CN1787739B - 精子处理系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及精液或精子的处理系统，该系统可维持或增强精子在收集、处理、储存、运输、分离或授精等各个过程中的生物学、化学、物理、生理或功能特性。

Description

精子处理系统 
技术领域
本发明涉及精液或精子(sperm cell)的处理系统，该系统可维持或增强精子在收集、处理、储存、运输、分离或授精等各个过程中的生物学、化学、物理、生理或功能特性。 
背景技术
随着精子分离方法的发展，精子被安全可靠地将分离为富含X染色体和富含Y染色体的群体，由此导致在许多种家畜中实现了有效的性别预选。如本文及多项专利申请所公开，可以将含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分离开来，所述专利申请有例如国际专利申请PCT/US99/17165、PCT/US98/27909、PCT/US01/45237、PCT/01/18879、PCT/US01/15150和PCT/US01/02304，以及美国专利申请09/582,809和09/015,454，在此以参考的方式将其引入本文。这些将含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分离开来的实例并不意味着将本精子处理系统发明限制于使用流式细胞分选装置或流式分选方法的精子处理技术，而是意在以之作为用以理解本发明的背景，来说明使精子彼此分离的各种方法，以及说明收集、处理、分离、运输、使用或储存精子的方式。 
对于基于精子的某一特定性质而分离成亚群的精子，其显著问题是运动力降低、存活力降低或生育力下降。此问题的一个方面是，在将精子分离成亚群之前处理及运输精液的传统方法通常是在约5℃下实施，或是在精子的膜脂已从液相转化成凝胶态的温度下实施。精子的膜脂从液相转化成凝胶态可以改变精子的化学、物理、生理或功能性质，导致精子生育力下降，或使精子死亡。此问题的另一个方面是，精子的膜脂从液相转化成凝胶态的温度可因作为精液来源的哺乳动物的不同而不同。这样，对于特定的哺乳动物来说，为了防止精子的膜脂从液相转化成凝 胶态而维持的温度必须在进行后续的收集、处理、运输及分离过程前确定下来。此问题的另一个方面是，传统上认为，为了在后续的处理、运输或分离过程中保持精子的存活力和生育力，应该降低所收集的精液的温度，这与本发明中所收集精液的孵育或维持温度相背离，在本发明中所述温度大大高于已有常规应用的温度。 
将精子分离成亚群的常规方法所具有的另一显著问题是，精子所暴露的染色剂浓度可能对于取自特定哺乳动物的精子来说太高了。例如，马精子暴露于Hoechst 33342染色剂的浓度为染色牛精子的常规所用浓度时，其可能表现出生育力基本丧失。 
将精子分离成亚群的常规方法所具有的另一显著问题是，精子在诸如Hoechst 33342等染色剂中孵育的时间对于特定哺乳动物来说太长了。例如，在Hoechst 33342中孵育1小时的马精子可能表现出运动力或生育力基本丧失。 
常规处理精液方法的另一显著问题是，用某些组合物来稀释(extension)精液，在这些组合物中，精子表现出运动力或生育力基本丧失。 
尽管已经改善了各种各样的精子分离装置及方法，但是对于在收集、处理、运输、分离、使用或储存过程中保持精子存活力来说仍存在显著问题。 
发明内容
因此，本发明的主要目的是提供用于收集、处理、运输、储存或分离精液或精子的装置或方法以保持精子存活力。 
本发明的另一主要目的是提供收集、处理、运输、储存或分离精液或精子的装置或方法以保持或增强精子存活力，所述精液或精子取自各种哺乳动物，包括但不限于马科动物、牛科动物、猫科动物、ovids、犬科动物、水牛、牛、麋鹿或猪；或取自哺乳动物的珍贵、濒临灭绝或稀有个体；或取自动物学标本。 
本发明的另一重要目的是提供处理和运输取自马科哺乳动物的精子 的装置或方法。 
本发明的另一重要目的是提供分离精子的装置或方法，该装置或方法可在整个流式分选过程中使哺乳动物的精子保持更高的存活力。 
本发明的另一重要目的是提供使精子保持更高存活力的装置或方法，这些精子用于如上所述不同种哺乳动物的人工授精，甚或用于与这些人工授精方法中常用或典型使用的精子数量相比精子数降低或减少的人工授精，而无论在这些方法中精子是否分离成富含X染色体或富含Y染色体的精子。 
本发明的另一重要目的是提供包括以下步骤的方法，所述步骤为在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育精液。 
本发明的另一重要目的是提供在流式分选精子前运输公马精子的装置或方法。 
本发明包括以下技术方案： 
1、一种分离精子的方法，该方法包括： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取精液，该精液含有大量精子； 
b.在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液； 
c.测定所述大量精子的精子性质； 
d.基于所述精子性质分离所述精子；及 
e.收集分离的精子。 
2、上述1所述的分离精子的方法，其中在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括以下步骤：将所述精液在不高于精子膜脂转化成凝胶态的温度孵育。 
3、上述1所述的分离精子的方法，其中在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括以下步骤：在使所述精子膜脂维持于所述液相的温度孵育所述精液。 
4、上述1所述的分离精子的方法，其中在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，在约5℃至约25℃之间的温度孵育所述精液。 
5、上述1所述的分离精子的方法，其中所述温度选自约5℃、约6℃、 约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃。 
6、上述1所述的分离精子的方法，其中所述哺乳动物选自牛、马、羊、猪、犬、猫、鹿、麋鹿或海洋动物。 
7、上述1所述的分离精子的方法，其中所述哺乳动物包括牛，并且其中在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液于约17℃至约19℃之间的温度孵育。 
8、上述1所述的分离精子的方法，其中所述哺乳动物包括牛，并且其中所述在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液于约17℃的温度孵育。 
9、上述1所述的分离精子的方法，其中所述哺乳动物包括马，并且其中所述在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液于约15℃的温度孵育。 
10、上述1所述的分离精子的方法，其中在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液在所述不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育约1小时至约18小时。 
11、上述1所述的分离精子的方法，所述方法还包括以下步骤：在进行所述在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤过程中，将所述精液从初始地点运输到第二地点。 
12、上述1所述的分离精子的方法，所述方法还包括以下步骤：在所述在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤之前，向所述精液加入抗菌药。 
13、上述1所述的分离精子的方法，其中所述测定所述精液中的大量精子的精子性质的步骤包括，测定所述精子的性别特征。 
14、上述1所述的分离精子的方法，其中所述基于所述精子性质分离所述精子的步骤包括，基于所述性别特征分离所述精子。 
15、上述1所述的分离精子的方法，该方法还包括以下步骤：用选自KMT或INRA96的稀释剂稀释精液。 
16、上述1所述的分离精子的方法，该方法还包括以下步骤：通过除去一部分精液浆而浓缩所述精子。 
17、上述1所述的分离精子的方法，该方法还包括对所述精子进行染色的步骤。 
18、上述17所述的分离精子的方法，其中所述对所述精子进行染色的步骤包括，对所述精子内含有的DNA进行染色。 
19、上述18所述的分离精子的方法，其中所述对所述精子内含有的DNA进行染色的步骤包括，用Hoechst 33342染色剂对所述精子内的DNA进行染色。 
20、上述19所述的分离精子的方法，其中所述用Hoechst 33342染色剂对所述精子内的所述DNA进行染色的步骤包括，将所述精子与Hoechst 33342一起孵育约30分钟至约1小时。 
21、上述1所述的分离精子的方法，其中所述基于所述精子性质分离所述精子的步骤包括，用选自流式细胞计数仪或细胞分选仪的仪器分离所述精子。 
22、一种人工授精样品，该人工授精样品包括： 
a.人工授精装置； 
b.精子稀释剂；及 
c.含有大量精子的精液，其来自于哺乳动物中的雄性动物，在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液1小时至18小时，其中基于性别特征分离所述的大量精子，并且其中一部分所述分离后精子被置于所述精子稀释剂中，以及其中这部分置于所述精子稀释剂中的所述分离后精子容纳于所述人工授精装置中。 
23、上述22所述的人工授精样品，其中所述精子稀释剂包含蛋黄稀释剂。 
24、上述22所述的人工授精样品，其中所述精子稀释剂包含蛋黄-TRIS稀释剂。 
25、上述22所述的人工授精样品，其中所述精子稀释剂包含基本等体积的所述蛋黄-TRIS稀释剂和蛋黄-TRIS稀释剂/12％甘油。 
26、上述23-25所述的人工授精样品，其中所述精子稀释剂的体积为约0.1毫升至约2.0毫升。 
27、上述22所述的人工授精样品，其中所述人工授精装置包括人工授精管。 
28、上述22所述的人工授精样品，其中所述置于所述精子稀释剂中的这部分所述分离后精子包含1×105个分离后精子至约25×106个分离后精子。 
29、上述28所述的人工授精样品，其中容纳于所述人工授精装置中的、置于所述精子稀释剂中的这部分所述分离精子是冷冻的。 
30、上述29所述的人工授精样品，其中容纳于所述人工授精装置中的、冷冻于所述精子稀释剂中的这部分所述分离后精子是解冻的。 
31、一种生产人工授精样品的方法，该方法包括下列步骤： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取精液，该精液含有大量精子； 
b.在不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液； 
c.测定所述大量精子的性别特征； 
d.基于所述性别特征分离所述大量精子；及 
e.建立包含分离后精子的人工授精样品，所述分离后精子具有使所述哺乳动物中的雌性动物体内的至少一个卵细胞受精的能力。 
32、给哺乳动物授精的方法，该方法包括下列步骤： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取精液，该精液含有大量精子； 
b.将所述精液在不高于精子膜脂转化成凝胶态的温度孵育； 
c.测定所述大量精子的性别特征； 
d.基于所述性别特征分离所述大量精子； 
e.建立包含分离后精子的人工授精样品，所述分离后精子具有使所述哺乳动物的雌性动物体内的至少一个卵细胞受精的能力； 
f.将所述人工授精样品的一部分导入所述哺乳动物的雌性动物体内；及 
g.在所述哺乳动物的所述雌性动物体内使至少一个卵细胞受精。 
33、一种产生哺乳动物后代的方法，该方法包括下列步骤： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取精液，该精液含有大量精子； 
b.将所述精液在不高于精子膜脂转化成凝胶态的温度孵育； 
c.测定所述大量精子的性别特征； 
d.基于所述性别特征分离所述大量精子； 
e.建立包含分离后精子的人工授精样品，所述分离后精子具有使所述哺乳动物的雌性动物体内的至少一个卵细胞受精的能力； 
f.将所述人工授精样品的一部分导入所述哺乳动物的雌性动物体内； 
g.在所述哺乳动物的所述雌性动物体内使至少一个卵细胞受精；及 
h.产生哺乳动物后代。 
附图说明
图1提供的图表显示，随染色剂浓度升高，精子的总运动力及前进运动力下降，死亡精子百分比(死亡％)增多，流式细胞计数技术将含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分辨开来的能力上升。 
图2提供的图表显示，与新鲜精子样品和于室温储存一段时间如于室温储存18小时的精子样品相比，在KMT中稀释的精子保持更强的运动力。 
图3提供的图表显示，在更高pH下染色精子可以降低染色后精子样品中精子的死亡百分比，并增加了用流式细胞计数分析法评价时的分辨率。 
图4提供的图表显示，将染色孵育时间从传统的60分钟减少到约30分钟的孵育时间可以提高染色后精子样品中精子的运动力，降低精子的死亡百分比，并在流式分选染色精子时提高将含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分离开来的分辨率。 
图5提供的图表显示，加入诸如咖啡因等刺激剂可以提高精子的运动力。 
图6提供的图表显示使用NaH2PO4所制备的改良KMT时精子的总运动力和前进运动力。 
图7提供的图表显示，无论精子是否暴露于诸如咖啡因之类的刺激 剂，使用NaH2PO4所制备的改良KMT可以提高精子的总运动力和前进运动力。 
图8提供的图表显示，在储存、处理、转移或运输时，可对取自哺乳动物中雄性动物的精子的温度加以调节，以提高总运动力和前进运动力。 
图9提供的图表显示，在进行染色步骤前的转移、储存或处理时，可对精子的温度加以调节，以提高精子、经刺激的精子或用咖啡因刺激的精子的总运动力和前进运动力。 
图10提供的图表显示，在进行染色步骤前的转移、储存或处理时，可对精子的温度加以调节，以提高染色步骤后的精子、经刺激的精子或用咖啡因刺激的精子的总运动力和前进运动力。 
图11提供的图表显示，可通过于15℃储存或运输精子，以使染色后精子样品中的精子死亡百分比下降。 
图12提供的图表显示，当精子染色时的浓度约为100M/mL时，与浓度为200M/mL相比，能保持更多存活的精子而不会降低流式细胞计数的分辨率。 
图13提供的图表显示，随着染色剂浓度的升高，存活的精子较少而分辨率提高。 
图14提供的图表显示，可以大大缩短染色时间，而不会降低用流式细胞计数法进行评价时的含有X染色体的精子类群与含有Y染色体的精子类群间的分辨率。 
具体实施方式
本发明涉及精液或精子的处理系统，该系统可维持或增强精子在采集、处理、储存、运输、分离或授精等各个过程中的生物学、化学、物理、生理或功能特性。 
实施例1 
从三匹具有合格生育力的公马收集精液，在基于台氏液(Tyrode’s based)的脱脂乳-葡萄糖稀释剂中稀释到约25×106个精子/mL，并在约5℃或约15℃下储存18小时。储存后，将精液离心以除去精液浆而将精子浓缩，用Hoechst 33342(Hoechst)染色，采用SX 
Figure G200380017484701D00091
精子分选仪根据DNA含量将其分选成含有X染色体的类群和含有Y染色体的类群。 
在所有授精过程中使用在体积为300μl中含有约20×106个流式分选后的精子的最终剂量。使年龄为2～12岁的35匹母马的发情期同步。当母马的优势卵泡直径不小于35mm时施用人绒毛膜促性腺激素(hCG，3000IU，iv(静脉注射)； 
Figure G200380017484701D00092
Intervet，Millsboro，DE，US)，并在施用hCG后约30小时进行授精。授精时，将母马分配到以下3个处理组之中的一个：1)精子被储存于15℃，使用内镜录像技术进行授精；2)精子被储存于5℃，也使用内镜录像技术授精；3)精子被储存于5℃，使用直肠引导技术授精。 
在即将授精前给母马注射安定剂布托啡诺(4mg，iv； Ft.Dodge Co.，Fort Dodge，IA，US)和地托咪定(6mg，iv； Pfizer，Lees summit，MO，US)。每日评价母马的排卵情况，结果中只计入授精后48小时内排卵的母马。排卵后12至14天内超声波扫描测定妊娠。于排卵后第16天给母马施用前列腺素F2α，并在随后两个周期内使用。 
如表1所示，用储存于15℃的分选的精子进行子宫镜授精的母马其妊娠率约为72％，精子储存于5℃则妊娠率约为55％。当用储存、分选的精子授精时，与子宫镜授精(55％)相比，采用直肠引导技术授精时(38％)，妊娠的母马更少(P＝0.12)。 
表1.储存于5℃或15℃的流式分选精子进行子宫镜授精或直肠引导授精后的妊娠率 
a，b同一栏内具有不同上标的值具有显著性差异(P＜0.05)。 
与分选前储存于5℃相比，用分选前储存于15℃的分选精子授精后有更多的母马受孕。与分选前于5℃储存18小时相比，分选前于15℃储存18小时的所有公马精子的生育力也与上述结果一致。 
采用以标准方法(5℃，12至72小时)运输的1×109个公马精子授精后，预期的妊娠率为65％。本研究中所获得的妊娠率(72％)是很高的，与采用储存18小时、用常规技术流式分选的精子所获得的妊娠率(35％)相比，它具有巨大进步。本研究中的生育力的提高可反映出进行流式细胞计数前的精子处理的作用。若不是在实施本发明的两天中所有被授精母马的妊娠率非常低，本研究中的妊娠率甚至会更高。 
子宫镜授精所得的妊娠率比子宫深部授精的妊娠率高。这与Rigby等所报道的结果相反，他们采用经过运输的精子进行内镜录像授精与直肠引导授精，得到了相近的妊娠率。但是，他们的结果确实表明子宫镜授精具有12％的优势。与他们的研究相反，本试验使用流式分选的精子，众所周知这样的精子处于获能前的状态。总之，用储存18小时的流式分选精子进行子宫镜授精获得了极好的妊娠率。 
对于全部三只公马，与保持在5℃相比，当精子保持在15℃时，获得更高的妊娠率。用储存于15℃的精子进行子宫镜授精比用储存于5℃的精子进行直肠引导授精获得了更高的妊娠率。 
同样，本精子处理系统发明可包括：从哺乳动物中的雄性动物获取精子；在给哺乳动物的雌性动物进行人工授精前，将所述取自哺乳动物中雄性动物的精子维持于选自5℃至25℃的温度，从而使该哺乳动物中的雌性动物获得更高的妊娠率。对于马科动物尤其是所公开的马科动物来说，根据本发明，为了提高妊娠率，获自雄性马科动物的精子的温度可维持于约10℃和约20℃之间，具体的说是约为15℃。参见下面涉及马科动物的应用的实施例。另外参见下面的实施例8，其显示了本发明的应用，其中取自雄性麋鹿的精子在给雌性麋鹿授精前保持于约20℃。 
本精子处理系统发明还可包括，将取自哺乳动物的雄性动物的精子 维持在本发明的温度来进行运输。此类运输可具有短于一个小时的有限持续时间，或具有约1小时至约72小时之间的更长的持续时间，或如上所述可持续约18小时。 
本发明还可包括将如上所述取自哺乳动物中雄性动物的精子染色的步骤，所述精子已被维持于使此类哺乳动物的雌性动物产生最高妊娠率的温度。 
本发明还可包括哺乳动物的雌性动物的子宫镜人工授精或直肠引导的人工授精。具体地说，正如本文所引用的文献所述，在马科哺乳动物的子宫镜人工授精中，采用经过性别预选而分选的精子，这种精子可依据本发明进行处理，并且与通常用于给特定哺乳动物的雌性动物授精的精子数量相比，还可包括更低数量的精子，所述哺乳动物包括但不限于马科动物。 
实施例2 
分别在如表2所列四种经过运输的稀释剂中将来自8匹公马的精液稀释到约25×106个精子/mL。在模拟运输18小时的过程中，样品维持于环境温度(20℃～24℃)，而稀释于INRA96的精子则储存于15℃。储存之后，将样品于600×g离心10分钟，并将沉淀稀释到400×106个精子/mL。19℃～24℃孵育1小时后稀释到200×106个精子/mL，精子用224μM的Hoechst 33342于34℃染色1小时，然后用KMT稀释到100×106个精子/mL。为了模拟分选条件，将精子用不含BSA的HBGM-3稀释到700,000个精子/mL，并且在环境温度下静置1.5小时，然后于850×g离心20分钟。如表2所示，评价四种化学环境中的运动力。 
表2.储存于四种不同运输介质中的样品中能动的精子的百分比 
Figure G200380017484701D00111
a，b同一栏内无共同上标的值具有差异(P＜0.05)，Tukey检验。 
从表2所列数据可看出，KMT和INRA96在特定的精子处理过程中保持了更高的运动力。 
本精子处理系统发明还可包括将取自哺乳动物的雄性动物的精子在KMT中稀释的步骤，尤其是对于取自马科哺乳动物中雄性动物的精子来说，KMT可以显著增强精子的运动力。 
本精子处理系统发明还可包括将取自哺乳动物的雄性动物的精子在INRA96中稀释的步骤，尤其是对于取自马科哺乳动物雄性动物的精子来说，INRA96可以显著增强精子的运动力。 
实施例3 
将8匹公马射出的精液用KMT稀释到25×106个精子/mL，将其分成40ml的等分，于5℃、10℃、15℃、20℃和25℃放置18小时。然后将样品按实施例2中的方法进行类似处理。评价有及没有2mM咖啡因作为刺激剂时的运动力。利用碘化丙啶染色进行死亡百分比的流式细胞计数评价。 
表3.在不同温度(℃)下18小时后能动精子的百分比(无刺激/有刺激) 
Figure G200380017484701D00122
a，b，c同一栏内无共同上标的值具有差异(P＜0.05) 
如表3所示，就5℃、10℃或15℃的储存或运输温度来说，使用KMT可以缩小运动力的差异。 
同样，本精子处理系统发明还可包括将取自哺乳动物中雄性动物的精子在所述浓度的KMT中稀释或保存的步骤，该步骤在用Hoechst染色剂对这些精子染色之前及对这些精子进行流式分选之前进行。 
实施例4 
首先评价3匹公马射出的精液中的精子的体积、浓度和运动力。精液的余下部分用具有浓度为0％额外的精液浆或10％精液浆的KMT或EZMixin稀释到下列精子/染色剂浓度：50×106个精子/mL、2.6μl Hoechst；50×106个精子/mL、3.9μl Hoechst；150×106个精子/mL、7.8μl Hoechst；或450×106个精子/mL、23.4μl Hoechst，然后立即处理或于室温储存18小时后进行处理。然后对染色的精子样品用流式细胞计数分析评价分辨率和死亡百分比，进一步取20μl各染色精子样品用140μl的EZ Mixin或KMT稀释。 
现主要参考图1，可以看出，随着染色剂浓度的升高，精子尤其是马精子的总运动力和前进运动力下降、精子的死亡百分比升高、流式细胞计数技术将含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分开来的分辨率升高。 
本精子处理系统发明可包含一定范围的染色剂浓度，与取自特定种的精子的常规技术中所用染色剂浓度范围或其他已公开的染色剂浓度范围相比，这些浓度使染色精子的总运动力或前进运动力增强、使流式分选中含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分开来的分辨率增强或使死亡精子百分比下降。尤其是对于本发明在马科动物方面的应用来说，所述浓度范围可介于约50×106个精子/mL、2.6μl Hoechst和50×106个精子/mL、3.9μl Hoechst之间，该浓度范围可使染色精子的总运动力或前进运动力增强、使流式分选中含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分开来的分辨率增强或使死亡精子百分比下降。染色剂浓度可介 于150×106个精子/mL、7.8μl Hoechst和约450×106个精子/mL、23.4μl Hoechst之间，尽管此时结果稍差。 
现主要参考图2，可以看出，对于新鲜精子样品和于室温储存了一段时间(如于室温储存18小时)的精子样品来说，稀释于KMT中的精子保持了更好的运动力。 
本发明还可包括使用KMT作为稀释剂以增强以下类型的精子的总运动力或前进运动力：新鲜精子；储存了一段时间如18小时或更久的精子；或是从初始地点转移或运输到第二地点或更多地点的精子，所述的初始地点为例如从雄性哺乳动物获得精子的地点，所述第二地点或更多地点为对从雄性哺乳动物处所获得精子进行进一步处理的地点，所述处理为如精子计数、分离含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子，或制备含有精子的产品，该制备过程包括但不限于制造用于人工授精的精子(不论是否经过分选)管；或转移或运输到第二或更多地点，在所述第二或更多地点给哺乳动物的雌性动物进行授精、卵细胞体外授精等。 
实施例5 
首先评价3匹公马射出的精液中的精子的体积、浓度和运动力。各自精液的余下部分用KMT稀释到25×106精子/mL，然后于室温储存18小时。将储存的精液于600g离心10分钟使之成为沉淀。将沉淀中的精子重悬于含有Hoechst的KMT中以生成400×106个精子/mL、12.4μlHoechst的精子样品，调节到pH 7.1或pH 7.9，然后于34℃孵育30分钟或60分钟。将染色的精子样品用以下稀释剂稀释：含1.5μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT；含2.0μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT；含2.5μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT或含3.0μl/mL 2％红色食用色素的1mL KMT。然后用流式细胞计数分析法评价死亡百分率和分辨率，将处理后的样品进一步在以下稀释剂中稀释以评价运动力：140μl KMT∶20μl精子；140μl KMT+2mM咖啡因∶20μl精子；或140μl KMT+2.5mM丙酮酸钠∶20μl精子。 
表4.公马的影响 
  Gunsmoke   Rowdy   Sylekt
  死亡百分比(％)   15.5   16   17.13
  分辨率   5.81   4.5   5.88
  Gunsmoke   Rowdy   Sylekt
  运动力0小时   55   68.44   59.69
  前进运动力0小时   43.13   68.44   56.25
  运动力3小时-无   63.13   65.94   67.19
  运动力3小时-咖啡因   66.25   67.5   69.38
  运动力3小时-丙酮酸盐   62.19   67.19   65.94
  前进运动力3小时-无   55.94   65.94   63.75
  前进运动力3小时-咖啡因   63.13   67.5   69.06
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   56.56   67.19   63.13
表5.染色剂pH的影响 
  7.1   7.9
  死亡百分比(％)   17.25   15.17
  分辨率   5.58   5.21
  7.1   7.9
  运动力0小时   62.08   60
  前进运动力0小时   55.83   56.04
  运动力3小时-无   66.25   64.58
  运动力3小时-咖啡因   68.54   66.88
  运动力3小时-丙酮酸盐   65.83   64.38
  前进运动力3小时-无   62.29   61.46
  前进运动力3小时-咖啡因   67.5   65.63
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   63.13   61.46
表6.食物着色的影响 
  1.5   2   2.5  3
  死亡百分比(％)   16   16.33   16.17   16.33
  分辨率   5.33   5.25   5.5   5.5
  1.5   2   2.5   3
  运动力0小时   60.42   62.08   62.5   59.17
  前进运动力0小时   55.83   56.67   57.08   54.17
  运动力3小时-无   64.58   65.42   66.25   65.42
  运动力3小时-咖啡因   66.67   68.33   68.75   67.08
  运动力3小时-丙酮酸盐   64.58   65   65.83   65
  前进运动力3小时-无   61.67   61.67   62.92   61.25
  前进运动力3小时-咖啡因   65.42   67.5   67.92   65.42
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   62.08   60.83   64.58   61.67
表7.染色时间的影响(只有12个样品) 
  30分钟   60分钟
  死亡百分比(％)   14.83   16.17
  分辨率   4.92   5.5
  30分钟   60分钟
  运动力0小时   66.25   62.5
  前进运动力0小时   62.08   57.08
  运动力3小时-无   65.83   66.25
  运动力3小时-咖啡因   66.67   68.75
  运动力3小时-丙酮酸盐   64.58   65.83
  前进运动力3小时-无   62.08   62.92
  前进运动力3小时-咖啡因   65   67.92
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   60.42   64.58
表8.pH和染色时间 
  7.1   7.9
  30分钟   60分钟   30分钟   60分钟
  死亡百分比(％)   15.67   17   14   15.33
  分辨率   4.83   5.83   5   5.17
  7.1   7.9
  30分钟   60分钟   30分钟   60分钟
  运动力0小时   65.83   62.5   66.67   62.5
  前进运动力0小时   61.67   55.83   62.5   58.33
  运动力3小时-无   65.83   68.33   65.83   64.17
  运动力3小时-咖啡因   66.67   70   66.67   67.5
  运动力3小时-丙酮酸盐   64.17   67.5   65   64.17
  前进运动力3小时-无   63.33   64.17   60.83   61.67
  前进运动力3小时-咖啡因   65   70   65   65.83
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   60.83   66.67   60   62.5
表9.运动力刺激剂 
  无   咖啡因   丙酮酸盐
 运动力3小时   65.42   67.71   65.1
 前进运动力3小时   61.88   66.56   62.29
现主要参考图3，可以获知，用流式细胞计数分析法进行评价，在更高的pH下对精子染色可以减少的死亡精子百分比。 
现主要参考图4，可以获知，将染色精子的孵育时间从常规的60分钟降到30分钟可以降低死亡精子的百分比，并可提高流式细胞计数时将含有X染色体的精子与含有Y染色体的精子分开来的分辨率。 
现主要参考图5，可以获知，加入刺激剂如浓度约为2mM的咖啡因可以刺激精子的运动力，尤其是在刺激应激的马科动物精子时特别有效。 
同样，本发明还可包括调节溶液的pH的步骤，在所述溶液中用荧光染料对取自哺乳动物的雄性动物的精子进行染色，所述荧光染料例如Hoechst。染色溶液的pH可升至介于约pH 7.2和约pH 8.0之间，以选择特定精子样品所需的pH，或在特定类型的染色精子样品中使死亡百分比减少或最小的pH。具体地说，对于取自公马的精子来说，染色溶液的 pH可以升至介于约pH 7.5至约pH 8.0之间，具体地说可以为pH 7.9，以减少染色的马科动物精子样品中精子的死亡百分比。 
本发明还可包括缩短精子在染色溶液中孵育的时间的步骤，以减少染色精子样品中的死亡百分比，或提高运动力，或在流式分选或其他基于DNA含量的分离时提高将含有X染色体的染色精子与含有Y染色体的染色精子分开来的分辨率。根据本发明不同的应用，精子在染色溶液中暴露、孵育或悬浮的时间可以明显缩短。所述时间可比通常所用时间缩短10％、20％、30％、40％、50％，或更多；或可缩短到使精子因荧光染料染色所致的死亡数量减少而在流式分选时分辨率未有明显下降；或可缩短到流式分选时分辨率提高而染色样品中的死亡精子百分比无明显上升。例如，马科动物精子样品在Hoechst(如上所述)染色溶液中孵育的时间可以介于约25分钟与约50分钟，具体的说可以是30分钟，以获得更好的流式分选分辨率或减少死亡精子百分比。可以确定时间的实际缩短量，以在最接近的染色时间内使精子群中的运动力、死亡精子百分比和流式分选的分辨率之间保持所需的平衡。 
本发明还可包括在精子样品中加入刺激剂的步骤。刺激剂可以是咖啡因，或是与咖啡咽类似的刺激剂，或是提高精子运动力或其他精子功能或性质的刺激剂，无论这些功能或性质是物理性的还是生理学的。刺激剂可以在精子暴露于处理步骤之前或之后加入，所述处理步骤如储存、运输、稀释、流式分选、授精等等。具体地说，可以使用浓度介于约1mM至约5mM之间的咖啡因，具体地，就马科动物精子来说可使用浓度为2mM的咖啡因。 
实施例6 
首先评价10匹公马射出的精液的体积、精子浓度和运动力。将各自精液的余下部分在用Na2H2PO4KMT制备的KMT或用Na2H2PO4制备的KMT(改良的KMT)中稀释到25×106个精子/mL，并于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃储存18小时。将处理后精子的100μl等分液用100μl KMT或100μlKMT+4mM咖啡因稀释，然后测定精子的运动力。各样品中处理后精子的余 下部分于600g离心10分钟。吸出上清液，至约0.75mL，然后将沉淀的精子重悬于该体积中。离心后取20μl各样品并用520μl KMT或520μlKMT+2mM咖啡因稀释，然后评价处理后精子的运动力。 
将各处理组的200×106个精子/mL，12.4μl Hoechst等分液调节到pH 7.1，于34℃孵育60分钟。染色的精子样品用含1.5μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT稀释。然后通过在175μl染色精子(100×106个精子/mL)中加入3ml KMT或3ml改良的KMT及22ml 5mM HBGM-3制备高度稀释的样品。 
然后用流式细胞计数分析法测定处理后精子样品的死亡百分比和分辨率，进一步将处理样品稀释于140μl KMT∶20μl精子；或140μl KMT+2mM咖啡因∶20μl精子中测定运动力。 
表10.公马的影响 
 运输后 (Pship)  离心后 (Pcent)   染色后  (Pstain)   高度稀释  (Hdil)   死亡百分比  (％dead)   分辨率  (resolution)
  A  63.3  52.5   44.5   47.5   22.8   5.7
  B  54.5  50.8   32.3   31.8   41.1   8.2
  C  68.8  62.8   55.6   44.1   21.4   6.2
  D  64.7  58.4   46.6   48.4   26.1   7.3
  E  65.3  57.8   48.8   45.5   21.6   5.2
  G  58.8  58   36.8   37   30.7   7
  H  58  51.5   48.5   46.5   25.2   8
  I  58  50   41.8   41.8   17.9   6.8
表11稀释剂的影响 
  运输后   离心后   染色后   高度稀释   死亡百分比   分辨率
 KMT   60.7   52.8   42.8   40.9   26.6   6.8
 改良的KMT   61.6   57.1   45.2   44.4   25.5   6.8
表12.运输温度的影响 
  运输后   离心后   染色后   高度稀释   死亡百分比   分辨率
  5   62.5   56.1   48.8   45   27.9   6.9
  10   62   58   47.5   44.7   26.4   6.8
  15   64.7   56.3   44.5   44.8   23.1   6.7
  20   59.2   53.6   42.2   41.4   23.3   6.6
  25   55.8   49.4   34.6   35.4   31.4   7.2
表13.运输后的运动力 
  总运动力  (Total)   前进运动力  (Prog.)   刺激剂  (Stim.)   T  Stim.Prog
  5   62.5   59.2   62.5   61.4
  10   62   58.9   63.3   61.9
  15   64.7   62.7   64.2   62.7
  20   59.2   59.1   62.3   61.1
  25   55.8   55   59   57.9
表14.离心后的运动力 
  总运动力   前进运动力   刺激剂   T      Stim.Prog
  5   56.1   55.6   56.3   55.2
  10   58   56.3   56.4   54.4
  15   56.3   56.1   53.6   52.2
  20   53.6   52.8   56.4   55.6
  25   49.4   48.5   52.7   51.9
表15.染色后的运动力 
  总运动力   前进运动力   Stim.，T   Stim.，   前进运动力
  5   48.8   48.6   49.1   49.1
  10   47.5   47.2   52   51.9
  15   44.5   44.5   51.4   51.3
  20   42.2   42.2   48.1   47.5
  25   34.6   34   42.7   42.7
表16.高度稀释后的运动力 
  总运动力   前进运动力   刺激剂   刺激剂，前进运动力百分比   (T Stim.，Prog)
  5   45   45   49.5   49.5
  10   44.7   44.1   49.5   48.9
  15   44.8   44.8   51.1   51.1
  20   41.4   40.5   46.9   46.9
  25   35.4   36.9   44.4   43.3
表17.死亡百分比和分辨率 
  死亡百分比   分辨率
  5   27.9   6.9
  10   26.4   6.8
  15   23.1   6.7
  20   23.3   6.6
  25   31.4   7.2
表18.KMT和改良的KMT，运输后的运动力 
  KMT  改良的KMT
  5   62.8  62.2
  10   61.9  62.2
  15   63.4  65.9
  20   57.8  60.6
  25   56.3  55.4
表19.KMT和改良的KMT，高度稀释中的运动力 
  KMT  改良的KMT
  5   42.8  47.2
  10   44.4  45
  15   43.1  46.6
  20   40  42.8
  25   31.7  39.2
表20.KMT和改良的KMT，死亡百分比 
  KMT  改良的KMT
  5   27.5  28.4
  10   26.4  26.5
  15   23.3  23
  20   23  23.6
  25   36.8  26
现主要参考图6，精子的总运动力和前进运动力显示使用由NaH2PO4制备的改良的KMT的结果。 
现主要参考图7，可以获知，经过处理步骤(如用于流式分选的染色及稀释精子)后，使用由NaH2PO4制备的改良的KMT时，无论精子是否暴露于诸如咖啡因的刺激剂中，精子的总运动力和前进运动力可能并不提高。 
现主要参考图8，可以获知，可以调节储存、处理、转移或运输取自哺乳动物的雄性动物的精子的温度，以提高总运动力和前进运动力。 对于一些来自某些种哺乳动物的精子来说，于约15℃储存、处理、转移或运输可以保持精子或经刺激精子的总运动力或前进运动力处于最高水平。 
现参考图9，可以获知，如上所述在进行染色过程之前可以对转移、储存或处理精子的温度加以调节以提高精子、经刺激精子或用咖啡因刺激的精子的总运动力或前进运动力。就本发明的某些实施方案来说，包括那些处理马科动物精子的方案，介于约5℃至约20℃之间的储存、转移或运输温度可以提高精子的总运动力和前进运动力。另外，对于根据本发明处理的经刺激精子来说，包括那些本发明中用咖啡因刺激马科动物精子的实施方案在内，介于约5℃至约20℃之间的处理、储存、转移或运输温度也可以提高总运动力和前进运动力。具体地说，本发明用于处理经刺激马科动物精子的实施方案包括介于约10℃至约15℃之间的用于处理、储存或转移经刺激的马科动物精子的温度。 
现参考图10，可以获知，如上所述在进行染色过程之前可以对转移、储存或处理精子的温度加以调节，以提高在染色过程后精子、经刺激的精子或用咖啡因刺激的精子的总运动力或前进运动力。就本发明的某些实施方案来说，包括那些处理马科动物精子的方案，介于约5℃至约20℃之间的储存、转移或运输温度可以提高精子的总运动力和前进运动力。另外，对于根据本发明处理的经刺激精子来说，包括那些本发明中用咖啡因刺激马科动物精子的实施方案在内，介于约5℃至约20℃之间的处理、储存、转移或运输温度也可以提高总运动力和前进运动力。具体地说，本发明用于处理经刺激的马科动物精子的实施方案包括介于约10℃至约15℃之间的用于处理、储存或转移经刺激的马科动物精子的温度。 
现参考图11，可以获知，通过将精子于15℃储存或运输，可以降低在如上所述染色之后的精子死亡百分比。 
实施例7 
首先评价12匹公马射出的精液的体积、精子浓度和运动力。将各精液的余下部分于KMT中稀释到25×106个精子/mL，并于15℃储存18小时。 将处理后精子100μl等分液用100μl KMT+4mM咖啡因稀释，然后测定储存后的运动力。将各样品中处理后精子的余下部分于600g离心10分钟。吸出上清液，至约1.50mL，然后将沉淀的精子重悬于该体积中。将处理后精子稀释至400×106个精子/mL，并将各等分液转移到染色试管中以进行下列处理： 
1.200×106个精子/mL，8.68μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
2.200×106个精子/mL，10.54μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
3.200×106个精子/mL，12.44μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
4.200×106个精子/mL，8.68μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
5.200×106个精子/mL，10.54μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
6.200×106个精子/mL，12.44μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
7.100×106个精子/mL，4.34μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
8.100×106个精子/mL，5.27μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
9.100×106个精子/mL，6.22μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
10.100×106个精子/mL，4.34μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
11.100×106个精子/mL，5.27μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
12.100×106个精子/mL，6.22μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
将各染色精子用含0.75μl/mL 5％红色食用色素的KMT稀释到75×106个精子/mL。然后在234μl染色精子样品(75×106个精子/mL)中加入3ml KMT及22ml 5mM HBGM-3以制备高度稀释的样品。然后用流式细胞计数分析法评价各染色精子样品的死亡百分比和分辨率，在KMT和KMT+2mM咖啡因中测定运动力。 
然后在234μl染色精子样品(75×106个精子/mL)中加入3ml KMT及22ml 5mM HBGM-3以制备高度稀释的样品，并于室温孵育约1.5小时。然后在KMT和KMT+4mM咖啡因中测定高度稀释的精子样品的运动力。 
现主要参考图12，可以获知，当染色时精子浓度为约100M/mL时，与200M/mL相比，精子保持更好的存活力而未造成分辨率的丧失。 
本精子处理系统发明的某些实施方案还可包括将取自哺乳动物的雄性动物的精子稀释到约75M/mL至200M/mL的步骤，以使精子浓度下降、最小化，或使染色后样品中死亡百分比不会随精子稀释程度进一步增加而降低。具体地说，对于本发明的某些实施方案来说，精子的浓度可少于200M/mL，对于马科动物精子来说可以约为100M/mL，以减少经上述染色过程后用流式细胞计数法评价的死亡百分比。 
现主要参考图13，可以获知，随着染色剂浓度的升高，存活的精子更少，而分辨率升高。 
现主要参考图14，可以获知，可以大大缩短染色时间而不会造成用流式细胞计数法评价的含有X染色体的类群和含有Y染色体的类群之间分辨率下降。 
同样，本发明的实施方案还可包括以下步骤：降低上述染色过程中所用染色剂浓度，直至染色精子样品中的死亡百分比不再进一步明显下降，还可包括以下步骤：降低所用染色剂浓度直至由含有X染色体精子与含有Y染色体流式细胞的分辨率获得的分选精子样品纯度低于60％；或低于必需或所需纯度百分比，如低于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％；或低于来自所述雄性哺乳动物的精子所能达到的纯度；或低于以一定分选速度流式分选含有X 染色体类群及含有Y染色体类群之一或两者的纯度，所述分选速度不低于约500次分选/秒(sorts/sec)到约1000次分选/秒之间、约750次分选/秒到约1250次分选/秒之间、约1000次分选/秒到约1500次分选/秒之间、约1250次分选/秒到约1750次分选/秒之间、约1500次分选/秒到约2000次分选/秒之间、约1750次分选/秒到约2250次分选/秒之间、约2000次分选/秒到约2500次分选/秒之间、约2250次分选/秒到约2750次分选/秒之间、约2500次分选/秒到约3000次分选/秒之间、约2750次分选/秒到约3250次分选/秒之间、约3000次分选/秒到约3500次分选/秒之间、约3250次分选/秒到约3750次分选/秒之间、约3500次分选/秒到约4000次分选/秒之间、约3750次分选/秒到约4250次分选/秒之间、约4000次分选/秒到约4500次分选/秒之间、约4250次分选/秒到约4750次分选/秒之间、约4500次分选/秒到约5000次分选/秒之间。 
实施例8用经过性别分选的冷冻精液给母麋鹿授精 
将科罗拉多州和明尼苏达州的年龄为3～6岁的母麋鹿，在9月份通过将孕酮CIDR(含有孕酮并缓慢释放的阴道栓)植入阴道12～14天以使它们发情期同步。移去CIDR后，给麋鹿肌肉内施用200IU的eCG，在60小时后使其同步授精。通过电刺激射精从5岁大的公麋鹿收集新鲜的精液，缓慢冷却4小时以上，直到约20℃，以纯射精液运输到精子分选试验室。将1.5ml等分液于15,000×g离心10秒，使射精液浓缩到1×109个精子/mL用于染色。将精液于112μM Hoechst 33342中，在TALP液中的浓度为200×106个精子/mL的条件下，于34℃孵育45分钟，然后稀释到100×106个精子/mL用于分选。以含有X及Y染色体的精子其DNA含量不同为基础分选精子。含有X染色体的麋鹿精子DNA含量比含有Y染色体的麋鹿精子DNA含量多3.8％。使用 
Figure G200380017484701D00261
SX，以50psi操作，使用基于TRIS的鞘液，对精子进行4小时以上的流式分选。发射功率为150mW的氩光的351及364波段激发了与DNA结合的Hoechst 33342染色剂。收集含有X染色体和含有Y染色体的精子(通过对声波降解精子等分液进行DNA重分析，验证其纯度约为92％)，将之以约4700个精子/秒的速度收集到含2ml 20％蛋黄-TRIS稀释液的试管中。连续收集15ml的分选体积。对于每一性别，分选得到约110×106个精子，冷却90分钟以上使之达到5℃。于5℃将等体积含甘油(12％)的稀释剂加到分选好的体积中。通过将含30ml的分选精子等分液于4℃以850×g离心20分钟，进行浓缩。汇集精子沉淀，调节到21.7×106个精子/mL，并装到0.25ml的管内。每一管均含总量为5×106的精子，将其在液氮气中冷冻。作为对照，同时将来自相同射精液的总量为5×106个精子象经过性别分选的精子一样在0.25ml的管中冷冻。于37℃解冻30秒后，通过视觉估计，分别有65％和60％的精子(对照和有性别)具有前进运动力。用常规的经颈精液子宫体内沉积法，对三匹来自不同地方及不同饲养条件的母麋鹿进行授精。授精后40天，通过检测血液中妊娠特异性的蛋白B(Bio Tracking，Moscow，Idaho)来确定妊娠情况。位于一个地方的10匹母麋鹿授精时状态不好，用经过性别分选的或对照精子均未能妊娠。其他地方的有性别精子妊娠率(61％，11/18)与对照授精者(50％，3/6)类似。这些妊娠率(经过性别分选的和对照)是使用比正常麋鹿人工授精所用精子更少的精子所获得的。11只用经过性别分选的精子得到的小仔中的9只(82％)为预期的性别。 
本发明还可包括根据本发明上述任意实施方案产生的哺乳动物；或可包括根据本发明各种实施方案产生的预定性别的哺乳动物，所述实施方案提供了精子授精样品，这些样品含有富含X染色体精子或富含Y染色体精子的群体；或包括根据本发明任意实施方案产生的哺乳动物，在所述实施方案中含有比特定哺乳动物的授精常用精子数量要少的精子授精样品；或包括根据如上所述本发明而产生的麋鹿子代。 
正如可以很容易地从前文所理解一样，本发明的基本思想可用不同途径具体实施。本发明涉及精子处理系统，该系统包括进行精子处理的技术及装置。在此申请中，通过公开所述各种装置所得结果的一部分和固有使用步骤而公开了各种细胞处理技术。它们仅仅是利用预期的所述装置的自然结果。另外，尽管公开了一部分装置，但是应该理解，这些装置不仅完成了某些方法，它们也可以多种方式加以改变。重要的是应当理解，对于所有的前述内容，本公开包含了所有的上述方面。 
这份非临时申请中所包括的讨论的目的是提供基本的描述。读者应知道，具体的讨论可能并非明确地描述所有可能的实施方案，许多替代选择是隐含的。它可能没有充分地解释本发明的普遍性质，也可能没有明确地显示各个性质或件实际上如何代表大量不同功能或大量替代方案或等同元件。同样，这些也隐含地包括在本公开内容中。当以装置术语的角度描述本发明时，装置的每一元件隐含地执行一种功能。装置权利要求不仅可包括所述的装置，还可包括实现本发明的功能或每一元件执行的功能的方法或过程的权利要求。描述及术语均非意在限制权利要求的范围。 
而且，本发明及权利要求的每一不同元件还可以多种方式获得。本公开内容应理解为包括每一个这样的变化，不论它是任意装置实施方案、方法或过程实施方案的变更，还是甚至仅仅是其中任意元件的变更。特别是，应该理解，由于本公开内容涉及本发明的元件，每一元件的文字可以用等同的装置术语或方法术语来表达——甚至仅仅是其具有相同的功能或结果。应认为这些等同的、更广泛的甚至是更上位的术语包含于各元件或动作的描述中。当需要使本发明所包括的隐含的广泛范围明确时，这些术语可加以替换。仅举一个例子来说，应该理解的，是所有的动作均可以用执行该动作的装置或促使产生该动作的元件来表达。类似地，每一公开的物理元件应理解为包含了对所述物理元件执行的动作的公开。就此最后一方面来说，仅举一个例子，“流式分选仪”的公开内容应理解为包含了“流式分选”动作的公开内容，无论其是否明确讨论过；反过来说，当有“流式分选”动作的有效公开时，这样的公开内容应理解为包括了“流式分选仪”，甚至包括了“流式分选方式”的公开。这些变化及替代术语应理解为明确包括在说明书内。 
本专利申请中提及的任何法律、法令、规章或准则的条款，或此专利申请中提及的专利、出版物或其他参考文献均以参考的方式引入本文。另外，对于所用的每一术语，应当理解，除非其在本申请中的应用与通用词典中的解释不一致，否则应当认为，本文引入了通用词典中对各条术语的定义。在此以参考的方式引入例如Random House Webster’s UnabridgedDictionary(《兰登书屋韦氏大词典》)第二版的所有定义、替代术语和同 义词。 
因此，应理解为申请人至少要求如下：i)本文所公开和描述的各精子处理装置；ii)所公开和描述的相关方法；iii)这些装置和方法的类似、等同甚至是隐含的变化；iv)完成公开和描述的所示功能的替代设计；v)完成每一所示功能的替代设计和方法，其为隐含的完成所公开和描述的功能的替代设计和方法；vi)作为分开的和独立的发明所示的每一性质、元件及步骤；vii)由所公开的不同系统或组分改进的申请；viii)由此类系统或元件所生成的终末产品；以及ix)基本在上文和参考任何所附实施例所描述的方法和装置，X)所公开元件的各种组合及排列，及xi)作为所述独立权利要求或概念中的每一从属的各潜在从属权利要求或概念，以及提供的所述的各项独立权利要求或概念。就这点上，应理解的是出于实际的原因及为了避免增加数以百计权利要求的可能性，申请人可最终仅提交具有最初的从属权利要求的权利要求。应当理解的是，应当达到有关发明创造的法规(new matter laws)所要求的支持程度，以便能够在一项独立权利要求或概念之下增加任何不同的从属权利要求或其他要素，作为任何其他独立权利要求或概念的从属权利要求或要素，上述法规包括但不限于《欧洲专利公约》第123(2)条款和美国专利法35 USC 132或其他此类法律。而且，如果使用或当使用表示转接关系的措词“包含”时，根据习惯上对权利要求的解释，使用该词是为了保持本文权利要求为“开放式”。因此，除非上下文需要，术语“包含”或诸如“包括“或“含有”等变化形式应理解为，它们意指包括所声明的要素或步骤或一组要素或步骤，而不排除任何其他的要素或步骤或一组要素或步骤。这样的术语应以其最广泛的形式来解释，以使申请人获得法律许可的最广泛的范围。 

Claims (17)

1.一种分离精子的方法，该方法包括：
a.从非人类哺乳动物中的雄性动物获取精液，该精液含有大量精子；
b.在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液；
c.测定所述大量精子的性别特征；
d.基于所述精子的性别特征分离所述精子；及
e.收集分离的精子。
2.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括以下步骤：在使所述精子膜脂维持于所述液相的温度孵育所述精液。
3.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中所述温度选自10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。
4.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中所述非人类哺乳动物选自牛、马、羊、猪、犬、猫、鹿、麋鹿或海洋动物。
5.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中所述非人类哺乳动物包括牛，并且其中在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液于17℃至19℃之间的温度孵育。
6.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中所述非人类哺乳动物包括牛，并且其中所述在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液于17℃的温度孵育。
7.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中所述非人类哺乳动物包括马，并且其中所述在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液于15℃的温度孵育。
8.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤包括，将所述精液在所述10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育1小时至18小时。
9.如权利要求1中所述分离精子的方法，所述方法还包括以下步骤：在进行所述在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤过程中，将所述精液从初始地点运输到第二地点。
10.如权利要求1中所述分离精子的方法，所述方法还包括以下步骤：在所述在10℃至20℃之间的不高于精子膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述精液的步骤之前，向所述精液加入抗菌药。
11.如权利要求1中所述分离精子的方法，该方法还包括以下步骤：用选自KMT或INRA96的稀释剂稀释精液。
12.如权利要求1中所述分离精子的方法，该方法还包括以下步骤：通过除去一部分精液浆而浓缩所述精子。
13.如权利要求1中所述分离精子的方法，该方法还包括对所述精子进行染色的步骤。
14.如权利要求13中所述分离精子的方法，其中所述对所述精子进行染色的步骤包括，对所述精子内含有的DNA进行染色。
15.如权利要求14中所述分离精子的方法，其中所述对所述精子内含有的DNA进行染色的步骤包括，用Hoechst 33342染色剂对所述精子内的DNA进行染色。
16.如权利要求15中所述分离精子的方法，其中所述用Hoechst33342染色剂对所述精子内的所述DNA进行染色的步骤包括，将所述精子与Hoechst 33342一起孵育30分钟至1小时。
17.如权利要求1中所述分离精子的方法，其中所述基于所述精子性别特征分离所述精子的步骤包括，用选自流式细胞计数仪或细胞分选仪的仪器分离所述精子。
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