JP2009244080A - 蛍光検出装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光検出装置は、流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を散乱させる光散乱板と、散乱した蛍光の一部を取り込んで受光することにより、受光信号を出力する光電子増倍管およびフォトダイオードが、並列して構成された受光部と、この受光部の光電子増倍管から出力した受光信号に基づいて求められるパルス信号の計数値と、フォトダイオードから出力した受光信号に基づいて求められる受光信号積分値とのいずれか一方を選択することにより、測定対象物の発する蛍光強度を求める処理部と、を有する。
【選択図】図4
Description
蛍光検出装置では、蛍光強度を出力するために、光センサとして光電子増倍管(PMT)が用いられ、この蛍光強度の算出には、アナログ計測方式あるいはフォトンカウンティング計測方式が用いられる。
このため、微弱の蛍光から、強度の強い蛍光まで、1つの計測装置で幅広いレンジで精度良く計測することができない。
あるいは、前記処理部は、前記フォトダイオードからの受光信号に基づいて求められた前記受光信号積分値が設定された値以下の場合、前記計数値から蛍光強度の値を求め、前記受光信号積分値が設定された値を超える場合、前記処理部は前記受光信号積分値から蛍光強度の値を求めることも同様に好ましい。
あるいは、前記光電子増倍管および前記フォトダイオードの少なくともいずれか一方と前記光散乱体との間に、蛍光の光量を調整する絞り板が設けられ、前記設定された値において、前記計数値から求められる蛍光強度の値と、前記受光信号積分値から求められる蛍光強度の値とが一致するように、前記絞り板が調整されることが好ましい。
図1は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ10の概略構成図である。
フローサイトメータ10は、レーザ光を測定対象とする細胞等の試料12に照射し、試料12中の一部分から発する蛍光を検出して信号処理をする信号処理装置(蛍光検出装置)20と、信号処理装置20で得られた処理結果から試料12中の測定対象物の分析を行なう分析装置80とを有する。
レーザ光源部22は、350nm〜800nmの可視光の、レーザ光を出射する部分で、主に赤色のレーザ光Rを所定の強度で出射するR光源22r、緑色のレーザ光Gを所定の強度で出射するG光源22gおよび青色のレーザ光Bを所定の強度で出射するB光源22bと、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー23a1、23a2と、レーザ光R,GおよびBからなるレーザ光をフローセル体31中の測定点に集束させるレンズ系23cと、R光源22r、G光源22gおよびB光源22bのそれぞれを駆動するレーザドライバ34r,34gおよび34bと、供給された信号をレーザドライバ34r,34gおよび34bに分配する各パワースプリッタ35と、を有して構成される。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
この構成によりレーザ光R,GおよびBが合成されて、測定点を通過する試料12を照射する照射光となる。
受光部24は、試料12に当たって前方散乱するレーザ光を集光する集光レンズ24aと、集光した光を検出する多チャンネルの前方散乱光検出ユニット24bと、遮蔽板24cと、を有する。
前方散乱光検出ユニット24bは、レーザ光の照射方向と直交し、かつ、試料12の流れる方向(図3中紙面に垂直方向)と直交する方向に、複数の検出器24dが並列配置されている。検出器24dのそれぞれは、検出信号が処理部28及び制御部29に出力されるように接続されている。検出器24dは、例えば、いずれも同じ構成をしたフォトダイオードが用いられる。このように、検出器24dを複数並列配置したのは、試料12が予め設定された測定点(レーザ光の集束点)の中心に対して位置ずれして通過するときの位置ずれの情報を得るためである。具体的には、試料12が、図3中、X方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット24bの中心位置Aより図中下側の位置(図3中矢印の方向の位置)で集束する。試料12が、図3中、X方向と反対側方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット24bの中心位置Aより図中上側の位置で集束する。この集束位置は、試料12のX方向の位置ずれ量に応じて変化する。したがって、計測した散乱光の最大強度がどの検出器24dで検出されたかによって、集束位置を知ることができる。これより、測定対象の試料12が測定点に対してどのくらい位置ずれして流れたかを知ることができる。測定した検出器24dの検知信号が処理部28及び制御部29に供給される。検知信号は、検出器24dそれぞれから出力されるので、最大値を示す検知信号を特定することで、散乱光の最大強度がどの検出器24dで検出されたか、知ることができる。また、検知信号は、データ処理の開始のためにトリガー信号として用いられる。
遮蔽板24cは、照射されたレーザ光の直接光が検出器24dで受光されないように、この直接光を遮蔽するために用いられる。
図4は、受光部26の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
レンズ系26aは、受光部26に入射した蛍光を後述する散乱板52〜56の面上で集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー26b1,26b2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ26c1〜26c3でフィルタリングして光電変換器40〜50で所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー26b1,26b2の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
光電変換器40、42,44,46,48,50には、それぞれ順に、同じフィルタ特性を有するバンドパスフィルタ26c1,26c1、同じフィルタ特性を有するバンドパスフィルタ26c2,26c2 、同じフィルタ特性を有するバンドパスフィルタ26c3,26c3が設けられている。
光電変換器40,44,48は、いずれも、図5に示すように、複数の光電子増倍管70が複数並列配置した構成のマルチチャンネル光電子増倍管となっており、処理部28は、光電子増倍管70がそれぞれで受光し出力した受光信号中のパルス信号の数をカウント(計数)し、このときのカウント値を合計することで、受光した蛍光の光子数である合計カウント値(計数値)を求める。
光電変換器40,44,48から出力される受光信号は、後述するように、蛍光強度が微弱あるいは比較的弱いとき蛍光強度の情報として用い、光電変換器42,46,50から出力される受光信号は、蛍光強度が比較的強いとき、蛍光強度の情報として用いる。
散乱板52〜56は、レンズ系26aで集光した蛍光が、散乱板52〜56の面上で集束するように配置されている。散乱板52〜56は、入射した光を散乱して、均一な散乱光とする板材である。この板材で散乱した蛍光は、光電変換器40,42に向けて、光電変換器44,46に向けて、光電変換器48,50に向けて、それぞれ同じ強度で散乱する。本実施形態では、蛍光を拡散する光散乱体の一例として散乱板を用いる。
処理部28は、所定の信号処理を行って蛍光強度の値を分析装置80に出力する部分である。
同様の処理が、マルチチャンネルの光電子増倍管で構成された光電変換器44,48からの受光信号、およびフォトダイオードで構成されている光電変換器46,50からの受光信号についても行われる。
合計カウント値及び受光信号積分値から蛍光強度の値を求める方法は、設定された参照テーブルを用いて蛍光強度の値を求める。
図6(a),(b)は、光電子増倍管を用いたときの受光信号の例を示している。
蛍光が微弱光から弱い蛍光の場合、図6(a)に示すように、パルス信号が離散的に発生する信号形態を成し、この1つのパルス信号が1つ光子に相当する。図6(a)に示す場合、4つの光子を受光したことを意味する。したがって、このパルス信号の数を計数することで、受光した光子数を知ることができ、蛍光強度を知ることができる。なお、図6(a)中、パルス信号の振幅が変動しているが、これは、光電子増倍管の増幅機構の不安定性によるものである。
すなわち、蛍光強度が微弱〜弱の範囲では、光電子増倍管からの受光信号を用いて求められる合計カウント値を、蛍光強度が中〜強の範囲では、フォトダイオードからの受光信号を用いて求められる受光信号積分値を選択して用いる。
処理部28で求める蛍光強度は、蛍光強度が徐々に強く変化する場合、蛍光強度の値も連続的に変化するため、合計カウント値と受光信号積分値との間で選択を切り替えるとき、求める蛍光強度の値が連続的に繋がるように、光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68の開口部の面積は調整される。
蛍光強度がL1以下の領域では、図7(a)の太線で示すように、合計カウント値は蛍光強度に比例して増大するが、蛍光強度L1を超えると、合計カウント値は一定値となって飽和する。これは、上述したように、パルス信号が重畳となって計数できないためである。
この場合、蛍光強度がL1以下の領域では、図7(a)に示す太線の特性を用いた蛍光強度が求められ、蛍光強度がL2〜L4の領域では、図7(b)に示す太線の特性を用いた蛍光強度が求められる。しかし蛍光強度L1〜L2の領域で蛍光強度の値が存在しないため、蛍光強度がL1以下の値から蛍光強度の値がL4に徐々に変化したとき、蛍光強度の値は連続的に繋がらない。このため、蛍光強度の値が連続して繋がるように、光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68の開口部の面積が調整される。
このように、光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68の開口部の面積を調整することにより、図7(a),(b)に示す細線のように特性を変えることができる。つまり、合計カウント値と受光信号積分値との間の選択を切り替えるとき、切り替える値において、合計カウント値から求められる蛍光強度の値と、受光信号積分値から求められる蛍光強度の値とが一致するように調整することができ、蛍光強度の値が連続して繋がるように調整できる。処理部28では、光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68の調整に応じて、参照テーブルも自働的に設定されるように構成されていることが好ましい。
この場合も、合計カウント値と受光信号積分値との間の選択を切り替えるとき、切り替える値において、合計カウント値から求められる蛍光強度の値と、受光信号積分値から求められる蛍光強度の値とが一致するように調整することができ、蛍光強度の値が連続的に繋がるように調整できる。このときも同様に、処理部28では、光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68の調整に応じて、参照テーブルも自働的に設定されるように構成されていることが好ましい。
処理部28は、検出器24dの集光位置からレーザ光の強度を求め、この強度に応じた補正係数を求める処理を一括して行うために、予め記憶されている補正テーブルを用いて補正を行う。この補正テーブルは、試料12に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と蛍光強度の値を補正するための補正係数とを関係付けて設定されたものである。
本発明では、受光信号は、後述する分析装置80において、図8(d)に示すような蛍光強度に対する試料12の頻度分布を算出し、この頻度分布から、特定の蛍光が測定されたか否かを判別するために使用する。このとき、蛍光強度が2種類存在する場合、頻度分布において2つのピークを形成する。この2つのピークの蛍光強度が近接しているとき、この2つのピークが判別できるためには、ピークの幅が狭いこと(分散が小さいこと)が必要である。図8(e)のように、1つのピークのピーク幅が広い(分散が大きい)場合、2つのピークは判別できない。図8(e)は、上述の補正をしない場合の頻度分布である。
補正は単純に補正係数を、求めた蛍光強度の値に乗算するものである。これは、蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度に応じて線形的に変化する部分を好適に用いるからである。しかし、本発明ではこれに限定されない。少なくとも蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度と対応関係にあり、この関係を用いて補正係数を定めるとよい。
一方、処理部28では、光電変換器40〜50からの受光信号を用いて、合計カウント値及び受光信号積分値を求め、例えば、合計カウント値が所定値以下の場合、合計カウント値から、合計カウント値と蛍光強度との間の特性を示す参照テーブルに基づいて、蛍光強度の値を求める。合計カウント値が所定値を超える場合、受光信号積分値から、受光信号積分値と蛍光強度との間の特性を示す参照テーブルに基づいて、蛍光強度の値を求める。
求めた蛍光強度の値に対して、先に求めた補正係数を乗算することにより、蛍光強度は補正される。
補正された蛍光強度の値は、分析装置80に供給されて、図8(d)に示すような頻度分布が作成される。
また、開口部の面積を調整可能な光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68を光電変換器40〜50の前面に設けるので、光量調整用絞り板58,60,62,64,66,68を調整することにより、微弱な蛍光から強い蛍光まで、蛍光強度の値を連続したデータとして求めることができる。
さらに、レーザ光の光強度の分布を用いた補正テーブルを用いて蛍光強度の補正を行うので、分析装置80では、ピーク幅の狭い頻度分布を得ることができる。一方、レーザ光に光強度分布が存在しても、この分布を用いて補正するので、従来のように、一定の光強度を有するレーザ光の中心部のみを蛍光の測定に使用する必要はなく、従来測定に用いられなかったレーザ光の中心部分の外側部分も蛍光の測定に使用することができる。このため、レーザ光を効率よく使用することができる。
12 試料
20 信号処理装置
22 レーザ光源部
22r R光源
22g G光源
22b B光源
23a1,23a2,26b1,26b2 ダイクロイックミラー
23c レンズ系
24,26 受光部
24a 集光レンズ
24b 前方散乱検出ユニット
24c 遮蔽板
24d 検出器
26a 集束レンズ
26c1,26c2,26c3 バンドパスフィルタ
28 処理部
29 制御部
30 管路
31 フローセル体
32 回収容器
34r,34g,34b レーザドライバ
35 パワースプリッタ
40,42,44,46,48,50 光電変換器
52,54,56 散乱板
58,60,62,64,66,68 光量調整用絞り板
70 光電子増倍管
80 分析装置
Claims (6)
- 流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を散乱させる光散乱体と、
散乱した蛍光の一部を取り込んで受光することにより、受光信号を出力する光電子増倍管およびフォトダイオードが、並列して構成された受光部と、
前記受光部の光電子増倍管から出力した受光信号に基づいて求められるパルス信号の計数値と、前記フォトダイオードから出力した受光信号に基づいて求められる受光信号積分値とのいずれか一方を選択することにより、測定対象物の発する蛍光強度を求める処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記処理部は、前記光電子増倍管からの受光信号に基づいて求められた前記計数値が所定値以下の場合、前記計数値から蛍光強度の値を求め、前記計数値が前記所定値を超える場合、前記処理部は前記受光信号積分値から蛍光強度の値を求める請求項1に記載の蛍光検出装置。
- 前記処理部は、前記フォトダイオードからの受光信号に基づいて求められた前記受光信号積分値が設定された値以下の場合、前記計数値から蛍光強度の値を求め、前記受光信号積分値が設定された値を超える場合、前記処理部は前記受光信号積分値から蛍光強度の値を求める請求項1に記載の蛍光検出装置。
- 前記光電子増倍管および前記フォトダイオードの少なくともいずれか一方と前記光散乱板との間に、蛍光の光量を調整する絞り板が設けられている請求項1〜3のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 前記光電子増倍管および前記フォトダイオードの少なくともいずれか一方と前記光散乱体との間に、蛍光の光量を調整する絞り板が設けられ、
前記所定値において、前記計数値から求められる蛍光強度の値と、前記受光信号積分値から求められる蛍光強度の値とが一致するように、前記絞り板が調整される請求項2に記載の蛍光検出装置。 - 前記光電子増倍管および前記フォトダイオードの少なくともいずれか一方と前記光散乱体との間に、蛍光の光量を調整する絞り板が設けられ、
前記設定された値において、前記計数値から求められる蛍光強度の値と、前記受光信号積分値から求められる蛍光強度の値とが一致するように、前記絞り板が調整される請求項3に記載の蛍光検出装置。
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