KR20120130772A

KR20120130772A - Ｆｒｅｔ 측정 방법 및 ｆｒｅｔ 측정 장치

Info

Publication number: KR20120130772A
Application number: KR1020127024489A
Authority: KR
Inventors: 가즈테루 호시시마; 시게유키 나카다
Original assignee: 미쯔이 죠센 가부시키가이샤
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2012-12-03
Also published as: CN102792153A; EP2570798A4; JP4866964B2; EP2570798A1; JP2011237342A; WO2011142103A1; US20130052656A1

Abstract

리셉터(receptors)와 리간드(ligands)가 결합하고, 제1 분자 및 제2 분자가 설치된 측정 샘플에 레이저광을 조사하고, 제1 분자로부터 제2 분자로 에너지가 이동하는 FRET를 측정하는 FRET 측정 방법에 있어서, 레이저광을 측정 샘플에 조사하는 단계, 측정 샘플이 발하는 형광을 계측하는 단계, 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 단계, 결합 비율을 산출하는 단계, 측정 샘플의 결합 조건을 설정하는 단계, 해리 상수를 산출하는 단계를 포함하고, 해리 상수를 산출하는 단계는, 최소 제곱법을 이용하여 측정 샘플 중의 리셉터의 전농도와 해리 상수를 변수로 하는 함수를 결합 비율 산출 단계에서 산출된 결합 비율에 적합시킴으로써 해리 상수를 구한다.

Description

ＦＲＥＴ 측정 방법 및 ＦＲＥＴ 측정 장치{FRET MEASUREMENT METHOD AND FRET MEASUREMENT DEVICE}

본 발명은, 레이저광의 조사에 의해 도너 분자(제1 분자)가 에너지를 흡수하고, 도너 분자로부터 억셉터 분자(제2 분자)로 에너지가 이동하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer: 형광 공명 에너지 이동)를 측정하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 구체적으로는, 리셉터(receptor)와 리간드(ligand)가 결합하고, 도너 분자 및 억셉터 분자가 설치된 측정 샘플에 레이저광을 조사하여 해리 상수를 구하는 FRET 측정 장치 및 FRET 측정 방법에 관한 것이다.

현재, 의료, 제약, 식품 산업에서의 포스트 게놈(post-genome)관련 기술로서, 단백질의 기능 해석이 중요해지고 있다. 특히, 세포의 작용을 해석하기 위하여, 생 세포에서의 생체 물질인 단백질과 다른 단백질이나 저분자 화합물 사이의 상호작용(결합, 분리)의 연구가 필요하다.

형광 공명 에너지 이동(FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer)현상을 이용하여, 생 세포에서의 생체 물질인 단백질과 다른 단백질이나 저분자 화합물 사이의 상호작용의 해석이 행해지고 있다. FRET 현상에 의해 생기는 형광을 측정함으로써, 수 나노 미터의 영역에서의 분자 사이의 상호작용을 측정할 수 있다.

예를 들면, FRET 발생시의 도너 분자의 형광 수명τ^* _d와 억셉터 분자가 존재하지 않을 때의 도너 분자의 형광 수명τ_d를 사용하여, 도너 분자로부터 억셉터 분자로의 에너지 이동의 정도를 나타내는 FRET 효율을 구하는 기술이 알려져 있다(특허 문헌 1).

상기 특허 문헌 1에서, FRET 효율은 1-τ^* _d/τ_d에 의해 구해진다.

그러나, 상기 FRET 효율은 도너 분자나 억셉터 분자의 농도에 영향을 받으므로, 상기 기술을 사용하여 세포 등에 포함되는 단백질의 상호작용의 힘을 정량적으로 구하는 것은 어렵다.

일반적으로, 분자가 상호작용할 때의 결합의 힘을 나타내는 지표로서, 해리 상수 K_d가 사용된다. 그러나, 해리 상수 K_d를 양호한 정밀도로 측정하는 것이 용 이하지 않은 경우가 있다. 이하, 해리 상수 K_d에 대하여 설명한다. 예를 들면, 하기 식 (1)에 나타난 반응의 경우, 해리 상수 K_d는 하기 식 (2)와 같이 정의된다. 여기서, L는 리간드, R는 리셉터, LR는 리간드와 결합되어 있는 리셉터를 나타낸다. 또, [L]은 리셉터와 결합하고 있지 않은 리간드의 농도(이하, 「리간드 농도」라 함), [R]은 리간드와 결합하고 있지 않은 리셉터의 농도(이하, 「리셉터 농도」라 함), [LR] 는 리간드와 결합되어 있는 리셉터의 농도를 나타낸다.

여기서, 샘플 중에 포함되는 전체 리간드 농도를 [L₀], 전체 리셉터 농도를 [R₀]로 하면, [L₀], [R₀]는 다음과 같은 관계식에 의해 표현된다.

식 (2)와 식 (4)로부터 [R]을 소거하면, 하기 식 (5)를 얻을 수 있다.

식 (5)의 좌변은 전체 리셉터 중 리간드와 결합되어 있는 리셉터의 비율을 나타낸 것이다.

[LR]/[R₀]를 [L]의 대수축(對數軸)에 대하여 플롯 하면, 시그모이드(sigmoid) 곡선이 된다.

해리 상수 K_d가 큰 것은 식 (1)의 우변으로부터 좌변으로의 반응이 일어나기 쉬운 것을 나타낸다. 그러므로, 해리 상수 K_d가 어느 정도 큰 경우에는, [L]?[LR] 의 관계가 성립된다. 이때, 식 (3)과 식 (5)로부터, [LR]/[R₀]는 하기 식 (6)과 같이 근사된다.

식 (6)에 의하면, 전체 리간드 농도 [L₀]가 해리 상수 K_d과 동등하게 될 때, 샘플 중에 포함된 전체 리셉터 중 리간드와 결합되어 있는 리셉터의 비율[LR]/[R₀]이 0.5가 된다. 그러므로, 전체 리간드 농도 [L₀]를 변화시키면서[LR]/[R₀]를 측정하고, [LR]/[R₀]가 0.5가 되는 경우 전체 리간드 농도 [L₀]로부터 해리 상수 K_d를 구할 수 있다.

평형 상태에 있는 리간드의 농도 [L]을 측정하는 것이 곤란한 경우에도, 전체 리간드 농도 [L₀]를 구하는 것은 가능하므로, 상기와 같은 방법에 의해 해리 상수 K_d를 구하는 방법이 사용된다.

특허 문헌 1: 일본 특허출원 공개번호 2007-240424호 공보

그러나, 해리 상수 K_d가 작은 경우에는, [L]?[LR]의 관계식이 성립되지 않기 때문에, 식 (5)를 식 (6)과 같이 근사시킬 수 없다. 그러므로, 해리 상수 K_d가 작은 경우, 전체 리간드 농도 [L₀]를 변화시키면서 [LR]/[R₀] 를 측정하고, [LR]/[R₀]가 0.5가 되는 경우 전체 리간드 농도 [L₀]는, 해리 상수 K_d의 값과는 상이한 값이 되어, 종래의 방법에서는 해리 상수 K_d를 정확하게 구할 수 없다.

그래서, 본 발명은, 해리 상수 K_d의 크기에 관계 없이, 해리 상수 K_d를 양호한 정밀도로 측정할 수 있는 FRET 측정 방법 및 FRET 측정 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 FRET 측정 방법은, 리셉터와 리간드가 결합하고, 제1 분자 및 제2 분자가 설치된 측정 샘플에 레이저광을 조사하고, 제1 분자로부터 제2 분자에 에너지가 이동하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)를 측정하는 FRET 측정 방법에 있어서, 강도가 시간 변조된 레이저광을 상기 측정 샘플에 조사하는 조사 단계, 상기 레이저광을 조사된 상기 측정 샘플이 발하는 형광을 계측하는 계측 단계, 상기 계측 단계에서 계측된 형광 신호를 사용하여 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 형광 수명 산출 단계, 상기 형광 수명 산출 단계에서 산출된 상기 형광 수명을 사용하여 상기 측정 샘플에 포함되는 상기 리셉터 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터의 비율인 결합 비율을 산출하는 결합 비율 산출 단계, 상기 결합 비율이 상이하도록 상기 측정 샘플의 결합 조건을 설정하는 결합 조건 설정 단계, 상기 리셉터와 상기 리간드와의 결합의 정도를 나타내는 해리 상수를 산출하는 해리 상수 산출 단계를 포함하고, 상기 해리 상수 산출 단계는, 최소 제곱법을 이용하여, 상기 측정 샘플 중의 상기 리셉터의 전체 농도와 상기 해리 상수를 변수로 하는 함수를 상기 결합 비율 산출 단계에서 산출된 상기 결합 비율에 적합(適合)(fitting)시킴으로써, 상기 해리 상수를 구하는 것을 특징으로 한다.

또, 상기 결합 비율을 κ_FRET, 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리셉터의 전체 농도를 [R₀], 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리간드의 전체 농도를 [L₀], 상기 해리 상수를 K_d로 하면, 상기 해리 상수 산출 단계는, [R₀]와 K_d를 변수로 하는 2변수 최소 제곱법을 이용하여, 하기 식을 κ_FRET와 [L₀]에 적합시킴으로써, 상기 해리 상수 K_d를 구하는 것이 바람직하다.

또, 상기 형광 수명 산출 단계는, 상기 계측 단계에서 계측된 형광 신호와 상기 레이저광을 변조하는 변조 신호와의 위상차를 사용하여, 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 것이 바람직하다.

또, 상기 리셉터에는 제1 분자와 제2 분자가 결합되어 있고, 상기 결합 조건 설정 단계는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율이 상이하도록 상기 샘플의 결합 조건을 설정하는 것이 바람직하다.

또, 상기 리셉터에는 제1 분자가 결합되어 있고, 상기 리간드에는 제2 분자가 결합되어 있고, 상기 결합 조건 설정 단계는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율이 상이하도록 상기 샘플의 결합 조건을 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 FRET 측정 장치는, 리셉터와 리간드가 결합하고, 제1 분자 및 제2 분자가 설치된 측정 샘플에 레이저광을 조사하고, 제1 분자로부터 제2 분자에 에너지가 이동하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)를 측정하는 FRET 측정 장치에 있어서, 강도가 시간 변조된 레이저광을 상기 측정 샘플에 조사하는 레이저 광원부, 상기 레이저광을 조사된 상기 측정 샘플이 발하는 형광을 계측하는 계측부, 상기 계측부로 계측된 형광 신호를 사용하여 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 형광 수명 산출부, 상기 형광 수명 산출부에서 산출된 상기 형광 수명을 사용하여 상기 측정 샘플에 포함되는 상기 리셉터 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터의 비율인 결합 비율을 산출하는 결합 비율 산출부, 상기 리셉터와 상기 리간드와의 결합의 정도를 나타내는 해리 상수를 산출하는 해리 상수 산출부를 포함하고, 상기 해리 상수 산출부는, 최소 제곱법을 이용하여, 상기 측정 샘플 중의 상기 리셉터의 전체 농도와 상기 해리 상수를 변수로 하는 함수를, 상기 결합 비율이 상이한 복수개의 결합 조건에 있어서 상기 결합 비율 산출부에서 산출된 상기 결합 비율에 적합시킴으로써, 상기 해리 상수를 구하는 것을 특징으로 한다.

또, 상기 결합 비율을 κ_FRET, 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리셉터의 전체 농도를 [R₀], 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리간드의 전체 농도를 [L₀], 상기 해리 상수를 K_d로 하면, 상기 해리 상수 산출 단계는, [R₀] 와 K_d를 변수로 하는 2변수 최소 제곱법을 이용하여, 하기 식을 κ_FRET와 [L₀]에 적합시킴으로써, 상기 해리 상수 K_d를 구하는 것이 바람직하다.

또, 상기 형광 수명 산출부는, 상기 계측부에서 계측된 형광 신호와 상기 레이저광을 변조하는 변조 신호와의 위상차를 사용하여 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 것이 바람직하다.

또, 상기 리셉터에는 제1 분자와 제2 분자가 결합되어 있고, 상기 해리 상수 산출부는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율을 상이하게 한 복수개의 결합 조건에서, 상기 결합 비율 산출부에서 산출된 상기 결합 비율을 적합시킴으로써, 상기 해리 상수를 구하는 것이 바람직하다.

또, 상기 리셉터에는 제1 분자가 결합되어 있고, 상기 리간드에는 제2 분자가 결합되어 있고, 상기 해리 상수 산출부는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율을 상이하게 한 복수개의 결합 조건에서, 상기 결합 비율 산출부에서 산출된 상기 결합 비율을 적합시킴으로써, 상기 해리 상수를 구하는 것이 바람직하다.

본 발명의 FRET 측정 방법 및 FRET 측정 장치에 의하면, 해리 상수 K_d의 크기에 관계없이 해리 상수 K_d를 양호한 정밀도로 측정할 수 있다.

도 1은 FRET 측정 장치의 일 실시형태인 플로 사이트 미터(flow sight meter)의 개략 구성도이다.
도 2a는 리셉터에 리간드가 결합하고 있지 않은 상태의 샘플을 나타낸 도면이며, 도 2b는 리셉터에 리간드가 결합되어 있는 상태의 샘플을 나타낸 도면이다.
도 3은 도너 분자와 억셉터 분자의 에너지 흡수 스펙트럼과 형광 방사 스펙트럼의 일례를 나타낸 도면이다.
도 4는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터의 계측부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 5는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터의 제어 처리부의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 6은 도 1에 나타난 플로 사이트 미터의 분석 장치의 일례를 나타낸 개략 구성도이다.
도 7은 FRET 측정 방법의 일례를 나타낸 흐름도다.
도 8은 전체 리간드 농도에 대한 도너 분자의 형광 수명의 측정 결과의 일례를 나타낸 도면이다.
도 9는 전체 리간드 농도에 대한 결합 비율의 측정 결과의 일례를 나타낸 도면이다.

(FRET 측정 장치의 개략 구성)

이하, 본 발명의 FRET 측정 방법 및 장치에 대하여 상세하게 설명한다. 도 1은 본 발명의 FRET 측정 장치의 일 실시형태인 플로 사이트 미터(flow sight meter)(10)의 개략 구성도이다.

본 실시형태의 플로 사이트 미터(10)는, 예를 들면, 측정 대상이 되는 생 세포 중의 단백질을 도너 분자와 억셉터 분자로 표시한 샘플(12)(측정 샘플)에 레이저광을 조사하고, 샘플(12)이 발하는 형광을 계측한다. 계측된 형광 신호를 사용함으로써, 플로 사이트 미터(10)는 해리 상수 K_d의 값을 구한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 플로 사이트 미터(10)는 관로(20), 레이저 광원부(30), 계측부(40, 50), 제어 처리부(100), 분석 장치(150)를 구비한다.

관로(20)는 고속류를 형성하는 시스(sheath)액과 함께 샘플(12)을 흐르게 한다. 관로(20)의 출구에는 샘플(12)을 회수하는 회수 용기(22)가 설치되어 있다.

여기서, 도 2를 참조하여, 본 실시형태의 샘플(12)에 대하여 설명한다. 본 실시형태의 샘플(12)에서는, 리셉터(R)에 도너 분자(16)와 억셉터 분자(18)가 결합되어 있다. 도 2a는 리셉터(R)에 리간드(L)가 결합하고 있지 않은 상태의 샘플(12)을 나타낸 도면이며, 도 2b는 리셉터(R)에 리간드(L)가 결합되어 있는 상태의 샘플(12)을 나타낸 도면이다. 도 2a, 2b에 나타낸 바와 같이, 본 실시형태에서는 리셉터(R)에 리간드(L)가 결합하면, 리셉터(R)가 변형된다. 그 결과, 도너 분자(16)와 억셉터 분자(18)와의 거리가 가깝게 되어, FRET 현상이 생긴다. 따라서, 본 실시형태의 플로 사이트 미터(10)에 의해 FRET 현상을 측정함으로써, 리셉터(R)에 리간드(L)가 어느 정도 결합되어 있는지를 알 수 있다.

다시 도 1을 참조하면, 레이저 광원부(30)는 강도가 시간 변조된 레이저광을 샘플(12)에 조사한다. 샘플(12)에 레이저광이 조사되면, 도너 분자(16)와 억셉터 분자(18)는 각각 에너지를 흡수한다. 예를 들면, 도너 분자(16)가 CFP(Cyan Fluorescent Protein), 억셉터 분자(18)가 YFP(Yellow Fluorescent Protein)인 경우, 도너 분자(16)가 주로 에너지를 흡수하는 파장 405nm~450nm의 레이저광이 사용된다. 레이저 광원부(30)는, 예를 들면, 반도체 레이저이다. 레이저 광원부(30)가 출사하는 레이저광의 출력은, 예를 들면, 5mW~100mW이다.

여기서, 레이저 광원부(30)가 조사하는 레이저광의 파장과 도너 분자(16) 및 억셉터 분자(18)가 에너지를 흡수하는 파장과의 관계 및 FRET의 발생에 대하여 설명한다.

도 3은 도너 분자(16)가 CFP, 억셉터 분자(18)가 YFP인 경우의 에너지 흡수 스펙트럼과 형광 방사 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 곡선 A₁은 도너 분자(16)의 에너지 흡수 스펙트럼이며, 곡선 A₂는 도너 분자(16)의 형광 방사 스펙트럼이다. 또, 곡선 B₁은 억셉터 분자(18)의 에너지 흡수 스펙트럼이며, 곡선 B₂는 억셉터 분자(18)의 형광 방사 스펙트럼이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 도너 분자(16)가 주로 에너지를 흡수하는 파장 영역은 405nm~450nm이다. 또, 억셉터 분자(18)가 주로 에너지를 흡수하는 파장 영역은, 470nm~530nm이다.

일반적으로, 도너 분자(16)와 억셉터 분자(18)와의 거리가 10nm 이하인 경우, 레이저광의 조사에 의해 도너 분자(16)가 흡수한 에너지의 일부가 쿨롬 상호작용(coulomb interaction)에 의해 억셉터 분자(18)로 이동한다. 억셉터 분자(18)는 쿨롬 상호작용에 의해 도너 분자(16)로부터 이동한 에너지를 흡수함으로써 여기되어 형광을 발한다. 이 현상은, 형광 공명 에너지 이동(FRET)이라 한다.

도너 분자(16)로서 CFP를 사용하고, 억셉터 분자(18)로서 YFP를 사용한 경우에도 FRET가 발생한다. 즉, 쿨롬 상호작용에 의해 도너 분자(16)로부터 억셉터 분자(18)로 에너지가 이동함으로써, 억셉터 분자(18)가 여기된 것에 기인한 형광을 발한다.

다시 도 1을 참조하면, 계측부(40)는 관로(20)를 협지(挾持)하여 레이저 광원부(30)와 대향하도록 배치되어 있다. 계측부(40)는 측정점을 통과하는 샘플(12)에 의해 레이저광이 전방 산란함으로써, 샘플(12)이 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 계측부(40)로부터 출력되는 신호는 제어 처리부(100)에 공급된다. 계측부(40)로부터 제어 처리부(100)에 공급되는 신호는 샘플(12)이 관로(20) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 트리거 신호로서 사용된다.

계측부(50)는 측정점을 통하고 레이저 광원부(30)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 직교하는 평면과, 측정점을 통하고 관로(20) 중의 샘플(12)의 이동 방향에 대하여 직교하는 평면과의 교선 상에 배치되어 있다. 계측부(50)는 측정점에 의해 레이저광을 조사된 샘플(12)이 발하는 형광을 수광하는 광전 변환기를 구비한다. 광전 변환기는, 예를 들면, 광전자 증배관이나 어발란체 포토 다이오드(avalanche photo diode)이다.

여기서, 도 4를 참조하여, 계측부(50)의 구성을 상세히 설명한다. 도 4는 본 실시형태의 계측부(50)의 일례를 나타낸 개략 구성도이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 계측부(50)는 렌즈계(51), 다이크로익 미러(52), 제1 및 제2 밴드 패스 필터(53, 54), 광전 변환기(55, 56)를 구비한다.

렌즈계(51)는 샘플(12)이 발하는 형광을 집속시킨다. 다이크로익 미러(52)는 억셉터 분자(18)가 발하는 형광을 투과하고, 도너 분자(16)가 발하는 형광을 반사시키도록, 반사, 투과의 파장 특성이 정해져 있다.

제1 및 제2 밴드 패스 필터(band pass fileter)(53, 54)는 광전 변환기(55, 56)의 수광면의 앞면에 설치된다. 제1 및 제2 밴드 패스 필터(53, 54)는 소정의 파장 대역의 형광만을 투과시킨다. 구체적으로는, 제1 밴드 패스 필터(53)는 도너 분자(16)가 주로 형광을 발하는 파장 대역(도 3에서 A로 나타내는 대역)의 형광을 투과하도록 설정되어 있다. 또, 제2 밴드 패스 필터(54)는 억셉터 분자(18)가 주로 형광을 발하는 파장 대역(도 3에서 B로 나타내는 대역)의 형광을 투과하도록 설정되어 있다.

광전 변환기(55, 56)는 수광한 광을 전기 신호로 변환한다. 광전 변환기(55, 56)는, 예를 들면, 광전자 증배관을 구비한 센서이다. 광전 변환기(55, 56)가 수광한 형광은 강도 변조된 레이저광보다 위상이 지연되어 있다. 그러므로, 광전 변환기(55, 56)는 강도 변조된 레이저광에 대한 위상차의 정보를 가진 광신호를 수광하여 전기 신호로 변환한다. 광전 변환기(55, 56)로부터 출력된 신호(형광 신호)는 제어 처리부(100)에 공급된다.

여기서, 도 5를 참조하여, 제어 처리부(100)의 구성을 상세히 설명한다. 도 5는 본 실시형태의 제어 처리부(100)의 일례를 나타낸 개략 구성도이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 제어 처리부(100)는 신호 생성부(110), 신호 처리부(120), 컨트롤러(130)를 구비한다.

신호 생성부(110)는, 레이저광의 강도를 시간 변조하기 위한 변조 신호를 생성한다. 변조 신호는, 예를 들면, 소정의 주파수의 정현파 신호이며, 10MHz~100MHz의 범위의 주파수로 설정된다.

신호 생성부(110)는 발진기(112), 파워 스플리터(114), 제1 및 제2 증폭기(116, 118)를 구비한다. 발진기(112)에 의해 생성된 변조 신호는, 파워 스플리터(114)에 의해 분류되어, 레이저 광원부(30)와 신호 처리부(120)에 공급된다. 신호 생성부(110)가 변조 신호를 신호 처리부(120)에 공급하는 것은, 후술하는 바와 같이, 변조 신호에 대한 형광 신호의 위상차를 측정하기 위한 참조 신호로서 사용하기 때문이다. 또, 변조 신호는, 레이저 광원부(30)가 출사하는 레이저광의 진폭을 변조하기 위한 신호로서 사용된다.

신호 처리부(120)는 광전 변환기(55, 56)로부터 출력되는 형광 신호를 사용하여 샘플(12)이 발하는 형광의 정보를 추출한다. 샘플(12)이 발하는 형광의 정보는, 예를 들면, 형광의 강도에 관한 정보나, 형광의 수명에 관한 정보이다. 신호 처리부(120)는 제3 및 제4 증폭기(122, 124), 위상차 검출기(126)를 구비한다.

제3 및 제4 증폭기(122, 124)는 광전 변환기(55, 56)로부터 출력되는 신호를 증폭하여, 증폭한 신호를 위상차 검출기(126)에 출력한다.

위상차 검출기(126)는 광전 변환기(55, 56)로부터 출력된 형광 신호의 각각에 대하여 변조 신호(참조 신호)에 대한 위상차를 검출한다. 위상차 검출기(126)는 도시하지 않은 IQ 믹서를 구비하고 있다. IQ 믹서는 참조 신호와 형광 신호를 승산함으로써, 형광 신호의 cos성분(실수부)과 고주파 성분을 포함하는 처리 신호를 산출한다. 또, IQ 믹서는, 참조 신호의 위상을 90도 시프트 시킨 신호와 형광 신호를 승산함으로써, 형광 신호의 sin성분(허수부)과 고주파 성분을 포함하는 처리 신호를 산출한다.

컨트롤러(130)는 신호 생성부(110)가 소정의 주파수의 정현파 신호를 생성하도록 신호 생성부(110)를 제어한다. 또, 컨트롤러(130)는 신호 처리부(120)에 의해 출력된 형광 신호의 cos성분과 sin성분을 포함하는 처리 신호로부터 고주파 성분을 없애, 형광 신호의 cos성분과 sin성분을 구한다.

컨트롤러(130)는 로우 패스 필터(low pass filter)(132), 제5 증폭기(134), A/D 변환기(136), 시스템 제어기(138)를 구비한다. 로우 패스 필터(132)는 신호 처리부(120)로부터 출력된 형광 신호의 cos성분과 sin성분과 고주파 성분을 포함하는 신호로부터 고주파 성분을 없앤다. 제5 증폭기(134)는 로우 패스 필터(132)에 의해 고주파 성분이 제거된 신호인, 형광 신호의 cos성분, sin성분의 처리 신호를 증폭하여 A/D 변환기(136)에 출력한다. A/D 변환기(136)는 형광 신호의 cos성분, sin성분의 처리 신호를 샘플링하여, 분석 장치(150)에 공급한다. 시스템 제어기(138)는 계측부(40)로부터 출력되는 트리거 신호의 입력을 받는다. 또, 시스템 제어기(138)는 발진기(112)와 A/D 변환기(136)를 제어한다.

다시 도 1을 참조하면, 분석 장치(150)는 형광 신호의 cos성분(실수부), sin성분(허수부)의 처리 신호로부터, 형광 수명, 결합 비율, 해리 상수 등을 산출한다.

분석 장치(150)는 컴퓨터 상에서 소정의 프로그램을 기동시킴으로써 구성되는 장치이다. 여기서, 도 6을 참조하여, 분석 장치(150)의 구성을 상세하게 설명한다. 도 6은 본 실시형태의 분석 장치(150)의 일례를 나타낸 개략 구성도이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 분석 장치(150)는 CPU(152), 메모리(154), 입출력 포트(156), 형광 수명 산출 유닛(158), 결합 비율 산출 유닛(160), 해리 상수 산출 유닛(162), 판정부(164)를 구비한다.

또, 분석 장치(150)에는 디스플레이(200)가 연결되어 있다.

CPU(152)는 컴퓨터에 설치된 연산 프로세서이다. CPU(152)는 형광 수명 산출 유닛(158), 결합 비율 산출 유닛(160), 해리 상수 산출 유닛(162)의 각종 계산을 실질적으로 실행한다.

메모리(154)는, 컴퓨터 상에서 실행함으로써, 형광 수명 산출 유닛(158), 결합 비율 산출 유닛(160), 해리 상수 산출 유닛(162)을 형성하는 프로그램을 저장한 ROM, 이들 유닛에 의해 산출된 처리 결과 및 입출력 포트(156)로부터 공급된 데이터를 기억하는 RAM을 구비한다.

입출력 포트(156)는 컨트롤러(130)로부터 공급되는 형광 신호의 cos성분(실수부), sin성분(허수부)의 값의 입력을 받는다. 또, 입출력 포트(156)는 각 유닛에 의해 산출된 처리 결과를 디스플레이(200)에 출력한다.

디스플레이(200)는 각 유닛에 의해 구해진 각종 정보나 처리 결과 등을 표시한다.

형광 수명 산출 유닛(158)은 계측부(50)에서 계측된 형광 신호를 사용하여, 도너 분자(16)의 형광 수명을 산출한다. 예를 들면, 형광 수명 산출 유닛(158)은 컨트롤러(130)로부터 공급되는 형광 신호의 cos성분 및 sin성분의 값으로부터, 변조 신호에 대한 형광 신호의 위상차를 구한다. 또, 형광 수명 산출 유닛(158)은, 구한 위상차를 사용하여 도너 분자(16)의 형광 수명을 산출한다. 구체적으로, 형광 수명 산출 유닛(158)은 후술하는 식 (21)에 따라 위상차의 tan성분을 변조 신호의 각 주파수로 나누어 형광 수명을 산출한다. 형광 수명은 레이저광의 조사에 의해 발해지는 형광 성분이 1차 지연계의 완화 응답인 것으로 한 경우의 형광 완화 시정수에 의해 표현된다.

결합 비율 산출 유닛(160)은 형광 수명 산출 유닛(158)에서 산출된 형광 수명을 사용하여, 샘플(12) 중에 포함된 리셉터(R) 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터의 비율인 결합 비율을 산출한다. 구체적으로는, 결합 비율 산출 유닛(160)은 후술하는 식 (23)에 의해 규정되는 결합 비율 κ_FRET를 산출한다.

해리 상수 산출 유닛(162)은 리셉터(R)와 리간드(L)와의 결합의 정도를 나타내는 해리 상수 K_d를 산출한다. 구체적으로는, 해리 상수 산출 유닛(162)은 샘플(12) 중의 리셉터(R)의 전체 농도와 해리 상수 K_d를 변수로 하는 최소 제곱법을 이용하여, 결합 비율 산출부(160)에서 산출된 결합 비율 κ_FRET에 적합(適合)(fitting)시킴으로써 해리 상수 K_d를 구한다. 보다 구체적으로는, 해리 상수 산출 유닛(162)은 샘플(12) 중의 리셉터(R)의 전체 농도와 해리 상수 K_d를 변수로 하는 2변수 최소 제곱법을 이용하여, 후술하는 식 (8)을 적합시킴으로써 해리 상수 K_d를 구한다.

판정부(164)는 해리 상수 산출 유닛(162)이 2변수 최소 제곱법을 이용하여 적합시키기 위해 필요로 하는 소정수의 측정 데이터가 얻어지는지 아닌지를 판정한다.

이상이, 본 실시형태의 플로 사이트 미터(10)의 구성이다.

(FRET 측정 방법의 개요)

이하, 본 발명의 FRET 측정 방법의 개요를 설명한다.

도 2를 참조하여 설명한 바와 같이, 본 실시형태에서는 리셉터(R)에 리간드(L)가 결합함으로써 FRET 현상이 생긴다. 샘플(12) 중, 리셉터(R)와 리간드(L)는, 전술한 식 (1)에 의해 표현되는 평형 상태가 된다. 여기서, 전술한 식 (2), 식 (3), 식 (4)를 사용하여 [L], [R]을 소거하면, 하기 식 (7)을 얻을 수 있다.

[LR]＜[L₀] 의 조건에서, 상기 식 (7)을 [LR]에 대하여 풀면 하기 식 (8)을 얻을 수 있다.

상기 식 (8)은, 식 (7)의 엄밀해(exact solution)이며, 해리 상수 K_d의 크기에 관계없이 성립되는 관계식이다. 또, [LR]/[R₀]는 전체 리셉터(R) 중 리간드(L)와 결합되어 있는 리셉터(R)의 비율을 나타낸다. 이하, 리셉터(R)와 리간드(L)가 결합하면 항상 FRET가 발생한다고 가정한다. 또, 샘플(12)에 포함되는 리셉터(R) 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터(R)의 비율[LR]/[R₀]를 결합 비율 κ_FRET라고 정의한다.

본 발명의 FRET 측정 방법에서는, 전체 리간드 농도[L₀]의 값을 다르게 하여, 전체 리간드 농도[L₀] 각각에 대하여 전체 리간드 농도[L₀]에 대응하는 결합 비율 κ_FRET를 측정한다. 또, 전체 리셉터 농도[R₀]와 해리 상수 K_d를 변수로 하고, 상기 식 (8)에 따른 곡선을 2변수 최소 제곱법을 이용하여[L0], κ_FRET에 적합시킴으로써 해리 상수 K_d를 구한다.

(결합 비율 κ_FRET의 산출 방법)

먼저, 결합 비율 κ_FRET의 산출 방법을 설명한다.

샘플(12) 중의 전체 리셉터 농도를 C₀, FRET가 발생하고 있는 리셉터의 농도를 C^＋, FRET가 발생하고 있지 않은 리셉터의 농도를 C^-라고 정의한다. 여기서, C^-=C₀-C^＋이다. 또, 레이저광에 의한 여기 파워를 P(t), FRET가 발생하고 있는 리셉터(R)에 결합되어 있는 도너 분자(16)의 여기 전자 수를 N⁺(t), FRET가 발생하고 있지 않은 리셉터(R)에 결합되어 있는 도너 분자(16)의 여기 전자 수를 N^-(t)로 정의한다. 이때, 여기(勵起) 전자의 레이트 방정식(rate equation)은 하기 식 (9), 식 (10)에 의해 표현된다.

여기서, k_f는 발광 천이의 속도 상수, k_nr은 무복사 천이의 속도 상수, k_t는 공명 에너지 이동의 속도 상수이다. 또, KP(t)는, 단위 시간, 단위 체적 당 레이저광에 의해 여기되는 전자 수이다.

샘플(12)에 포함되는 리셉터(R) 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터(R)의 비율인 결합 비율 κ_FRET는, 하기 식 (11)에 의해 표현된다.

여기서, 식 (9), 식 (10), 식 (11)로부터 C^＋, C^-를 소거하고, K_ex=C₀K로 하면, 여기 전자의 레이트 방정식은 하기 식 (12), 식 (13)에 의해 표현된다.

식 (12), 식(13)을 라플라스 변환하면, 하기 식 (14), 식 (15)를 얻을 수 있다.

여기서, τ_min은 도너 분자(16)의 형광 수명의 최소값이며, 1/τ_min=k_f＋k_nr＋k_t의 관계식을 만족시킨다. 또, τ_max는 도너 분자(16)의 형광 수명의 최대값이며, 1/τ_max=k_f＋k_nr의 관계식을 만족시킨다.

τ_min은 샘플(12) 중의 전체 도너 분자(16)에서 FRET가 발생하고 있는 경우의 도너 분자(16)의 형광 수명이다. 예를 들면, 도너 분자(16)에 대하여 억셉터 분자(18)의 농도를 충분히 크게 한 조건에서 도너 분자(16)의 형광 수명을 측정함으로써 τ_min을 측정할 수 있다.

또, τ_max는 샘플(12) 중의 전체 도너 분자(16)에서 FRET가 발생하고 있지 않은 경우의 도너 분자(16)의 형광 수명이다. 예를 들면, 샘플(12) 중에 억셉터 분자(18)를 첨가하지 않는 조건으로 도너 분자(16)의 형광 수명을 측정함으로써, τ_max를 측정할 수 있다.

이와 같이, τ_min과 τ_max의 값은 측정에 의해 구할 수 있다.

상기 식 (14), 식 (15)로부터, 샘플(12) 중의 도너 분자(16)의 여기 전자 수N(s)는, 하기 식 (16)에 의해 표현된다.

식 (16)의 괄호로 나타내는 부분이 도너 분자(16)의 형광 수명에 관련되기 때문에, 식 (16)의 괄호로 나타내는 부분을 T라고 정의하여 정리하면, 하기 식 (17)을 얻을 수 있다.

여기서, 상기 식 (17)의 s에 jω를 대입하여 정리 하면, 하기 식 (18)을 얻을 수 있다.

여기서, θ₁, θ₂는 하기 식 (19), 식 (20)에 의해 표현된다.

여기서, ω는 레이저광을 변조하는 변조 신호의 각 주파수이다. 또, θ₁-θ₂는 도너 분자(16)의 형광 신호와 레이저광을 변조하는 변조 신호와의 위상차이다.

도너 분자(16)의 형광 신호와 레이저광을 변조하는 변조 신호와의 위상차 및 변조 신호의 각 주파수로부터, 도너 분자(16)의 형광 수명 τ은, 하기 식 (21)에 의해 구해진다.

여기서, 상기 식 (19), 식 (21)로부터 θ₁을 소거하면, 하기 식 (22)을 얻을 수 있다.

상기 식 (22)을 κ_FRET에 대하여 풀면, 하기 식 (23)을 얻을 수 있다.

상기 식 (23)에 의해, 도너 분자(16)의 형광 수명 τ로부터 결합 비율 κ_FRET를 구할 수 있다. 그리고, 전술한 바와 같이, τ_min, τ_max의 값은, 별도 측정에 의해 구할 수 있다. 식 (23)에 의해 구해진 결합 비율 κ_FRET를 사용하여, 후술하는 바와 같이 결합 상수 K_d를 구할 수 있다.

(FRET 측정 방법)

다음에, 도 7, 도 8, 도 9를 참조하여, 본 발명의 FRET 측정 방법에 대하여 설명한다. 도 7은 본 발명의 FRET 측정 방법의 일례를 나타낸 흐름도다. 도 8은 전체 리간드 농도 [L₀]에 대한 도너 분자(16)의 형광 수명 τ의 측정 결과의 일례를 나타낸 도면이다. 도 9는 전체 리간드 농도[L₀]에 대한 결합 비율 κ_FRET의 측정 결과의 일례를 나타낸 도면이다.

먼저, 플로 사이트 미터(10)가 샘플(12)의 결합 조건을 설정한다(단계 S101). 예를 들면, 샘플(12)에 첨가되는 전체 리간드 농도 [L₀]를 조정함으로써, 샘플(12)의 결합 조건이 설정된다.

다음에, 강도가 시간 변조된 레이저광을 레이저 광원부(30)가 샘플(12)에 조사한다(단계 S102). 다음에, 계측부(50)가 측정점에 의해 레이저광을 조사된 샘플(12)이 발하는 형광을 수광한다(단계 S103).

다음에, 형광 수명 산출 유닛(158)이 계측부(50)에서 계측된 형광 신호를 사용하여 도너 분자(16)의 형광 수명을 산출한다(단계 S104). 구체적으로는, 형광 신호와 변조 신호와의 위상차(θ₁-θ₂)로부터, 전술한 식 (21)에 따라 형광 수명 산출 유닛(158)이 도너 분자(16)의 형광 수명을 산출한다. 단계 S104에 의해, 도 8에 나타내는 1개의 측정 결과를 얻을 수 있다.

다음에, 결합 비율 산출 유닛(160)이, 형광 수명 산출 유닛(158)에서 산출된 형광 수명 τ을 사용하여, 결합 비율 κ_FRET를 산출한다(단계 S105). 구체적으로는, 형광 수명 산출 유닛(158)에서 산출된 형광 수명 τ를 사용하여 전술한 식(23)에 따라 결합 비율 산출 유닛(160)이 결합 비율 κ_FRET를 산출한다. 조정한 [L₀]에 따라 결합 비율 κ_FRET를 얻을 수 있다. 따라서, 단계 S105에 의해, 도 9에 나타내는 1개의 측정 결과를 얻을 수 있다.

다음에, 2변수 최소 제곱법을 이용하여 적합시키기 위해 필요로 하는 소정수의 측정 데이터가 얻어지는지 아닌지를 판정부(164)가 판정한다(단계 S106). 해리 상수 산출 유닛(162)이 2변수 최소 제곱법을 이용하여 적합시키기 위하여, 예를 들면, 10~15점(点) 정도의 측정 데이터가 얻어지는 것이 바람직하다. 얻어진 측정 데이터의 수(측정 수)가 소정수보다 적다고 판정부(164)가 판정한 경우, 소정수의 측정 데이터가 얻어지기까지 전술한 단계 S101~S105를 반복한다.

소정수의 측정 데이터가 얻어지고, 측정수가 소정수와 동등한 것으로 판정부(164)가 판정한 경우, 해리 상수 산출 유닛(162)이 리셉터(R)와 리간드(L)와의 결합의 정도를 나타내는 해리 상수 K_d를 산출한다. 구체적으로는, 전체 리셉터 농도 [R₀]와 해리 상수 K_d를 변수로 하는 2변수 최소 제곱법을 이용하여, 해리 상수 산출 유닛(162)이 전술한 식 (8)을 결합 비율 κFRET, 전체 리간드 농도[L0]에 적합시킴으로써, 해리 상수 K_d가 구해진다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 최소 제곱법을 이용하여 샘플(12) 중의 전체 리셉터 농도 [R₀] 와 해리 상수 K_d를 변수로 하는 함수를 결합 비율 κ_FRET, 전체 리간드 농도 [L₀]에 적합시킴으로써, 해리 상수 K_d가 구해진다. 그러므로, 본 발명에 의하면, 해리 상수 K_d의 크기에 관계없이 해리 상수 K_d를 양호한 정밀도로 측정할 수 있다.

그리고, 전술한 실시형태에서는, 도 2를 참조하여 설명한 바와 같이, 리셉터(R)에 도너 분자(16)와 억셉터 분자(18)가 결합되어 있는 경우에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 리셉터(R)에 도너 분자(16)가 결합하고 있고, 리간드(L)에 억셉터 분자(18)가 결합되어 있는 경우에도, 본 발명을 적용할 수 있다.

이상, 본 발명의 FRET 측정 방법, 및 FRET 측정 장치에 대하여 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시형태에 한정되는 것은 아니다. 또, 본 발명의 주지를 벗어나지 않는 범위에 있어서, 각종의 개량이나 변경을 해도 되는 것은 물론이다.

10: 플로 사이트 미터
12: 샘플
16: 도너 분자
18: 억셉터 분자
20: 관로
22: 회수 용기
30: 레이저 광원부
40, 50: 계측부
51: 렌즈계
52: 다이크로익 미러
53, 54: 제1 및 제2 밴드 패스 필터
55, 56: 광전 변환기
100: 제어 처리부
110: 신호 생성부
112: 발진기
114: 파워 스플리터
116, 118: 제1 및 제2 증폭기
120: 신호 처리부
122, 124: 제3 및 제4 증폭기
126: 위상차 검출기
130: 컨트롤러
132: 로우 패스 필터
134: 제5 증폭기
136: A/D 변환기
138: 시스템 제어기
150: 분석 장치
152: CPU
154: 메모리
156: 입출력 포트
158: 형광 수명 산출 유닛
160: 결합 비율 산출 유닛
162: 해리 상수 산출 유닛
164: 판정부
200: 디스플레이
R: 리셉터
L: 리간드

Claims

리셉터와 리간드가 결합하고, 제1 분자 및 제2 분자가 설치된 측정 샘플에 레이저광을 조사하고, 제1 분자로부터 제2 분자에 에너지가 이동하는 형광 공명 에너지 이동(FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer)을 측정하는 FRET 측정 방법에 있어서,
강도가 시간 변조된 레이저광을 상기 측정 샘플에 조사하는 조사 단계;
상기 레이저광이 조사된 상기 측정 샘플이 발하는 형광을 계측하는 계측 단계;
상기 계측 단계에서 계측된 형광 신호를 사용하여, 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 형광 수명 산출 단계;
상기 형광 수명 산출 단계에서 산출된 상기 형광 수명을 사용하여, 상기 측정 샘플에 포함되는 상기 리셉터 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터의 비율인 결합 비율을 산출하는 결합 비율 산출 단계;
상기 결합 비율이 상이하도록 상기 측정 샘플의 결합 조건을 설정하는 결합 조건 설정 단계; 및
상기 리셉터와 상기 리간드와의 결합의 정도를 나타내는 해리 상수를 산출하는 해리 상수 산출 단계
를 포함하고,
상기 해리 상수 산출 단계는, 최소 제곱법을 이용하여, 상기 측정 샘플 중의 상기 리셉터의 전체 농도와 상기 해리 상수를 변수로 하는 함수를, 상기 결합 비율 산출 단계에서 산출된 상기 결합 비율에 적합(適合)(fitting)시킴으로써, 상기 해리 상수를 구하는 것을 특징으로 하는, FRET 측정 방법.
제1항에 있어서,
상기 결합 비율을 κ_FRET, 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리셉터의 전체 농도를 [R₀], 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리간드의 전체 농도를 [L₀], 상기 해리 상수를 K_d로 하면,
상기 해리 상수 산출 단계는, [R₀]와 K_d를 변수로 하는 2변수 최소 제곱법을 이용하여, 하기 식을 κ_FRET와 [L₀]에 적합시킴으로써 상기 해리 상수 K_d를 구하는, FRET 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 형광 수명 산출 단계는, 상기 계측 단계에서 계측된 형광 신호와 상기 레이저광을 변조하는 변조 신호와의 위상차를 사용하여, 제1 분자의 형광 수명을 산출하는, FRET 측정 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리셉터에는 제1 분자와 제2 분자가 결합되어 있고,
상기 결합 조건 설정 단계는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율이 상이하도록 상기 샘플의 결합 조건을 설정하는, FRET 측정 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리셉터에는 제1 분자가 결합되어 있고,
상기 리간드에는 제2 분자가 결합되어 있고,
상기 결합 조건 설정 단계는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율이 상이하도록 상기 샘플의 결합 조건을 설정하는, FRET 측정 방법.
리셉터와 리간드가 결합하고, 제1 분자 및 제2 분자가 설치된 측정 샘플에 레이저광을 조사하고, 제1 분자로부터 제2 분자에 에너지가 이동하는 형광 공명 에너지 이동(FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer)을 측정하는 FRET 측정 장치에 있어서,
강도가 시간 변조된 레이저광을 상기 측정 샘플에 조사하는 레이저 광원부;
상기 레이저광이 조사된 상기 측정 샘플이 발하는 형광을 계측하는 계측부;
상기 계측부에서 계측된 형광 신호를 사용하여, 제1 분자의 형광 수명을 산출하는 형광 수명 산출부;
상기 형광 수명 산출부에서 산출된 상기 형광 수명을 사용하여, 상기 측정 샘플에 포함되는 상기 리셉터 중 FRET가 발생하고 있는 리셉터의 비율인 결합 비율을 산출하는 결합 비율 산출부;
상기 리셉터와 상기 리간드와의 결합의 정도를 나타내는 해리 상수를 산출하는 해리 상수 산출부
를 포함하고,
상기 해리 상수 산출부는, 최소 제곱법을 이용하여, 상기 측정 샘플 중의 상기 리셉터의 전체 농도와 상기 해리 상수를 변수로 하는 함수를, 상기 결합 비율이 상이한 복수개의 결합 조건에서 상기 결합 비율 산출부에서 산출된 상기 결합 비율에 적합(適合)(fitting)시킴으로써, 상기 해리 상수를 구하는 것을 특징으로 하는, FRET 측정 장치.
제6항에 있어서,
상기 결합 비율을 κ_FRET, 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리셉터의 전체 농도를 [R₀], 상기 측정 샘플 중에 포함되는 상기 리간드의 전체 농도를 [L₀], 상기 해리 상수를 K_d로 하면, 상기 해리 상수 산출부는, [R₀] 와 K_d를 변수로 하는 2변수 최소 제곱법을 이용하여, 하기 식을 κ_FRET와 [L₀]에 적합시킴으로써, 상기 해리 상수 K_d를 구하는, FRET 측정 장치.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 형광 수명 산출부는, 상기 계측부에서 계측된 형광 신호와 상기 레이저광을 변조하는 변조 신호와의 위상차를 사용하여, 제1 분자의 형광 수명을 산출하는, FRET 측정 장치.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리셉터에는 제1 분자와 제2 분자가 결합되어 있고,
상기 해리 상수 산출부는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율을 상이하게 한 복수개의 결합 조건에서, 상기 결합 비율 산출부에서 산출된 상기 결합 비율을 적합시킴으로써 상기 해리 상수를 구하는, FRET 측정 장치.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리셉터에는 제1 분자가 결합되어 있고,
상기 리간드에는 제2 분자가 결합되어 있고,
상기 해리 상수 산출부는, 상기 측정 샘플에 상기 리간드를 첨가함으로써 상기 결합 비율을 상이하게 한 복수개의 결합 조건에서, 상기 결합 비율 산출부에서 산출된 상기 결합 비율을 적합시킴으로써 상기 해리 상수를 구하는, FRET 측정 장치.