WO2018117434A1 - 아날로그 평균지연 방법에서 수집한 신호로부터 가상의 형광분포 모델을 통해 최소자승오차를 계산하여 2개 이상의 형광수명 성분을 구하는 형광수명 측정장치 및 그 측정방법 - Google Patents

아날로그 평균지연 방법에서 수집한 신호로부터 가상의 형광분포 모델을 통해 최소자승오차를 계산하여 2개 이상의 형광수명 성분을 구하는 형광수명 측정장치 및 그 측정방법 Download PDF

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황원상
김동은
강민구
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence lifetime measuring apparatus and a measuring method for measuring the fluorescence lifetime, and more particularly to a measuring apparatus and measuring method capable of independently measuring at least a minimum time for two or more mixed samples. .
  • Microscopes are classified into first-generation optical microscopes, second-generation electron microscopes, and third-generation scanning probe microscopes, and are widely used in medicine, molecular biology, drug development, and materials engineering. do.
  • the fluorescence lifetime microscope is a device (FLIM-FRET) capable of measuring the fluorescence resonance energy transfer (FRET) most accurately.
  • FRET is a phenomenon in which energy is transferred from one phosphor to another without emitting or absorbing light when two phosphors are located at a proximity of 10 nm or less. Phenomenon that occurs on a scale of several nm or less and cannot be seen with conventional optical microscopes, can be identified by FRET, and the demand for many life sciences such as cell membranes, DNA, RNA, and protein-protein interactions is rapidly increasing.
  • TCSPC which is used as a fluorescence lifetime microscope, detects the response by a single photon using a light sensor having a high signal gain such as PMT or avalanche photo diode (APD). Regardless of how long the shape of the response pulse by a single photon is in the time axis, the arrival time of a single photon can be precisely measured. Using this, the fluorescence lifetime of 0.1 nanosecond level can be measured. If only a single photon is detected at each measurement, the arrival time of the single photon can be measured by detecting the arrival time of the rising edge of the measured single photon response. In principle, the accuracy of the arrival time measured is independent of the output pulse width of the light detector.
  • TCSPC transit time spread
  • TCSPC is a highly sensitive and stable measurement method that is widely used in time resolved spectroscopy and FLIM.
  • TCSPC there is a fundamental problem in the measurement time of the single photon counting method.
  • TCSPC only one photon can be counted at every measurement cycle. Even if a large number of fluorescent photons are generated from a plurality of fluorescent molecules by an excitation light pulse, the count is intentionally increased so that there is only one photon counted for each pulse. Must be reduced.
  • the counter only measures the value of the photon that arrived first, and the signal is lost. This occurrence causes the measured fluorescence lifetime to be shorter than the actual value.
  • an apparatus and a method for measuring fluorescence lifetime which enable a fast measurement speed independently are provided.
  • An apparatus for measuring fluorescence lifetime includes a fluorescence photon for collecting a fluorescence signal of a fluorescence photon generated by irradiating at least one sample containing a fluorescent molecule with an irradiation light generating unit for generating irradiation light and irradiation light
  • the detection unit includes a measurement unit for calculating the fluorescence life using the least squares method for the function of the collected fluorescence signal and the simulation function.
  • Fluorescence life measurement method is a light generation step of generating irradiation light, an irradiation step of collecting the fluorescent photons generated by irradiating the irradiation light to at least one sample, converting the fluorescent photon to a fluorescent signal A conversion step, a measurement step of calculating the fluorescence life using the least squares method for the function of the fluorescence signal and the simulation function.
  • the fluorescence lifetime value of the sample can be calculated more quickly.
  • FIG. 1 is a block diagram of an apparatus for measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating a method of measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a block diagram of an apparatus 100 for measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • the irradiation light generating unit 110 generates irradiation light capable of exciting the sample S.
  • the irradiated light is incident in space and parallel through the collimator 112 in the form of a pulse with respect to time.
  • the incident irradiation light passes through the SPF 113 (Short Pass Filter), is reflected from the dichroic filter 320, and is incident on the sample S through the objective lens 131.
  • the incident irradiation light causes fluorescent photons to be generated from the sample S.
  • the generated fluorescent photons are collected by the confocal scanner 120 through the objective lens 131 and then passed through the dichroic filter 132.
  • the fluorescent photons are amplified by the converter 140 and transferred to the fluorescent signal.
  • the amplified fluorescent signal is transmitted to the measurement unit 150.
  • the measurement unit 150 calculates the fluorescence life of the fluorescent photon from the received fluorescence signal.
  • the irradiation light generating unit 110 is a structure for generating irradiation light to be irradiated to the sample S containing fluorescent molecules, and includes an irradiation light source 111.
  • the irradiation light has a pulse width of 100 psec or less and has a wavelength in the range of 300 nm to 700 nm.
  • the irradiation light source 111 according to the embodiment of the present invention includes a semiconductor laser.
  • the semiconductor laser may include an electric pulse signal generator having a pulse width of 300 ps or less, a pulse clock unit for generating a stable trigger signal, and a semiconductor pulse laser head having a wavelength of 400 nm.
  • the irradiation light generating unit 110 may further include a collimator 112 and a SPF 113 (short pass filter) for collecting the irradiation light.
  • a collimator 112 and a SPF 113 (short pass filter) for collecting the irradiation light.
  • SPF 113 short pass filter
  • a change in time or wavelength of light with respect to the sample S may be measured in three dimensions.
  • the confocal scanner 120 includes a horizontal scan unit and a sig scan unit.
  • the horizontal scan unit includes a galvanometer mirror and can scan two-dimensionally at high speed using the galvanometer mirror.
  • the vertical scan part comprises motor driven means or piezoelectric-driven means (PZT). Both motor driven or piezoelectric driven means can be regulated by an open loop or closed loop system.
  • the fluorescent photon detector 130 is a module for collecting a plurality of fluorescent photons generated by irradiating at least one sample (S).
  • the fluorescent photon detector 130 includes a dichroic filter 132 to prevent the fluorescent photon collecting lens 131 and the irradiated light from being received by the converter 140.
  • the fluorescent photon collecting lens 131 is a lens for collecting a plurality of fluorescent photons generated from the sample (S).
  • the fluorescent photon collecting lens 131 may serve as an objective lens.
  • the dichroic filter 132 is an optical filter for selectively passing the incident irradiation light according to the wavelength.
  • the dichroic filter 132 according to the exemplary embodiment of the present invention has a characteristic of reflecting a wavelength band corresponding to the irradiation light and passing a wavelength band corresponding to the fluorescent photon. However, if necessary, the pass or reflection wavelength band of the dichroic filter 132 may be adjusted.
  • the fluorescent photon from which the irradiated light is removed is concentrated through a collimator (not shown) of the fluorescent photon detector after passing through a LPF (Loss Pass Filter).
  • the conversion unit 140 is a module that amplifies the fluorescent photons passing through the dichroic filter 132 and converts them into fluorescent signals.
  • the converter 140 includes a photodetector, an amplifier, and a digitizer.
  • the photodetector and the amplifier according to the embodiment of the present invention may include a photo multiply tube (PMT), an avalanche photo diode (APD) and / or an LPF, an amplifier.
  • PMT photo multiply tube
  • APD avalanche photo diode
  • LPF low noise amplifier
  • Photodetectors convert the collected fluorescent photons into fluorescent signals.
  • the converted fluorescence signal is transmitted to LPF.
  • LPF is a filter that passes low frequencies and amplifies clock signals in time.
  • LPF according to an embodiment of the present invention includes an electronic Gaussian low-pass filter (GLPF).
  • GLPF electronic Gaussian low-pass filter
  • GLPF eliminates the high frequency portion to facilitate data processing of the converted clock signal.
  • GLPF is symmetrical and free of ringing.
  • GLPF reduces the bandwidth of the clock signal to match the digitizer bandwidth.
  • the digitizer takes into account the irradiated light having a small pulse width to perform signal recovery. Specifically, it functions as part of the AMD meter 150 that collects clock signals and calculates fluorescence lifetime based thereon.
  • the measurement unit 150 is a module for obtaining a fluorescence lifetime of fluorescent photons collected from at least one sample.
  • the measurement unit 150 measures the fluorescence lifetime through the following principle.
  • the measurement unit 150 may measure the fluorescence lifetime of at least one sample, and the measurement of one or more samples is performed through the following method.
  • the most intuitive way to measure fluorescence lifetime is to inject a short pulse of excitation light into the sample and measure the time waveform of the emitted fluorescence with a high-speed photodetector.
  • a pulsed laser is used as the excitation light having a short pulse width.
  • the waveform measured by the light detector is a form in which the response of the light detector is convolved with the exponential decay waveform of the fluorescence, which is expressed by the following equation.
  • g (t) is the fluorescence signal measured by AMD method
  • f (t) is the fluorescence distribution function of the sample
  • h (t) is the impulse response function of the measurement system.
  • g (t) is a value obtained by reconstructing the measured signal through interpolation after quantization and sampling.
  • the simulation function To calculate the difference between the measured function g (t) and And g (t) functions obtained by sampling n values at equal intervals over time t ( ) can be defined as:
  • Is the measured fluorescence signal function Denotes a reference fluorescence signal function.
  • square error Is the minimum value of If you get the value The value is the fluorescence lifetime of the sample.
  • the fluorescence distribution function f (t) is given by the following equation.
  • the square error (in accordance with an embodiment of the present invention) ) Becomes the minimum , And Explain how to find the roots of.
  • the method for finding a root according to an aspect may use the following algorithm, which is repeated.
  • Equation 9 according to the present invention , , , ,
  • the squared error ( ) Becomes the minimum , And Since can be obtained, the fluorescence lifetime of the two fluorescent samples can be obtained.
  • the fluorescence lifetime cannot be obtained independently by separating the mixed samples into fluorescence lifetimes.
  • the fluorescence lifetime of the sample can be calculated independently.
  • fluorescence lifetime values can be obtained for three, four, and more fluorescent samples, respectively, through the same method as described above.
  • square error ) Becomes the minimum
  • the method of obtaining is not limited to the above, and the square error ( ) Becomes the minimum , And Includes all ways to obtain.
  • the fluorescence lifetime measuring method 200 is composed of steps processed in the fluorescence lifetime measuring apparatus 100 shown in FIG. Therefore, the description overlapping with the above-described content is omitted, the omitted content is also applied to the fluorescence lifetime measurement method 200 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart of a fluorescence lifetime measuring method 200 according to an embodiment of the present invention.
  • the light generating step 210 At least one or more samples S having different fluorescence lifetimes are prepared in the fluorescence lifetime measuring apparatus 100, and the light generating step 210 generates irradiation light to irradiate the sample S. to be.
  • the irradiation step 220 is a step of irradiating the sample S with irradiation light. At this time, the fluorescent photon generated in the sample (S) through the fluorescent photon collection unit is detected.
  • the converting step 230 amplifies the collected fluorescent photons and converts them into fluorescent signals.
  • the measurement step 240 calculates the fluorescence lifetime using the least square method for the function of the fluorescence signal and the simulation function.
  • the function, simulation function, and least squares method of the fluorescence signal are based on the principles described above.

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치는 조사광을 발생시키는 조사광 발생부, 조사광으로 형광 분자를 포함하는 적어도 하나 이상의 시료를 조사하여 생성되는 형광 광자의 형광 신호를 수집하는 형광 광자 검출부, 수집된 형광 신호의 함수와 시뮬레이션 함수에 대하여 최소 자승법을 이용하여 형광수명을 계산하는 계측부를 포함한다.

Description

아날로그 평균지연 방법에서 수집한 신호로부터 가상의 형광분포 모델을 통해 최소자승오차를 계산하여 2개 이상의 형광수명 성분을 구하는 형광수명 측정장치 및 그 측정방법
본 발명은 형광수명을 측정하기 위한 형광수명 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로, 상세하게는 혼합된 2개 이상의 시료에 대하여 최소한의 시간으로 각각 독립적으로 측정할 수 있는 측정장치 및 측정방법에 관한 것이다.
현미경은 제1세대 광학 현미경(optical microscope), 제2세대 전자 현미경(electron microscope), 제3세대 원자 현미경(scanning probe microscope)으로 분류되고, 의학, 분자 생물학, 신약 개발, 재료공학 분야에 폭넓게 활용된다.
그러나 최근에는 형광수명 현미경이 연구의 핵심으로 떠오르고 있다. 형광수명 현미경은 형광공명-에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)를 가장 정확하게 측정할 수 있는 장비(FLIM-FRET)이다. FRET이란 두 개의 형광체가 10 nm 이하의 근접거리에 위치해 있을 때 빛의 방출이나 흡수 없이 하나의 형광체에서 다른 형광체로 에너지가 전이되는 현상이다. 수 nm 이하의 스케일에서 일어나 기존의 광학현미경으로 볼 수 없었던 현상들을 FRET으로 확인할 수 있게 되면서, 세포막, DNA, RNA, 단백질-단백질 상호작용 등 수많은 생명과학 분야에서 수요가 급증하고 있다.
특히, 형광수명 현미경으로 사용되는 TCSPC는 PMT나 APD(avalanche photo diode)와 같은 높은 신호이득을 갖는 광 감지기를 이용하여 단일 광자에 의한 응답을 감지해낸다. 단일 광자에 의한 응답 펄스의 모양이 시간축에서 얼마나 긴 폭을 지니는가와는 상관없이 단일 광자의 도착 시간은 정밀하게 측정될 수 있다. 이를 이용하면 0.1 나노초 수준의 형광수명도 측정할 수 있게 된다. 만약 매 측정시마다 단일 광자만이 감지된다면 측정된 단일 광자 응답의 상승 모서리(risingedge)의 도착 시간을 검출함으로써 단일 광자의 도착 시간을 잴 수 있다. 원칙적으로 측정된 도착 시간의 정밀성은 광 감지기의 출력 펄스폭과 무관하다. 다만, 이러한 고이득의 광 감지기가 지니는 원리상의 문제로서, 통과시간 확산(transit time spread : TTS)의 문제가 있다. PMT의 경우 통상 TCSPC에서 아날로그 임펄스 응답 펄스 폭에 비해 5배 수준의 시간 측정 정밀성을 보인다. 이와 같은 방법으로 계수된 단일 광자의 도착 시간은 디지털 방법에 의해 시간축 도수분포표(histogram)를 그리는데 활용되고, 수백에서 수천번 이상 계수된 이후에는 도수분포표를 형광 광자 방출의 확률분포 함수(PDF, probability distribution function)로 간주하여 지수감쇠 함수(exponential decay funiction)로 어림짐작(fitting)하여 형광수명을 계산해낸다.
TCSPC는 고감도의 안정적인 측정방법으로 시분해 분광학과 FLIM 분야에서 다양하게 활용되고 있다. 그러나 TCSPC에서는 근본적으로 단일광자 계수 방법이 지니는 측정 시간에 있어서의 제약 문제가 나타난다. TCSPC에서는 오직 하나의 광자만이 매 측정 주기마다 계수될 수 있는데, 여기광 펄스에 의해 다수의 형광 분자로부터 다수의 형광 광자가 생성되더라도 계수기에서 계수되는 광자는 각 펄스별로 하나만 되도록 의도적으로 그 세기를 줄여야만 한다. 만약 측정 주기 내에 두 개 이상의 광자가 계수기에 의해 감지된다면 특히, 두 개의 광자의 도착 시간이 두 개의 펄스로 분해될 수 없을 만큼 가깝다면, 계수기는 오직 먼저 도착한 광자의 값만을 계측하며, 신호의 손실이 발생하여 측정된 형광수명은 실제 값보다 짧아지게 된다.
나아가, 단일한 광자라 하더라도 서로 다른 2개 이상의 형광수명을 갖는 시료가 다수 섞여 있는 경우 형광수명을 독립적으로 측정하기는 더욱 많은 문제가 생긴다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 서로 다른 형광 수명을 갖는 2개 이상의 형광 시료가 혼합된 경우에도, 독립적으로 빠른 측정 속도를 가능하게 하는 형광수명 측정장치 및 측정방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치는 조사광을 발생시키는 조사광 발생부, 조사광으로 형광 분자를 포함하는 적어도 하나 이상의 시료를 조사하여 생성되는 형광 광자의 형광 신호를 수집하는 형광 광자 검출부, 수집된 형광 신호의 함수와 시뮬레이션 함수에 대하여 최소 자승법을 이용하여 형광수명을 계산하는 계측부를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법은 조사광을 발생시키는 광발생 단계, 조사광을 적어도 하나 이상의 시료에 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 조사 단계, 형광 광자로부터 형광 신호로 변환하는 변환 단계, 형광 신호의 함수와 시뮬레이션 함수에 대하여 최소 자승법을 이용하여 형광수명을 계산하는 계측 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 서로 다른 형광 수명을 갖는 2개 이상의 시료가 혼합된 상태에서도 보다 빠르게 시료의 형광 수명 값을 계산할 수 있도록 한다.
상세하게는, 여러가지 다른 종류의 형광신호가 방출될 경우에도 각각의 형광수명을 분리하여 측정할 수 있도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치의 블록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법의 흐름도이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(100)를 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(100)의 블록도이다. 도 1을 참조하면, 조사광 발생부(110)는 시료(S)을 여기시킬 수 있는 조사광을 발생시킨다. 조사광은 시간에 대하여 펄스 형태로 콜리메이터(112)(Collimator)를 통하여 공간상 평행하게 입사된다.
입사된 조사광은 SPF(113)(Short Pass Filter)를 통과한 다음, 다이크로익 필터(320)(Dichroic filter)로부터 반사되며 대물렌즈(131)를 통해 시료(S)로 입사된다. 입사된 조사광은 시료(S)로부터 형광 광자를 생성하도록 한다.
생성된 형광 광자는 대물렌즈(131)를 통해 공초점 스캐너(120)에 수집된 후 다이크로익 필터(132)를 통과한다.
다음, 형광 광자는 변환부(140)를 통해 증폭되고 형광 신호로 전이된다. 증폭된 형광 신호는 계측부(150)로 전달된다.
계측부(150)는 전달 받은 형광 신호로부터 형광 광자의 형광수명을 계산한다.
조사광 발생부(110)는 형광 분자를 포함하는 시료(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 구조로서, 조사광원(111)을 포함한다.
조사광은 100psec 이하의 펄스폭을 갖고, 300nm 내지 700nm 범위 내의 파장을 갖는다. 본 발명의 일 실시예에 따른 조사광원(111)은 반도체 레이저를 포함한다.
또한, 반도체 레이저는 300ps 이하의 펄스폭을 갖는 전기펄스 신호 발생기, 안정적 트리거 신호를 생성하는 펄스 클럭부, 400nm 파장의 반도체 펄스레이저 헤드를 포함할 수 있다.
조사광 발생부(110)는 조사광을 집광하기 위한 콜리메이터(112)(Collimator)와 SPF(113)(Short Pass Filter)를 더 포함할 수 있다.
공초점 스캐너(120)는 3차원 이미징을 가능하게 하므로, 시료(S)에 대하여 빛의 시간 또는 파장에 따른 변화를 3차원으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 공초점 스캐너(120)는 수평 스캔부 및 스직 스캔부를 포함한다. 수평 스캔부는 갈바노미터 미러를 포함하며, 갈바노미터 미러를 이용해 초고속으로 2차원 스캔할 수 있다. 수직 스캔부는 모터 구동식 수단 또는 압전 구동식 수단(PZT, piezoelectric-driven means)을 포함한다. 모터 구동식 수단 또는 압전 구동식 수단은 모두 개방 루프 또는 폐쇄 루프 시스템에 의해 조절될 수 있다.
형광 광자 검출부(130)는 하나 이상의 시료(S)에 조사하여 생성되는 다수의 형광 광자를 수집하는 모듈이다. 형광 광자 검출부(130)는 형광 광자 수집렌즈(131)와 조사광이 후출하는 변환부(140)에 수광되는 것을 막기 위한 다이크로익 필터(132)를 포함한다.
형광 광자 수집렌즈(131)는 시료(S)로부터 생성된 다수의 형광 광자를 수집하는 렌즈이다. 형광 광자 수집렌즈(131)는 대물렌즈의 역할을 할 수도 있다.
다이크로익 필터(132)는 입사된 조사광을 파장에 따라 선택적으로 통과시키는 광 필터이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 다이크로익 필터(132)는 조사광에 대응되는 파장대역은 반사시키고 형광 광자에 대응되는 파장대역은 통과시키는 특성을 갖는다. 단, 필요에 따라 다이크로익 필터(132)의 통과 또는 반사 파장 대역은 조절될 수 있다.
또한, 조사 광이 제거된 형광 광자는 LPF(Loss Pass Filter)를 통과한 후 형광 광자 검출부의 콜리메이터(미도시)를 통해 집중된다.
변환부(140)는 다이크로익 필터(132)를 통과한 형광 광자를 증폭시켜 형광 신호로 변환하는 모듈이다. 변환부(140)는 광검출기, 증폭기 및 디지타이저를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 광검출기 및 증폭기는 광증폭관(PMT, Photo multiply tube), APD(Avalanche Photo Diode) 및/또는 LPF, 엠프를 포함할 수 있다.
광검출기는 수집된 형광 광자를 형광 신호로 변환한다. 변환된 형광 신호는 LPF로 전달된다.
LPF는 낮은 주파수를 통과시키는 필터로, 클럭 신호를 시간적으로 증폭시킨다. 본 발명의 일 실시예에 따른 LPF는 전자적 가우시안 저역 필터(GLPF, Gaussian low-pass filter)를 포함한다.
GLPF는 변환된 클럭 신호의 데이터 처리를 용이하게 할 수 있도록 높은 주파수 부분을 제거한다. GLPF는 대칭적이고, 링잉현상이 없도록 구현된다. GLPF는 디지타이저 대역폭에 대응될 수 있도록 클럭 신호의 대역폭을 감소시킨다.
디지타이저는 작을 펄스 폭을 갖는 조사 광을 참작하여, 신호 복원을 한다. 상세하게는, 클럭 신호들을 수집하고 이를 기초로 형광 수명을 계산하는 AMD 계측부(150)의 일부로서 기능한다.
계측부(150)는 적어도 하나 이상의 시료로부터 수집된 형광 광자의 형광 수명을 구하는 모듈이다. 계측부(150)는 아래와 같은 원리를 통해 형광 수명을 측정한다.
계측부(150)는 적어도 하나 이상의 시료에 대한 형광 수명을 측정할 수 있으며, 하나 이상의 시료에 대한 측정은 아래와 같은 방법을 통해 진행한다.
형광 수명을 측정하는 가장 직관적인 방법은 짧은 펄스 형태의 여기광을 시료에 입사시키고 방출되는 형광의 시간 파형을 고속의 광 감지기를 통해 측정하는 방법이다. 짧은 펄스폭을 갖는 여기광으로는 펄스형 레이저를 이용하게 된다.
이 때, 광 감지기를 통해 측정된 파형은 형광의 지수함수 감쇠 파형에 광 감지기의 응답이 컨볼루션 된 형태이며, 이는 다음의 수학식과 같다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000001
여기서 '
Figure PCTKR2017013140-appb-I000001
'기호는 컨볼루션을 나타내며, g(t)는 AMD방법으로 측정된 형광신호, f(t)는 시료의 형광분포 함수, h(t)는 측정시스템의 임펄스 반응함수를 나타낸다. 자세하게는 g(t)는 측정신호를 양자화 및 샘플링 후 보간(interpolation)을 통해 복원한 값이다.
첫번째로, 시료의 단일 형광수명 값을'
Figure PCTKR2017013140-appb-I000002
'라고 정의하면, 형광분포함수 f(t)를
Figure PCTKR2017013140-appb-I000003
라고 쓸 수 있다. 이 때,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000004
와 측정시스템의 임펄스 반응함수인 h(t)를 컨벌루션하면 이론적인 형광신호 함수인 시뮬레이션 함수
Figure PCTKR2017013140-appb-I000005
를 얻을 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000002
이 때, 시뮬레이션 함수
Figure PCTKR2017013140-appb-I000006
와 측정된 함수 g(t)의 차이를 계산하기 위하여 아래와 같이
Figure PCTKR2017013140-appb-I000007
와 g(t) 함수를 시간 t에 대하여 등간격으로 n개의 값을 샘플링하여 구한 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000008
)는 다음과 같이 정의할 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000003
여기서,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000009
는 측정된 형광신호 함수를,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000010
는 기준 형광신호함수를 나타낸다. 이 때, 자승오차
Figure PCTKR2017013140-appb-I000011
의 값이 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000012
값을 구하면
Figure PCTKR2017013140-appb-I000013
값은 시료의 형광수명이 된다.
이를 응용하면 측정 대상 시료가 2개인 경우에도 각 시료의 형광 수명값을 독립적으로 구할 수 있다.
일 예로, 측정 대상인 2개 시료의 형광수명 값을
Figure PCTKR2017013140-appb-I000014
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000015
라고 가정하면, 형광분포함수 f(t)는 다음과 같은 식을 같는다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000004
여기서
Figure PCTKR2017013140-appb-I000016
는 2개 시료 전체중에서 형광수명
Figure PCTKR2017013140-appb-I000017
을 갖는 형광체의 비율을 나타내는 상수이다.
이 때,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000018
식을 측정시스템의 임펄스 반응함수인 h(t)와 컨벌루션 하면 다음과 같은 이론적인 형광신호 함수인 시뮬레이션 함수
Figure PCTKR2017013140-appb-I000019
를 얻을 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000005
이 때, 시뮬레이션 함수
Figure PCTKR2017013140-appb-I000020
와 측정된 함수
Figure PCTKR2017013140-appb-I000021
의 차이를 계산하기 위하여 아래와 같이
Figure PCTKR2017013140-appb-I000022
와
Figure PCTKR2017013140-appb-I000023
함수를 시간 t에 대하여 등간격으로 n개의 값을 샘플링하여 구한 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000024
)는 다음과 같이 정의할 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000006
상기의
Figure PCTKR2017013140-appb-I000025
는 측정된 형광신호의
Figure PCTKR2017013140-appb-I000026
에서의 샘플링 값, 그리고
Figure PCTKR2017013140-appb-I000027
는 이론적인 형광신호 함수인 시뮬레이션 함수의
Figure PCTKR2017013140-appb-I000028
에서의 샘플링 값을 나타낸다.
이 때,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000029
에 대하여 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000030
)가 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000031
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000032
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000033
값을 구하면, 2개의 대상 시료에 대한 형광수명을 모두 측정할 수 있다.
다음, 본 발명의 일 실시예에 따른 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000034
)가 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000035
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000036
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000037
의 근을 구하기 위한 방법을 설명한다. 일 양상에 따른 근을 구하는 방법은 반복되는 다음과 같은 알고리즘을 사용할 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000007
여기서
Figure PCTKR2017013140-appb-I000038
의 야코비얀 행렬이다. 상기와 같은 알고리즘은 다변수 함수이면서 조건이 많은 경우에 사용될 수 있다.
상기와 같은 식은 다음과 같은 식을 통해 도출될 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000008
여기서 y는 데이터, g는 모델,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000039
는 모델의 파라미터이다.
Figure PCTKR2017013140-appb-I000040
로 정의하면, 위의 식은
Figure PCTKR2017013140-appb-I000041
의 근을 찾는 연립방정식이 되고,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000042
로 정의하면 상기와 같은 식을 구할 수 있다.
이를, 본원발명에 적용하여 최소자승법을 통해 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000043
)가 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000044
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000045
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000046
을 구한다. 여기서 본원발명에서는 데이터의 개수가 모델의 파라미터보다 많고, 모델이 파라미터에 대해 선형이 되지 않기 때문에 비선형 최소자승법이된다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000009
수학식 9에서, 본원발명에 의하면
Figure PCTKR2017013140-appb-I000047
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000048
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000049
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000050
이다.
여기서,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000051
는 단위 계단 함수(unit step function)이고,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000052
는 가우시안 로우 패스 필터를 나타낸다. 컨볼루션의 정의식을 활용하면 g를 다음과 같이 쓸 수 있다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000010
야코비안 행렬에 들어가는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000053
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000054
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000055
를 계산하는 식은 다음과 같다.
Figure PCTKR2017013140-appb-M000011
Figure PCTKR2017013140-appb-I000056
Figure PCTKR2017013140-appb-I000057
Figure PCTKR2017013140-appb-I000058
즉, 상기와 같은 식을 통해 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000059
)가 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000060
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000061
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000062
를 구할 수 있으므로 2개의 형광 시료에 대한 형광수명 값을 구할 수 있다.
기존의 평균지연 방법은 계산식을 이용하여 두 형광수명의 평균값만을 얻어 낼 수 있으므로, 섞여있는 시료를 형광수명으로 분리해서 독립적으로 형광수명의 값을 얻을 수 없는 반면, 상기와 같은 방법을 통해 섞여있는 시료의 형광수명을 독립적으로 산출할 수 있다.
나아가, 상기와 같은 방법을 통해 3개, 4개 및 그 이상의 형광 시료에 대해서도 각각 형광수명 값을 구할 수 있다.
다만, 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000063
)가 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000064
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000065
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000066
를 구하는 방법은 위에 한정되지 않고, 자승오차(
Figure PCTKR2017013140-appb-I000067
)가 최소가 되는
Figure PCTKR2017013140-appb-I000068
,
Figure PCTKR2017013140-appb-I000069
및
Figure PCTKR2017013140-appb-I000070
를 구할 수 있는 모든 방법을 포함한다.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(100)의 구성에 대해서 설명하였다. 이후에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(200)에 대하여 설명한다. 형광수명 측정방법(200)은 도1에 도시된 형광수명 측정장치(100)에서 처리되는 단계들로 구성된다. 따라서 상기에 서술한 내용과 중복되는 내용은 생략하며, 생략된 내용들은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(200)에도 적용된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(200)의 흐름도이다.
광 발생 단계(210)는 서로 다른 형광 수명을 갖는 적어도 하나 이상의 시료(S)를 형광수명 측정장치(100)에 준비시키고, 시료(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 광 발생 단계(210)이다.
조사 단계(220)는 조사광으로 시료(S)를 조사하는 단계이다. 이 때, 형광 광자 수집부를 통해 시료(S)에서 생성되는 형광 광자를 검출한다.
변환 단계(230)는 수집된 형광 광자를 증폭시켜 형광 신호로 변환한다.
계측 단계(240)는 형광 신호의 함수와 시뮬레이션 함수에 대하여 최소 자승법을 이용하여 형광수명을 계산한다. 형광 신호의 함수, 시뮬레이션함수 및 최소 자승법은 전술한 원리에 의한다.

Claims (10)

  1. 조사광을 발생시키는 조사광 발생부;
    상기 조사광으로 형광 분자를 포함하는 적어도 하나 이상의 시료를 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부;
    상기 형광 광자를 증폭시켜 형광 신호로 변환하는 변환부; 및
    상기 형광 신호의 함수와 시뮬레이션 함수에 대하여 최소 자승법을 이용하여 형광수명을 계산하는 계측부를 포함하는 형광수명 측정장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료의 형광수명을
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000071
    , 시료의 형광분포 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000072
    , 형광수명 측정장치의 응답 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000073
    라 할 때, 상기 시뮬레이션 함수
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000074
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정장치.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000075
  3. 제2항에 있어서,
    상기 형광 신호의 측정 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000076
    라 할 때,
    상기 최소 자승법에서, 자승
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000077
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 시료의 형광수명을 각각
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000078
    및
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000079
    , 상기 시료의 전체 대비 형광수명
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000080
    값을 갖는 시료의 비율을
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000081
    , 시료의 형광분포 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000082
    , 측정장치의 응답 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000083
    라 할 때, 상기 시뮬레이션 함수
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000084
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정장치.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000085
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광 신호의 측정 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000086
    라 할 때,
    상기 최소 자승법에서, 자승
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000087
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정장치.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000088
  6. 조사광을 발생시키는 광발생 단계;
    상기 조사광을 적어도 하나 이상의 시료에 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 조사 단계;
    상기 형광 광자로부터 형광 신호로 변환하는 변환 단계;
    상기 형광 신호의 함수와 시뮬레이션 함수에 대하여 최소 자승법을 이용하여 형광수명을 계산하는 계측 단계를 포함하는 형광수명 측정방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 계측 단계는,
    상기 시료의 형광수명을
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000089
    , 시료의 형광분포 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000090
    , 측정장치의 응답 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000091
    라 할 때, 상기 시뮬레이션 함수
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000092
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정방법.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000093
  8. 제7항에 있어서,
    상기 계측 단계는,
    상기 형광 신호의 측정 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000094
    라 할 때, 상기 최소 자승법에서, 자승
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000095
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정방법.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000096
  9. 제6항에 있어서,
    상기 계측 단계는,
    상기 시료의 형광수명을 각각
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000097
    및
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000098
    , 상기 시료의 전체 대비 형광수명
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000099
    값을 갖는 시료의 비율을
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000100
    , 시료의 형광분포 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000101
    , 측정장치의 응답 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000102
    라 할 때, 상기 시뮬레이션 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000103
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정방법.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000104
  10. 제9항에 있어서,
    상기 계측 단계는,
    상기 형광 신호의 측정 함수를
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000105
    라 할 때,
    상기 최소 자승법에서, 자승
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000106
    는 다음 수학식을 이용하여 계산되는 형광수명 측정방법.
    Figure PCTKR2017013140-appb-I000107
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