WO2009110314A1 - 蛍光検出方法及び蛍光検出装置 - Google Patents

蛍光検出方法及び蛍光検出装置 Download PDF

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WO2009110314A1
WO2009110314A1 PCT/JP2009/052757 JP2009052757W WO2009110314A1 WO 2009110314 A1 WO2009110314 A1 WO 2009110314A1 JP 2009052757 W JP2009052757 W JP 2009052757W WO 2009110314 A1 WO2009110314 A1 WO 2009110314A1
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fluorescence
signal
phase difference
difference information
laser light
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PCT/JP2009/052757
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Inventor
一輝 星島
林　弘能
成幸 中田
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三井造船株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1425—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry using an analyser being characterised by its control arrangement
    • G01N15/1427—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry using an analyser being characterised by its control arrangement with the synchronisation of components, a time gate for operation of components, or suppression of particle coincidences
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    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G01N2015/1438—Using two lasers in succession

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection method and a fluorescence detection apparatus for detecting fluorescence emitted from a measurement object by irradiating the flow of a fluid flowing with the measurement object such as cells and bacteria contained in a buffer solution. About.
  • a flow cytometer used in the medical and biological fields incorporates a fluorescence detection device that receives fluorescence from a fluorescent dye of a measurement object by irradiating laser light and identifies the type of the measurement object. .
  • a flow cytometer labels a turbid liquid containing a biological substance such as cells, DNA, RNA, enzymes, and proteins as a measurement object in a buffer solution with a fluorescent reagent, and applies pressure every second.
  • a laminar sheath flow is formed by flowing an object to be measured into a sheath liquid flowing in a pipeline at a speed of about 10 m or less.
  • the biological material By irradiating the measurement object in the flow with laser light, fluorescence emitted from the fluorescent dye in the biological material is received, and the biological material is identified by identifying this fluorescence as a label.
  • the intracellular relative amounts of intracellular DNA, RNA, enzymes, proteins, etc. can be measured, and their functions can be analyzed in a short time.
  • a cell sorter or the like is used that identifies specific types of cells and chromosomes by fluorescence, and selects and collects only the identified cells and chromosomes in a live state. In the use of this, it is required to distinguish more measurement objects from the fluorescence information in a short time.
  • Patent Document 1 discloses a fluorescence detection device.
  • the intensity of the laser beam emitted from the laser light source unit is time-modulated, and the biological material is irradiated with this laser beam.
  • the fluorescence emitted from the sample is received, and the fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted by the biological material or the like is calculated using the phase difference information with respect to the modulation signal of the laser light.
  • Patent Document 1 can accurately identify the type of received fluorescence when the fluorescence intensity of the fluorescence emitted by the biological material or the like is strong, but the emission region of the fluorescence emitted by the biological material or the like is limited, and When the fluorescence intensity is relatively weak, there arises a problem that accurate identification is not always possible. For example, when the fluorescence emitted by a fluorescent dye with a known fluorescence relaxation time is measured in advance, when the fluorescence intensity is weak, the obtained fluorescence relaxation time is different from the known fluorescence relaxation time, so that accurate identification cannot be performed. Occurs.
  • a fluorescence relaxation time constant is obtained each time a biological substance passes through the irradiation position of the laser beam, and a plurality of obtained fluorescence relaxation time constants are taken on the horizontal axis and the frequency is taken on the vertical axis.
  • the shape of the mountain to be formed becomes broad and a plurality of fluorescence cannot be accurately identified.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescence detection method and a fluorescence detection apparatus.
  • the present invention irradiates a laser beam whose light intensity is modulated using a modulation signal having a set frequency with respect to a flow of fluid flowing with a measurement object contained in a buffer solution.
  • the first and second phase difference information is configured by a value of a signal component in phase with the modulation signal and a value of a signal component having a phase difference of 90 degrees with respect to the modulation signal.
  • the third phase difference information is preferably data obtained by subtracting the data of the second phase difference information from the data of the first phase difference information for each component.
  • the present invention is a fluorescence detection apparatus for detecting fluorescence emitted from a measurement object by irradiating a laser beam to a flow of fluid that flows while the measurement object is contained in a buffer solution,
  • a laser light source unit that emits laser light whose light intensity is modulated using a modulation signal of a set frequency toward the flow, a light receiving unit that outputs a fluorescent signal of fluorescence emitted by laser light irradiation, and the measurement
  • a timing detection unit that detects a timing at which the object passes through the irradiation position of the laser beam, a first fluorescence signal of fluorescence received by the light receiving unit is collected according to the detected timing, and the measurement particle is a laser
  • the second fluorescence signal of the fluorescence received by the light receiving unit is collected in a state that is not at the laser beam irradiation position after passing through the light irradiation position, and the first position of the first fluorescence signal with respect to the modulation signal is collected.
  • the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the measurement object is adjusted with respect to the modulation signal.
  • a processing / analyzing unit that obtains third phase difference information and obtains a fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted from the measurement object from the obtained third phase difference information.
  • the first and second phase difference information is data composed of a value of a signal component in phase with the modulation signal and a value of a signal component having a phase difference of 90 degrees with respect to the modulation signal.
  • the processing / analyzing unit obtains the data of the third phase difference information by subtracting the data of the second phase difference information from the data of the first phase difference information for each component. preferable.
  • the fluorescence detection method and the fluorescence detection apparatus of the present invention measure fluorescence detection not only for fluorescence emitted by a measurement object but also for fluorescence emitted by a buffer solution after the measurement object passes through the irradiation position of the laser beam. set to target. This is because when the fluorescence of the measurement object is relatively weak, the fluorescence emitted by the buffer solution itself cannot be ignored.
  • the fluorescence measured when the measurement object passes through the irradiation position of the laser beam includes fluorescence emitted by the buffer solution itself in addition to the fluorescence emitted by the measurement object.
  • the phase difference information of the fluorescence emitted by the measurement object can be accurately obtained using this measurement result. .
  • the fluorescence relaxation time constant can be calculated more accurately and quickly than in the past.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light.
  • a biological substance M having a fluorescent dye suspended in a buffer solution will be described as a measurement object.
  • a predetermined fluorescent dye is provided, It is also possible to include the microbeads to be included in the buffer solution together with the biological material M, and use the biological material M and the microbeads as the measurement object.
  • the flow cytometer 10 irradiates a sample 12 configured by suspending a biological material M that emits fluorescence by irradiating a laser beam in a buffer solution, and emits fluorescence emitted from a fluorescent dye included in the biological material M in the sample 12. It has a signal processing device 20 that detects a fluorescence signal and performs signal processing, and an analysis device (computer) 80 that analyzes a measurement object in the sample 12 from the processing result obtained by the signal processing device 20.
  • the signal processing apparatus 20 includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, a control unit that controls the laser light from the laser light source unit 22 to generate a modulation signal that modulates the intensity of the laser light at a predetermined modulation frequency, and a sample.
  • a control / processing unit 28 including a signal processing unit for identifying a fluorescent signal from 12 and a tube for forming a flow cell by flowing a sample 12 made of a buffer solution containing a biological material M through a sheath liquid forming a high-speed flow. And a path 30.
  • a recovery container 32 is provided at the outlet of the conduit 30.
  • the flow cytometer 10 may be configured such that a cell sorter for identifying and separating the biological material M in the sample 12 is arranged within a short time by laser light irradiation and separated into separate collection containers. it can.
  • a lens system is provided so that the laser beam is focused at a predetermined position in the pipe line 30, and a measurement point of the sample 12 is formed at this focusing position. This measurement point corresponds to the irradiation position of the laser beam in the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the configuration of the laser light source unit 22.
  • the laser light source unit 22 is a part that emits intensity-modulated laser light having a wavelength in the visible light band of 350 nm to 800 nm.
  • the laser light source unit 22 mainly emits a red laser beam R as a CW (continuous wave) laser beam, an R light source 22r that modulates the intensity of the CW laser beam at a predetermined frequency, and a green laser beam G as a CW laser beam.
  • a G light source 22g that emits (continuous wave) laser light and modulates the intensity of the CW laser light at a predetermined frequency and a blue laser light B are emitted as CW (continuous wave) laser light.
  • the laser light source unit 22 transmits laser light composed of dichroic mirrors 23a 1 and 23a 2 that transmit laser light in a specific wavelength band and reflect laser light in other wavelength bands, and laser light R, G, and B.
  • a lens system 23c for focusing on a measurement point in the pipe line 30, laser drivers 34r, 34g and 34b for driving the R light source 22r, the G light source 22g and the B light source 22b, respectively, and the supplied signals as laser drivers 34r and 34g.
  • a power splitter 35 distributed to 34b.
  • a semiconductor laser is used as a light source for emitting these laser beams.
  • the laser beam has an output of about 5 to 100 mW, for example.
  • the frequency (modulation frequency) for modulating the intensity of the laser light is slightly longer than the fluorescence relaxation time constant, for example, 10 to 50 MHz.
  • the dichroic mirror 23a 1 is a mirror that transmits the laser beam R and reflects the laser beam G
  • the dichroic mirror 23a 2 is a mirror that transmits the laser beams R and G and reflects the laser beam B.
  • the R light source 22r, the G light source 22g, and the B light source 22b oscillate in a predetermined wavelength band so that the laser beams R, G, and B excite the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band.
  • the fluorescent dye excited by the laser beams R, G, and B is attached to the biological material M to be measured, and when the biological material M passes through the conduit 30 as a measurement object, the laser beam R, Fluorescent light is emitted at a specific wavelength when irradiated with G and B. Further, even after the biological material M passes through the measurement point, preferably immediately after passing, the buffer solution is irradiated with laser light for a certain period in the absence of the biological material M to detect fluorescence emitted from the buffer solution.
  • the light receiving unit 24 is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe line 30 interposed therebetween, and the biological material M passes the measurement point by the forward scattering of the laser light by the biological material M passing through the measurement point.
  • a photoelectric converter is provided that outputs a detection signal indicating that it passes.
  • the signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control / processing unit 28, and is used as a trigger signal for informing the timing at which the biological material M passes through the measurement point in the conduit 30. Note that the time when the biological material M passes the measurement point is T, the average diameter of the biological material M is D, the velocity of the biological material M flowing through the flow cell is V, and the spot width at the measurement point of the laser light is W.
  • This time T is a known value.
  • the signal processing device 20 starts detection of fluorescence using the trigger signal generated by the light receiving unit 24 as a measurement start timing, and continues measurement for a time 2 ⁇ T that is twice the time T.
  • the measurement means that during the period of time T, fluorescence emitted from the sample 12 is received, signal processing is performed by the control / processing unit 28 described later, and phase difference information is supplied to the analyzer 80.
  • the first fluorescent signal of the fluorescence received by the light receiving unit 26 is collected, and the biological material M after the biological material M passes through the measurement point becomes the measurement point.
  • the second fluorescence signal of the fluorescence received by the light receiving unit 26 can be collected in the state of only the buffer solution that is not present.
  • FIG. 3 is a schematic configuration diagram illustrating a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26.
  • the light receiving unit 26 shown in FIG. 3 includes a lens system 26a that focuses a fluorescent signal from the biological material M in the sample 12, dichroic mirrors 26b 1 and 26b 2 , bandpass filters 26c 1 to 26c 3, and a photomultiplier tube. Photoelectric converters 27a to 27c.
  • the lens system 26a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c.
  • the dichroic mirrors 26b 1 and 26b 2 are mirrors that reflect fluorescence in a wavelength band within a predetermined range and transmit the other fluorescence.
  • the reflection wavelength band and the transmission wavelength band of the dichroic mirrors 26b 1 and 26b 2 are set so as to be filtered by the band-pass filters 26c 1 to 26c 3 and to capture fluorescence of a predetermined wavelength band by the photoelectric converters 27a to 27c. .
  • the band-pass filters 26c 1 to 26c 3 are filters that are provided in front of the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c and transmit only fluorescence in a predetermined wavelength band.
  • the wavelength band of the transmitted fluorescence is set corresponding to the wavelength band of the fluorescence emitted by the fluorescent dye.
  • the photoelectric converters 27a to 27c are sensors that include a sensor including, for example, a photomultiplier tube, and convert light received by the photoelectric surface into an electrical signal.
  • the output electric signal is a fluorescence signal having phase difference information.
  • the fluorescence signal is amplified by an amplifier and supplied to the control / processing unit 28.
  • the control / processing unit 28 includes a signal generation unit 40, a signal processing unit 42, and a controller 44.
  • the signal generation unit 40 and the controller 44 form a light source control unit that generates a modulation signal having a predetermined frequency.
  • the control / processing unit 28 corresponds to a part for collecting the first fluorescence signal and the second fluorescence signal in the present invention.
  • the signal generation unit 40 is a part that generates a modulation signal for modulating (amplitude modulation) the intensity of the laser light at a predetermined frequency.
  • the signal generation unit 40 includes an oscillator 46, a power splitter 48, and amplifiers 50 and 52, and supplies the generated modulation signal to the power splitter 35 of the laser light source unit 22, and the signal processing unit 42. It is a part to supply to.
  • the modulation signal is supplied to the signal processing unit 42, as will be described later, a reference signal for detecting the fluorescence signals (first fluorescence signal and second fluorescence signal) output from the photoelectric converters 27a to 27c. It is for using as.
  • the modulation signal is a sine wave signal having a predetermined frequency, and is set to a frequency in the range of 10 to 50 MHz.
  • the signal processing unit 42 is a part that processes a signal including phase difference information of fluorescence emitted from the sample 12 by irradiation with laser light, using the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c.
  • the signal processing unit 42 amplifies the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c, and the modulated signals that are sine wave signals supplied from the signal generation unit 40 to the amplified fluorescence signals.
  • a power splitter 56 that distributes the signal and IQ mixers 58a to 58c that combine the modulated signal with the fluorescence signal amplified using the modulated signal as a reference signal.
  • the IQ mixers 58a to 58c are devices that synthesize the fluorescence signals supplied from the photoelectric converters 27a to 27c using the modulation signal supplied from the signal generator 40 as a reference signal. Specifically, as shown in FIG. 5, each of the IQ mixers 58a to 58c multiplies the reference signal by the fluorescence signal (RF signal), and the cos component of the fluorescence signal (the signal component having the same phase as the reference signal). And a processing signal including a high-frequency component, and a signal obtained by shifting the phase of the reference signal by 90 degrees is multiplied by the fluorescence signal to obtain a sin component of the fluorescence signal (a signal having a phase difference of 90 degrees with respect to the reference signal). Component) and a processing signal including a high frequency component. The processing signal including the cos component and the processing signal including the sin component are supplied to the controller 44.
  • the controller 44 controls the signal generation unit 40 to generate a modulation signal (sine wave signal) having a predetermined frequency, and further, the value of the cos component and the sin component of the fluorescence signal obtained by the signal processing unit 42. This is a part for obtaining the value of the cos component and the value of the sin component of the fluorescence signal by removing the high frequency component from the processing signal including the value.
  • a modulation signal sine wave signal
  • the controller 44 gives an instruction for operation control of each part of the signal processing device 20 and is calculated by a system controller 60 that manages all operations of the flow cytometer 10 and the signal processing unit 42.
  • a low-pass filter 62 that removes the high-frequency component from the processed signal obtained by adding the high-frequency component to the cos component and sin component, an amplifier 64 that amplifies the processed signal of the cos component and sin component from which the high-frequency component has been removed, and the amplified processing And an A / D converter 66 for sampling the signal.
  • the system controller 60 determines the oscillation frequency of the oscillator 46 for intensity modulation of the laser light.
  • the controller 44 amplifies the value of the cos component and the value of the sin component that have been filtered by the low-pass filter 62 and from which the high-frequency signal has been removed, amplified by the amplifier 64, and further digitized by sampling by the A / D converter 66.
  • the processed signals of the cos component and the sin component are supplied to the analyzer 80.
  • the analyzer 80 is a part that obtains the fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) of the fluorescence emitted by the biological material M, and identifies the type of fluorescence of the biological material M in the sample 12 from the fluorescence relaxation time constant. It is also possible to examine the characteristics of the biological material M, such as whether or not the biological material M is biologically bound, by including microbeads with a predetermined fluorescent dye attached to the sample 12.
  • the analyzer 80 forms a processing unit for calculating the fluorescence relaxation time constant in the present invention, and is configured by a computer.
  • the calculation of the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted from the biological material M is performed by calculating phase difference information for the modulation signal of the first fluorescence signal of the fluorescence emitted when the biological material M suspended in the buffer solution passes through the measurement point, and the biological material. This is performed using the phase difference information of the second fluorescence signal of the fluorescence emitted by the buffer solution immediately after M passes the measurement point. As described above, measurement is started based on the trigger signal generated by the light receiving unit 24, and measurement is continued for a time 2 ⁇ T that is twice the time T for which the biological material M passes the measurement point.
  • the processing signal of the cos component and the sin component supplied to the analyzer 80 is the phase difference information of the fluorescence from the start of measurement to the first time T, that is, the phase difference information of the fluorescence emitted from the buffer solution and the biological material M.
  • phase difference information of fluorescence from time T to time 2 ⁇ T that is, phase difference information of fluorescence emitted from the buffer solution.
  • the calculation of the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted from the biological material M includes the phase difference information of the measurement vector having the cos component value and the sin component value supplied from the controller 44 as vector components. Use as data.
  • the measurement vector of the first fluorescence signal when the biological material M suspended in the buffer solution passes the measurement point is P ms
  • the buffer solution immediately after the biological material M passes the measurement point is fluorescent.
  • a second fluorescent signal P mb measurement vector of time for emitting, when the vector of the biological material M composed of the values of the values and the sin component of the cos component of the fluorescence emitted from the biological material M was P s, P s P ms -P mb FIG.
  • the phase difference information in the present invention is data composed of a value of a signal component (cos component) in phase with the modulation signal and a value of a signal component (sin component) having a phase difference of 90 degrees with respect to the modulation signal. It has become.
  • the fluorescence emitted from the sample 12 when the biological material M passes the measurement point includes the fluorescence emitted from the biological material M and the fluorescence emitted from the buffer solution. Therefore, in the analyzer 80, the fluorescence is received by the light receiving unit 26 in a state where these fluorescences are mixed. Therefore, the measurement vector P ms obtained by the analyzer 80 is the value of the cosine component and the value of the sin component of the fluorescent fluorescence signal emitted from the biological substance M, and the value of the cosine component and the value of the sin component of the fluorescent fluorescence signal emitted from the buffer solution. Component values.
  • the fluorescence vector P s emitted by the substance M can be calculated. That is, by subtracting the value of the cos component of the measurement vector P mb and the value of the sin component from the value of the cos component and the sin component of the measurement vector P ms for each component, the fluorescence vector P s emitted by the biological material M is obtained. calculate.
  • FIG. 7 is a graph showing temporal changes in the fluorescence intensity of the fluorescence emitted from the sample 12.
  • the region R 7 is a region where fluorescence emitted from the biological material M and fluorescence emitted from the buffer solution are mixed.
  • the region R 2 is a region where only the fluorescence emitted from the buffer solution exists.
  • the generation of the trigger signal output from the light receiving unit 24 is used as the measurement start timing to measure the region R 1 from the measurement start to the time T, and immediately thereafter, the region R 2 is measured. Note that the vector P s is calculated for each fluorescent signal obtained by the photoelectric converters 27a to 27c.
  • the analyzer 80 obtains a fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) from the fluorescence vector P s emitted from the biological material M thus obtained.
  • the fluorescence relaxation time constant is calculated every time the biological material M passes the measurement point. Calculation is performed using the supplied measurement vectors P ms and P mb . For this reason, the analyzer 80 creates a histogram representing the frequency of the calculated fluorescence relaxation time constant, statistically processes the fluorescence relaxation time constant, and obtains the average value and variance of the fluorescence relaxation time constant. Thereby, the fluorescence emitted from the biological material M can be identified.
  • ⁇ s is the inclination angle of the calculated vector P s with respect to the axis of the cos component (see FIG. 6)
  • ⁇ is the frequency of the modulation signal of the laser light
  • ⁇ is the fluorescence relaxation time constant.
  • the time constant ⁇ fluorescence relaxation when the initial fluorescence intensity when the laser light pulse irradiation and I 0, the fluorescence intensity from the point becomes I 0 / e (e is the base of natural logarithms, e ⁇ 2.71828) The time until the time.
  • the flow cytometer 10 is configured as described above.
  • the signal processing device 20 of the flow cytometer 10 first generates a modulation signal of a predetermined frequency in the transmitter 46 according to an instruction from the controller 44, and this signal is amplified by the amplifier 50, and the laser light source unit 22 and the signal processing unit 42. In this state, the sample 12 flows through the conduit 30 and a flow is formed. For example, the flow has a flow rate of 1 to 10 m / sec over a flow path diameter of 100 ⁇ m.
  • a detection signal for detecting the passage of the biological material M by the light receiving unit 24 is output to the controller 44 as a trigger signal.
  • the controller 44 uses this detection signal as a trigger signal and supplies a measurement start instruction signal to each part.
  • the laser light emitted from the laser light source unit 22 is used to excite the fluorescent dye in the sample 12 at the measurement point.
  • the fluorescent dye emits fluorescence when irradiated with the laser light, and is received by the light receiving unit 26. Since the intensity of the laser light is modulated at a predetermined frequency, the fluorescence intensity of the laser light is also modulated at a predetermined frequency correspondingly.
  • the fluorescence from the fluorescent dye emitted by irradiation with such laser light has information on the phase difference with respect to the modulation signal that modulates the intensity of the laser light.
  • the biological material M is irradiated with laser light that is amplitude-modulated at a predetermined frequency during several ⁇ to several tens of ⁇ seconds when the biological material M passes the measurement point.
  • the modulation frequency of the laser light is, for example, 10 to 50 MHz.
  • the first and second fluorescent signals received and output by the photoelectric converters 27a to 27c of the light receiving unit 26 are amplified by the amplifiers 54a to 54c and supplied from the signal generating unit 40 by the IQ mixers 58a to 58c. It is synthesized with a modulation signal which is a sine wave signal.
  • a modulation signal which is a sine wave signal.
  • the IQ mixers 58a to 58c a composite signal obtained by multiplying the modulation signal (reference signal) that is a sine wave signal and the first and second fluorescent signals is generated, and the modulation signal (reference signal) that is a sine wave signal is generated.
  • a signal synthesized by multiplying the signal whose phase is shifted by 90 degrees and the fluorescence signal is generated.
  • the two synthesized signals generated for the first fluorescence signal are sent to the low-pass filter 62 of the controller 44, the high frequency component is removed, and the cos component and the sin component of the first fluorescence signal are extracted. It is.
  • the cos component and sin component signal of the first fluorescence signal are amplified, A / D converted, and sent to the analyzer 80.
  • the A / D conversion is synchronized at the timing of the trigger signal from the light receiving unit 24, and sampling is performed.
  • the two synthesized signals generated for the second fluorescence signal are sent to the low pass filter 62 of the controller 44, the high frequency component is removed, and the cos component and the sin component of the second fluorescence signal are extracted. It is.
  • the cos component and sin component signal of the second fluorescence signal are amplified, A / D converted, and sent to the analyzer 80.
  • Such signal processing is performed on-time when the first and second fluorescence signals obtained by measurement are supplied from the photoelectric converters 27a to 27c, and the cos component value after signal processing and The value of the sin component is sequentially supplied.
  • the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted from the biological material M can be calculated accurately and efficiently. Note that the fluorescence emission time of the fluorescence emitted from the buffer solution is not measured every time the biological substance M passes the measurement point, but the fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted from the buffer solution is measured in advance and stored in the analyzer 80.
  • the fluorescence relaxation time of the fluorescence of the biological material M is calculated. There is also a way to calculate.
  • the above method cannot be quickly handled.
  • the amount of the medium contained in the sample 12 changes depending on the degree of dilution, and the fluorescence emitted from the buffer solution Since the relaxation time also changes, the above method cannot be used.
  • the measurement vectors P ms and P mb are obtained by using a modulation signal of laser light as an input signal instead of the above-described processing methods in the signal processing unit 42 and the controller 44, and IQ mixers 58a to 58m.
  • the frequency spectrum of the transfer function whose response signal is the processing signal output from 58c is obtained using a frequency analyzer, the value of the real part and the value of the imaginary part in this frequency spectrum are obtained, and the real number of the DC component at this time

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Abstract

　レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する際、従来に比べて正確に蛍光緩和時定数を算出する蛍光検出方法及び蛍光検出装置を提供する。 　所定の周波数の変調信号で光強度を変調したレーザ光の照射位置を測定対象物が通過するとき、受光手段が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集する。さらに、測定対象物がレーザ光の照射位置を通過した後の、測定対象物がレーザ光の照射位置に無い状態において、受光手段が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集する。収集した第１の蛍光信号と第２の蛍光信号とを用いて、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、レーザ光の変調信号に対する位相差情報を求め、この求めた測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める。

Description

蛍光検出方法及び蛍光検出装置
　本発明は、細胞や細菌等の測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出方法及び蛍光検出装置に関する。
　医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
　具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を測定対象物としてバッファー液に含んで構成される混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、生体物質中の蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで生体物質を識別するものである。
　このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって識別し、識別した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
　これの使用においてはより多くの測定対象物を短時間に蛍光の情報から識別することが要求されている。
　下記特許文献１には、蛍光検出装置が開示されている。この蛍光検出装置では、レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させ、このレーザ光を生体物質等に照射する。このとき試料から発する蛍光を受信して、レーザ光の変調信号に対する位相差情報を用いて生体物質等が発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。これにより、多数の蛍光の種類を識別することができ、特に短時間で効率よく蛍光信号を識別することができる、とされている。
特開２００６－２２６６９８号公報
　上記特許文献１の装置は、生体物質等が発する蛍光の蛍光強度が強い場合、受光した蛍光の種類を正確に識別することができるが、生体物質等が発する蛍光の発光領域が限られ、しかも蛍光強度が比較的弱い場合、必ずしも正確な識別ができないといった問題が生じる。
　例えば、予め蛍光緩和時間が既知の蛍光色素の発する蛍光を測定した場合、蛍光強度が弱いとき、求められた蛍光緩和時間が既知の蛍光緩和時間とずれが生じるため、正確な識別ができないといった問題が生じる。この他、生体物質がレーザ光の照射位置を通過するたびに蛍光緩和時定数を求め、求めた複数の蛍光緩和時定数を横軸に採り、縦軸にその頻度を採ったヒストグラムにおいて、ヒストグラムを形成する山の形状がブロードになり、複数の蛍光を正確に識別することができない。
　今日、生体物質中の極めて限られた狭い局所領域を蛍光の発光領域とする生体物質を扱うことが多くなっている。この場合、生体物質の発する蛍光の発光領域が小さくなるので、蛍光強度も弱くなる。このため、上述したように蛍光の正確な識別が益々困難となっている。
　そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、レーザ光を照射することにより生体物質等の測定対象物が発する蛍光を検出する際、従来に比べて正確に蛍光緩和時定数を算出する蛍光検出方法及び蛍光検出装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明は、測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を照射することにより、通過する測定対象物が発する蛍光を受光手段が受光して蛍光を検出する際、
　レーザ光の照射位置を測定対象物が通過するとき、前記受光手段が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集する第１のステップと、前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過した後の、前記測定対象物がレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光手段が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集する第２のステップと、前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める第３のステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
　その際、前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分の値とにより構成されることが好ましい。さらに、前記第３の位相差情報は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引いたデータであることが好ましい。
　また、本発明は、測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
　設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を、前記流れに向けて出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射によって発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記測定対象物がレーザ光の照射位置を通過するタイミングを検知するタイミング検出部と、前記検知したタイミングに従って、前記受光部が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集し、さらに、前記測定粒子がレーザ光の照射位置を通過後のレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光部が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集し、前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める処理・分析手段と、を有することを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
　その際、前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分の値とにより構成されるデータであることが好ましい。さらに、前記処理・分析手段は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引くことにより前記第３の位相差情報のデータを求めることが好ましい。
　本発明の蛍光検出方法及び蛍光検出装置は、測定対象物の発する蛍光のみならず、測定対象物がレーザ光の照射位置を通過した後のバッファー液の発する蛍光に対しても、蛍光検出の計測対象とする。これは、測定対象物の蛍光が比較的弱い場合、バッファー液自体が発する蛍光を無視できないからである。測定対象物がレーザ光の照射位置の通過時において計測される蛍光には、測定対象物の発する蛍光の他にバッファー液自体が発する蛍光が含まれているが、本発明では、測定対象物がレーザ光の照射位置を通過した後のバッファー液の発する蛍光に対しても蛍光を計測を行うので、この計測結果を用いて、測定対象物の発する蛍光の位相差情報を正確に求めることができる。これにより、従来に比べて正確かつ迅速に蛍光緩和時定数を算出することができる。
本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 本発明の蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。 本発明の蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。 本発明の蛍光検出装置に用いられる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。 図４に示す制御・処理部のＩＱミキサを説明する図である。 本発明の蛍光検出装置で行う蛍光緩和時定数の算出方法を説明する図である。 蛍光強度の時間的変化の概略の様子を示す図である。
発明を実施するための形態
　以下、本発明の蛍光検出方法を実施する本発明の蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
　図１は、強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。以下説明する実施形態では、バッファー液に懸濁した蛍光色素を有する生体物質Ｍを、測定対象物として説明するが、生体物質Ｍの他に所定の蛍光色素を備え、生体物質Ｍと生体結合をするマイクロビーズを生体物質Ｍとともにバッファー液に含ませ、生体物質Ｍ及びマイクロビーズを測定対象物とすることもできる。
　フローサイトメータ１０は、レーザ光を照射することにより蛍光を発する生体物質Ｍをバッファー液に懸濁して構成された試料１２に照射し、試料１２中の生体物質Ｍが備える蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。
　信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の変調周波数で強度変調させる変調信号を生成するために制御する制御部、及び試料１２からの蛍光信号を識別する信号処理部を含んだ制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液に、生体物質Ｍを含んだバッファー液からなる試料１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
　管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の生体物質Ｍを識別し分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
　レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ1＝４０５ｎｍ、λ2＝５３３ｎｍおよびλ3＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点を形成する。この測定点が、本発明におけるレーザ光の照射位置に対応する。
　図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
　レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ～８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する部分である。
　レーザ光源部２２は、主に赤色のレーザ光ＲをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調するＲ光源２２ｒと、緑色のレーザ光ＧをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調するＧ光源２２ｇと、青色のレーザ光ＢをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調するＢ光源２２ｂと、を有する。
　さらに、レーザ光源部２２は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのそれぞれを駆動するレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂに分配するパワースプリッタ３５と、を有する。
　これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
　レーザ光は、例えば５～１００ｍＷ程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時定数に比べてやや長い、例えば１０～５０ＭＨｚである。
　ダイクロイックミラー２３ａ1は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ2は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
　この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点の試料１２を照射する照射光となる。
　Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質Ｍに付着されており、生体物質Ｍが測定対象物として管路３０を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。さらに、生体物質Ｍが測定点を通過後も、好ましくは通過直後も、生体物質Ｍが無い状態でバッファー液に対し一定期間レーザ光を照射し、バッファー液の発する蛍光の検出を行う。
　受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する生体物質Ｍによってレーザ光が前方散乱することにより、生体物質Ｍが測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において生体物質Ｍが管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
　なお、生体物質Ｍが測定点を通過する時間をＴとし、生体物質Ｍの平均直径をＤ、フローセルを流れる生体物質Ｍの速度をＶとし、レーザ光の測定点におけるスポット幅をＷとしたとき、時間Ｔは、Ｔ＝（Ｄ＋Ｗ）／Ｖとなる。この時間Ｔは既知の値である。信号処理装置２０は、受光部２４で生成されるトリガ信号を計測開始のタイミングとして、蛍光の検出を開始し、時間Ｔの２倍の時間２・Ｔの間計測を続行する。計測とは、時間Ｔの期間中、試料１２の発する蛍光を受光して、後述する制御・処理部２８にて信号処理を行い、分析装置８０に位相差情報を供給することをいう。この計測により、測定点を生体物質Ｍが通過するとき、受光部２６が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集し、生体物質Ｍが測定点を通過した後の、生体物質Ｍが測定点に無いバッファー液のみの状態において、受光部２６が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集することができる。
　一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２から発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
　図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
　図３に示す受光部２６は、試料１２中の生体物質Ｍからの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２と、バンドパスフィルタ２６ｃ１～２６ｃ３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ～２７ｃと、を有する。
　レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ～２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
　ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１～２６ｃ３でフィルタリングして光電変換器２７ａ～２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
　バンドパスフィルタ２６ｃ１～２６ｃ３は、各光電変換器２７ａ～２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。
　光電変換器２７ａ～２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光はレーザ光の変調信号に対して位相差情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は位相差情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部２８に供給される。
　制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。なお、制御・処理部２８は、本発明における第１の蛍光信号及び第２の蛍光信号を収集する部分に対応する。
　信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）する変調信号を生成する部分である。
　具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のパワースプリッタ３５に供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ～２７ｃから出力される蛍光信号（第１の蛍光信号、第２の蛍光信号）を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０～５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
　信号処理部４２は、光電変換器２７ａ～２７ｃから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により試料１２が発する蛍光の位相差情報を含む信号を処理する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ～２７ｃから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ～５４ｃと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ５６と、この変調信号を参照信号として増幅された蛍光信号と合成するＩＱミキサ５８ａ～５８ｃと、を有して構成される。
　ＩＱミキサ５８ａ～５８ｃは、光電変換器２７ａ～２７ｃから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成する装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ～５８ｃのそれぞれは、図５に示すように、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分（参照信号と同位相の信号成分）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分（参照信号に対して９０度の位相差のある信号成分）と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。
　コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の変調信号（正弦波信号）を生成させるように制御し、さらに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を求める部分である。
　具体的には、コントローラ４４は、信号処理装置２０の各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
　システム制御器６０は、レーザ光の強度変調のために、発振器４６の発振周波数を定める。
　コントローラ４４は、ローパスフィルタ６２によってフィルタリング処理されて高周波信号が除去されたｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値をアンプ６４で増幅し、さらに、Ａ／Ｄ変換器６６によりサンプリングすることにより、デジタル化されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を、分析装置８０に供給する。
　分析装置８０は、生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求め、試料１２中の生体物質Ｍの蛍光の種類を、蛍光緩和時定数から識別する部分である。所定の蛍光色素を付着したマイクロビーズを試料１２に含ませて、生体物質Ｍが生体結合するか否か等の生体物質Ｍの特性を調べることもできる。
　なお、分析装置８０は、本発明における蛍光緩和時定数を算出する処理部を形成し、コンピュータにより構成される。
　生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数の算出は、バッファー液に懸濁する生体物質Ｍが測定点を通過するとき発する蛍光の第１の蛍光信号の変調信号に対する位相差情報と、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が発する蛍光の第２の蛍光信号の位相差情報とを用いて行われる。
　上述したように、受光部２４で生成されるトリガ信号に基づいて計測を開始し、生体物質Ｍが測定点を通過する時間Ｔの２倍の時間２・Ｔの間計測を続ける。このため、計測開始から最初の時間Ｔまでは、バッファー液に懸濁する生体物質Ｍが測定点を通過するときの蛍光を検出し、時間Ｔ～時間２・Ｔでは、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が発する蛍光を検出する。したがって、分析装置８０に供給されるｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号は、計測開始から最初の時間Ｔまでの蛍光の位相差情報、すなわち、バッファー液と生体物質Ｍとが発する蛍光の位相差情報と、時間Ｔ～時間２・Ｔまでの蛍光の位相差情報、すなわちバッファー液が発する蛍光の位相差情報を含んでいる。
　生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数の算出は、具体的には、コントローラ４４から供給された上述のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値をベクトル成分とする計測ベクトルを位相差情報を含むデータとして用いる。この計測ベクトルについて、バッファー液に懸濁する生体物質Ｍが測定点を通過するときの第１の蛍光信号の計測ベクトルをＰmsとし、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が蛍光を発するときの第２の蛍光信号の計測ベクトルをＰmbとし、生体物質Ｍの発する蛍光のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値からなる生体物質ＭのベクトルをＰsとしたとき、Ｐs＝Ｐms－Ｐmbで表される。図６には、計測ベクトルＰms，Ｐmbと、生体物質ＭのベクトルＰsとの関係を示している。図６に示す図は、横軸にレーザ光の変調信号のｃｏｓ成分（実数部）の値（振幅）を、縦軸にはｓｉｎ成分（虚数部）の値（振幅）を採って表している。すなわち、本発明における位相差情報は、変調信号と同相の信号成分（ｃｏｓ成分）の値と、変調信号に対して９０度位相差のある信号成分（ｓｉｎ成分）の値とにより構成されるデータとなっている。
　実際、生体物質Ｍが測定点を通過するとき試料１２から発する蛍光は、生体物質Ｍが発する蛍光とバッファー液が発する蛍光を含む。このため、分析装置８０では、これらの蛍光が混在した状態で、受光部２６で蛍光か受光される。したがって、分析装置８０で得られる計測ベクトルＰmsは、生体物質Ｍが発する蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値と、バッファー液が発する蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値とが含まれる。このため、生体物質Ｍが測定点を通過した直後のバッファー液が発する蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値からなる計測ベクトルＰmbを、計測ベクトルＰmsから差し引くことにより、生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsを算出することができる。すなわち、計測ベクトルＰmsのｃｏｓ成分の値,ｓｉｎ成分の値から計測ベクトルＰmbのｃｏｓ成分の値、ｓｉｎ成分の値を成分ごとに差し引くことにより、生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsを算出する。
　生体物質Ｍの蛍光が弱い場合、背景成分となって生体物質Ｍの蛍光の蛍光信号に含まれるバッファー液の発する蛍光は無視できない。本実施形態では、生体物資Ｍが測定点を通過した直後の一定期間（時間Ｔ～２・Ｔの期間）、例えば、生体物質Ｍが測定点を通過する時間Ｔと同じ時間の長さで、バッファー液の発する蛍光を計測することにより、上述のように、生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsを算出する。図７は、試料１２が発する蛍光の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図７中の領域Ｒ1は、生体物質Ｍが発する蛍光とバッファー液が発する蛍光とが混在する領域である。一方、領域Ｒ2は、バッファー液が発する蛍光のみが存在する領域である。このように、受光部２４から出力されるトリガ信号の生成を計測の開始のタイミングとして計測開始～時間Ｔの間、領域Ｒ1の計測を行い、この直後、領域Ｒ2の計測を行う。なお、ベクトルＰsの算出は、光電変換器２７ａ～２７ｃで得られた蛍光信号毎に行われる。
　分析装置８０は、こうして求められた生体物質Ｍが発する蛍光のベクトルＰsから、蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求める、蛍光緩和時定数は、生体物質Ｍが測定点を通過するたびに供給される計測ベクトルＰms，Ｐmbを用いて算出される。このため、分析装置８０では、算出された蛍光緩和時定数の頻度を表すヒストグラムを作成し、蛍光緩和時定数を統計的に処理して、蛍光緩和時定数の平均値及び分散を求める。これにより、生体物質Ｍの発する蛍光を識別することができる。
　なお、蛍光緩和時定数の算出方法は、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数に依存しており、例えば蛍光を１次緩和過程で表した場合、下記式に従って算出される。
　　τ　＝　１／ω・ｔａｎθs
　ここで、θsは、算出されたベクトルＰsの、ｃｏｓ成分の軸に対する傾斜角度（図６参照）であり、ωはレーザ光の変調信号の周波数であり、τは蛍光緩和時定数である。蛍光緩和時定数τは、レーザ光をパルス照射したときの初期蛍光強度をＩ0とすると、この時点から蛍光強度がＩ0／ｅ（ｅは自然対数の底、ｅ≒２．７１８２８）となる時点までの時間をいう。
　フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
　このようなフローサイトメータ１０の信号処理装置２０は、まず、コントローラ４４からの指示により、所定の周波数の変調信号を発信器４６に発生させ、この信号がアンプ５０により増幅されて、レーザ光源部２２及び信号処理部４２に供給される。
　この状態で、試料１２が管路３０を流れ、フローが形成される。フローは、例えば１００μｍの流路径に１～１０ｍ／秒の流速を有する。
　測定点を通過する生体物質Ｍにレーザ光が照射されると、受光部２４で生体物質Ｍの通過を検出する検出信号がコントローラ４４にトリガ信号として出力される。
　コントローラ４４では、この検出信号をトリガ信号とし、計測開始の指示信号を各部分に供給する。
　レーザ光源部２２から出射したレーザ光は測定点において試料１２中の蛍光色素を励起させるために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が蛍光を発し、受光部２６にて受光される。レーザ光は、所定の周波数で強度が変調しているので、蛍光もこれに対応して蛍光強度が所定の周波数で変調している。
　このようなレーザ光で照射されて発する蛍光色素からの蛍光は、レーザ光の強度を変調する変調信号に対して位相差の情報を持っている。
　このとき、生体物質Ｍが測定点を通過する数μ～数１０μ秒の間に、所定の周波数で振幅変調するレーザ光が生体物質Ｍに照射される。レーザ光の変調周波数は、例えば１０～５０ＭＨｚである。
　生体物質Ｍが測定点を通過する計測開始～時間Ｔの期間中、蛍光の計測、すなわち、図７に示す領域Ｒ1の計測が行われ第１の蛍光信号が得られ、時間Ｔの経過直後、さらに、時間Ｔの間、蛍光の別の計測、すなわち、図７に示す領域Ｒ2の計測が行われ第２の蛍光信号が得られる。
　受光部２６の光電変換器２７ａ～２７ｃで受光されて出力される第１、第２の蛍光信号は、アンプ５４ａ～５４ｃで増幅され、ＩＱミキサ５８ａ～５８ｃにより、信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号と合成される。
　ＩＱミキサ５８ａ～５８ｃでは、正弦波信号である変調信号（参照信号）と第１、第２の蛍光信号を乗算した合成信号が生成されるとともに、正弦波信号である変調信号（参照信号）に対して位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号を乗算して合成した信号が生成される。
　次に、第１の蛍光信号に対して生成された２つの合成信号は、コントローラ４４のローパスフィルタ６２に送られ、高周波成分が除去されて、第１の蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分が取り出される。この第１の蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号は増幅され、Ａ／Ｄ変換され、分析装置８０に送られる。Ａ／Ｄ変換は、受光部２４からのトリガ信号のタイミングで同期が取られ、サンプリングが行われる。
　同様に、第２の蛍光信号に対して生成された２つの合成信号は、コントローラ４４のローパスフィルタ６２に送られ、高周波成分が除去されて、第２の蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分が取り出される。この第２の蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号は増幅され、Ａ／Ｄ変換され、分析装置８０に送られる。
　このような信号処理は、計測によって得られる第１、第２の蛍光信号が光電変換機２７ａ～２７ｃから供給されるとオンタイムで行われ、分析装置８０へ信号処理後のｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値が逐次供給される。
　分析装置８０では、供給されたｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を逐次収集した後、このｃｏｓ成分の値及びｓｉｎ成分の値を用いて算出される領域Ｒ1の計測ベクトルＰmsの平均値と、領域Ｒ2の計測ベクトルＰmbの平均値の差分が求められ、生体物質ＭのベクトルＰmが求められる。分析装置８０では、さらに、このベクトルＰmを用いて、τ　＝　１／ω・ｔａｎθsの式に従って蛍光緩和時定数τが求められる。
　このように本実施形態では、生体物質Ｍが測定点を通過する時の蛍光を計測した直後に、バッファー液の発する蛍光も計測し、これらの計測結果の情報を用いて蛍光緩和時定数を算出する。これによって、生体物質Ｍの発する蛍光の蛍光緩和時定数を正確に、かつ効率的に算出することができる。
　なお、生体物質Ｍが測定点を通過する毎にバッファー液から発せられる蛍光の計測を行わずに、バッファー液から発せられる蛍光の蛍光緩和時間を予め計測して分析装置８０に記憶保存しておき、生体物質Ｍが測定点を通過するときの蛍光の計測結果と、分析装置８０に記憶されたバッファー液から発せられる蛍光の蛍光緩和時間とに基づいて、生体物質Ｍの蛍光の蛍光緩和時間を演算する方法もある。
　しかし、一定の期間に計測すべき試料１２が複数種類かつ多量にあり、しかも、バッファー液の種類が異なる場合、上記方法では迅速に対応できない。また、蛍光タンパク質を導入した細胞等が培地中に存在し、これを希釈して試料１２とする場合、希釈の度合いによって、試料１２中に含まれる培地の量が変化し、バッファー液が発する蛍光緩和時間も変化するため、上記方法では対応できない。さらに、生体物質Ｍがその生体活動によりバッファー液の成分も変化し、バッファー液の発する蛍光緩和時間も変化するため、上記方法では対応できない。
　このような不都合を、本実施形態は解消し、迅速にかつ正確に蛍光緩和時定数を算出することができる。
　なお、本実施形態においては、計測ベクトルＰms及びＰmbを求める方法は、信号処理部４２及びコントローラ４４における上述した処理方法の替わりに、レーザ光の変調信号を入力信号とし、ＩＱミキサ５８ａ～５８ｃから出力される処理信号を応答信号とする伝達関数の周波数スペクトルを周波数分析器を用いて求め、この周波数スペクトルにおける、実数部の値及び虚数部の値を求め、このときのＤＣ成分の実数部の値及び虚数部の値を計測ベクトルＰms,Ｐmbのベクトル成分とし、生体物質Ｍの発する蛍光のベクトルＰs＝Ｐms－Ｐmbを求めることにより、蛍光緩和時定数の算出することもできる。
　以上、本発明の蛍光検出方法及び蛍光検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
符号の説明
１０　フローサイトメータ
１２　試料
２０　信号処理装置
２２　レーザ光源部
２２ｒ　Ｒ光源
２２ｇ　Ｇ光源
２２ｂ　Ｂ光源
２３ａ1，２３ａ2，２６ｂ1，２６ｂ2　ダイクロイックミラー
２３ｃ．２６ａ　レンズ系
２４，２６　受光部
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ３　バンドパスフィルタ
２７ａ～２７ｃ　光電センサ
２８　制御・処理部
３０　管路
３２　回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ　レーザドライバ
３５，４８，５６　パワースプリッタ
４０　信号生成部４０
４２　信号処理部
４４　コントローラ
４６　発信器
５０，５２，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４　アンプ
５８ａ，５８ｂ，５８ｃ　ＩＱミキサ
６２　ローパスフィルタ
６６　Ａ／Ｄ変換器
８０　分析装置

Claims (6)

  1. 　測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を照射することにより、通過する測定対象物が発する蛍光を受光手段が受光して蛍光を検出する際、
    　レーザ光の照射位置を測定対象物が通過するとき、前記受光手段が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集する第１のステップと、
    　前記測定対象物が前記レーザ光の照射位置を通過した後の、前記測定対象物がレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光手段が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集する第２のステップと、
    　前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める第３のステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
  2. 　前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分の値とにより構成されるデータである請求項１に記載の蛍光検出方法。
  3. 　前記第３の位相差情報は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引いたデータである請求項２に記載の蛍光検出方法。
  4. 　測定対象物をバッファー液に含ませて流れる流体の流れに対して、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
    　設定された周波数の変調信号を用いて光強度を変調したレーザ光を、前記流れに向けて出射するレーザ光源部と、
    　レーザ光の照射によって発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
    　前記測定対象物がレーザ光の照射位置を通過するタイミングを検知するタイミング検出部と、
    　前記検知したタイミングに従って、前記受光部が受光する蛍光の第１の蛍光信号を収集し、さらに、前記測定粒子がレーザ光の照射位置を通過後のレーザ光の照射位置に無い状態において、前記受光部が受光する蛍光の第２の蛍光信号を収集し、前記第１の蛍光信号の前記変調信号に対する第１の位相差情報を、前記第２の蛍光信号の前記変調信号に対する第２の位相差情報を用いて調整することにより、測定対象物の発する蛍光の蛍光信号の、前記変調信号に対する第３の位相差情報を求め、この求めた第３の位相差情報から、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時定数を求める処理・分析手段と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
  5. 　前記第１及び第２の位相差情報は、前記変調信号と同相の信号成分の値と、前記変調信号に対して９０度位相差のある信号成分の値とにより構成されるデータである請求項４に記載の蛍光検出装置。
  6. 　前記処理・分析手段は、前記第１の位相差情報のデータから前記第２の位相差情報のデータを、各成分毎に差し引くことにより前記第３の位相差情報のデータを求める請求項５に記載の蛍光検出装置。
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