JPS60209147A - フロ−サイトメ−タにおけるバツクグランド干渉の消去装置 - Google Patents

フロ−サイトメ−タにおけるバツクグランド干渉の消去装置

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JPS60209147A
JPS60209147A JP60000749A JP74985A JPS60209147A JP S60209147 A JPS60209147 A JP S60209147A JP 60000749 A JP60000749 A JP 60000749A JP 74985 A JP74985 A JP 74985A JP S60209147 A JPS60209147 A JP S60209147A
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ジヨン シイ・マーチン
ジエームズ エツチ・ジエツト
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、一般には多重レーザを用いるフロー−クイ1
〜メータ(flow cytometer)に関し、更
に詳しくは、多重レーザ・フロー」ノイI〜メータを用
いて行なわれる蛍光測定においてバックグラウンド干渉
を消去するための装置に関するものである。
〈従来の技術〉 多重レーク゛・フロー1ナイ1〜メータにおいては、生
物学的細胞は蛍光染料により染色され、液体懸濁状態で
フローヂ1ンハを通って流れ、このフローチ」−ンバ内
では細胞は個々に分離され整列されて測定されることに
なる。このフローチェンバを通る際、細胞は空間的に隔
てて配置された複数のレーザ・ビームを順次通過づる。
各レーザ・ビームは、細胞の特定成分に結合した各々異
なる蛍光染料を励起させる。この蛍光染料からの蛍光を
測定覆ることによって、染料が結合している細胞成分に
ついての定量的情報がもたらされる。フローサイ1〜メ
ータは種々の細胞特性、例えば細胞の大きざ、DNA含
有量、蛋白質含有量、細胞膜浸透性等を測定りることが
できる。かようなフロ〜ザイトメータはまた、細胞の抗
原や、個々の染色体の形状、大きさおよびDNA含量等
も測定できる。
多重レーザ・フローサイ1〜メータによる細胞測定法は
多くの文献に記載されている。例えば、ジエイ、エイ、
スタインカンプ、ディ、エイ。
オーリッキイ、エッチ、エイ、クリスマン著「哺乳類の
単細胞の二重レーザ・フローリーイ1ヘメ1ヘリイ」、
ジエイ、ヒス!−ケム、ザイ1〜ケム。
27巻、273頁(1979年) (J、A、Stei
llkamp、D。
A、0rlicky、 H,A、Crissman 、
”Dual−LaserFlow Cytometry
 of Single Mam−malian Ce1
ls”J、旧5tOChel11. CytOClle
nl、27. 273 (1979) ) や、ジエイ
、エイ、スタインカンプ、シイ、シイ。
スチュワー1〜.エッチ、エイ、クリスマン著「三つの
レーザ波長で励起された単細胞に対する三色蛍光測定」
、サイ1〜メ1〜リイ、2巻、226頁(1979年)
 (J、A、5tei+1kamp、 C,C,StM
wart。
旧A、 cr : ssman、“Three−Col
or Fluorescence)1easureme
nts on Single Ce1ls Excit
ed atTllree La5er Wavelen
gtbs” 、Cytometry 2゜22B (1
982) )等かある。
多重レーザ゛・フローサイ1〜メータによる測定は、多
種類の蛍光染料により染色された細胞の分析のための測
定能力を向上せしめた。2種の蛍光染料で染色された細
胞を単一レーザにより励起させる場合には、染料の組合
せを選択する必要がある。すなわち、2種の染料を1つ
のレーザ波長で同時に励起させ、かつ蛍光発光のスペク
1ヘルの重複が最小となるように染料を選択しなければ
ならない。かようなスペクトルの問題は、二重レーザ・
フローサイ1〜メータの開発によって大いに低減された
。これは、流れている゛リンプル流を2つの独立したレ
ーザ・ビームがこの流れに沿った異なる個所で横切るよ
うに構成されている。この技術は、著しく相違する励起
波長をもつ蛍光染料に対しては良好に機能するか、発光
スペクトルが完全に重複する可能性もある。この技術に
対りる鍵は、別個のレーザ゛・ビームからの測定値の空
間的および時間的分解にある。
多重レーザ・フロー−クイ1−メータによる測定は、細
胞からの蛍光信号がほど良く明るく、かつ各測定チャン
ネルにおける蛍光強度がほぼ等しい場合に限って良好に
機能覆る。しかしながら、免疫蛍光法のごとく、測定チ
ャンネルの1つが非常に暗い蛍光しか検出しえないよう
な場合には、明るいチャンネルのレーザ・ビームからの
迷走シー9光の漏゛洩により、暗いチャンネルにかなり
のバックグラウンドをもたらす。しばしば、他のレーザ
・ビームの波長がこの暗い蛍光発光スペクトルと重複し
、検出されやすいバックグラウンドを与える。レーザの
遮蔽フィルタによりこのレーザ漏洩を低減できるが、同
時に所望の暗い蛍光信号も減じられてしまう。
レーザ漏洩干渉は染色体の二重レーザ測定において特に
困難な問題となる。染色された染色体からの蛍光は薄暗
く、ある場合には、比較的小さい染色体からの蛍光は非
常に暗いために、光子係数統旧か重要になる。二重レー
ザによる染色体分析においては、2つのレーザ・ビーム
からの交差的干渉が重要になる。
レーザ漏洩を低減するためにレーザ遮蔽フィルタを使用
することは周知であるが、多重レーザ゛・フローサイ1
〜メータにおける薄暗い蛍光を検出づるという問題を解
決しない。米国特許第4.198,567 @は、少量
の蛍光物質を測定する方法と装置を開示している。これ
によると、放射線パルスにより→ノンプルが励起され、
蛍光放側線検出器出力信号がゲートされて、励起放射 
;線パルスが散乱放射線信号より蛍光発光信号の方が明
らかに大きくなるような点へと減衰した後まで遅延され
る。この特許では多重レーザ・フローサイトメータは用
いられていない。
米国特許第4.’243.318月は、2つのレーザ・
ビームにより横切られた2点間を個々の染色された生物
学的粒子が移動lる時間に相当覆る蛍光パルスのみを測
定する方法が開示されている。この特許の問題点は、D
NAと蛋白質とに対して異なる蛍光染料を使用ぜねばな
らないことである。
〈発明の目的〉 本発明の1つの目的は、多重レーザ・フローリーイ1〜
メータにおける複数のレーザがらの交差的干渉によるバ
ックグラウンドを消去する装置と提供することである。
本発明のもう1つの目的は、多重レーザ・フローサイ1
〜メータにおける複数のレーザ・ビームを制御された様
式でオン−オフするための枝道を提供することである。
ざらに別な目的は、薄暗い蛍光を検出すること、および
染色体についての正確な蛍光測定を行なうことである。
〈発明の要旨〉 本発明によれば、多重光源フロー−リイトメータにあけ
る改良がもたらされる。この改良は、フローサイ1〜メ
ータの複数光源の少なくとも1つの光源からの光をオン
−オフ変調して光源間のバックグラウンド干渉を消去す
る装置によって構成される。フロー1ノイドメータは少
なくとも第1と第2の光源を有してあり、光源の代表的
なものはレーザである。かようなフローサイ1〜メータ
は本発明の一部を構成するものではない。これらのレー
ザは光を発するが、この光は同一波長でもよいし異なる
波長でもよい。これらのレーザ・ビームは、生物学的粒
子の流路の異なる点に焦点されてこの流路を横切る。各
レーク゛は、1つの生物学的粒子の特定成分に結合した
異なる蛍光染料を通常励起する。このサイ゛1へメータ
は、染料からの蛍光を測定するための少なくとも1つの
蛍光検出器、および蛍光データを蓄積するためのデータ
蓄積システムを有しでいる。
本発明による上記のバックグラ・ノンド干渉消去装置は
、生物学的粒子により散乱された光を検出するための第
1および第2の光散乱検出器、前記の各光散乱検出器に
応答する第1および第2のゲート信号発生器、および前
記各グー1−信号発生器からの第1および第2グー1〜
信号を受信しかつ蛍光データをデータ蓄積システムへ伝
送するための第1および第2のゲーテッド信号処理装置
からなる。本発明の装置にはざらに少なくとも1つの光
変調器か含まれ、これは光源の1つをオン−オフ変調す
る。遅延装置は、グー1〜信号発生器からのグー1〜信
号を受信しかつそれに応答して遅延ゲート信号を発生づ
るように接続されている。この遅延装置は、遅延ゲート
信号が光変調器の動作を制御り−るように光変調器に接
続される。光変調器は第1の光源おるいは第2の光源の
いずれかと協働することができる。好ましくは、第1の
光変調器が第1の光源と協働し、第2の光変調器が第2
の光源と協動するようにづる。生物学的粒子は染色体と
することができる。生物学的粒子が、検出可能な強さの
光を」−分に散乱できない程に小さい場合には、グー1
〜信号発生器が各蛍光検出器に応答−りることができる
〈実施例〉 第1図は本発明の好適な実施例を示しているにの図にお
いて、本発明の装置と共に関連するフローシイ1〜メー
タの一部を示しておる。フロー1ノイドメータは第1の
光源10と第2の光源12を有している他、更に集束レ
ンズ14を備え、各光源からの光を4ノンプル流に沿っ
である距離Sだけ離れた異なった点に集束する。この4
ノンプル流16を通って、1本の線上に互いに隔置され
た複数のビーズのように−・列になって生物学的粒子か
通過する。この光源としては、同一または異なった波長
を有する光を発するレーザが使用できる。このレーザは
パルス化してもよく、あるいは連続波(CW)とするこ
ともできる。第1の光源10からの第1の光ビーム18
が第1の生物学的粒子20を励起している状態が図示さ
れている。第1の生物学的粒子20と第2の生物学的粒
子22は蛍光染料で染色されている。各染料は生物学的
粒子の特定成分に結合している。各光源は同一または異
なる染料を励起できる。第1の生物学的粒子20は蛍光
23を発し、これが第1の蛍光検出器24で検出される
。光ビーム18からの光は、蛍光23と同様に第2の蛍
光検出器26に到達する。
生物学的粒子の移動方向を矢印28で示しである。フロ
ー1ノイドメータは更に、蛍光、光散乱および生物学的
粒子に関して得られたその他のデータを蓄積するための
データ蓄積システム30を備えている。
本発明の装置は、少なくとも一方の光源をオン−オフ変
調して、蛍光測定中のバックグラウンド干渉を消去させ
ている。本装置は第1の光散乱検出器32と第2の光散
乱検出器34を有している。図示の状態においては、第
1の生物学的粒子20が散乱光36を発している。第1
のゲート信号発生器37は、第1の光散乱検出器32に
よる散乱光の検出に応答して第1のグー1〜信号を発生
する。第2のゲート信号発生器38は、第2の光散乱検
出器34による散乱光の検出に応答して第2のグー1〜
信号を発生する。
第1のゲーテッド信号処理装置40と第2のゲーテッド
信号処理装置42は各々のグー1〜信号を受け、蛍光と
光散乱データをデータ蓄積システム30に送る。第1の
光変調器44は第1の光源と協働的に作動する。第2の
光変調器46は第2の光源と協働的に作動する。第1の
光変調器44と第2の光変調器46は遅延装置48に接
続されている。第1の生物学的粒子20は、図示の状態
においては、第1の蛍光検出器24で検出される蛍光2
3を発し、また第1の光散乱検出器32へ達Jる散乱光
36を生ずる。この時、第1の光ビーム18の干渉信号
が第2の蛍光検出器26に達するが、この干渉信号は第
2のゲーテッド信号処理装置42に−で遮断される。第
1のグー1〜信号発生器37は、第1の光散乱検出器3
2に応答して第1のグー1〜信号を発生する。第1のゲ
ート信号は遅延装置48へ送られる。第1のグー1〜信
号発生器37は更に、第3のゲート信号を発生し、これ
が第1のグーデッド信号処理装置40に送られて第1の
蛍光検出器24からの信号を遮断し、第1の生物学的粒
子20が第2の光ビーム50(鎖線で示し、第2の光源
がオフであることを示している)に到達するとぎにこの
装置40が信号処理を行なわないようにしである。遅延
装置48は直ちに第1のゲート信号を第1の光変調器4
4に送り、第1の生物学的粒子20が第1の光ビーム1
8を通り過ぎたのちにこの変調器44は第1の光源10
からの光をオフ変調する。遅延装置48は第1のグー1
〜信号に応答して遅延グー1〜信号を発生する。第1の
グー1−信号は、第1の生物学的粒子20が第1の光ビ
ーム18から第2の光ビーム50までの距離Sを移動す
るのに十分な時間だけ効果的に遅延される。第2の光変
調器は、遅延装置48からの遅延信号を受信すると、第
2の光源12を十分に長い時間オンとしてパルス化し、
第1の生物学的粒子20を励起する。第2の蛍光検出器
26は得られた蛍光を検出し、第2の光散乱検出器34
は散乱光を検出する。蛍光と光散乱のデータは第2のゲ
ーテッド信@処理装置42を介してデータ蓄積装置30
に送られる。第2のゲート信号発生器38は、第2の光
散乱検出器34に応答して第4のグー1〜信号を発生す
る。この第4のグー1〜信号は第1のグー1〜信号発生
器37へと送られ、そこから第1のゲーテッド信号処理
装置へと送られて第1の蛍光検出器24をオンに戻す。
更にこの第4のゲート信号は遅延装置48へ、次いで第
1の光変調器44へと送られ、この第1の光変調器44
は次に第1の光源10からの光をオンに戻すように変調
する。第1の光ビーム18は、この光ビーム18到達す
るザンプル流中の次の生物学的粒子を励起することがで
きる。
生物学的粒子は、細胞、ウィルス、分子、細菌または染
色体とすることができる。光源としてはパルス化された
ヒん光電法や水銀灯とすることかできる。光変調器とし
ては、電子光学的変調器、音響光学的変調器または液晶
スイッチを採用できる。
本発明の別の実施例においては、第1図を参照して説明
すれば、1個の光学的変調手段として第2の光変調器4
6だけがある。第1の光ビーム18は継続してオンされ
たままとなっている。第1の光ビーム18パらの光を散
乱しまたは蛍光を発することによって、グー1〜信号を
発生せしめかつこれを遅延装置18へ到達せしめた同一
の生物学的粒子を励起づるのに十分な長い時間にわたっ
て、遅延装置48と第2の光変調器46とは第2の光源
12をオンとしてパルス化する。
本発明の更に別の実施例においては、唯一の光学的変調
手段が第1の光変調器4/′Iである(第1図参照)。
第2の光ビーム50は継続しでオンされたままとなって
いる。生物学的粒子が第2の光ビ゛−ム50の光を散乱
した後、ゲート信号が発生されて第1の光変調器44に
送られ第1の光ビーム18をオンに変調する。次に、第
1の光ビーム18は1ノンプル流16中の次の生物学的
粒子を励起し得ることとなる。
第3図乃至第5図は、第1図に示した好ましい実施例の
複数光源の変調を示したものである。
第2図は、第1の光源61からの第1の光ビーム60に
よって励起されている生物学的粒子aを示している。第
2の光源62はオフとされ、従ってこのときの第2の光
ビーム63は破線で示しである。第3図は第1の光源6
1と第2の光源62の両方かオフとなり、第1の光ビー
ム60と第2の光ビーム63との間に生物学的粒子aか
存在している状態を示している。第4図は、第2の光源
62をオンとし、粒子aが第2の光ビーム63によって
励起されている様子を示している。第1の光源61と第
1の光ビーム60はオフとされている。第5図は第2の
光源62と第2の光ビーム63がオフとされた状態を示
している第1の光源61は既にオンとされている。生物
学的粒子すが第1の光ビーム60に接近しつつある状態
を図示している。
第6図は、2個のレーザを常時オンとした場合の二重レ
ーザ・フローサイ1〜メータによって得られた蛍光デー
タを図示したものである。第7図は一方のレーザを常時
オンとし、他方の(干渉)レーザ・ビームは遮断した場
合の二重レーザ・フローリイトメータで得た蛍光データ
を示している。第8図は一方のレーザを常時オンとし、
他方をオン−オフ変調した場合の二重レーザ・フロー1
ノーイトメータで得た蛍光を示している。第6図乃至第
8図において、縦軸は粒子数に、横軸は蛍光強度に対応
している。急峻なピークは得られた測定値が正確である
こと、および分解か好適であったことを示している。
第6図から理解される通り、従来の二重レーザ・フロー
サイ1〜メータ、を用いて得たピーク70はかなり広く
、バックグランドが寄与したため石側にシフ1〜してい
る。加えて、多くのバックグラウンド信号71が存在し
ている。第7図においてはピーク72はかなり狭くなっ
ており、第8図のピーク74も一層狭くなっている。
第8図に示されたデータを得るに際し、使用した遅延装
置はオーチック(Ortec )グー1〜と遅延発生器
(モデル416へ)であった。また、光変調器はコビー
レン1へ(Coherent)モデル317て、光源は
アルゴンのイオンレーザを使用した。更に、第1の光源
を457.9nmの波長を有づるスペク1〜う・フィツ
クス(SpectraPhysics )モデル164
−04とし、第2の光源を514.5nmの波長を有す
るスペク1ヘラ・フィツクス +デル164−05とし
た。上記457.9nmで励起された蛍光に対して採用
したレーザ遮蔽フィルタはショク1〜(Schott)
 GG 495であった。
以上本発明の好適な実施例について詳述したか、本発明
はこれらの実施例に限定されるものではなく、特許請求
の範囲内で種々変更が可能である。
〈発明の効果〉 本発明の1つの利点は、多重光源ノL]−1ノイ1〜メ
ータの複数光源からの交差的干渉によるバックグラウン
ドを消去でさることである。
もう1つの利点は、薄暗い蛍光を検出できることである
更にもう1つの利点は、多重レーザを用いて染色体の正
確な蛍光測定かできることである。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の好ましい実施例を示づ説明図; 第
2図、第3図;第4図および第5図は本発明の好ましい
実施例における複数光源の変調を経時的に示ず説明図;
 第6図は、二重レーザ・フローサイ1〜メータの2個
のレー11を常時オンにした場合に得られる蛍光データ
のグラフ; 第7図は、二重レーザ・フローサイ1〜メ
ータの一方のレーザを常時オンとし、他方のレーザは遮
断した場合に得られる蛍光データのグラフ; および輌
8図は、二重レーザ・フローサイ1〜メータの一方のレ
ーザを常時オンとし、他方のレーク゛をオン−オフ変調
した場合に得られる蛍光データのグラフである。 10.12・・・光源、18.50・・・光ビーム、2
0.22・・・生物学的粒子、23・・・蛍光、24゜
26・・・蛍光検出器、30・・・データ蓄積システム
、32.34・・・光散乱検出器、36・・・散乱光、
37.38・・・ゲート信号発生器、40.42・・・
ゲーテッド信号処理装置、44.46・・・光変調器、
48・・・遅延装置。 特許出願人 アメリカ合衆国 代理人 尾股行雄 手続ネ甫正書(方式)− 昭和60年5月7日 特許庁長官 志賀 学 殿 2、発明の名称 フローリイ1へメータにおけるバックグラウンド干渉の
消去装置 3、補正をづる占 事イ41との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国、コロンビア特別区20585゜
ワシン1〜ン(無番地) 名称 アメリカ合衆国 4、代理人〒104 住所 東京都中央区銀座8丁目12番15号5、拒絶理
由通知の日付 昭和60年4月30日(発送日) 6、補正の対象

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、生物学的粒子の特定成分に結合した種々の蛍光染料
    を励起させるために第1および第2の集束光ビームを各
    々形成する第1および第2の光源、蛍光データを作るた
    めの蛍光検出器、および該蛍光データを蓄積するデータ
    蓄積システムを備えたフローザイトメータにあける光源
    からの光をオン−オフ変調してバックグラウンド干渉を
    消去するための装置であって、 a、生物学的粒子により散乱された光を検出するための
    第1および第2の光散乱検出器;b、前記第1の光散乱
    検出器に応答して第1のグー1〜信号を発生する第1の
    グーミル信号発生器、および前記第2の光散乱検出器に
    応答して第2のグー1〜信号を発生ずる第2のゲート信
    号発生器; C9前記第1のゲート信号を受信しかつ蛍光データを前
    記データ蓄積システムへ伝送するために、前記第1のゲ
    ート信号、蛍光検出器およびデ−タ蓄積システムに接続
    された第1のゲーテッド信号処理装置、および前記第2
    のゲート信号を受信しかつ蛍光データを前記データ蓄積
    システムへ伝送覆るために、前記第2のゲート信号、蛍
    光検出器およびデータ蓄積システムに接続された第2の
    ゲーテッド信尚処理装置; d、前記グー)・イ凡号発生器の1つによってi、生じ
    たグー1〜信号を遅延させるために、前記ゲート信号を
    受信しかつ該グー1〜信号に応答して遅延グー1〜信号
    をつくる遅延装置;および e、前記遅延ゲート信号を受信しかつ該遅延グー1〜信
    号に応答して光源からの光をオン−オフ変調するために
    前記遅延装置に接続された、光源の1つと協動する光変
    調装置からなり、これによって一方の光源からの干渉バ
    ックグラウンドをなくし、他方の光源は生物学的粒子を
    励起し、発生ずる蛍光を検出するようにしたことを特徴
    とするフロー−ライ1〜メーりにおけるバックグラウン
    ド干渉の消去装置。 2、検出可能な強さの光を十分に散乱できない程に小さ
    い生物学的粒子の特定成分に結合した種々の蛍光染料を
    励起させるために第1および第2の集束光ビームを各々
    形成する第1および第2の光源、蛍光データを作るため
    の第1および第2の蛍光検出器、および該蛍光データを
    蓄積するデータ蓄積システムを備えたフローリイトメー
    タにあける光源からの光をオン−オフ変調してバックグ
    ラウンド干渉を消去り−るための装置であって、 a、前記第1の蛍光検出器に応答して第1のグー1へ信
    号を発生する第1のゲート信号発生器、および前記第2
    の蛍光検出器に応答して第2のグー1〜信号を発生する
    第2のグー1〜信号発生器: b、前記第1のグー1〜信号を受信しかつ蛍光データを
    前記データ蓄積システムへ伝送するために、前記第1の
    グー1〜信号、第1の蛍光検出器およびデータ蓄積シス
    テムに接続された第1のゲーテッド信号処理装置、およ
    び前記第2のグー1〜信号を受信しかつ蛍光データを前
    記データ蓄積システムへ伝送するために、前記第2のグ
    ー1〜信号、第2の蛍光検出器およびデータ蓄積システ
    ムに接続された第2のゲーテッド信号処理装置; C0前記ゲート信号発生器の1つによって発生したゲー
    ト信号を遅延させるために、前記ゲート信号を受信しか
    つ該グー1〜信号に応答して遅延ゲート信号をつくる遅
    延装置;および d、前記遅延グー1〜信号を受信しかつ該遅延ゲート信
    号に応答して光源からの光をオン−オフ変調するために
    前記遅延装置に接続された、光源の1つと協働する光変
    調装置からなり、これによっていずれの光源からの干渉
    バックグラ1ランドをもなくし、もう1つの光源は生物
    学的粒子を励起し、発生ずる蛍光を検出するようにした
    ことを特徴と覆るフローサイ1〜メータにおけるバック
    グラウンド干渉の消去装置。
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