BR132016001430E2

BR132016001430E2 - Composições e métodos para aprimorar a qualidade do esperma processado

Info

Publication number: BR132016001430E2
Application number: BR132016001430-0A
Authority: BR
Inventors: W. Lenz Richard; F. Moreno Juan; Vishwanath Ramakrishnan
Original assignee: Inguran, Llc
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2018-07-31
Also published as: BR132016001430F1

Abstract

composições e métodos para aprimorar a qualidade do esperma processado. a presente invenção refere-se em geral a composições e métodos para o manejo de populações de esperma processado que incluem amostras que são coletadas de modo fresco, as mesmas transportadas como amostras frescas, assim como amostras que são congeladas e degeladas, as mesmas classificadas em uma ou mais subpopulações, e as mesmas que são processadas ou manejadas de outra maneira que impõem um trauma na célula de esperma. tal trauma pode reduzir a motilidade, fertilidade, viabilidade e integridade geral do esperma e reduzir a habilidade do esperma para fertilizar um óvulo, proliferar em um embrião saudável e produzir uma prole saudável. a presente invenção refere-se a novos compostos que podem ser adicionados à amostra de célula de esperma para reduzir os efeitos traumáticos de estresse físico durante um processamento de célula de esperma moderado assim como extensivo, métodos para usar os compostos em procedimentos padrão de processamento de esperma, em que os produtos finais feitos a partir desses métodos incluem esperma e embriões, assim como métodos para usar esses produtos finais em técnicas de biologia reprodutiva assistidas em animais.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para “COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA APRIMORAR A QUALIDADE DO ESPERMA PROCESSADO” - Certificado de adição de invenção do pedido de patente de invenção n° BR1120130308150, depositado em 29/11/2013.

[001] Este pedido é uma Continuação do Pedido em Estágio Nacional no U.S. 13/823.843 depositado em 15 de março de 2013 do Pedido Internacional no PCT/US2012/040553 depositado em 1 de junho de 2012, que reivindica prioridade dos Pedidos Provisórios U.S. 61/492.151 depositado em 1 de junho de 2012, U.S. 61/569.143 depositado em 9 de dezembro de 2011 e U.S. 61/570.691 depositado em 14 de dezembro de 2011, cujos conteúdos são todos incorporados integralmente a título de referência.

[002] A presente invenção geralmente refere-se a composições e métodos para o manuseio de populações de esperma processado, incluindo aquelas recentemente coletadas, assim como aquelas classificadas em uma ou mais subpopulações, e para tratar soluções e amostras de sêmen processadas e/ou manuseadas que contêm células de esperma para aumentar a qualidade como um todo do esperma processado, incluindo sua viabilidade, motilidade, fertilidade, integridade de DNA, e longevidade in vitro. A presente invenção também se refere a composições que compreendem células de esperma e pelo menos um composto que pode ser um antioxidante, vitamina ou outro redutor de estresse orgânico, os métodos de uso desses compostos para reduzir trauma e estresse do esperma processado, o esperma resultante e produtos finais de embrião, e os métodos de uso desses produtos em tecnologias reprodutivas assistidas (ART) para aumentar a qualidade, quantidade e viabilidade de embriões, e taxas aprimoradas de nascimentos de animais.

ANTECEDENTES

[003] A tecnologia reprodutiva assistida (ART) inclui tais técnicas como em fertilização in vitro (IVF), inseminação artificial (AI), injeção de esperma intracitoplásmica (ICSI) (outras técnicas que usam células enucleadas) e transferência de embrião e ovulação múltipla (MOET) (assim como outras técnicas de transferência de embrião), e é usada em todo o reino animal, incluindo humanos e outros animais. Os métodos de ART são normalmente dispendiosos, demorados e tem sucesso marginal dada a fragilidade inerente de gametas e embriões quando fora de seus ambientes naturais. Adicionalmente, o uso de ART dentro da indústria de procriação animal de maneira comercialmente viável é adicionalmente desafiante devido à disponibilidade limitada de gametas e zigotos geneticamente desejáveis. Um modo de diminuir o custo de ART e de aprimorar sua viabilidade comercial é de aumentar a eficácia dos processos envolvidos ao aprimorar a viabilidade e qualidade como um todo de gametas e zigotos. Embora tenha sido um interesse crescente nesse campo durante a última década ou mais, ainda há uma forte necessidade de aumentar a qualidade como um todo de gametas e zigotos para uso em ART, especialmente quando a procriação foca em seleção de gênero pré-natal, incluindo aprimorar sua viabilidade (no caso de gametas e zigotos), sua motil idade e fertilidade (no caso de células de esperma), assim como outras características de longevidade.

[004] Por exemplo, na AI convencional, um problema que limita sua aplicação comercial em certas espécies é a necessidade de usar números extremamente altos de células de esperma por dose de AI para garantir fertilização com sucesso. Similarmente, em IVF, a porcentagem de zigotos que desenvolvem em embriões permanece baixa de modo frustrante; essa alta taxa de perda aumenta significativamente o custo de embriões e serviços relacionados a usuários finais. Também permanece a necessidade por procedimentos mais eficazes e menos dispendiosos para aprimorar manuseio pós-embrião através da criopreservação, assim como transporte não congelado. A criopreservação de embriões é limitada pela taxa de sucesso de produção de embrião, assim como proliferação de blastocisto in vitro. Atualmente, apenas uma porcentagem marginal de embriões de IVF são adequados para criopreservação, o que adiciona ao progressivo alto custo de procedimentos de ART.

[005] Especialmente quando do processamento de gametas, como oócitos lavados ou células de esperma, ambos convencionais e classificados por sexo, antes de seu uso em ART adiciona uma tremenda quantidade de estresse na célula de gameta e impacta de modo negativo sua integridade celular e estrutura de membrana que, por sua vez, é refletida em menor viabilidade, motilidade e fertilidade. Um exemplo de processamento de gametas antes de seu uso em ART é a classificação de células de esperma com base em sexo (conhecida como “enriquecimento de gênero” ou “classificação por sexo”), que é um procedimento altamente desejado para minimizar nascimentos desperdiçados do sexo errado para procriação seletiva na indústria de gado, mas é frequentemente proibitiva em relação ao custo e pode ser arriscado para aqueles com menores rebanhos de procriação.

[006] O popular processo de classificação por sexo com base em citometria de fluxo estressa e danifica severamente as células e produz uma baixa porcentagem de esperma útil que, embora capaz de fertilizar oócitos maduros, têm viabilidade, motilidade e fertilidade reduzida após o processo de classificação por sexo. Tipicamente, a classificação por sexo envolve muitas etapas severas incluindo, mas não limitadas a: a coleta e manuseio inicial de esperma ejaculado que naturalmente começa a deteriorar rapidamente mediante a coleta; a coloração de células de esperma que envolve ligar um corante excitável ao DNA ou um procedimento de seleção de membrana danoso; a classificação física das células de esperma com o uso de fluorescência de alta energia que energiza fisicamente o corante que é ligado ao DNA, orientação forçada através de um orifício estreito, e aplicação de uma carga elétrica à célula; a coleta física das células em um contentor que frequentemente impacta a célula frágil mediante o contato; os estresses osmóticos associados a diluição da gotícula de esperma em meio de coleta; e o armazenamento do esperma classificado normalmente por congelamento que é bem conhecido por eleva destruição com os sistemas de membrana da célula. Cada etapa coloca o esperma processado sob estresse anormal, o que diminui a motilidade, viabilidade e/ou fertilidade como um todo do esperma. O resultado pode levar a amostras menos eficazes para uso em ART, como IVF e AI, e outros tipos de processamento subsequente ou adicional.

[007] Mesmo o esperma processado não classificado exibe perdas significativas em fertilidade, viabilidade e motilidade quando é coletado, manuseado e transportado sem congelar, e experimenta visivelmente estresse significativo quando misturado com crioprotetor e é congelado e degelado. Muitos no campo tentaram aprimorar métodos para o uso em sêmen convencional não classificado para minimizar a perda nos processos de manuseio associados a manuseio m vitro, preservação e uso de amostras de sêmen.

[008] Independentemente do processamento, o esperma perde seu potencial de fertilizar quando exposto a: temperaturas elevadas, tampões anormais, colorações, sistemas de pH alterado, orientação pressurizada física como quando forçada através de um bocal ou quando oscilada para formar gotas em um citômetro de fluxo, radiação usada para iluminar o corante de ligação de DNA, fatores de estresse físico associados a técnicas de separação e coleta, crioprotetores, congelamento, degelo e micromanipulação pelo manipulador.

[009] A grande classe de compostos referidos como antioxidantes foi associada ao fornecimento de efeitos benéficos para todos os tipos de células, in vivo e in vitro, mas esses efeitos são tão variados quanto a natureza do próprio antioxidante. Um antioxidante é simplesmente um de uma grande variedade de moléculas que, ou inibem a oxidação de outra molécula, se toma, o próprio, oxidado no lugar do substrato alvo, ou liga intermediários de radical livre nocivos e interrompe reações em cadeia oxidativa dentro de uma célula. A maior parte tem papéis duplos; alguns são enzimas, outros são não enzimáticos; ainda outros são vitaminas e outros são cofatores. Tal diversidade enaltece a diversidade de antioxidantes, mas devido a sua conhecida capacidade de minimizar dano celular, os mesmos são frequentemente agregados como uma única classe de compostos que tem apenas uma única função, ligar radicais livres.

[010] Vários antioxidantes se mostraram promissores em promover integridade celular com alguns relatos mostrando efeitos positivos na motilidade de esperma e integridade de membrana durante a criopreservação, mas alguns testes mostraram ter efeitos mínimos ou mesmo danosos no esperma processado.

[011] Similarmente, as vitaminas são novamente um grupo um tanto diverso de moléculas que tem muitas propriedades biológicas diferentes. Vitaminas são qualquer uma de um grande grupo de compostos orgânicos exigidos em quantidades muito pequenas como nutrientes vitais para um organismo que não pode sintetizar as mesmas. Os mesmos podem ser antioxidantes, enzimas, hormônios ou não enzimas; podem ser reguladores de proliferação celular, diferenciação celular ou moderadores de metabolismo mineral.

[012] Até o presente, nenhum estudo tratou suficientemente do uso de antioxidantes, vitaminas ou outros suplementos no manuseio de rotina de gametas frágeis durante processamento in vitro, especialmente durante o processamento severo associado à classificação por sexo de esperma, segundo o qual o resultado final é um aprimoramento reproduzível da viabilidade, motilidade e fertilidade de células e embriões de esperma extensivamente processado. Há ainda uma necessidade contínua de aprimorar métodos atuais de ART para reduzir o custo e para tomar os procedimentos mais confiáveis e comercialmente viáveis àqueles com um orçamento limitado, especialmente aqueles criadores menores que veem procriação de seleção de sexo como uma opção de alto risco e dispendiosa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[013] Um amplo objetivo da presente invenção é fornecer aprimoramentos na motilidade, viabilidade, fertilidade e integridade como um todo de células de esperma processado. Consequentemente, uma modalidade da presente invenção compreende um método para tratar células de esperma ao adicionar pelo menos um agente de “redução de estresse orgânico” (OSR), que pode compreender um antioxidante, uma vitamina ou outra molécula orgânica envolvida direta ou indiretamente na modulação de estresses fisiológicos na célula. A OSR podería ser adicionada na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml para uma amostra de célula de esperma para formar uma composição de célula de esperma. Em certas modalidades, uma ou mais OSRs, cada uma na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml, pode ser adicionada à amostra de célula de esperma antes da criopreservação (incluindo, por exemplo, congelamento e vitrificação), após a amostra de célula de esperma ter degelado, ou em ambas as vezes. Em outras modalidades, a OSR pode ser adicionada em um ou mais dos vários estágios durante o procedimento de processamento de célula de esperma. O termo “amostra de célula de esperma” pode compreender uma amostra de sêmen processado ou uma amostra de sêmen convencional não classificado.

[014] Outra modalidade específica da invenção compreende a composição de célula de esperma que compreende uma amostra de célula de esperma e pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. Outra modalidade abrange uma “composição de célula de esperma” que compreende uma amostra de célula de esperma, pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml e um crioprotetor. A maioria dos crioprotetores pode ser usada com a invenção, incluindo, mas não limitada a, gema de ovo, propilenoglicol, sulfóxido de dimetila, sacarose, etileno glicol e glicerol, ou uma combinação dos mesmos. Uma modalidade abrange uma composição de célula de esperma fresca, descongelada, congelada, vitrificada ou degelada que compreende uma amostra de célula de esperma e pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. Outra modalidade abrange uma composição de célula de esperma fresca, descongelada, congelada, vitrificada ou degelada que compreende uma amostra de célula de esperma, pelo menos um antioxidante e/ou uma vitamina na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml, e uma coloração.

[015] Outro amplo objetivo da presente invenção é aprimorar a motilidade, viabilidade (incluindo longevidade e capacidade de sobreviver ao estresse ambiental) e/ou fertilidade de células de esperma, em que cada uma contribui para a integridade geral da célula de esperma, aprimorar o sucesso do uso de ART, incluindo técnicas como IVF, AI, ICSI (assim como outras técnicas com o uso de células enucleadas), e MOET (assim como outras técnicas de transferência de embrião).

[016] Tais técnicas de ART envolvem diferentes níveis de processamento de célula de gameta que, no caso de esperma pode acarretar, apenas para fins de exemplo e sem limitação, em um ou mais dos seguintes: coletar artificialmente uma amostra de sêmen do animal macho que pode envolver estímulo sexual natural, eletrônico ou de outro tipo; reter; transportar; tamponar com diferentes pHs; esfriar; amornar; coloração; diluir; concentrar; excitar energeticamente como com um laser; carregar eletronicamente; desviar; remover por ablação para matar células indesejadas normalmente com lasers direcionados; classificar; coletar; agitar; oscilar; separar magneticamente; oxigenar como associado a procedimentos de classificação por microchip; etiquetar; precipitar; centrifugar; ressuspender; misturar; dialisar; crioestabilizar; congelar; vitrificar; degelar; cultivar; inseminar; microinjetar; processamento microfluídico; processamento por microchip; processamento por jato e ar; processamento de citometria de fluxo; e técnicas de manuseio similares. Enquanto que uma única etapa de processamento pode exercer apenas estresse mínimo em uma célula de esperma, outras ou uma combinação pode adicionar estresse significativo, frequentemente matando a célula. Um exemplo extremo é o processo de classificação por sexo usado para separar células que portam cromossomo X das que portam cromossomo Y; o processo de classificação combina um grande número de etapas estressantes altamente independentes que comprometem severamente a integridade como um todo da população de célula de esperma classificado.

[017] Consequentemente, uma modalidade da presente invenção reside amplamente no uso de uma composição de célula de esperma, que compreende uma amostra de célula de esperma e pelo menos um antioxidante e/ou pelo menos uma vitamina na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml, em ART. Uma modalidade específica da invenção compreende um método para aumentar a porcentagem de zigotos que se desenvolvem em embriões em uma dada amostra em uma dada quantidade de tempo, assim como aumentar a porcentagem de embriões que são adequados para criopreservação (isto é, a porcentagem de embriões que são blastócitos, blastócitos expandidos e de incubação, ou blastócitos incubados), ao misturar um ovo com uma amostra de célula de esperma que foi tratada com pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. Uma modalidade adicional da invenção reside em um método para produzir um embrião que compreende misturar pelo menos um ovo com uma amostra de células de esperma tratada com pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. Os embriões produzidos por esse método constituem uma modalidade adicional da invenção. Outra modalidade inclui um método para inseminar um organismo através de uma técnica de AI com o uso de uma amostra de célula de esperma tratada com pelo menos uma OSR na concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. Outra modalidade inclui um método para transferir um embrião em uma fêmea receptiva (ET), em que o dito embrião é produzido com o uso de uma amostra de célula de esperma tratada com pelo menos uma OSR na concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. A progênie do organismo que resulta do método de AI previamente mencionado também constitui uma modalidade da invenção.

[018] A maioria das modalidades da invenção utiliza concentrações de OSRs selecionadas a partir das seguintes faixas: 0,01 a 5,0 mg/ml; 0,01 a 0,25 mg/ml; 0,01 a 0,5 mg/ml; 0,01 a 1 mg/ml; 0,01 a 2,5 mg/ml; 0,01 a 5 mg/ml; 0,05 a 0,1 mg/ml; 0,05 a 1,0 mg/ml; 0,05 a 2,5 mg/ml; 0,1 a 0,25 mg/ml; 0,1 a 0,5 mg/ml; 0,1 a 1 mg/ml; 0,1 a 2,5 mg/ml; 0,1 a 5 mg/ml; 0,15 a 0,45 mg/ml; 0,15 a 0,5 mg/ml; 0,25 a 0,35 mg/ml; 0,25 a 0,5 mg/ml; 0,25 a 1 mg/ml; 0,25 a 2,5 mg/ml; 0,25 a 5 mg/ml; 0,35 a 0,5 mg/ml; 0,35 a 1 mg/ml; 0,35 a 2,5 mg/ml; 0,35 a 5 mg/ml; 0,5 a 1 mg/ml; 0,5 a 2,5 mg/ml; 0,5 a 5 mg/ml; 1 a 2,5 mg/ml; 1 a 5 mg/ml; cerca de 0,05 mg/ml; cerca de 0,1 mg/ml; cerca de 0,15 mg/ml; cerca de 0,25 mg/ml; cerca de 0,35 mg/ml; cerca de 0,45 mg/ml; e cerca de 0,5 mg/ml.

[019] Em algumas modalidades da invenção, a composição de célula de esperma pode ser usada imediatamente ou processada dentro dos primeiros minutos após a adição da OSR para qualquer etapa de processamento que for necessária, segundo a qual o período de retenção podería ser na faixa de 2 seg. a 3 min. Em outras modalidades, a composição de célula de esperma é retida após a adição das OSR(s) para permitir que a(s) OSR(s) incorporem nas células e efetuem efeitos protetores sobre a população de célula. Tais períodos de retenção podem ser curtos, como na faixa de 3 a 15 minutos, moderados, como na faixa de 15 min a 1 h; e períodos de processamento mais longos situados na faixa de até cerca de 8 h ou de um dia para o outro para processamento extensivo, como com técnicas de classificação por sexo. Os períodos de retenção de transporte associados a transportar composições de célula de esperma descongeladas podem ser muito maiores, se estendendo até alguns dias, o que pode ocorrer, por exemplo, se a amostra for coletada, tratada com a adição de uma ou mais OSRs, transportada ou enviada para outro local, possivelmente pelo ar, e adicionalmente processada no segundo local como para classificação por sexo em uma instalação designada. Em outros casos, a composição de célula de esperma pode precisar ser retida por alguns dias enquanto uma fêmea recipiente é hormonalmente preparada para inseminação artificial, como pode ocorrer se a amostra for degelada por engano e não puder ser recongelada. A adição de OSRs podería, teoricamente, prolongar esses períodos de retenção estendidos para além do que é atualmente aceito na técnica, e poderia fornecer proteção suficiente ao esperma na composição de célula de esperma de modo que o mesmo poderia permanecer viável e fértil por até uma semana ou mais.

[020] Em algumas modalidades da invenção, a OSR é adicionada diversas vezes durante um procedimento de processamento complexo para minimizar estresse celular por todo o procedimento. Em outras modalidades, a OSR é adicionada apenas em uma ou mais etapas particulares que são notavelmente severas para as células para auxiliar a minimizar o estresse e fadiga nas células de esperma. Para fins de exemplo, o processo de coloração durante a classificação de sexo é frequentemente desempenhada em pH não fisiológico e em temperaturas elevadas, ambos conhecidos por serem severos às células. Similarmente, a criopreservação é também extremamente severa às células e rompe membranas celulares, ambas interna e externa. Seguindo um procedimento de classificação multietapas intensivo, células de esperma classificadas por sexo que já são comprometidas são mesmo mais suscetíveis a processamento criogênico e de congelamento.

[021] Várias OSRs podem ser usadas no contexto da invenção atual incluindo, mas não limitadas a: catalase, superóxido dismutase (SOD), mímicos de SOD, glutationa, glutationa redutase, glutationa peroxidase, piruvato, marcaptoetanol, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido lipoico, flavinas, quininas, vitamina K (e vitâmeros relacionados), vitamina B12 (e vitâmeros relacionados), com ‘vitâmeros’ definidos como compostos que tem a mesma atividade de vitamina (como cobalamina, cianocobalamina, metilcobalamina, adenosilcobalamina, hidroxocobalamina, e pseudo-B12), vitamina E (incluindo seus vitâmeros, tocoferóis (α, β, γ), tocotrienóis, e a-tocoferila), alfa-cetoglutarato (também conhecido como α-KG, AKG ou oxo-glutarato) e várias formas biológicas de AKG (como arginina, aspartato, lisina, e derivados similares), outros compostos que regulam óxido nítrico na célula, incluindo malondialdeído (MDA) e dimetilarginina assimétrica (ADMA) e derivados biologicamente ativos dos mesmos.

[022] Uma modalidade adicional da invenção compreende um método de classificação de uma amostra de célula de esperma para formar uma ou mais subpopulações que compreende as etapas de fornecer uma amostra de célula de esperma, classificar a amostra de célula de esperma para formar uma ou mais subpopulações e adicionar pelo menos uma OSR à amostra de célula de esperma durante uma ou mais das etapas de classificação previamente mencionadas, sendo que a concentração da OSR é na faixa de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml.

[023] Uma modalidade adicional da invenção abrange meio usado no processamento de células de esperma que compreende pelo menos uma OSR na concentração de estoque apropriada a estar presente em uma concentração de processamento final na faixa de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml na composição de célula de esperma no momento do processamento. Um meio de redução de estresse pode ser usado para diferentes processos incluindo, mas não limitados a, coleta de esperma, inseminação artificial, classificação de esperma, fertilização m vitro, cultura de embrião, assim como congelamento de esperma e embrião. O meio usado na classificação de células de esperma tipicamente compreende um ou mais tampões e/ou extensores (isto é, substâncias que preservam a viabilidade e/ou fertilidade das células de esperma).

[024] Qualquer tampão ou solução tampão usado no processamento de esperma pode ser usado no meio previamente mencionado incluindo, mas não limitado a, fosfatos, citratos, acetatos, lactatos, e combinações dos mesmos, ou uma solução que contém um sal, um carboidrato, ou uma combinação dos mesmos pode ser empregada em algumas das modalidades da invenção, tal como, mas não limitadas a: Tris, TES, HEPES, TALP, TCA, PBS, citrato, leite e derivados dos mesmos, conforme discutido em detalhes na Patente n° U.S. 7.208.265 cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência integralmente.

[025] Qualquer extensor usado no processamento de esperma pode ser usado no meio previamente mencionado incluindo, mas não limitado a, fontes de energia, fontes de proteína e antibióticos e pode incluir um ou mais dos seguintes: mono e dissacarídeos, como frutose, glicose, manose, sacarose, e lactose; fontes de proteína, como gema de ovo, leite, BSA e derivados dos mesmos; e qualquer um dos agentes antimicrobianos ou antibióticos comumente conhecidos, como gentamicina, lincomicina, espectinomicina, seus derivados, ou qualquer combinação dos mesmos.

[026] Conforme usado no presente documento, o termo “extensor” também pode incluir certas substâncias orgânicas, como dissacarídeos, trissacarídeos, e qualquer combinação dos mesmos, gema de ovo, leite, albumina, lecitina, colesterol, seus derivados e qualquer combinação dos mesmos. Um extensor também pode incluir um detergente que pode ser um detergente iônico de alquila, como dodecil sulfato de sódio (SDS).

[027] Uma modalidade adicional da presente invenção fornece um método para aprimorar a motilidade, viabilidade e/ou fertilidade de uma amostra de célula de esperma que já foi submetida a processo de classificação, incluindo, mas não limitado a, classificação de sexo, que compreende a etapa de adicionar pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml a uma amostra de célula de esperma classificada para formar uma composição de célula de esperma.

[028] Consequentemente, a presente invenção reside amplamente no uso de uma composição de célula de esperma, que em algumas modalidades compreende uma amostra de célula de esperma classificada e pelo menos uma OSR na faixa de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml, para uso em ART. Uma modalidade adicional abrange uma composição de célula de esperma que compreende células de esperma classificadas, pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml e um meio de captura (isto é, meio encontrado no vasilhame que recebe, ou captura, o esperma classificado no fim do processo de classificação). Outra modalidade abrange uma composição de célula de esperma que compreende uma amostra de célula de esperma processada ou classificada, uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml e um crioprotetor. Uma modalidade adicional da invenção abrange uma composição de célula de esperma congelada ou vitrificada que compreende uma amostra de célula de esperma processada ou classificada, e pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml.

[029] Outro amplo objetivo da presente invenção é aprimorar a motilidade, viabilidade (incluindo longevidade e capacidade de sobreviver ao estresse ambiental) e fertilidade de células de esperma processadas e/ou classificadas para uso em ART, como IVF, AI, ICSI (assim como outras técnicas com o uso de células enucleadas) e MOET (assim como outras técnicas de transferência de embrião).

[030] Consequentemente, algumas das modalidades da presente invenção incorporam o uso de células de esperma classificadas por sexo que tiveram uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml adicionada às mesmas em ART.

[031] Consequentemente, outras modalidades da presente invenção incorporam o uso de uma composição de célula de esperma, uma amostra de célula de esperma classificada, e pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml, em ART.

[032] Uma modalidade específica da invenção compreende um método para aumentar a porcentagem de zigotos que se desenvolvem em embriões em uma dada amostra em uma dada quantidade de tempo, assim como aumentar a porcentagem de embriões que são adequados para criopreservação (isto é, a porcentagem de embriões que são blastócitos, blastócitos expandidos e de incubação, e blastócitos incubados), ao misturar um ovo com uma amostra de célula de esperma classificada que foi tratada com pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml.

[033] Uma modalidade adicional da invenção reside em um método para produzir um embrião que compreende misturar pelo menos um ovo com pelo menos uma célula de esperma tratada com pelo menos uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. Os embriões produzidos por esse método constituem uma modalidade adicional da invenção.

[034] Outras modalidades da invenção também incluem um método para inseminar um organismo através de uma técnica de AI com o uso de uma amostra de célula de esperma processada ou classificada tratada com pelo menos uma OSR na concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. A progênie do organismo que resulta do método de AI previamente mencionado também constitui uma modalidade da invenção. Adicionalmente, uma modalidade da invenção abrange um método para recuperar embriões que são produzidos pelo método de AI previamente mencionado.

[035] As modalidades da invenção podem incluir células de esperma, ou espermatozóides, coletados de inúmeras espécies de mamíferos machos, e a invenção deve ser entendida como não limitada às espécies de mamíferos machos descritos pelos exemplos específicos dentro desse pedido. Ao invés disso, os exemplos específicos dentro desse pedido se destinam a ser ilustrativos das variadas e inúmeras espécies de mamíferos machos a partir dos quais o sêmen pode ser coletado e utilizado em certas modalidades da invenção. As modalidades da invenção, por exemplo, podem incluir as células de esperma de humanos, assim como animais que tem valor comercial para produção de carne ou laticínios, como suíno, ovino, bovino, equino, cervo, alce, búfalo, ou similares (naturalmente, os mamíferos usados para produção de carne ou laticínios podem variar de cultura para cultura). A mesma também pode incluir as células de esperma de várias espécies de mamíferos domesticados abrangidas por caninos e felinos, assim como células de esperma de primatas, incluindo, mas não limitado a, chimpanzés, gorilas ou humanos e os espermatozóides de baleias, golfinhos e outros mamíferos marinhos. A mesma também pode incluir células de esperma congeladas/degeladas de todos os vários mamíferos descritos acima e adicionalmente, incluindo, mas não limitados a, células de esperma de doadores falecidos, desde mamíferos raros ou exóticos, espécimes zoológicas, ou espécies em risco de extinção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[036] A fim de que a invenção possa ser mais claramente entendida, modalidades preferenciais da presente invenção serão agora descritas para fins de exemplo apenas com referência aos desenhos anexos em que: [037] A Figura 1 é uma representação esquemática de parte de um citômetro de fluxo que ilustra um método de classificação de uma amostra de célula de esperma em uma ou mais subpopulações de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[038] A Figura 2 ilustra uma representação gráfica da motilidade e motilidade progressiva encontrada na Tabela 1.

[039] A Figura 3 é uma representação gráfica do percentual de blastócitos e percentual de incubação encontrado na Tabela 4.

[040] A Figura 4 é uma representação gráfica do percentual de blastócitos e percentual de incubação encontrado na Tabela 5.

[041] A Figura 5 é uma representação gráfica do percentual de esperma móvel encontrado na Tabela 1.

[042] A Figura 6 é uma representação gráfica do percentual de esperma progressivamente móvel encontrado na Tabela 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[043] Em um aspecto da presente invenção, a Figura 1 ilustra em forma esquemática parte de um citômetro de fluxo usado em um método para classificar uma amostra de célula de esperma para formar uma ou mais subpopulações, sendo que o citômetro de fluxo é geralmente referenciado 10. Nessa modalidade particular, a classificação de sexo ocorre de modo que as subpopulações sejam células de esperma que portam cromossomo X e células de esperma que portam cromossomo Y. A Figura 1 representa uma única técnica para classificação de sêmen, mas qualquer técnica conhecida para classificação de células conhecida na técnica pode ser usada com certas modalidades da invenção. Detalhes adicionais do aparelho e metodologia de classificação de esperma básico são descritos nas Patentes n- U.S 5.135.759 e n- 7.371.517, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência integralmente.

[044] Uma vez que uma amostra de célula de esperma tenha sido coletada, a mesma pode ser estendida logo após a coleta com um extensor que inclui um ou mais antioxidantes ou vitaminas. A amostra é então tipicamente retida em uma temperatura de cerca de 5°C por entre cerca de 12 horas a cerca de 18 horas enquanto é enviada desde o ponto de coleta até o citômetro de fluxo 10 para o processo de classificação. Essa temperatura de retenção pode ser na faixa dentre 4°C e 39°C e é comumente na faixa de 4°C e 16°C.

[045] Mediante a chegada ao citômetro de fluxo, a amostra é colorida com um corante seletivo de DNA e um corante de têmpera para formar uma amostra de célula de esperma colorida e subsequentemente colocada em uma fonte de célula de esperma 11 do citômetro de fluxo 10. O citômetro de fluxo 10 pode ser programado por um operador para gerar duas correntes de gotícula carregadas, uma contendo células de esperma que portam cromossomo X, positivamente carregadas, 12, uma contendo células de esperma que portam cromossomo Y, negativamente carregadas 13 enquanto uma corrente não desviada e não carregada de células mortas 14 simplesmente são desperdiçadas.

[046] Um operador pode também escolher programar o citômetro de fluxo de tal maneira que ambos os espermas que portam os cromossomos X e Y são coletados com o uso de uma “classificação de alta pureza” (em outras palavras, apenas espermas vivos que portam os cromossomos X e Y são coletados) ou para programar o citômetro de fluxo para coletar ambos os espermas que portam os cromossomos X e Y com o uso de uma “classificação enriquecida” (em outras palavras irá coletar gotículas que contém vivos que não foram previamente classificados e excluindo todos os mortos iniciais novamente pelo uso de porta lógica booleana disponível com o computador que controla o citômetro de fluxo). A porta lógica booleana pode também ser usada para coletar apenas um de esperma que porta o cromossomo X ou Y.

[047] Inicialmente, uma corrente de células de esperma sob pressão é depositada no bocal 15 a partir da fonte de célula de esperma 11 de tal maneira que as mesmas são capazes de serem cercadas de modo coaxial por um fluido de bainha abastecido ao bocal 15 sob pressão de uma fonte de fluido de bainha 16. Um oscilador 17, que pode estar presente, pode ser muito precisamente controlado por meio de um mecanismo de controle de oscilador 18, que cria ondas de pressão dentro do bocal 15 que são transmitidas à corrente de célula de esperma cercada de modo coaxial conforme a mesma deixa o orifício de bocal 19. Como resultado, a corrente de célula de esperma cercada de modo coaxial de saída 20 podería formar gotículas 21, eventual e regularmente.

[048] O carregamento das respectivas correntes de gotículas se toma possível pelo sistema de sensoriamento de célula 22 que inclui um laser 23, que ilumina a corrente de saída do bocal 20, e a emissão de luz da corrente de fluorescência é detectada por um sensor 24. As informações recebidas pelo sensor 24 são alimentadas em um sistema de discriminação classificador 25 que, muito rapidamente, toma a decisão sobre carregar uma gotícula em formação e, se sim, qual carregamento fornecer à gota em formação e então carregar a gotícula 21, consequentemente.

[049] Uma característica de esperma que porta o cromossomo X é que esse tende a absorver mais corante fluorocromo do que esperma que porta o cromossomo Y e, como tal, a quantidade de luz emitida pelo corante absorvido excitado a laser no esperma que porta o cromossomo X difere daquele do esperma que porta o cromossomo Y e essa diferença na característica diz ao sistema de discriminação classifícador 25 qual carregamento aplicar às gotículas que contém apenas células de esperma que porta o cromossomo X ou apenas o Y. Células mortas (ou aquelas prestes a morrer) absorveram o corante de têmpera e o sistema de discriminação classifícador 25 não carrega gotículas que contém tais células.

[050] As correntes de gotícula carregadas ou descarregadas então passam entre um par de placas eletrostaticamente carregadas 26, que fazem com que as mesmas sejam desviadas de um modo ou outro, ou de modo algum dependendo de seu carregamento em respectivos vasilhames de coleta 28 e 29 para formar, respectivamente, uma população enriquecida de gênero de células de esperma que portam o cromossomo X e as enriquecida de gênero que portam o cromossomo Y que tem um corante seletivo de DNA associado a seu DNA. A corrente não desviada descarregada que contém uma subpopulação de células mortas (ou aquelas que estão prestes a morrer) vai para o contentor de resíduos 30.

[051] As células de esperma classificadas por sexo coletadas podem ser então congeladas e armazenadas ou congeladas e enviadas para processamento adicional (ou simplesmente usadas para processamento adicional imediatamente), em que processamento adicional significa, por exemplo, os propósitos de pesquisa ou para uso em ART como IVF, AI, ICSI (assim como outras técnicas com o uso de células enucleadas), e MOET (assim como outras técnicas de transferência de embrião).

[052] Em modalidades alternativas não ilustradas, o meio de captura contido nos vasilhames de coleta de outro modo vazios pode conter também OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml. A OSR pode ser adicionada durante esse estágio do processo de classificação (seja classificação de sexo ou outra forma de classificação) e/ou em adição a outro processo de etapa de método na classificação (seja classificação de sexo ou outra forma de classificação).

[053] Adicionalmente, nas modalidades alternativas, a OSR administrada na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml à amostra ou composição de célula de esperma pode ser adicionada às soluções de corante seletivo de DNA e/ou corante de têmpera. Algumas modalidades incluem uso de uma ou mais OSRs como componentes pré-misturados dos tampões, extensores, colorações, fluidos de captura, e/ou crioextensores preparados usados no procedimento de classificação de sexo. Consequentemente, a OSR pode ser adicionada à amostra de célula de esperma em uma ou mais etapas durante a classificação por sexo, incluindo quando a amostra de célula de esperma é primeiramente manuseada seguindo a coleta, e/ou colorida com um corante seletivo de DNA e/ou o corante de têmpera, e/ou no momento de coleta do citômetro de fluxo, e/ou mais tarde quando da preparação da amostra para criopreservação ao adicionar a OSR ou coquetel de OSR ao crioextensor.

[054] Do mesmo modo, algumas modalidades de classificação incluem classificação de sêmen convencional congelado-degelado, segundo o qual a OSR pode ser adicionada à amostra de sêmen degelado logo após degelar e então classificar reversamente para produzir subpopulações de célula de esperma classificada por sexo, que incluem a adição de uma OSR em uma ou mais etapas durante o procedimento de processamento estendido de seleção de gênero.

[055] Em alguns casos, quando a classificação de células de esperma não envolver classificação de sexo, um corante de têmpera sem a necessidade de um corante de coloração de DNA pode ser exigido, em cujo caso a OSR estará presente apenas no corante de têmpera para formar a amostra colorida. Desse modo, dependendo da modalidade escolhida, a OSR pode novamente ser apenas adicionada durante esse estágio do processo de classificação (seja classificação de sexo ou outra forma de classificação) ou em adição a pelo menos outra etapa de método no processo de classificação (seja classificação de sexo ou outra forma de classificação).

[056] Novamente, nas modalidades alternativas, as células de esperma classificadas por sexo coletadas (ou em modalidades alternativas, as classificadas, isto é, amostras de célula de esperma não classificadas por sexo) uma vez congeladas, antes de tal processamento adicional, precisarão ser degeladas. Antes de congelar ou mediante o degelo, o antioxidante, novamente na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml, pode ser adicionado à amostra antes de congelar e/ou à amostra degelada. Desse modo, dependendo da modalidade escolhida, a OSR pode novamente ser apenas adicionada durante esse estágio do processo de classificação (seja classificação de sexo ou outra forma de classificação) ou em adição a pelo menos outra etapa de método no processo de classificação (seja classificação de sexo ou outra forma de classificação).

[057] Em ainda outras modalidades alternativas, o período de tempo permitido a ser percorrido após a adição da OSR pode variar e pode ser na faixa de cerca de 5 segundos a cerca de 72 horas (excluindo tempo de congelamento e tempo percorrido no congelador ou no estado criopreservado), a extremidade inferior da escala fornece classificação quase imediata da amostra de esperma, enquanto que a extremidade superior da escala podería cobrir o quadro de tempo máximo típico associado a movimentar uma amostra de esperma desde seu ponto de coleta até seu ponto de classificação. Isso é normalmente um tempo de voo e/ou trajeto de estrada. Mais particularmente, os períodos de tempo podem ser cerca de 5 segundos a cerca de 3 horas; cerca de 3 horas a cerca de 6 horas; cerca de 6 horas a cerca de 12 horas; cerca de 12 horas a cerca de 18 horas; cerca de 18 horas a cerca de 24 horas; cerca de 24 horas a cerca de 36 horas; cerca de 36 horas a cerca de 48 horas; cerca de 48 horas a cerca de 60 horas; e cerca de 60 horas a cerca de 72 horas.

[058] Outra modalidade alternativa pode incluir o uso de um extensor dentro de uma faixa de pH de 5,5 à 7,8 e frequentemente aproximadamente de 6,5; aproximadamente 6,6; aproximadamente 6,7; aproximadamente 6,8; aproximadamente 6,9; aproximadamente 7,0; aproximadamente 7,1; aproximadamente 7,2; aproximadamente 7,3; aproximadamente 7,4; ou aproximadamente 7,5.

[059] Conforme descrito na modalidade ilustrada, as etapas diferentes do método são realizadas em temperaturas diferentes. Nas modalidades alternativas, pelo menos uma das etapas de método é realizada dentro de uma faixa de temperatura selecionada a partir do grupo que consiste em aproximadamente 5 °C à aproximadamente 15 °C; aproximadamente 15 °C à aproximadamente 20 °C; aproximadamente 20 °C à aproximadamente 25 °C; aproximadamente 25 °C à aproximadamente 30 °C; aproximadamente 30 °C à aproximadamente 35 °C; aproximadamente 35 °C à aproximadamente 40 °C e aproximadamente 40 °C à aproximadamente 45 °C. Isso permite que as etapas diferentes no método de classificação a ser realizado dentro de faixas de temperatura diferentes.

[060] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratar a motilidade de células de esperma em uma amostra de célula de esperma. Nessa modalidade, a amostra de célula de esperma que pode ser uma população enriquecida de gênero de células de esperma que portam cromossomo X ou que portam cromossomo Y que tem um corante de ligação de DNA ou seletivo de DNA associado ao DNA das mesmas, uma amostra classificada em uma ou mais subpopulações ou uma amostra não classificada convencional, o método para tratar a motilidade das células de esperma na amostra de célula de esperma compreende a etapa de adicionar uma OSR na faixa de concentração de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml à amostra de célula de esperma para formar uma composição de célula de esperma (e nessa modalidade em uma concentração de 0,5 mg/ml). A OSR que é adicionado forma uma parte de um extensor que está em uma faixa de pH de 6,5 a 7,5 e, em modalidades particulares, a pH é selecionada a partir de um grupo que consistem em aproximadamente 6,5; aproximadamente 6,6; aproximadamente 6,7; aproximadamente 6,8; aproximadamente 6,9; aproximadamente 7,0; aproximadamente 7,1; aproximadamente 7,2; aproximadamente 7,3; aproximadamente 7,4 e aproximadamente 7,5.

[061] Após a adição do antioxidante, um período de tempo que está na faixa de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 72 horas é permitido a passar antes da amostra se submeter a um processamento adicional na forma de, por exemplo, pesquisa ou para uso em tecnologias reprodutivas assistidas tal como IVF, AI, ICSI (assim como outras células que usam células enucleadas) e MOET (assim como outras técnicas de transferência de embrião). O período de tempo que é permitido a passar pode ser selecionado a partir da faixa que consiste em: aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 3 horas; aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas; aproximadamente 6 horas a aproximadamente 12 horas; aproximadamente 12 horas a aproximadamente 18 horas; aproximadamente 18 horas a aproximadamente 24 horas; aproximadamente 24 horas a aproximadamente 36 horas; aproximadamente 36 horas a aproximadamente 48 horas; aproximadamente 48 horas a aproximadamente 60 horas; e aproximadamente 60 horas a aproximadamente 72 horas. As técnicas para fertilizar um óvulo envolvem a etapa adicionada de misturar pelo menos um óvulo com a amostra de célula de esperma. Qualquer técnica convencional, tal como aquelas listadas acima, pode ser usada com a invenção, inclusive qualquer técnica convencional de IFV ou de AI. Técnicas típicas de IVF são reveladas no documento n- WO/0243486, por exemplo, que é incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade. As técnicas típicas de AI são reveladas na patente n-U.S. 6.149.867, por exemplo, que é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[062] Em modalidades alternativas, a amostra de célula de esperma pode ter sido uma amostra congelada que foi permitida a degelar. O método pode compreender adicionalmente a etapa de colorir a amostra de célula de esperma ou a composição de célula de esperma com um corante de DNA seletivo caso a amostra não esteja em uma amostra selecionada por sexo.

[063] O método também pode compreender a etapa de congelar a composição de célula de esperma para formar uma composição de célula de esperma congelada que pode ser permitida a degelar. Pelo menos uma dentre as etapas de método nesse segundo aspecto da presente invenção é realizada dentro de uma faixa de temperatura selecionada a partir de um grupo que consiste em aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C; aproximadamente 5 °C a aproximadamente 15 °C; aproximadamente 15 °C a aproximadamente 20 °C; aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C; aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C; aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C; aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 °C e aproximadamente 40 °C a aproximadamente 45 °C. Portanto, cada etapa de método pode ser realizada em uma faixa de temperatura diferente ou similar.

MÉTODOS SUGERIDOS

[064] A título de exemplo, o seguinte procedimento de maturação de oócito, o procedimento de IVF, o procedimento de cultura in vitro e o procedimento de cocultura podem ser usados com a invenção. Uma pessoa versada na técnica saberá que as variações desses métodos existem e que esses métodos não devem ser interpretados como limitantes da funcionalidade da atual invenção. Esses métodos são ilustrativos apenas.

[065] Coleta de oócito. Coleta oócitos de matadouro, lava IX com aproximadamente 3 ml de meio de lavagem de Hepes e com IX com TCM-199 (Invitrogen, Carlsbad, CA) + 10% de soro bovino fetal (FBS). A cultura no meio de maturação por 22 horas em um Incubador de C02 a 38,5 °C. Em uma modalidade, o meio de maturação contém TCM-199, FBS, piruvato, gonadotrofma coriônica (por exemplo, Chorulon (Internet, Summit NJ)), hormônio folículo estimulante (FSH) (por exemplo, Folltropin (Bioniche, Belleville, Canada)), estradiol e pelo menos um antibiótico. Em uma modalidade adicional, Amicacina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pode ser usada como o antibiótico. Em outra modalidade, o meio de maturação também pode compreender um hormônio luteinizante.

[066] Em uma modalidade, o meio de maturação pode compreender de 5 a 20 ml de TCM-199 EarTs; 0,5 a 2 ml de FBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); de 10 a 30 μΐ de piruvato (preparado através da adição de 0,05 a 0,20 g de piruvato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 5 a 20 ml de solução salina); de 50 a 200 μΐ de gonadotrofma coriônica (preparada através da adição de 5 a 20 UI de Chorulon (Intervet, Summit NJ) a 5-20 ml de TCM-199 EarTs); de 5 a 20 μΐ de FSH (preparado através da adição de 0,001 a 0,01 g de Folltropin (Bioniche, Belleville, Canada) a 5 a 20 ml de TCM-199 EarTs); de 5 a 20 μΐ de estradiol (preparado através da adição de 0,001 a 0,05 g de estradiol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 5 e 20 ml de Etanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)); e de 10 a 30 μΐ de Amicacina (preparada através da adição de 0,1 a 1 g de sulfato de sódio de Amicacina (Sigma-Aldrich) a 20 a 40 ml de solução salina). Em modalidades alternativas, o meio de maturação pode compreender os componentes supracitados que usam volumes diferentes, porém mutuamente na mesma proporção, por exemplo, em uma modalidade, o meio de maturação pode compreender de 10 a 40 ml de TCM-199; de 1 a 4 ml de FBS; 20-60 μΐ de piruvato de sódio, etc. Em uma modalidade adicional, o meio de maturação compreende as preparações acima de TCM-199 EarTs, FBS, piruvato, gonadotrofína coriônica, FSH, estradiol e um antibiótico na razão aproximada de 9 : 1 : 0,02 : 0,1 : 0,01: 0.01 : 0,02 em volume, respectivamente.

[067] Fertilização in Vitro. Retira células de cumullus de oócitos maturados. Transfere as mesmas a um prato de fertilização e retoma ao incubador de CO2. Degela palhetas de sêmen congeladas com o uso de procedimentos padrões, centrifuga em 800 μΐ de gradiente de Esperma Puro (Nidacon, Molndal, Suécia), ou um gradiente de percoll ou similar a 2500 rpm por 10 minutos para remover componentes de óvulo, glicerol e outros detritos. Remover sobrenadante, sendo que deixa um pélete solto de esperma vivo. Combinar os péletes com o uso de uma pequena quantidade de meio de fertilização e repeletizar a 1500 rpm por 3 minutos. Remover cuidadosamente 0 sobrenadante. Então, suavemente misturar 0 pélete. Após determinar a dose de inseminação desejada, inseminar os oócitos através da adição de esperma ao pélete, então cultivar em um prato e retomar ao incubador de CO2 por aproximadamente de 18 a 22 horas.

[068] Cultura In Vitro. Remover zigotos presumíveis a partir de prato de fertilização e transferir para um tubo eppendorf de 1,5 ml estéril. Permitir que os zigotos formem um pélete solto e removam meio em excesso para formar uma a razão de 1 : 1 de pélete e solução. Limpar 0 tubo eppendorf com TCM-199, colocar os teores em um prato e lavar com meio de BSA. Então, zigotos presumíveis de cultura (descartar oócitos desfigurados, assim como oócitos com citoplasma de cor amarela ou citoplasma vacuolado) em um incubador de gás duplo (5% C02, 5% O2) a 38,5 °C por aproximadamente 48 horas.

[069] Cocultura. Transferir os zigotos clivados aos pratos de cocultura que compreendem as células de cumullus dos oócitos maduros e o meio de FBS cobertas com óleo mineral e incuba em um em um incubador de C02 a 38,5 °C até que necessário.

[070] Avaliações de motilidade de esperma por CASA. Uma comparação de câmaras e slides de visualização pode ser feita em uma variedade de instrumentos IVOS, que, por exemplo, que podem ser apenas um IVOS Hamilton-Thome (Hamilton-Thorne, Beverly, MA). As configurações de instrumento: captura de imagem; quadros por segundo = 60; número de quadros = 30; detecção de célula; contraste mínimo = 50; tamanho de célula mínimo = 5; padrões, tamanho de célula = 5; intensidade de célula = 50; células progressivas, velocidade de trajeto = 50 pm/s; retidão > 70%; células lentas (pm/s); velocidade de trajeto média (VAP, <30 pm/s), velocidade em linha reta (VSL, <15 pm/s). As variáveis de motilidade por CASA medidas podem ser uma porcentagem de esperma móvel total (móvel), porcentagem de esperma móvel progressivamente (progressivo), VAO, VSL, velocidade curvilínea (VCL, pm/s), deslocamento de cabeça lateral média (ALK, um) e o número de vezes em que a cabeça de esperma atravessa o trajeto/s de meio (BCF, Hz), motilidade de esperma em linha reta (STR, %) e motilidade de esperma em linha (LIN, %). Consulte, por exemplo, Lenz, RW, et al., J Anim Sei (2011) 89:383-388, incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[071] Um aspecto adicional da presente invenção confere o uso de uma amostra de célula de esperma tratada com uma OSR em AI. A AI na presente invenção inclui um método pelo qual a amostra de célula de esperma congelada degelada ou fresca é usada para inseminar por meio de passagem do sêmen ou da amostra de esperma no trato reprodutivo feminino, com ou sem ferramenta de fornecimento de acessórios tal como uma arma de AI, cateter ou pipeta.

[072] As amostras de sêmen congelado podem ser contidas em palhetas de sêmen que são degeladas antes do procedimento de AI com o uso de métodos padrões. Em determinadas modalidades da invenção, as palhetas de sêmen contêm aproximadamente 0,25 a 0,5 ml de fluido e são muitas vezes suficientes para uma única inseminação.

[073] Para aumentar o número de prole que uma fêmea pode produzir, técnicas de transferência de embrião (tais como MOET) foram desenvolvidas e são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Técnicas de transferência convencionais de embrião incluem injeção de fêmeas com hormônios artificiais que fazem com que os mesmos produzam múltiplos óvulos (oócitos) em um único ciclo do cio. Esse processo é muitas vezes denominado como superovulação. Cada fêmea é, então, artificialmente inseminada com uma amostra de célula de esperma de um macho que ou está fresca ou foi criopreservada.

[074] Em outro aspecto da invenção, os zigotos e/ou os embriões das fêmeas inseminadas artificialmente podem ser recuperados e, então, cultivados e/ou criopreservados/vitrificados. EXEMPLO 1 [075] Um conjunto de sêmen de cada touro foi usado como um controle enquanto os conjuntos remanescentes de amostras de sêmen foram adicionados vitamina B12, como o antioxidante em concentrações respectivas de 0,5 mg/ml e 0,25 mg/ml. Para cada amostra, a mesma concentração de vitamina B12 foi adicionada (i) durante o processo de coração e (ii) no fluido de captura do vasilhame de coleta. As amostras de controle não contêm a vitamina B12. As amostras de esperma foram classificadas em modo de “Pureza alta” e o esperma classificado por sexo coletado foi estendido com um crioextensor que em alguns casos conteve novamente a mesma concentração de vitamina B12 e as amostras foram congeladas. Três horas após o degelo (que é um quadro de empo padrão para conduzir a estimativa de controle de qualidade nas amostras de esperma degeladas congeladas classificadas) as amostras degeladas foram passadas por CASA, uma máquina que fornece vários dados de esperma inclusive a motilidade e as informações de motilidade progressiva. Os resultados foram mostrados abaixo na Tabela 1 e a motilidade e a motilidade progressiva são representadas graficamente na Figura 2.

[076] Nas tabelas abaixo: a VAP (velocidade de trajeto média (pm/s)); a VSL (velocidade em linha reta (pm/s)); a VCL (velocidade curvilínea (pm/s)); o ALH (deslocamento de cabeça lateral média (pm)); BCF (o número de vezes em que a cabeça de esperma através o trajeto/s de meio em Hz); a STR (motilidade de esperma em linha reta em porcentagem); LIN (motilidade de esperma linear em porcentagem); PIA (acrossomos intactos em porcentagem); móvel (esperma móvel em porcentagem); e progressivo (esperma móvel progressivamente em porcentagem).

[077] Os resultados de adição de duas etapas representam tratamentos com vitamina B12 presente na mesma concentração indicada no fluido de captura do vasilhame de coleta e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra antes (congelamento de duas etapas; -+ +); os resultados de adição de três etapas indicam que a mesma concentração de vitamina B12 foi adicionada durante a etapa de coração, a etapa de coleta (no fluido de captura do vasilhame de coleta) e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra (3 etapa). Não há correlação em relação aos nomes determinadas aleatoriamente tal como “Touro A.” Touro A do Exemplo 5 não é o mesmo touro que o Touro A do Exemplo 7. TABELA 1 - MOTILIDADE (2 ETAPAS E 3 ETAPAS) (3 HORAS APÓS O DEGELO) EXEMPLO 2 [078] Em outras séries de experimentos, os resultados de CASA em relação à motilidade e à motilidade progressiva após 4,5 horas após o degelo de amostras classificadas por sexo contra um controle são mostrados abaixo na Tabela 2. Os (congelamento de duas etapas) resultados indicam que a vitamina B12 na mesma concentração estava presente no fluido de captura do vasilhame de coleta e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra; os (3 etapa) indicam que a mesma concentração de vitamina B12 foi adicionada durante a etapa de coração, a etapa de coleta (no fluido de captura do vasilhame de coleta) e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra.

[079] Em relação ao “Touro A,” os dois conjuntos de resultados mostrados foram obtidos em dois dias diferentes com uso de amostras degeladas a partir da mesma porção de esperma inicialmente classificada. Em ambos os casos, a concentração da vitamina B12 era de 1 mg/ml. Para todos os outros touros na tabela abaixo, a menos que indicado do contrário, a concentração de vitamina B12 adicionada também foi de 1 mg/ml. TABELA 2 - MOTILIDADE (4,5 HORAS PÓS-DEGELO) EXEMPLO 3 [080] Em um experimento adicional, a motilidade e a motilidade progressiva foram verificadas 3,75 horas após o degelo da amostra de sêmen classificado por sexo tratada com o antioxidante. A OSR não foi adicionada à amostra de controle. A amostra de sêmen foi derivada a partir de um único touro. A concentração de 0,25 mg/ml de vitamina B12 foi adicionada à amostra de teste durante a etapa de coração, a etapa de coleta (no fluido de captura do vasilhame de coleta) e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento de amostra. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3 - MOTILIDADE (3,75 HORAS PÓS-DEGELO)_____ EXEMPLO 4 [081] Um experimento foi designado para testar o efeito de Células de esperma tratadas com OSR no desenvolvimento de óvulos fertilizados com aquelas células de esperma. Nesse experimento, sêmen de touro de dois touros foi classificado por sexo com citometria de fluxo, com a vitamina B12 presente em concentrações iguais usado para marcar as células de esperma, no fluido de captura do vasilhame de coleta e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra escolhida por sexo (3 etapa). Para cada touro, três concentrações diferentes de vitamina B12 foram testadas: 0,05 mg/ml, 0,15 mg/ml e 0,25 mg/ml. As amostras de controle não foram tratadas com vitamina B12.

[082] Os oócitos de matadouro foram coletados e lavados IX com aproximadamente 3 ml de meio de lavagem de Hepes e com IX com TCM-199 Ί" 10% FBS. Os oocitos foram, então, cultivados no meio de maturaçao por 22 horas em um incubador de CO2 a 38,5 °C. As células de cumullus foram retiradas de oócitos maturados transferidos a um prato de fertilização e retornadas ao incubador de CO2.

[083] As palhetas de sêmen congeladas foram degeladas através do uso de procedimentos padrões e centrifugadas em 800 pl de gradiente de Esperma Puro a 2500 rpm por 10 minutos a fim de remover óvulo, glicerol e outros detritos. O sobrenadante foi removido, deixando um pélete solto de esperma vivo. Os péletes foram combinados através do uso de uma pequena quantidade de meio de fertilização e repeletizados a 1500 rpm por 3 minutos. O sobrenadante foi, então, cuidadosamente removido e o pélete foi suavemente misturado. Após determinar a dose de inseminação desejada, os oócitos maturados foram, então, inseminados adicionando-se esperma ao pélete, cultivados em um prato e retomados ao incubador de CO2 por aproximadamente de 18 a 22 horas.

[084] Os zigotos presumíveis foram removidos do prato de fertilização e transferidos para um tubo eppendorf de 1,5 ml estéril. Os zigotos foram permitidos para formar um a pélete solto e um meio em excesso foi removido para formar uma razão de 1 : 1 de pélete e solução. O tubo eppendorf foi agitado em vortex por 90 segundos e, então, limpado com TCM-199. Os terrores foram colocados em um prato e, então, lavados com o meio de BSA. Os zigotos presumíveis de cultura foram, então, cultivados em um incubador de gás duplo (5% CO2, 5% O2) a 38,5 °C por aproximadamente 48 horas. Os zigotos clivados foram, então, transferidos aos pratos de cocultura que compreendem as células de cumullus dos oócitos maduros e do meio de FBS coberto com óleo mineral e incubados em um incubador de CO2 a 38,5 °C.

[085] Os embriões foram observados 7 dias após a IVF para verificar: Zig (0 número de zigotos colocados em cultura); 4 a 2C (o número de zigotos que se submeteram à transição de 2 células a 4 células 48 horas após a IVF); 8C (o número de zigotos com 8 células 48 horas após a IVF); 8C% (a porcentagem de zigotos que têm 8 células 48 horas após IVF); % Clv (clicado em porcentagem 48 horas após a IVF); Cl (número de blastocistos expandidos e de incubação e incubados 7 dias após a IVF); Cl- (número de blastocisto 7 dias após IVF); e C2 (número de blastocistos precoces e mórulas compactas 7 dias após IVF), Embriões Totais (número total de blastocistos = C1+ Cl- + C2); Blasto % (porcentagem de zigotos cultivados que resultam em formação de blastocisto); n- de Incubação (o número de embriões que se dispersam da zona palucida em preparação para implantação observada em 8,5 dias após a IVF); e Incubação % (porcentagem de embriões que se dispersam da zona). Os resultados foram fornecidos na tabela 4 abaixo. TABELA 4 - IVF - EMBRIÃO/ FERTILIZAÇÃO (3 ETAPA) EXEMPLO 5 [086] Um experimento similar, conforme feito no Exemplo 4 foi feito para testar o efeito das Células de esperma tratadas com OSR no desenvolvimento de óvulos fertilizados com o uso de uma maior concentração de antioxidante, em comparação ao antioxidante das concentrações anteriores. As amostras de sêmen dos dois touros de diferentes raças (um Holstein; um Jersey) foram classificados por sexo com o uso de citometria de fluxo, novamente com uso da vitamina B12 como antioxidante, presentes em concentrações iguais durante coloração, no fluido de captura do vasilhame de coleta e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra escolhida por sexo (3 etapa). Para cada touro, as duas concentrações de vitamina B12 testadas foram: 0,5 mg/ml e 0,25 mg/ml. As amostras de controle não forma tratas com vitamina B12. Todas as etapas experimentais foram feitas as mesmas, conforme no Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. ______TABELA 5 - IVF - FERTILIZAÇÃO DE EMBRIÃO (3 ETAPA) Exemplo 6 [087] Outro experimento similar aos Exemplos 4 e 5 foi realizado para testar o efeito reprodutível de Células de esperma tratadas com OSR em relação a um único touro monitorando-se o desenvolvimento de embriões. O Touro A (.Holstein) foi amostrado três vezes diferentes; o Touro B foi amostrado cinco vezes diferentes; o Touro C apenas uma vez; todas as amostras de sêmen foram submetidos a procedimentos de classificação por sexo padrão com o uso de citometria de fluxo com vitamina B12 como a OSR e 0,25 mg/ml durante as etapas de coloração, coleta no fluido de captura e anterior à criopreservação (3 etapa). As amostras de controle não foram tratadas com vitamina B12. Todas as etapas experimentais foram feitas as mesmas, conforme no Exemplo 4. Os resultados são fornecidos na Tabela 6 abaixo.

______TABELA 6 - IVF (3 ETAPA) - CAPACIDADE DE REPRODUÇÃO EXEMPLO 7 [088] Um experimento de escala maior foi feito par atestar adicionalmente a capacidade de reprodução similar ao texto feito nos Exemplos 6 e 7, porém testando-se cada um dos touros três vezes separados. As Amostras de sêmen dos cinco touros foram amostradas e classificadas por sexo como uso de citometria de fluxo, com conformidade com os procedimentos anteriores e tratados com 0,25 mg/ml vitamina B12 como a OSR (3 etapa). As amostras de controle não foram tratadas com vitamina B12. TABELA 7 - EFEITO MEDIADO (HOLSTEIN E JERSEY MIX) EXEMPLO 8 [089] Em um experimento adicional, a motilidade pós-degelo e a motilidade progressiva foram verificados com o uso de CASA em 0, 3 e 5 horas após degelo das amostras de sêmen classificadas por sexo (classificadas através do uso de citometria de fluxo) tratadas com vitamina B12 como o antioxidante. A OSR não foi adicionada às amostras de controle. As amostras de sêmen foram derivadas de dois touros Holstein. A concentração de 0,25 mg/ml de vitamina B12 foi adicionada à amostra de testes durante a etapa de coração, a etapa de coleta (no fluido de captura do vasilhame de coleta) e no extensor crioprotetor anterior ao congelamento de amostra (3 etapa). Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo. TABELA 8 - MOTILIDADE PÓS-DEGELO (3 ETAPA)______ EXEMPLO 9 [090] Em um experimento adicional, a motilidade e a motilidade progressiva foram verificadas as 0 hora e 3 horas após degelar as amostras de sêmen classificado por sexo (classificado com o uso de citometria de fluxo) tratadas com o antioxidante, a vitamina B12. A OSR não foi adicionada à amostra de controle. As amostras de sêmen foram derivadas de duas raças diferentes de touro, um deles um Holstein e o outro um Texas Longhorn. Uma concentração de 0,25 mg/ml de vitamina B12 foi adicionada às amostras de teste ou (i) durante a etapa de etapa de coloração (1 etapa-coloração), (ii) a etapa de coloração e a etapa de coleta (no fluido de captura do vasilhame de coleta) (2 etapa-coloração), (iii) na etapa de coloração, na etapa de coleta e na etapa de congelamento (no extensor crioprotetor anterior ao congelamento da amostra) (3 etapa) - Tabela 9 (A) por 3 h e (B) por 0 h, ou (iv) apenas anterior à etapa de criopreservação (1 etapa-congelamento) - Tabela 9 (C) por 3 h. TABELA 9 (A) - 3 H MOTILIDADE PÓS-DEGELO (3 ETAPA, 2 ETAPA-COLORACÃO, 1 ETAPA-COLORAÇÃO) TABELA 9 (B) - 0 H MOTILIDADE PÓS-DEGELO (3 ETAPA, 2 ETAPA-COLORAÇÃO, 1 ETAPA-COLORAÇÃO) ________TABELA 9 (C) - 3 H MOTILIDADE PÓS-DEGELO (1 ETAPA-CONGELAMENTO) EXEMPLO 10 [091] Um experimento adicional foi conduzido para estimar a taxa de gravidez de bovinos fêmeas inseminadas com amostras de células de esperma classificados tratadas com um antioxidante. As amostras de sêmen dos dois touros foram classificadas por sexo através do uso do protocolo descrito acima. A concentração de 0,25 mg/ml de vitamina B12 foi adicionada às amostras de teste durante a etapa de coloração, a etapa de coleta (no fluido de captura do vasilhame de coleta) e a etapa de congelamento (3 etapa).

[092] As amostras de célula de esperma classificado que contêm palhetas de sêmen congelado foram desgeladas através do uso de procedimentos padrões. Uma pistola para inseminação artificial (AI) foi aquecida conforme necessário para se aproximar a temperatura corporal do recipiente e uma palheta foi colocada no tambor da pistola de inseminação. A extremidade vedada da palheta foi cortada e uma bainha de plástico foi colocada sobre a palheta e a pistola para propósitos higiênicos. A fêmea foi colocada previamente em um tiro de restrição para inseminação. A pistola foi enfiada através da vagina e do colo de útero e o sêmen distribuído no corpo uterino. 384 fêmeas foram inseminadas, cada uma inseminada com uma única célula de esperma e cada dose contém 2,1 milhões de células de esperma em 0,25 ml. As verificações de gravidez foram feitas 33 a 40 dias após a inseminação com uma máquina de ultrassom. Os resultados são mostrados na Tabela 10 abaixo. TABELA 10 - GESTAÇÕES (3 ETAPA) __________________ EXEMPLO 11 [093] Os ensaios de campo de gravidez adicionais foram realizados com o uso do sêmen classificado por sexo tratado com vitamina B12 a 0,25 mg/ml adicionada às amostras de teste durante a etapa de coloração, a etapa de coleta e de novo na etapa de congelamento (3-etapa), conforme feito no Exemplo 10, foi avaliado outra vez, através de observação, usando do sêmen de cinco Holstein touros diferentes. Cada amostra de sêmen foi dividida em grupos de controle e de tratamento por vitamina B12 (0,25 mg/ml) e inseminado posteriormente em vitelas recipientes primíparas. As verificações de gravidez foram feitas 33 a 40 dias após a inseminação através do uso de ultrassom. Os resultados são mostrados na Tabela 11 abaixo. TABELA 11 - GESTAÇÕES (3 ETAPA) EXEMPLO 12 [094] Os níveis de fragmentação de DNA também foram triados com o uso de um kit de “Halomax para animais” de fragmentação de DNA (Halotech DNA, sl, Madri, Espanha) para determinar se existiram quaisquer efeitos vantajosos do uso de antioxidantes durante a coloração e processamento de esperma classificado por sexo. Duas raças diferentes de gado, Jersey e Holstein, foram examinadas com o uso de duas concentrações diferentes de antioxidante, 0,25 mg/ml e 0,5 mg/ml de vitamina B12, sendo que o protocolo da 3 etapa adiciona a mesma concentração de OSR durante a coloração de célula, no fluido de captura de coleção e anterior à criopreservação. Um dos touros foi usado para avaliar o efeito da adição ou omissão de OSR em uma ou mais das etapas de classificação de esperma. A motilidade e o nível de fragmentação de DNA foram ambos gravados. Os resultados são mostrados na Tabela 12 abaixo. TABELA 12 - FRAGMENTAÇÃO DE DNA (1 ETAPA-COLORAÇÃO, 2 ETAPA, 3 ETAPA) EXEMPLO 13 [095] O efeito da OSR na motilidade foi avaliado como uma função da concentração do esperma classificado por sexo na palheta congelada. Os testes foram realizados com o uso de vitamina B12 em relação ao OSR em três concentrações diferentes do antioxidante: 0,15 mg/ml, 0,25 mg/ml e 0,35 mg/ml, todos foram adicionados às amostras de teste durante a etapa de coloração, a etapa de coleta e de novo na etapa de congelamento (3-etapa), conforme feito no Exemplo 8. O esperma de Holstein foi avaliado em três concentrações de células de esperma diferentes com base perante o número total de esperma por palheta: 1 milhão de esperma/palheta, 2,1 milhões esperma/palheta e 5 milhões de esperma/palheta. A motilidade foi gravada 3 h pós-degelo.

[096] Uma amostra de esperma de Jersey também foi avaliada da mesma maneira através do uso de 0,15 mg/ml ou 0,25 mg/ml vitamina B12 em cada um dos três estágios (3 etapa), mas apenas nas 2,1 milhões esperma/palheta concentração. Os resultados são mostrados na Tabela 13. TABELA 13 - CONCENTRAÇÃO DE CÉLULA DE ESPERMA CONGELADA (3 ETAPA) EXEMPLO 14 [097] O efeito de uma OSR diferente na motilidade de esperma bovino foi avaliado após zero hora e um período de três horas pós-degelo. A OSR, α-tocoferil, uma forma de Vitamina E, foi adquirida como “sebacato polioxietill-a-tocoferil” em uma solução mãe de 15% (Aldrich). Os testes foram realizados com o uso de α-tocoferil como a OSR, em três concentrações diferentes: 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml e 0,5 mg/ml, todas foram adicionadas às amostras de teste durante a etapa de coloração, a etapa de coleta e de novo na etapa de congelamento (3-etapa), conforme feito nos Exemplos anteriores. O esperma Holstein de classificado por sexo foi avaliado com o uso uma concentração de esperma padrão de 2,1 milhões esperma/palheta processada a partir de três touros separados. A motilidade das amostradas tratadas foram comparadas a controles não tratados e gravados em 0 h e 3 h pós-degelo. TABELA 14 - MOTILIDADE COM A-TOCOFERIL (VITAMINA E) (3 ETAPA) EXEMPLO 15 [098] O efeito de um terço de OSR na motilidade de esperma bovino foi avaliado após os períodos de zero hora, de três horas e de seis horas pós-degelo. O alfa-cetoglutarato (AKG) foi feito recentemente e usado em três concentrações diferentes: 0,25 mg/ml, 0,35 mg/ml e 0.45 mg/ml, todas foram adicionadas às amostras de teste durante a etapa de coloração, a etapa de coleta e de novo na etapa de congelamento (3-etapa), conforme feito nos Exemplos anteriores. O esperma bovino Holstein e Jersey classificado por sexo foram avaliados com o uso de uma concentração padrão de 2,1 M esperma/palheta. A motilidade das amostras tratadas foi comparada aos controles não tratados em 0 h, 3 h e 6 h pós-degelo. TABELA 15 - ALFA-CETOGLUTARATO (AKG) (3 ETAPA) EXEMPLO 16 [099] O efeito da combinação de dois antioxidantes na motilidade de esperma bovino foi avaliado após os períodos de zero hora, de três horas e de seis horas pós-degelo. A vitamina B12 foi usada em 0,25 mg/ml e o alfa-cetoglutarato fresco (AKG) foi usado em 0,35 mg/ml. Tanto a vitamina B12 como o AKG ou ambos os tratamentos foram adicionados nas concentrações designadas durante a etapa de coloração, a etapa de coleta e de novo na etapa de congelamento (3-etapa), conforme feito antes. O esperma classificado por sexo dos três touros de Jersey foi avaliado com o uso de 2,1 M esperma/palheta padrão. A motilidade das amostras tratadas foi comparada aos controles não tratados em 0 h, 3 h e 6 h pós-degelo. TABELA 16 - COMBINAÇÃO AKG, VITAMINA B12 E COMBINAÇÃO (3 ETAPA) EXEMPLO 17 [100] Em um experimento adicional, a motilidade e a motilidade progressiva de esperma de cervo fêmea e macho classificado por sexo foram verificadas em 0, 1 e 3 horas após o degelo das amostras de sêmen classificado por sexo que foram tratados com a antioxidante, vitamina B12 em duas concentrações: 0,25 mg/ml e 0,35 mg/ml, todas as amostras foram tratadas durante a coloração, captura e anterior à criopreservação (3 etapa). A OSR não foi adicionada à amostra de controle. As amostras de sêmen foram derivadas a partir de dois veados-de-cauda-branca. Cada amostra foi classificada para tanto populações enriquecidas de macho como fêmea de esperma. TABELA 17 - CERVO (MACHO E FÊMEA) - VITAMINA B12 (3 ETAPA) EXEMPLO 18 [101] Em outro experimento, a motilidade progressiva de sêmen convencional (isto é, não classificado) foi comparada a sêmen convencional tratado com vitamina B12 em uma concentração de 0,25 mg/ml e AKG em uma concentração de 0,35 mg/ml (o “tratamento antioxidante”) em 0,1 e 3 horas pós-descongelamento.

[102] O sêmen de 1.159 touros foi obtido. Ejaculações em bruto foram diluídas 1:1 com um meio à base de Tris que contém 20% de gema de ovo. O meio à base de Tris usado com o grupo de tratamento também continha o tratamento antioxidante, enquanto o meio à base de Tris usado com o grupo controle não continha. Ejaculações foram resfriadas a 4 °C. Após 90 minutos um crioextensor à base de glicerol foi adicionado às ejaculações. O crioextensor à base de glicerol usado com o grupo de tratamento também continha o tratamento antioxidante, enquanto o crioextensor à base de glicerol usado com o grupo controle não continha. Permitiu-se que as ejaculações repousassem por pelo menos 2 horas antes de serem colocadas em pistolas de inseminação artificial e depois congeladas em nitrogênio líquido. As pistolas foram descongeladas e a motilidade após o descongelamento das ejaculações foi verificada à 0 e às 3 horas.

[103] A motilidade à 0 hora após o descongelamento media 61,08 (SE = 0,48) para o grupo controle e 65,13 (SE = 0,76) para o grupo de tratamento. A motilidade às 3 horas após o descongelamento media 49,85 (SE = 0,77) para o grupo controle e 59,78 (SE = 1,16) para o grupo de tratamento. A convergência (motilidade após 3 horas do descongelamento/motilidade após 0 hora do descongelamento) para o grupo controle media 0,80 (SE = 0,01) e 0,92 (SE = 0,01) para o grupo de tratamento.

[104] Conforme pode ser facilmente entendido a partir do precedente, os conceitos básicos da presente invenção podem ser incorporados de uma variedade de maneiras. Como tal, as modalidades, os elementos, os termos ou as expressões em particular revelados pela descrição ou mostrados nas Figuras anexadas a esse pedido não são destinados a serem limitantes, mas, no entanto, são exemplos das modalidades numerosas e variadas abrangidas genericamente pela invenção ou seus equivalentes com relação a qualquer elemento em particular da mesma. Adicionalmente, a descrição especifica de uma única modalidade ou elemento da invenção pode não descrever explicitamente todas as modalidades ou elementos possíveis, muitas alternativas são reveladas implicitamente através da descrição e das Figuras.

[105] Deve-se entender que cada elemento de um aparelho ou cada etapa de um método pode ser descrito por um termo de aparelho ou termo de método. Tais termos podem ser substituídos quando se deseja tornar explicito a cobertura ampla implicitamente a qual essa invenção é destinada. Como exemplo, deverá ser entendido que todas as etapas de um método podem ser reveladas como uma ação, um meio para tomar essa ação ou como um elemento que causa essa ação. Similarmente, cada elemento de um aparelho pode ser revelado como o elemento físico ou a ação a qual o elemento físico facilita. Como outro exemplo, a revelação de um “classificador” deverá ser entendida como abrangendo a revelação do ato de “classificação”, tanto discutido explicitamente ou não, e, de modo contrário, a revelação eficaz do ato de “classificar” deverá ser entendida como abrangendo a revelação de um “classificador”. Tais termos alternativos para cada elemento ou etapa devem ser entendidos a serem incluídos explicitamente na descrição.

[106] Adicionalmente, deverá ser entendido que a menos que a utilização de um termo específico nesse pedido seja consistente com o uso comum e a interpretação daquele termo, as definições de dicionário deverão ser entendidas a serem incluídas na descrição para cada termo conforme contido no Random House Webster ’s Unabridged Dictionary, Segunda Edição, cada definição por meio dessa incorporada a título de referência.

[107] Além disso, para esses propósitos da presente invenção, o termo “um” ou “uma” antes de um item também se refere a um ou mais daqueles itens, por exemplo, “um contentor” se refere a um ou mais dos contentores. Como tal, os termos “um” ou “uma”, “um ou mais” e “pelo menos um(a)” podem ser usados intercambiavelmente no presente documento. Ademais, conforme usado no presente documento o termo “ou” significa "e/ou" a menos que indicado especificamente do contrário.

[108] A seção de antecedentes desse pedido de patente fornece uma declaração do campo de empenho o qual a invenção pertence. Essa seção também pode ser incorporada ou conter parafraseamento de certas patentes dos Estados Unidos, pedidos de patente, publicações ou matéria da invenção reivindicada úteis em relatar informações, problemas ou preocupações sobre o estado da tecnologia o qual a invenção é puxada em direção. Não é desejo que qualquer patente dos Estados Unidos, pedido de patente, publicação, declaração ou outra informação citada ou incorporada no presente documento seja interpretada, entendido ou considerada para ser admitida como técnica anterior em relação a presente invenção e os termos usados nesses documentos anteriores que podem ser similarmente usados nessa revelação, não deverão alterar a definição desejada desses mesmos termos conforme definido ou destinado no presente documento.

[109] As reivindicações apresentadas nesse relatório descritivo, se houverem, são por meio desse incorporado a título de referência como parte da descrição da presente invenção e o requerente reserva expressamente o direito ao uso de toda ou uma porção de tal conteúdo incorporado como descrição adicional ao suporte de qualquer ou todas as reivindicações ou qualquer elemento ou componente do mesmo. O requerente ainda reserva expressamente o direito de mover qualquer porção ou todo o conteúdo incorporado de tais reivindicações ou qualquer elemento ou componente do mesmo da descrição nas reivindicações ou vice versa, conforme necessário para definir a invenção para qual a proteção é procurada através desse pedido ou através de qualquer pedido ou continuação, divisão ou pedido de continuação em parte subsequente da mesma ou para obter qualquer benefício para redução em taxas em conformidade com as leis de patente relevantes, regras ou regulações de qualquer país ou tratado e tal conteúdo incorporado deverá sobrevier a toda a pendência desse pedido assim como qualquer continuação, divisão, pedido de depósito de continuação em parte ou qualquer reexpedição ou extensão subsequente do mesmo.

[110] As reivindicações apresentadas neste relatório descritivo são destinadas a descrever os marcos e limites de um número limitado das modalidades preferidas da invenção e não devem ser entendidas como a modalidade mais ampla da invenção ou uma listagem completa de modalidades da invenção que podem ser reivindicadas. O requerente não renuncia qualquer direito a desenvolver reivindicações adicionais com base sob a descrição apresentada acima como uma parte de qualquer continuação, divisão ou continuação em parte ou aplicação similar.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Composição de célula de esperma caracterizada por compreender uma amostra de célula de esperma e vitamina BI2, ou um vitâmero de vitamina B12 em uma concentração na faixa de 0,01 mg/ml a 1 mg/ml.

2. Composição de célula de esperma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente alfa cetoglutarato em uma concentração na faixa de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml.

3. Composição de célula de esperma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela concentração de alfa cetoglutarato acrescentada, ser selecionada a partir do grupo que consiste em: 0,01 a 5,0 mg/ml; 0,01 a 0,25 mg/ml; 0,01 a 0,5 mg/ml; 0,01 a 1 mg/ml; 0,01 a 2,5 mg/ml; 0,01 a 5 mg/ml; 0,05 a 0,1 mg/ml; 0,05 a 1,0 mg/ml; 0,05 a 2,5 mg/ml; 0,1 a 0,25 mg/ml; 0,1 a 0,5 mg/ml; 0,1 a 1 mg/ml; 0,1 a 2,5 mg/ml; 0,1 a 5 mg/ml; 0,15 para 0,45 mg/ml; 0,15 a 0,5 mg/ml; 0,25 a 0,35 mg/ml; 0,25 a 0,5 mg/ml; 0,25 a 1 mg/ml; 0,25 a 2,5 mg/ml; 0,25 a 5 mg/ml; 0,35 a 0,5 mg/ml; 0,35 para 1 mg/ml; 0,35 a 2,5 mg/ml; 0,35 a 5 mg/ml; 0,5 a 1 mg/ml; 0,5 a 2,5 mg/ml; 0,5 a 5 mg/ml; 1 a 2,5 mg/ml; e 1 a 5 mg/ml.

4. Composição de célula de esperma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela concentração da vitamina BI2, ou vitâmero de vitamina BI2, ou alfa cetoglutarato, ser selecionado a partir do grupo que consiste em: de 0,05 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,35 mg/ml; 0,45 mg/ml; e 0,5 mg/ml.

5. Composição de célula de esperma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela concentração da vitamina BI2, ou vitâmero de vitamina BI2, ou alfa cetoglutarato, ser selecionado a partir do grupo que consiste em: 0,15 mg/ml; 0,25 mg/ml; e 0,35 mg/ml.

6. Composição de célula de esperma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela composição de célula de esperma ser criopreservada.

7. Composição de célula de esperma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela amostra de célula de esperma ser derivada de um humano, um bovino, um suíno, um ovino, um equino, um veado, um alce, um búfalo, um canino, um felino, um chimpanzé ou gorila, ou baleia, golfinho ou outro mamífero marinho.