JPH09218155A - ２次元蛍光寿命測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡単な構成であって短時間に精度よく２次元
蛍光寿命を測定する。 【解決手段】 パルス光源１０から出力されたパルス励
起光Ａが被測定物３０に照射されて発生した蛍光Ｂは、
ビームスプリッタ５０によって蛍光Ｂ１およびＢ２とに
分岐される。この蛍光Ｂ１およびＢ２は、遅延光学系６
０によって両者間に所定の光路長差が与えられた後、撮
像タイミング生成部８０から出力された撮像タイミング
信号が指示する所定時刻に、撮像部７０によって光像が
撮像される。ここで撮像された蛍光Ｂ１およびＢ２それ
ぞれの光像は、被測定物３０において互いに異なる時刻
に発生した蛍光の像であるので、演算部９０によって、
撮像された蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの光像の強度比
に基づいて２次元蛍光寿命が算出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光物質を含む被
測定物に励起光が照射されて発生した蛍光の寿命を２次
元像として測定する２次元蛍光寿命測定技術に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】被測定物に励起光を照射すると、その被
測定物に含まれる蛍光物質から蛍光が発生する。その蛍
光の強度は、励起光照射時刻から時間を経るに従って指
数関数的に減衰していく。この蛍光減衰曲線の減衰特性
を表すのが蛍光寿命τであり、この蛍光寿命τは、蛍光
物質の種類によって決まっている。したがって、この蛍
光減衰曲線から蛍光寿命を測定することにより、蛍光物
質を同定することも可能である。又、被測定物から発生
する蛍光を２次元の光像として捉え、蛍光像の各位置に
おける蛍光寿命を測定することにより、被測定物中の蛍
光物質の密度分布や種類を知ることもできる。

【０００３】従来より、蛍光寿命を測定する技術とし
て、パルスサンプリング法、時間相関単一光子計数法、
位相変調法、ストリークカメラ法および励起プローブ法
が知られている。

【０００４】パルスサンプリング法は、被測定物にパル
ス励起光を照射し、発生した蛍光を分光した後、その蛍
光を光電子増倍管で検出し、そして、その光電子増倍管
の陽極電流を高速オシロスコープ等で観測・記録するも
のであり、構成が簡単であるという特徴を有する。

【０００５】時間相関単一光子計数法は、１回の励起事
象によって発生する蛍光が光子１個である場合に励起時
刻から蛍光発生時刻までの時間の確率分布が、蛍光強度
の時間変化に一致するという概念に基づくものである。
この手法では、１パルスの励起光の照射によって発生す
る蛍光光子の平均個数が１個になるように励起光の強度
を調整し、その励起光を被測定物に照射した後に単一蛍
光光子が発生するまでの時間を測定し、この時間を多数
回繰り返して測定してヒストグラムを作成し、このヒス
トグラムから蛍光寿命を求める。

【０００６】位相変調法では、例えば正弦波状に強度変
調した励起光を被測定物に照射すると、発生する蛍光の
強度も正弦波状のものとなるが、蛍光の強度変化と励起
光の強度変化とは、励起光強度と蛍光寿命に応じた位相
差が生ずるので、この位相差に基づいて蛍光寿命を測定
するものである。

【０００７】ストリークカメラ法は、蛍光を光電変換面
で受光して発生した光電子ビームを、掃引信号が印加さ
れた偏向電極間を通過させ、その光電子ビームを時刻に
応じて異なる角度に偏向させることによって、蛍光強度
の時間変化を空間変化に変換して、蛍光減衰曲線を測定
するものである。

【０００８】励起プローブ法は、Ｋｅｒｒセル等の光シ
ャッタを用い、この光シャッタが開く時刻を順次変更し
て、この光シャッタを通過した蛍光の強度を測定し、蛍
光減衰曲線すなわち蛍光寿命を測定するものである。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら上記従来
例では以下のような問題点がある。パルスサンプリング
法は、感度が悪く、更に、約１０ｎｓよりも短い蛍光寿
命の測定が困難である。時間相関単一光子計数法は、励
起光の１パルス毎に単一光子しか測定できないので、ヒ
ストグラムを作成するのに長時間を要するという問題点
がある。位相変調法は、時間分解能が低く、蛍光寿命の
測定精度が悪い。ストリークカメラ法は、時間分解能お
よび感度が高いものの高価である。さらに、これらの従
来技術では、２次元蛍光寿命を測定するには不適であ
る。

【００１０】これらに対し、励起プローブ法は、高い時
間分解能と高い感度で２次元蛍光寿命の測定が可能であ
る。しかし、Ｋｅｒｒセル等の光シャッタを開閉させる
ために大出力のレーザ光源が必要であって測定システム
が大規模となり、また、光シャッタが開く時刻を順次変
更して１点毎に測定するため測定に長時間を要するとい
う問題点がある。さらに、被測定物に多数パルスの励起
光を照射する必要があるため、蛍光物質に褪色現象が発
生し、その蛍光物質が励起光を吸収する割合が減少し
て、発生する蛍光も減少するので、蛍光寿命を正確に測
定することはできないという問題点もある。

【００１１】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、簡単な構成であって短時間に精度よく
２次元蛍光寿命を測定することができる２次元蛍光寿命
測定方法および装置を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明に係る２次元蛍光
寿命測定方法は、(1) 被測定物にパルス励起光を照射す
る第１のステップと、(2) パルス励起光が照射された被
測定物から発生した蛍光を分岐し第１の光束と第２の光
束とを形成する第２のステップと、(3) 第１および第２
の光束の間に所定の光路長差を与える第３のステップ
と、(4) 所定の光路長差が与えられた第１および第２の
光束それぞれの像を、パルス励起光の散乱光がもはや存
在しない所定時刻に撮像する第４のステップと、(5) 撮
像された第１および第２の光束それぞれの像に基づい
て、被測定物上の各位置から発生した蛍光の寿命を算出
する第５のステップと、を備えることを特徴とする。

【００１３】この２次元蛍光寿命測定方法では、第１の
ステップで被測定物にパルス励起光が照射されて発生し
た蛍光は、第２のステップで第１の光束と第２の光束と
に分岐される。この第１の光束および第２の光束は、第
３のステップで両者間に所定の光路長差が与えられた
後、第４のステップで、パルス励起光の散乱光がもはや
存在しない所定時刻に光像が撮像される。ここで撮像さ
れた第１および第２の光束それぞれの光像は、被測定物
において互いに異なる時刻に発生した蛍光の像であるの
で、第５のステップで、撮像された第１および第２の光
束それぞれの光像の強度比に基づいて２次元蛍光寿命が
算出される。

【００１４】また、第３のステップで所定の光路長差が
可変に設定されることとしてもよく、この場合には広い
蛍光寿命範囲に亘って蛍光寿命が測定される。

【００１５】本発明に係る２次元蛍光寿命測定装置は、
(1) 被測定物にパルス励起光を照射するパルス光源と、
(2) パルス励起光が照射された被測定物から発生した蛍
光を分岐し第１の光束と第２の光束とを形成する光束分
岐手段と、(3) 第１および第２の光束の間に所定の光路
長差を与える遅延光学系と、(4) 励起光源からパルス励
起光が出力されたタイミングに基づいて、パルス励起光
の散乱光がもはや存在しない所定時刻を指示する撮像タ
イミング信号を出力する撮像タイミング生成手段と、
(5) 所定の光路長差が与えられた第１および第２の光束
それぞれの像を、撮像タイミング信号に基づいて所定時
刻に撮像する撮像手段と、(6) 撮像された第１および第
２の光束それぞれの像に基づいて、被測定物上の各位置
から発生した蛍光の寿命を算出する演算手段と、を備え
ることを特徴とする。

【００１６】この２次元蛍光寿命測定装置では、パルス
光源から出力されたパルス励起光が被測定物に照射され
て発生した蛍光は、光束分岐手段によって第１の光束と
第２の光束とに分岐される。この第１の光束および第２
の光束は、遅延光学系によって両者間に所定の光路長差
が与えられた後、撮像タイミング生成手段から出力され
た撮像タイミング信号が指示する所定時刻に、撮像手段
によって光像が撮像される。ここで所定時刻とは、パル
ス励起光の散乱光がもはや存在しない時刻であり、撮像
された第１および第２の光束それぞれの光像は、被測定
物において互いに異なる時刻に発生した蛍光の像である
ので、演算手段によって、撮像された第１および第２の
光束それぞれの光像の強度比に基づいて２次元蛍光寿命
が算出される。

【００１７】また、遅延光学系は、所定の光路長差を可
変に設定する遅延量可変手段を備えることとしてもよ
く、この場合には広い蛍光寿命範囲に亘って蛍光寿命が
測定される。

【００１８】また、遅延光学系は、第１の光束の像を伝
搬させる第１の光ファイバ束を備えることとしてもよ
く、さらに、第２の光束の像を伝搬させる第２の光ファ
イバ束をも備えることとしてもよい。この場合には、第
１および第２の光束それぞれの光像が、第１および第２
の光ファイバ束それぞれによって撮像手段まで伝搬す
る。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。

【００２０】（第１の実施形態）まず、第１の実施形態
に係る２次元蛍光寿命測定装置について説明する。図１
は、本実施形態に係る２次元蛍光寿命測定装置の構成図
である。

【００２１】パルス光源１０は、蛍光物質を含む被測定
物３０に照射されるパルス励起光Ａを出力する。顕微鏡
２０は、このパルス励起光Ａを入力して、反射鏡２１で
被測定物３０に向けて反射し、ダイクロイックミラー２
２を透過させ、レンズ２３で集光して、被測定物３０に
照射させる。ここで、ダイクロイックミラー２２は、パ
ルス励起光Ａを透過させるが、被測定物３０から発生し
た蛍光Ｂを反射させるものである。したがって、顕微鏡
２０は、被測定物３０から発生した蛍光Ｂを、レンズ２
３で平行光束とし、ダイクロイックミラー２２で反射さ
せ、顕微鏡２０外に出力する。

【００２２】顕微鏡２０から出力された蛍光Ｂを入力す
るバンドパスフィルタ４０は、その蛍光Ｂを透過させ
る。しかし、バンドパスフィルタ４０は、被測定物３０
に励起光Ａが照射されて発生した反射光や散乱光を透過
させない。したがって、バンドパスフィルタ４０は、蛍
光Ｂのみを出力する。

【００２３】バンドパスフィルタ４０から出力された蛍
光Ｂを入力したビームスプリッタ５０は、その蛍光Ｂの
一部を透過し残部を反射させて２光束に分岐し、光束Ｂ
１およびＢ２を生成する。ビームスプリッタ５０を透過
した光束Ｂ１は、直接に撮像部７０に到達する。

【００２４】一方、ビームスプリッタ５０で反射した光
束Ｂ２は、遅延光学系６０に入力する。この遅延光学系
６０は、２個の反射鏡６１および６２からなり、ビーム
スプリッタ５０で反射した光束Ｂ２を反射鏡６１で反射
し、続いて反射鏡６２で反射する。反射鏡５１は、遅延
光学系６０から出力された蛍光Ｂ２を撮像部７０に向け
て反射させる。

【００２５】なお、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれが撮像
部７０に至るまでの光学系には、適当にリレーレンズ
（図示せず）やフィールドレンズ（図示せず）が配置さ
れており、撮像部７０のゲート付きイメージングインテ
ンシファイア７１の光電変換面７１ａ上には、蛍光Ｂ１
およびＢ２それぞれの２次元像が結像される。また、こ
れら蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの２次元像は、ゲート
付きイメージングインテンシファイア７１の光電変換面
７１ａ上の異なる領域に結像される。

【００２６】ビームスプリッタ５０を透過した光束Ｂ
１、および、ビームスプリッタ５０で反射した後に遅延
光学系６０を経て到達した光束Ｂ２を入力する撮像部７
０は、所定時刻に蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの２次元
像を検出する。この撮像部７０は、ゲート付きイメージ
ングインテンシファイア７１、ゲート付きイメージング
インテンシファイア用電源７２および光検出器７３から
なる。

【００２７】このゲート付きイメージングインテンシフ
ァイア７１は、その光電変換面７１ａ上に結像された蛍
光Ｂ１およびＢ２それぞれの２次元像を入力して、その
像の強度に応じた光電子を放出し、その光電子をマイク
ロチャンネルプレートで増倍し、その増倍された２次電
子を蛍光面に入力して再び光像に変換する。光検出器７
３は、ゲート付きイメージングインテンシファイア７１
の蛍光面上の光像を入力して、その光像の２次元強度分
布を検出するものであり、例えば、２次元ＣＣＤが用い
られる。

【００２８】また、このゲート付きイメージングインテ
ンシファイア７１は、ゲート付きイメージングインテン
シファイア用電源７２から電力が供給された時のみ、そ
の光電変換面７１ａ上に結像された像を増倍する。さら
に、このゲート付きイメージングインテンシファイア用
電源７２は、撮像タイミング生成部８０から出力される
撮像タイミング信号を入力して、この撮像タイミング信
号が指示する時刻にのみ、ゲート付きイメージングイン
テンシファイア７１に電力を供給する。この撮像タイミ
ング生成部８０は、パルス光源１０がパルス励起光Ａを
出力した時刻を示すタイミング信号を入力し、パルス励
起光Ａが出力された時刻から一定時間が経過した後の所
定時刻を指示する撮像タイミング信号を生成して出力す
る。

【００２９】このようにして光検出器７３によって撮像
された所定時刻の蛍光Ｂ１およびＢ２の光像は演算部９
０に入力される。演算部９０は、例えばコンピュータで
あり、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの光像の強度分布の
比と、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれがゲート付きイメー
ジングインテンシファイア７１に到達するまでの光路長
差すなわち遅延時間差とに基づいて２次元蛍光寿命を求
める。

【００３０】次に、この２次元蛍光寿命測定装置の作用
とともに、本発明に係る２次元蛍光寿命測定方法につい
て説明する。図２は、蛍光減衰曲線を示す図である。

【００３１】パルス光源１０から出力されたパルス励起
光Ａは、顕微鏡２０に入射する。顕微鏡２０に入射した
パルス励起光Ａは、顕微鏡２０内で、反射鏡２１で反射
されて、ダイクロイックミラー２２を透過し、レンズ２
３で集光されて、被測定物３０に照射される。そして、
被測定物３０にパルス励起光Ａが照射されると、その被
測定物３０内に含まれる蛍光物質から蛍光Ｂが発生す
る。この蛍光Ｂの強度分布の時間変化Ｉ(t) は、 Ｉ(t) ＝Ｉ₀・ｅｘｐ（−ｔ／τ） … (1) で表される（図２（ａ））。ここで、ｔは、パルス励起
光Ａが被測定物３０に照射された時刻を基準とする時間
変数である。Ｉ₀ は、時刻ｔ＝０における蛍光Ｂの強度
分布であり、レンズ２３から被測定物３０を見たときの
２次元の位置変数の関数である。τは、被測定物３０の
蛍光寿命であり、被測定物３０上の２次元の位置変数の
関数である。

【００３２】この蛍光Ｂは、レンズ２３に入射して平行
光束とされ、ダイクロイックミラー２２で反射されて、
顕微鏡２０から出力される。顕微鏡２３から出力された
蛍光Ｂは、バンドパスフィルタ４０を透過した後、ビー
ムスプリッタ５０によって蛍光Ｂ１およびＢ２の２つの
光束に分岐される。なお、被測定物３０表面からはパル
ス励起光Ａの反射光・散乱光も発生するが、この反射光
・散乱光は、ダイクロイックミラー２２で反射される割
合が極僅かであり、更に、バンドパスフィルタ４０を透
過する割合も極僅かであるので、ビームスプリッタ５０
に到達する量が殆どない。

【００３３】ビームスプリッタ５０を透過した蛍光Ｂ１
は、直接に撮像部７０のゲート付きイメージングインテ
ンシファイア７１の光電変換面７１ａに到達し結像され
る。その光電変換面７１ａに到達した蛍光Ｂ１の強度分
布の時間変化Ｉ１(t) は、 Ｉ１(t) ＝Ｉ(t−t1) ＝Ｉ₀・ｅｘｐ（−（ｔ−ｔ１）／τ） … (2) で表される（図２（ｂ））。ここでも、ｔはパルス励起
光Ａが被測定物３０に照射された時刻を基準とする時間
変数である。また、ｔ１は、被測定物３０で発生した蛍
光Ｂが、ビームスプリッタ５０を透過して蛍光Ｂ１とし
てゲート付きイメージングインテンシファイア７１の光
電変換面７１ａに到達するまでに要する時間である。

【００３４】一方、ビームスプリッタ５０で反射した蛍
光Ｂ２は、遅延光学系６０を経由して、撮像部７０のゲ
ート付きイメージングインテンシファイア７１の光電変
換面７１ａに到達し結像される。その光電変換面７１ａ
に到達した蛍光Ｂ２の強度分布の時間変化Ｉ２(t) は、 Ｉ２(t) ＝Ｉ(t−t2) ＝Ｉ₀・ｅｘｐ（−（ｔ−ｔ２）／τ） … (3) で表される（図２（ｃ））。ここでも、ｔはパルス励起
光Ａが被測定物３０に照射された時刻を基準とする時間
変数である。また、ｔ２は、被測定物３０で発生した蛍
光Ｂが、ビームスプリッタ５０で反射して遅延光学系６
０を経て蛍光Ｂ２としてゲート付きイメージングインテ
ンシファイア７１の光電変換面７１ａに到達するまでに
要する時間である。

【００３５】このゲート付きイメージングインテンシフ
ァイア７１の光電変換面７１ａに到達した蛍光Ｂ１およ
びＢ２それぞれは、その光電変換面７１ａ上の異なる領
域に結像され、所定時刻Ｔに光検出器７３によって撮像
される（図２（ｂ），（ｃ））。この所定時刻Ｔを指示
する撮像タイミング信号は、パルス光源１０からパルス
励起光Ａが出力されたタイミングを入力した撮像タイミ
ング生成部８０から出力され、その撮像タイミング信号
が指示する時刻にゲート付きイメージングインテンシフ
ァイア用電源７２からゲート付きイメージングインテン
シファイア７１に電力が供給さる。すなわち、撮像タイ
ミング生成部８０で設定された時刻Ｔに、ゲート付きイ
メージングインテンシファイア７１の光電変換面７１ａ
に結像されている光像が、光検出器７３によって撮像さ
れる。この時、光検出器７３で撮像された蛍光Ｂ１およ
びＢ２それぞれの強度分布Ｉ１(T) およびＩ２(T) は、 Ｉ１(T) ＝Ｉ₀・ｅｘｐ（−（Ｔ−ｔ１）／τ） … (4) Ｉ２(T) ＝Ｉ₀・ｅｘｐ（−（Ｔ−ｔ２）／τ） … (5) で表される（図２（ｄ））。

【００３６】このようにして光検出器７３で検出された
蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの強度分布Ｉ１(T) および
Ｉ２(T) は、演算部９０に入力される。演算部９０で
は、この２つの強度分布Ｉ１(T) およびＩ２(T) に基づ
いて、 τ＝Δｔ／ｌｎ（Ｉ２(T) ／Ｉ１(T) ） … (6) なる演算を行なって、被測定物３０に含まれる蛍光物質
の蛍光寿命τを求める。ここで、Δｔは、 Δｔ＝ｔ２−ｔ１ … (7) であり、蛍光Ｂ１およびＢ２がゲート付きイメージング
インテンシファイア７１に到達する遅延時間差を表すも
のであり、遅延光学系６０で設定された蛍光Ｂ１とＢ２
との間の光路長差に対応するものである。ここで求めら
れた蛍光寿命τは、被測定物３０上の２次元の位置変数
の関数であり、被測定物３０上の各位置における蛍光寿
命を表すものである。また、被測定物３０上の時刻ｔ＝
０における蛍光強度分布Ｉ₀ をも求めることができる。

【００３７】なお、光検出器７３が検出する蛍光Ｂ１お
よびＢ２の強度が弱い場合には、パルス励起光Ａの１パ
ルスについてのみの測定では、蛍光Ｂ１およびＢ２それ
ぞれの光像の検出はＳ／Ｎ比が悪い。その場合には、多
くのパルス数のパルス励起光Ａを被測定物３０に照射し
て、その多数のパルス励起光Ａについて、蛍光Ｂ１およ
びＢ２それぞれの光像を積算して検出する。これによっ
て、Ｓ／Ｎ比を改善することができる。

【００３８】また、実際には、ゲート付きイメージング
インテンシファイア７１は、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞ
れの光像を、所定時刻Ｔの瞬間だけ増倍するのではな
く、一定時間に亘って増倍する。すなわち、光検出器７
３が検出する光像は、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの光
像の当該一定時間に亘る積分量である。しかし、その場
合であっても、２次元蛍光寿命τは、（６）式および
（７）式で求めることができる。

【００３９】このように、１台の光検出器で同時に蛍光
Ｂ１およびＢ２それぞれの像を撮像することから、これ
ら２蛍光像を撮像する時刻Ｔは全く同一であり、かつ、
２蛍光像それぞれの撮像時間（ゲートが開いている時
間）は互いに全く同一である。また、これら２蛍光像の
間の遅延時間Δｔは、それぞれの光路長の差によって決
まるものであるので、これも極めて安定していて精度が
よい。仮に、撮像タイミング生成部８０で設定される時
刻Ｔが安定せず変動する場合であっても、（４）式〜
（６）式で判るように、蛍光寿命τは時刻Ｔに依存しな
い。したがって、精度のよい蛍光寿命τの測定が可能と
なる。

【００４０】また、以上の説明では蛍光Ｂ，Ｂ１および
Ｂ２それぞれの初期強度Ｉ₀ は等しいとして述べてき
た。しかし、実際には、蛍光Ｂ１およびＢ２の強度は蛍
光Ｂの強度よりも小さい。また、ビームスプリッタ５０
が蛍光Ｂを透過・反射する割合は１対１であるとは限ら
ず、したがって、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれの初期強
度も一致するとは限らない。しかし、例えば、蛍光Ｂの
光軸と同一の光軸上に連続光をビームスプリッタ５０に
入射させ、ビームスプリッタ５０で透過・反射した２光
束を光検出器７３で検出して、両者の強度比を予め求め
ておけば、（４）式および（５）式に示すように両者の
初期強度Ｉ₀ が一致するよう補正することができる。

【００４１】また、Ｔ−ｔ２およびＴ−ｔ１の値は、共
に、パルス励起光Ａのパルス幅より大きい必要がある。
これは以下の理由による。すなわち、Ｔ−ｔ２およびＴ
−ｔ１の何れか一方の値がパルス励起光Ａのパルス幅よ
り小さい場合には、撮像部７０に到達する蛍光Ｂ１およ
びＢ２のうち何れか一方は、未だパルス励起光Ａが照射
されている最中における蛍光であり、他方はパルス励起
光Ａの照射が終了した時刻以降における蛍光となるた
め、両者を比較することは無意味である。したがって、
撮像部７０に到達する蛍光Ｂ１およびＢ２の何れも、パ
ルス励起光Ａの照射が終了した時刻以降における蛍光と
なるように、Ｔ−ｔ２およびＴ−ｔ１の値は、共に、パ
ルス励起光Ａのパルス幅より大きくする必要がある。

【００４２】また、（６）式から判るように、Ｉ２(T)
／Ｉ１(T) の値が１に近いときには、Ｉ２(T) ／Ｉ１
(T) の値の僅かの誤差でも、（６）式から得られる蛍光
寿命τの値は大きく変化するので、測定精度が悪くな
る。このようなことは、遅延時間差Δｔの値が蛍光寿命
τの値に比して非常に小さい場合に発生する。したがっ
て、蛍光寿命τが長い場合には、遅延時間差Δｔも長く
設定することが望ましい。一方、遅延時間差Δｔの値が
蛍光寿命τの値の数倍程度以上に長く設定されると、今
度は、蛍光Ｂ１の強度Ｉ１(T) が小さくなり、蛍光寿命
τの測定精度はやはり悪くなる。以上のことから判るよ
うに、遅延時間差Δｔは、測定しようとする被測定物３
０に含まれる蛍光物質の蛍光寿命τの値の大きさに応じ
て適切に設定する必要がある。

【００４３】そこで、この問題に対処するため、遅延光
学系６０を、蛍光Ｂ２に対して与える遅延時間すなわち
光路長を可変に設定できる構成にする。すなわち、ビー
ムスプリッタ５０から反射鏡６１に向かう蛍光Ｂ２の光
軸と、反射鏡６２から反射鏡５１に向かう蛍光Ｂ２の光
軸とを互いに平行にし、また、反射鏡６１および６２を
移動台（図示せず）の上に固定し、この移動台を上述の
光軸に平行な方向に移動可能な構成とする。このような
構成とすることによって、移動台を移動させることによ
り遅延時間差Δｔを適切に設定することができるので、
広い蛍光寿命範囲に亘って蛍光寿命τを精度よく測定す
ることができる。

【００４４】（第２の実施形態）次に、第２の実施形態
に係る２次元蛍光寿命測定装置について説明する。図３
は、本実施形態に係る２次元蛍光寿命測定装置の構成図
である。

【００４５】本実施形態では、第１の実施形態と比較し
て、ビームスプリッタ５０で形成された蛍光Ｂ１および
Ｂ２それぞれをゲート付きイメージングインテンシファ
イア７１の光電変換面７１ａに導く光学系それぞれが、
光ファイバ束６３および６４で構成される点が異なる。

【００４６】光ファイバ束６３は、同一長さの多数本の
光ファイバが束ねられ、これら多数本の光ファイバが入
射端６３ａおよび出射端６３ｂそれぞれで平面状に揃え
られたものであり、入射端６３ａ面上に到達している光
像をその入射端６３ａから入力して、その内部を導光さ
せ、その入射光像と同形状または相似形状の出射光像を
出射端６３ｂ面上に出力するものである。光ファイバ束
６４も同様である。

【００４７】ビームスプリッタ５０を透過した蛍光Ｂ１
の光像は、光ファイバ束６３の入射端６３ａ面上に結像
されて、その入射端６３ａに入力し、光ファイバ束６３
内を導光され、出射端６３ｂ面上に出力される。同様
に、ビームスプリッタ５０で反射された蛍光Ｂ２の光像
は、光ファイバ束６４の入射端６４ａ面上に結像され
て、その入射端６４ａに入力し、光ファイバ束６４内を
導光され、出射端６４ｂ面上に出力される。

【００４８】光ファイバ束６３の出射端６３ｂおよび光
ファイバ束６４の出射端６４ｂは、ゲート付きイメージ
ングインテンシファイア７１の光電変換面７１ａに接し
て配置されており、出射端６３ｂおよび出射端６４ｂそ
れぞれから出力された蛍光Ｂ１およびＢ２の光像は、撮
像部７０によって所定時刻Ｔに検出される。

【００４９】本実施形態の場合も、第１の実施形態と同
様にして、所定時刻Ｔにおいて蛍光Ｂ１およびＢ２の光
像を撮像部７０で検出し、同様の演算を行なって２次元
蛍光寿命τを求めることができる。なお、遅延時間差Δ
ｔは、光ファイバ束６３および６４それぞれ長さの差に
応じて定まるものであるので、測定しようとする被測定
物３０に含まれる蛍光物質の蛍光寿命τの値に応じて、
光ファイバ束６３および６４それぞれの長さを適切に選
択することが重要である。

【００５０】このように光ファイバ束６３および６４に
よって蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれを導光することとす
れば、これら光ファイバ束６３および６４の可撓性によ
って、２次元蛍光寿命測定装置を小型のものにすること
ができ、また、その取扱いが容易になる。なお、図３で
は、蛍光Ｂ１およびＢ２それぞれを共に光ファイバ束で
導光することとしたが、何れか一方のみを光ファイバ束
で導光することとしても構わない。

【００５１】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、第１の実施
形態では、遅延光学系６０に２枚の反射鏡６１および６
２を備え、これによって蛍光Ｂ２に遅延を与えたが、反
射鏡の枚数は２に限られることはなく、より多数の反射
鏡を備えて、これらの多数の反射鏡で順次に蛍光Ｂ２を
反射させて遅延を与える構成としてもよい。この場合、
２次元蛍光寿命測定装置を更に小型化することも可能
で、しかも、大きな遅延時間差Δｔを設定することがで
きる。

【００５２】また、一方の蛍光Ｂ２の遅延時間を可変に
設定するだけでなく、蛍光Ｂ１およびＢ２の双方の遅延
時間を可変に設定する手段を備えてもよい。この場合、
蛍光Ｂ１および蛍光Ｂ２それぞれについて撮像部７０に
到達する時刻を設定することができる。

【００５３】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、被測定物にパルス励起光が照射されて発生した蛍
光は、第１の光束と第２の光束とに分岐され、この第１
の光束および第２の光束は、両者間に所定の光路長差が
与えられた後、所定時刻に光像が撮像される。ここで、
所定時刻とは励起光の散乱光がもはや存在しない時刻で
あり、撮像された第１および第２の光束それぞれの光像
は、被測定物において互いに異なる時刻に発生した蛍光
の像であるので、撮像された第１および第２の光束それ
ぞれの光像の強度比に基づいて２次元蛍光寿命が算出さ
れる。

【００５４】このような構成としたことにより、励起プ
ローブ法が必要とするような大出力レーザ光源を用いる
必要がなく、また、ＣＣＤカメラ等の撮像装置は１台し
か使用しないので、光検出器が簡単・小型となるだけで
なく安価となる。

【００５５】また、１台の光検出器で同時に２つの蛍光
像を撮像することから、これら２蛍光像の間の遅延時間
は極めて安定していて精度よく、２蛍光像それぞれの撮
像時間（ゲートが開いている時間）は互いに全く同一で
あるので、精度のよい蛍光寿命の測定が可能となる。

【００５６】さらに、蛍光を撮像部に導く光学系として
光ファイバ束を用いれば、更に小型化が可能となり、取
扱が容易となる。

【００５７】また、１パルスの励起光の照射に対して、
異なる２つの時刻における蛍光強度を検出することがで
きるので、短い時間で２次元蛍光寿命を測定することが
でき、また、褪色の問題が発生しないので精度よく測定
することができる。

【００５８】さらに、遅延光学系が光路長差を可変に設
定する構成とすることにより、広い蛍光寿命範囲に亘っ
て蛍光寿命を精度よく測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施形態に係る２次元蛍光寿命測定装置
の構成図である。

【図２】蛍光減衰曲線を示す図である。

【図３】第２の実施形態に係る２次元蛍光寿命測定装置
の構成図である。

【符号の説明】

１０…パルス光源、２０…顕微鏡、２１…反射鏡、２２
…ダイクロイックミラー、２３…レンズ、３０…被測定
物、４０…バンドパスフィルタ、５０…ビームスプリッ
タ、５１…反射鏡、６０…遅延光学系、６１，６２…反
射鏡、６３，６４…光ファイバ束、７０…撮像部、７１
…ゲート付きイメージングインテンシファイア、７１ａ
…光電変換面、７２…ゲート付きイメージングインテン
シファイア用電源、７３…光検出器、８０…撮像タイミ
ング生成部、９０…演算部、Ａ…パルス励起光、Ｂ，Ｂ
１，Ｂ２…蛍光。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物にパルス励起光を照射する第１
   のステップと、 前記パルス励起光が照射された前記被測定物から発生し
   た蛍光を分岐し第１の光束と第２の光束とを形成する第
   ２のステップと、 前記第１および前記第２の光束の間に所定の光路長差を
   与える第３のステップと、 前記所定の光路長差が与えられた前記第１および前記第
   ２の光束それぞれの像を、前記パルス励起光の散乱光が
   もはや存在しない所定時刻に撮像する第４のステップ
   と、 撮像された前記第１および前記第２の光束それぞれの像
   に基づいて、前記被測定物上の各位置から発生した蛍光
   の寿命を算出する第５のステップと、 を備えることを特徴とする２次元蛍光寿命測定方法。
2. 【請求項２】 前記第３のステップは、前記所定の光路
   長差が可変に設定される、ことを特徴とする請求項１記
   載の２次元蛍光寿命測定方法。
3. 【請求項３】 被測定物にパルス励起光を照射するパル
   ス光源と、 前記パルス励起光が照射された前記被測定物から発生し
   た蛍光を分岐し第１の光束と第２の光束とを形成する光
   束分岐手段と、 前記第１および前記第２の光束の間に所定の光路長差を
   与える遅延光学系と、 前記励起光源から前記パルス励起光が出力されたタイミ
   ングに基づいて、前記パルス励起光の散乱光がもはや存
   在しない所定時刻を指示する撮像タイミング信号を出力
   する撮像タイミング生成手段と、 前記所定の光路長差が与えられた前記第１および前記第
   ２の光束それぞれの像を、前記撮像タイミング信号に基
   づいて前記所定時刻に撮像する撮像手段と、 撮像された前記第１および前記第２の光束それぞれの像
   に基づいて、前記被測定物上の各位置から発生した蛍光
   の寿命を算出する演算手段と、 を備えることを特徴とする２次元蛍光寿命測定装置。
4. 【請求項４】 前記遅延光学系は、前記所定の光路長差
   を可変に設定する遅延量可変手段を備える、ことを特徴
   とする請求項３記載の２次元蛍光寿命測定装置。
5. 【請求項５】 前記遅延光学系は、前記第１の光束の像
   を伝搬させる第１の光ファイバ束を備える、ことを特徴
   とする請求項３記載の２次元蛍光寿命測定装置。
6. 【請求項６】 前記遅延光学系は、前記第２の光束の像
   を伝搬させる第２の光ファイバ束を更に備える、ことを
   特徴とする請求項５記載の２次元蛍光寿命測定装置。