CN104630137B

CN104630137B - 一种猪icsi操作的方法

Info

Publication number: CN104630137B
Application number: CN201510038499.XA
Authority: CN
Inventors: 李奎; 刘志国; 魏迎辉
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2015-01-26
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2035-01-26
Also published as: CN104630137A

Abstract

本发明公开了一种猪ICSI操作的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)用脂酶或脂酶溶液水解离体动物精液的精子，收集水解产物，得到用于制备ICSI受精卵的精子。(2)将所述用于制备ICSI受精卵的精子注射到离体卵母细胞中，得到ICSI卵；(3)将所述ICSI卵进行电激活、培养，得到ICSI受精卵。该发明的方法不仅避免了因为加PVP而对猪精子的解聚、雄原核的形成以及后期的发育所造成的不良影响，而且对猪精子的质膜、顶体等区域造成破坏，有助于行ICSI操作后猪精子释放促卵母细胞活化因子，增加雄原核的形成率、受精后胚胎的囊胚形成率。

Description

一种猪ICSI操作的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪ICSI操作的方法。

背景技术

ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)即卵胞浆内单精子显微注射技术，也就是第二代“试管婴儿”，该技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精。相对于小鼠和人来说，猪精子膜表面含有较多的脂类、糖脂和糖蛋白并且顶体区域富含磷脂和胆固醇。因此在ICSI操作过程中，猪精子容易粘附注射针，从而加大显微操作难度。

目前，通常在操作液中添加一种高分子物质聚乙烯吡咯烷酮(PVP)来减少精子与注射针的粘连，便于操作。但是PVP同精子一起注入到胞质内会包围在精子周围，不但使精子质膜变得坚韧影响破裂以及延迟胞质内钙离子振荡，影响精核解聚，而且阻碍精子向胞质释放卵母细胞激活因子，影响卵母细胞的活化，使ICSI的成功率受到严重影响。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备ICSI受精卵的精子的制备方法。

本发明提供的用于制备ICSI受精卵的精子的制备方法包括如下步骤：用脂酶或脂酶溶液水解离体动物精液的精子，收集水解产物，得到用于制备ICSI受精卵的精子。

上述方法中，所述脂酶溶液的制备方法：将脂酶与PBS溶液混匀，得到脂酶溶液。

上述方法中，所述PBS溶液的制备方法：所述PBS溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水；溶质及其在PBS溶液中的浓度为：0.27g/L KH₂PO₄、1.42g/L Na₂HPO₄、8g/L NaCl、0.2g/LKCl；所述PBS溶液的PH为7.4。

上述方法中，所述脂酶溶液中所述脂酶的浓度为2.5-10.0mg/ml；所述脂酶溶液中脂酶的浓度具体为2.5mg/ml、5.0mg/ml或10.0mg/ml，所述脂酶溶液中脂酶的浓度进一步具体为2.5mg/ml。

上述所述方法还包括如下步骤：

(1)将所述离体动物精液与所述脂酶溶液混匀，得到水解体系，进行水解反应，得到水解产物；将所述水解产物进行离心，收集沉淀，所述沉淀即为1次水解后精子；

(2)将所述1次水解后精子与所述脂酶溶液混匀，得到水解体系，进行水解反应，得到水解产物；将所述水解产物进行离心，收集沉淀，所述沉淀即为所述用于制备ICSI受精卵的精子。

上述方法中，步骤(1)和步骤(2)之间，还包括如下步骤：将所述1次水解后精子与PBS溶液混匀，得到混合体系，将所述混合体系加到percoll溶液中，静置，离心，收集沉淀。

上述方法中，所述水解体系中精子和脂酶的配比均为(10³-10⁴)个︰(2.5-10)mg。

上述方法中，将所述混合体系缓慢加到percoll溶液中。

上述方法中，所述水解反应时间为1min；所述静置的时间为1min。

上述方法中，所述percoll溶液的制备方法：将2ml的10×PBS溶液和18ml的percoll混匀，得到混合液，将所述混合液再与10ml的PBS溶液混匀，即得到percoll溶液。

上述方法中，还包括如下步骤：将所述用于制备ICSI受精卵的精子进行超声断尾处理。

上述方法中，所述超声的条件为：变幅杆：Φ3；功率：66.5W/h；所述超声时间为1min；所述超声过程为间断超声：超声时间：5.0s，停止时间：9.9s。

本发明的另一个目的是提供一种动物卵胞浆内单精子显微注射的方法。

本发明提供的动物卵胞浆内单精子显微注射的方法包括如下步骤：

(1)将上述的用于制备ICSI受精卵的精子注射到卵母细胞中，得到ICSI卵；

(2)将所述ICSI卵进行电激活、培养，得到ICSI受精卵。

上述方法中，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括如下步骤：将所述ICSI卵在PZM-3培养液中培养1h。

上述方法中，所述PZM-3培养液的制备方法：所述PZM-3培养液由溶剂和溶质组成，溶剂为纯水(Sigma)；溶质及其在培养液中的浓度：6.3115g/L NaCl、0.7455g/L KCl、0.0476g/L KH₂PO₄、0.0986g/L MgSO₄·7H₂O、2.1061g/L NaCO₃、0.022g/L丙酮酸钠、0.6166g/L CaC₂O₄·5H₂O、0.5％(体积分数)L-Glutamine、0.05g/L Gentamicin、0.5455g/LHypotaurine、2％(体积分数)BEM、1％(体积分数)MEM、3g/L BSA。

上述方法中，所述电激活在场强为1.5KV/cm；脉冲时程为80μs的条件下进行。

上述方法中，所述培养的时间为16-18h。

上述方法中，所述卵母细胞为具有第一极体的卵母细胞；所述具有第一极体的卵母细胞为具有第一极体且胞质均匀致密的成熟卵母细胞。

上述方法中，所述动物具体为家畜；所述家畜具体为猪。

上述所述的方法在如下(1)-(4)至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)降低猪ICSI中精子粘针；

(2)缩短猪ICSI的操作时间；

(3)提高猪ICSI的卵裂率和/或囊胚形成率；

(4)提高猪ICSI的雄原核形成率。

本发明通过实验证明：用不同浓度(0mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml、10.0mg/ml)的脂酶处理精子，水解掉猪精子膜周围较多的脂类，从而大大降低ICSI操作过程中猪精子与注射针的粘连问题。不仅避免了因为加PVP而对猪精子的解聚、雄原核的形成、以及后期的发育所造成的不良影响，而且对猪精子的质膜、顶体等区域造成破坏，有助于行ICSI操作后猪精子释放促卵母细胞活化因子，增加雄原核的形成率、受精后胚胎的囊胚形成率。

附图说明

图1为ICSI操作过程。其中，图1A为脂酶处理过后经超声波断尾后的单个精子被吸到注射针内；图1B为吸持针固定离心后的卵母细胞，使第一极体位于“6”点钟位置，注射针待注射单个精子头；图1C为单个精子头被注入成熟卵母细胞中；图1D为ICSI后168h的囊胚图。

图2为ICSI操作后16-18h的原核形成情况。其中，1为第一极体；2为第二极体；3为雌原核(FPN)；4为雄原核(MPN)。

图3为使用不同浓度脂酶处理的精子进行ICSI操作后卵裂率以及囊胚率。其中，图3A为24h卵裂率；图3B为48h卵裂率；图3C为144h囊胚率；图3D为168h囊胚率。

图4为ICSI后48h的卵裂图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的精液来源于北京市昌平区农业部北方地区SPF种猪场。

体外成熟培养液(IVM)的制备方法：体外成熟培养液由溶剂和溶质组成，溶剂为纯水；溶质及其在培养液中的浓度：Medium 199粉剂(Gibco，31100-035)9.5g/L，10％(体积分数)PFF，10ng/ml EGF、0.5mg/ml FSH、0.5mg/ml LH、70ng/ml Cys。

激活液的制备方法：激活液由溶剂和溶质组成，溶剂为纯水；溶质及其在培养液中的浓度：0.3M D-Mannitol、0.5mM Hepes、1.0mM CaCl₂·2H₂O、0.1mM MgCl₂·6H₂O。

PZM-3培养液的制备方法：PZM-3培养液由溶剂和溶质组成，溶剂为纯水(Singma)；溶质及其在培养液中的浓度：6.3115g/L NaCl、0.7455g/L KCl、0.0476g/L KH₂PO₄、0.0986g/L MgSO₄·7H₂O、2.1061g/L NaCO₃、0.022g/L丙酮酸钠、0.6166g/L CaC₂O₄·5H₂O、0.5％L-Glutamine、0.05g/L Gentamicin、0.5455g/L Hypotaurine、2％(体积分数)BEM、1％(体积分数)MEM、3g/L BSA。

PBS溶液的制备方法：PBS溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水；溶质及其在PBS溶液中的浓度为：0.27g/L KH₂PO₄、1.42g/L Na₂HPO₄、8g/L NaCl、0.2g/L KCl；所述PBS溶液的PH为7.4。

脂酶是Sigma公司的产品，产品目录号为L3126。

Percoll是GE Healthcare公司的产品，产品目录号为71501894-EH。

实施例1、提高猪ICSI操作效率的方法及效果检测

一、提高猪ICSI操作效率的方法

实验材料：猪卵巢采自当地屠宰场，置于加有双抗(青霉素和链霉素)的生理盐水(38℃)中，三小时内运回实验室。

1、将取回来的卵巢用加有双抗的生理盐水清洗三遍后，用10ml的注射器和18号针头抽取直径为3-6mm卵泡的卵泡液，口吸管挑选出包裹有3-5层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCs)。

2、将经步骤1挑选的COCs用洗卵液(PVA-TL-HEPES)清洗两遍，将杂质清洗干净后，挑选卵丘细胞包裹3-5层、卵丘细胞致密均匀包裹完整的卵母细胞，移入体外成熟培养液(IVM液)中，在38.5℃、饱和湿度为5％CO₂培养箱中培养，培养40h。

3、将经步骤2培养后的COCs用0.1％的透明质酸酶反复吹打20下左右，得到裸卵；将裸卵在IVM液中清洗三遍，挑选具有第一极体且胞质均匀致密的成熟卵母细胞。

4、将经步骤3挑选出来的成熟卵母细胞置于装有IVM液的1.5ml EP管中，13300r/min离心10min，移入提前做好的覆盖有石蜡油的显微操作液滴中。

5、取2ml新鲜精液分别加入到10ml的含有不同浓度的(2.5mg/ml、5.0mg/ml和10.0mg/ml)脂酶溶液中(脂酶溶液的制备方法：将脂酶与PBS溶液混匀，得到脂酶溶液，使脂酶在脂酶溶液中的浓度为2.5mg/ml、5.0mg/ml和10.0mg/ml)，室温(25℃)下晃动孵育1min以水解离体动物精液中精子膜表面的脂类，同时以不含脂酶(精子操作液滴中未添加5.0mg/ml聚乙烯吡咯烷酮PVP)和不含脂酶(精子操作液滴中添加5.0mg/ml聚乙烯吡咯烷酮PVP)的PBS溶液作为对照，1900r/min离心10min，弃上清，得到沉淀。

6、向经步骤5得到的沉淀中加4ml的PBS溶液，混匀，得到混合液，孵育1min，将所述混合液倾斜并缓慢加到3ml的percoll溶液中，静置1min，1900r/min离心10min，弃上清，得到沉淀。

7、向经步骤6得到的沉淀中加10ml的对应的不同浓度脂酶溶液，混匀，孵育1min，1900r/min离心10min，弃上清，得到沉淀，即为酶解后精子；最后将沉淀好的精子用PBS溶液稀释到浓度为10³-10⁴个/ml，备用。精液中精子和脂酶的配比为(10³-10⁴)个︰(2.5-10)mg。

8、取1ml将步骤7稀释好的精液用超声波细胞粉碎机进行超声波断尾处理，超声波断尾处理的条件：时间：1min；变幅杆：Φ3；功率：66.5W/h；间断超声(超声时间：5.0s，停止时间：9.9s)。

9、在显微操作仪下进行猪卵子ICSI操作(图1)：精子注射针内径为7-10μm左右，固定卵子的固定针内径为100-150μm左右。在60mm×15mm的显微操作盘中，中间做一条长条状的加有1μl/ml的细胞松弛素B(CB)的H199操作液(Gibco，31100-035)，两边做5个30μl的PBS滴，用于放置不同浓度的上述脂酶溶液处理过的精子。用固定管固定卵母细胞，转动卵母细胞使第一极体位于“12”点或者“6”点钟位置，注射针位于卵母细胞的“3”点钟位置进针穿过透明带深入到卵母细胞的“9”点钟位置，先回吸少量的胞质确定质膜已破，再将单个精子外加少量的H199操作液一起轻轻注入卵母细胞的胞浆中，得到ICSI卵。随后，轻轻撤出注射针，并将卵母细胞从固定管释放。

10、注射完毕后，将ICSI卵放在PZM-3培养液中恢复培养1h，培养条件为38.5℃、5％CO₂饱和湿度；恢复完成后移入激活液中平衡2min，放入填充电激活液的0.5mm宽度的电激活槽中(场强1.5KV/cm，脉冲时程80μs)，一次直流脉冲进行电激活；然后移入在培养箱中预先平衡2-4h的100μL的PZM-3洗涤液(PZM-3培养液)中洗涤三次；再移入50μL的PZM-3培养液中培养(15～20枚胚胎/滴)，培养条件为38.5℃、5％CO₂饱和湿度，培养时间为18h，得到猪ICSI受精卵。

二、检测

ICSI后18h用10μg/ml的H33342进行荧光避光染色，10-20min后在荧光显微镜下观察原核形成情况；分别在激活后第1天、第2天、第6天和第7天记录卵裂率和囊胚率。以1雄原核+1雌原核+2极体(1MPN+1FPN+2PB)并且无凝集的精子头为正常受精标准，按原核形成类型分组记录各种类型胚胎数。所有胚胎实验数据在分析之前进行反正弦转换后采用SAS双方面分类的ANOVA分析对ICSI后雌雄原核形成率、卵裂率及囊胚形成率进行统计分析，确定差异的显著性。结果如下：

1、不同浓度脂酶预处理精子后ICSI操作所需时间如表1所示，结果表明：用不同浓度的脂酶预处理精子后，ICSI操作所需时间比对照组明显减少。

表1、不同浓度脂酶预处理精子后ICSI操作所需时间

2、ICSI操作后16-18h的原核形成情况如图2和表2所示，图2中1为第一极体；图2中2为第二极体；图2中3为雌原核(FPN)；图2中4为雄原核(MPN)；表2中MPN：雄原核；表2中FPN：雌原核；表2中PB：第一极体或者第二极体；表2中DSH为解聚精子头(表明精子头解聚但是未正常发育成雄原核)。本试验重复次数n＝3，同一列中相同小写字母者标为差异不显著(P>0.05)，不同小写字母上标为差异显著(P<0.05)，不同大写字母上标为差异极显著(P<0.01)。

结果表明：当用2.5mg/ml的脂酶预处理精子进行ICSI后，雄原核数量显著提高。

表2、不同浓度脂酶预处理精子ICSI后(16-18h)原核形成情况

3、使用不同浓度脂酶处理的精子进行ICSI操作后卵裂情况以及囊胚形成情况如图1D、图3、图4和表3所示。其中，图3A为24h卵裂图；图3B为48h卵裂图；图3C为144h囊胚图；图3D为168h囊胚图。本试验重复次数n＝4，同一列中相同小写字母者标为差异不显著(P>0.05)，不同小写字母上标为差异显著(P<0.05)，不同大写字母上标为差异极显著(P<0.01)。

结果表明：当用2.5mg/ml的脂酶预处理精子行ICSI后，囊胚形成率显著提高。

表3、不同浓度脂酶预处理精子后ICSI胚胎发育情况

从上述结果可以看出，采用脂酶处理精子后，降低了猪ICSI中精子粘针，显著提高了猪精子雄原核形成率和囊胚率。

Claims

1.用于制备ICSI受精卵的精子的制备方法，包括如下步骤：

用脂酶溶液水解离体动物精液的精子，收集水解产物，得到用于制备ICSI受精卵的精子；

所述脂酶溶液的制备方法：将脂酶与PBS溶液混匀，得到脂酶溶液；所述脂酶溶液中脂酶的浓度为2.5 mg/ml；

所述动物为猪。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述方法还包括如下步骤：

（1）将所述离体动物精液与所述脂酶溶液混匀，得到水解体系，进行水解反应，得到水解产物；将所述水解产物进行离心，收集沉淀，所述沉淀即为1次水解后精子；

（2）将所述1次水解后精子与所述脂酶溶液混匀，得到水解体系，进行水解反应，得到水解产物；将所述水解产物进行离心，收集沉淀，所述沉淀即为所述用于制备ICSI受精卵的精子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤（1）和步骤（2）之间还包括如下步骤：将所述1次水解后精子与PBS溶液混匀，得到混合体系，将所述混合体系加到percoll溶液中，静置，离心，收集沉淀；

步骤（1）和步骤（2）的每一步中，所述水解体系中精子和脂酶的配比均为（10³-10⁴）个︰（2.5-10）mg。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述水解反应时间为1min；所述静置的时间为1min。

5.一种动物卵胞浆内单精子显微注射的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1-4中任一所述的用于制备ICSI受精卵的精子注射到离体卵母细胞中，得到ICSI卵；

（2）将所述ICSI卵进行电激活、培养，得到ICSI受精卵。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述电激活在场强为1.5 KV/cm；脉冲时程为80 μs的条件下进行。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述卵母细胞为具有第一极体的卵母细胞。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述动物为猪。

9.权利要求1-8中任一所述的方法在如下（1）-（4）至少一种中的应用：

（1）降低猪ICSI中精子粘针；

（2）缩短猪ICSI的操作时间；

（3）提高猪ICSI的卵裂率和/或囊胚形成率；

（4）提高猪ICSI的雄原核形成率。