間分解能をもって測定された放射の位置が検出器に相対的に変移し、検出器の空間分解能を高める目的のために、さまざまな変移によって測定された信号から、アルゴリズムを介して中間値が求められる方法。
変移のステップ量が前記検出器の空間分解能の網目量以下である、請求項４７に記載の配置。
前記検出器の変移がその空間分解能の方向で、および／または結像素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で、および／または反射素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で、および／または前記分散素子の変移または旋回が少なくとも１つの軸内で行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
スペクトル分解能を有するスペクトル測定が、前記検出器に前置された前記分散素子を通じて行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
前記分散素子が少なくとも１つの軸のまわりに旋回可能な、先行請求項の１項に記載の配置。
固定された前記分散素子によって、少なくとも１つの旋回軸内で、空間的に変化する旋回が、この軸内で前記スキャン・ユニットによって行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
リアルタイム顕微鏡法のためのラインスキャナによって、変移が、少なくとも１つの軸のまわりに旋回可能なミラー、および／または前記検出器の変移、および／または走査鏡配置のミラーによって行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
固定されたミラーによって、少なくとも１つの旋回軸内で、空間的に変化するこの軸内の旋回が、前記スキャン・ユニットによって行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
ラインスキャンと分散分割との間で行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
前記分散素子がスペクトル分解能を高めるために旋回され、さらに、前記検出器および／またはスキャナの付加的な動きが行われる、先行請求項の１項に記載の配置。
照明された試料の波長に依存する特性、特に放射および／または吸収の特性、主として蛍光および／またはルミネセンスおよび／または燐光および／または酵素活性化放射光および／または酵素活性化蛍光の特徴的な大きさを光学的に把握するための、先行請求項の１項に記載の配置。
さまざまな色素を区別するための、および／または数種の色素を同時に使用する際に像ポイントの局所的色素構成を決定するための、および／または色素が結合している局所的環境に依存して放射スペクトルの局所的変移を決定するための、および／またはイオン濃度を決定するために放射率色素を測定するための、先行請求項の１項に記載の配置。
さまざまな色素を区別するための、および／または数種の色素を同時に使用する際に像ポイントの局所的色素構成を決定するための、および／または色素が結合している局所的環境に依存して吸収スペクトルの局所的変移を決定するための、および／またはイオン濃度を決定するために吸収率を測定するための、先行請求項の１項に記載の配置。
試料の放射光が前記分散素子によって分割され、少なくとも１つの方向で空間分解能をもって検出される、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
前記検出チャンネルからの信号が変換され、デジタルで読み出され、アルゴリズムの計算がデジタルで計算機内で行われる、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
前記検出チャンネルからの信号が、入力信号の非線型の歪みによって影響を受ける、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
積分パラメータが影響を受ける、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
前記増幅器の特性曲線が影響を受ける、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
像を生成するために、計算された中間値および／または検出された信号が使用される、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
色コード化された蛍光像が造出される、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
別々の像が重なり合う、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
前記検出チャンネル内の比較器を通じて、測定された信号が参照信号と比較され、参照信号を下で超えおよび／または上で超えた場合に、検出チャンネルの運用法を変化させる、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
それぞれの検出チャンネルの接断および／または無視が行われる、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
関心のあるスペクトル領域が狭められる、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
前記検出チャンネルの信号が、それぞれ少なくとも１つの積分回路を介して発生する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
前記検出チャンネルの信号が、光子カウンタおよびそれに続くデジタル／アナログ変換を介して発生する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
光子カウンタが時間相関される、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
一光子蛍光および／または多光子蛍光および／またはもつれた光子によって励起される蛍光を把握するための、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
主として作用物質スクリーニングにおける平行な照明および検出を有する方法であって、試料が主として微滴定板である、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
ラインごとの検出を有する、請求項７５に記載の配置。
顕微鏡内の、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
走査型近視野顕微鏡内で検出するための、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
蛍光相関分光計内で一光子色素蛍光および／または多光子色素蛍光を検出するための、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
共焦点検出を介する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
走査する配置を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
照明内にＸ／Ｙスキャナを有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
Ｘ／Ｙスキャンテーブルを有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
非共焦点検出を介する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
走査する配置を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
デスキャン検出を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
明視野結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
点結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
デスキャンでない検出を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
明視野結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
走査型でないか、共焦点型か、または非共焦点型かの検出および点結像または明視野結像を有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。
Ｘ／Ｙスキャンテーブルを有する、先行請求項の少なくとも１項に記載の配置。