CN108333157B - 生物分子三维动态分析方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物分子动态分析技术领域，提供了一种生物分子三维动态分析方法和系统，包括脉冲激光器，双色镜，物镜，分束镜，成像透镜，门控探测器，光程调节装置，焦面调节装置以及时间同步装置，控制脉冲激光器和所控探测器同步开放。该系统通过两路荧光光路的光程差对应的时间、反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过反射荧光信号和透射荧光信号的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。本发明集荧光寿命检测和三维定位于一体，在高精度三维定位的同时能够获知微环境的变化，为细胞内分子动态研究提供了更加有利的支持，并且该系统结构简单紧凑，可靠性更好。

Description

生物分子三维动态分析方法和系统

技术领域

本发明属于细胞动态分析技术领域，特别涉及一种生物分子三维动态分析方法和系统。

背景技术

细胞内的蛋白质大分子往往是在复杂的运输网络的协调下运动到细胞内的不同位置。例如,细胞内吞首先从细胞膜开始,货物分子与细胞膜表面的受体分子结合后，通过特定的机制(例如网格蛋白小窝、cpp)被摄入细胞，然后被运送到细胞深处的内体室。对于细胞内生物学过程的追踪这一领域，我们目前的研究方法和手段还十分有限。

对于细胞动态过程研究，常用的一种分析工具是单粒子/分子追踪(SingleParticle Tracking,SPT)。SPT通过对单个分子信号进行分析，从而获得其纳米精度的位置信息。目前，利用宽场显微镜便可实现单分子的二维或者三维追踪。随着单分子显微技术的诞生，许多生物学家对于细胞内单个分子的运输路径产生浓厚的兴趣。SPT克服了传统群体分子研究时带来的平均效应，从而可以提供传统群体分子研究无法获取的信息。当要研究成分组成复杂的系统(例如研究货物分子从质膜到核内体的运输途径)时，这些细节信息就会变得尤为重要。鉴于SPT的这些优越性，在过去二十年里，利用SPT方法开展的各种生物学应用也急剧增加。例如，利用SPT已经揭示了细胞质膜分子组织的新的动力学信息。

SPT的发展非常迅速，当前的SPT的方法研究工作主要集中在获得精确的三维运动轨迹，不足之处在于，在这一运动过程中微环境的变化仍缺乏有效的分析手段。但微环境(例如PH值、粘滞度等)的变化却恰恰是影响囊泡和蛋白运动的重要因素，因此微环境的变化信息也尤为重要，目前的SPT技术在获得运动过程中局部微环境变化方面还存在技术缺口。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物分子三维动态分析系统，旨在解决传统技术在进行分子三维纳米精度定位时不能获知分子所处微环境的变化信息的技术问题。

本发明是这样实现的，生物分子三维动态分析系统，包括

脉冲激光器，用于发射脉冲激光；

双色镜，设置于所述脉冲激光器的输出光路上，用于向样品反射脉冲激光并透射样品产生的荧光；

物镜，设置于所述双色镜的反射光路上，用于将所述脉冲激光投射于所述样品上，收集所述样品产生的荧光并将所述荧光向所述双色镜输出；

分束镜，设置于所述双色镜的透射光路上，用于将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；

成像透镜，设置于所述反射荧光和透射荧光的光路上；

门控探测器，设置于所述成像透镜的输出光路上，用于探测反射荧光信号和透射荧光信号；

光程调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于控制反射荧光光路和透射荧光光路的光程差；

焦面调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于使反射荧光光路和透射荧光光路对应的焦平面错位；

时间同步装置，设置于所述脉冲激光器和所述门控探测器之间，用于控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；

所述生物分子三维动态分析系统通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。

进一步地，生物分子三维动态分析系统还包括光束调整装置，设置于所述脉冲激光器和所述双色镜之间，用于准直扩束。

进一步地，所述脉冲激光器为皮秒脉冲激光器或者飞秒脉冲激光器。

进一步地，所述反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间为1～3纳秒。

进一步地，所述光程调节装置包括可移动的反射镜组，所述反射镜组包括第一反射镜和第二反射镜，所述第一反射镜设置于所述分束镜的透射方向，所述第二反射镜设置于所述第一反射镜的反射方向，并与所述第一反射镜成90°角相对设置。

进一步地，所述第二反射镜和所述成像透镜之间还设有第三反射镜，所述第三反射镜反射的透射荧光与所述反射荧光平行。

进一步地，所述焦面调节装置为透镜，设置于所述第三反射镜和所述成像透镜之间。

本发明还提供一种生物分子三维动态分析方法，包括下述步骤：

获取脉冲激光；

将所述脉冲激光准直扩束后投射至样品，使所述样品发荧光；

将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；

调节反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，调节所述反射荧光对应的焦面和透射荧光对应的焦面错位；

通过门控探测器分别探测所述反射荧光信号和透射荧光信号，且控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；

通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。

进一步地，所述荧光寿命为

其中，τ为荧光寿命，Δt为反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间，I₁为光程较短的探测光路的荧光信号强度，I₂为光程较长的探测光路的荧光信号强度。

进一步地，根据所述反射荧光信号和透射荧光信号的双焦面图像获得分子三维定位信息的步骤具体为：

根据反射荧光信号和/或透射荧光信号的亮斑或亮环的位置确定所述分子的横向定位信息；

根据所述反射荧光信号和透射荧光信号的亮环直径确定所述分子的轴向定位信息。

本发明提供的生物分子三维动态分析系统的技术效果如下：

一方面，采用脉冲激光器发射脉冲激光，由脉冲激光激发样品产生荧光，通过分束镜将荧光分为两路，且通过光程调节装置使两路荧光具有一定的光程差，由时间同步装置控制门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间，通过门控制探测器探测两路荧光信号的强度，结合两路荧光光路的光程差对应的时间获得荧光寿命；另一方面，通过焦面调节装置使两路荧光对应的焦面错位，形成双焦面成像系统，通过门控探测器获得反射荧光成像和透射荧光成像，将反射荧光成像和透射荧光成像相结合，进行轴向和横向定位，即可获得分子三维定位信息。这样，该系统集荧光寿命检测和三维定位于一体，荧光寿命和分子所在微环境息息相关，因此，该系统在高精度三维定位的同时能够获知微环境的变化，为细胞内分子动态研究提供了更加有利的支持，并且该系统结构简单紧凑，可靠性更好。

附图说明

图1是本发明实施例提供的生物分子三维动态分析系统的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的生物分子三维动态分析系统的反射荧光光路和透射荧光光路的成像示意图；

图3是本发明实施例提供的生物分子三维动态分析方法的流程图；

图4是脉冲激光器和门控探测器的同步控制示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了说明本发明所述的技术方案，以下结合具体附图及实施例进行详细说明。

请参阅图1，本发明实施例提供一种生物分子三维动态分析系统，用于对细胞内分子进行定位和荧光寿命检测，以获取细胞内分子的运动状态信息和微环境信息。该系统至少包括如下光学器件：脉冲激光器10、双色镜20、物镜30、分束镜40、成像透镜50、光程调节装置60、焦面调节装置70、时间同步装置80以及门控探测器90。其中，脉冲激光器10，用于发射脉冲激光，该脉冲激光为皮秒级或者飞秒级脉冲激光；双色镜20，设置于脉冲激光的输出光路上，用于将脉冲激光向样品100反射，并透射样品100产生的荧光；物镜30，设置于双色镜20的反射光路上，用于将脉冲激光投射于样品100上，使样品100发出荧光，并且收集样品100产生的荧光并将该荧光向双色镜20输出，双色镜20将荧光透射出去；分束镜40，设置于双色镜20的透射光路上，用于将双色镜20透射的荧光分为两束，一束为反射荧光，另一束为透射荧光；成像透镜50，设置于反射荧光和透射荧光的光路上；门控探测器90，设置于成像透镜50的输出光路上，用于接收透镜输出的反射荧光和透射荧光并分别成像；光程调节装置60，设置于分束镜40和成像透镜50之间，可以位于反射荧光光路上或透射荧光光路上，用于控制反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，为荧光寿命检测提供必要条件；焦面调节装置70，设置于分束镜40和成像透镜50之间，可以位于反射荧光光路上或透射荧光光路上，用于使反射荧光光路和透射荧光光路对应不同的焦平面，即使两个焦平面错位，为双焦面三维成像提供必要条件；时间同步装置80，设置于脉冲激光器10和门控探测器90之间，用于控制脉冲激光器10和门控探测器90同步开放，也就是合理控制门控探测器90开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间，保证荧光寿命的检测正常进行。优选地，该系统在脉冲激光器10和双色镜20之间还设有光束调整装置110，用于准直扩束。

具体地，门控探测器的门控开放时间间隔根据荧光寿命量级确定，门控探测器的门控开放时间间隔小于荧光寿命，以保证门控探测器90先后开放时能够先后接收到两路荧光。参考图4，门控开放时间间隔由上述光程差决定，光程差所对应的时间差为门控开放时间间隔(即图4中的Δt)，图4中的t2和t3相等，分别为探测反射荧光和透射荧光的时间，图中的t1为通过时间同步装置80控制的门控探测器90开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间。具体地，该门控开放时间间隔Δt可以为1～3纳秒。

具体地，该系统可划分为荧光寿命检测系统和三维成像系统，其中，脉冲激光器10，双色镜20，物镜30，分束镜40，成像透镜50，光程调节装置60，门控探测器90以及时间同步装置80构成荧光寿命检测系统；脉冲激光器10，双色镜20，物镜30，分束镜40，成像透镜50以及焦面调整装置构成三维成像系统。可见，该系统中较多器件同时参与了三维定位和荧光寿命检测，系统集成度较高，结构紧凑。其中，采用脉冲激光对于荧光寿命检测是必要的，且该脉冲激光为皮秒级或者飞秒级脉冲激光，该脉冲宽度远小于荧光寿命，并且门控开放时间间隔亦小于荧光寿命，保证脉冲激光激发的荧光分束后形成的两路荧光能够在生命周期内分别被门控探测器90探测到，以获得不同的荧光信号强度，用于计算荧光寿命。时间同步装置80保证脉冲激光的发射和荧光的探测同步，即合理控制门控探测器90开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间，保证门控探测器90探测到两路荧光信号用于计算荧光寿命。光程调节装置60保证两路荧光具有一定的光程差，进而产生不同强度的荧光信号，即获得荧光强度和时间的关系，为荧光寿命的计算提供必要的数据。

该系统获得荧光寿命和三维定位信息的方法为：门控探测器90分别获得反射荧光信号和透射荧光信号后，通过门控开放时间间隔和反射荧光信号的强度和透射荧光信号的强度获得荧光寿命。根据上述荧光寿命公式

计算荧光寿命，其中，τ为荧光寿命，Δt为反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间，也就是门控开放时间间隔，I₁为光程较短的探测光路的荧光信号强度，I₂为光程较长的探测光路的荧光信号强度。门控探测器90分别获得反射荧光信号和透射荧光信号后，利用双焦面图像进行分子三维定位，具体是基于双焦面三维荧光纳米定位法(简称“双焦面法”)实现，双焦面法对于荧光的三维定位精度可以达到10nm以内。原理是通过两个焦平面错位的探测光路成像，定位分子若在焦，分子图像为一个高斯分布亮斑，定位分子若离焦，分子图像为一个亮环内接一个高斯分布亮斑。亮环直径与分子离焦距离有关，通过将两个通道探测的信号结合，可以确定分子相对焦面的位置(包括位于焦面以上或以下，以及与焦面之间的距离)，进而确定分子的轴向定位信息，通过任一个通道的在焦平面像高斯拟合或者离焦平面像亮环的质心位置可以确定分子的横向定位信息，将横向定位信息和轴向定位信息相结合可以确定分子的三维定位信息。参考图1和图2，本实施例通过反射荧光光路Ch1和透射荧光光路Ch2这两个焦平面错位的探测光路进行成像，获得两个通道的图像，基于上述原理对这两幅图像进行处理，可以得到轴向和横向位置信息，进而确定三维定位信息。

本发明实施例提供的生物分子三维动态分析系统的技术效果如下：

一方面，采用脉冲激光器10发射脉冲激光，由脉冲激光激发样品100产生荧光，通过分束镜40将荧光分为两路，且通过光程调节装置60使两路荧光具有一定的光程差，由时间同步装置80控制脉冲激光器10和门控制探测器同步开放，使两路荧光信号先后被门控探测器90探测，形成荧光寿命检测系统，通过两路荧光信号的强度以及两路荧光光路的光程差对应的时间可以获得荧光寿命；另一方面，通过焦面调节装置70使两路荧光对应的焦面错位，形成双焦面成像系统，通过门控探测器90获得反射荧光成像和透射荧光成像，将反射荧光成像和透射荧光成像相结合，进行轴向和横向定位，即可获得分子三维定位信息。这样，该系统集荧光寿命检测和三维定位于一体，荧光寿命和分子所在微环境息息相关，因此，该系统在高精度三维定位的同时能够获知微环境的变化，为细胞内分子动态研究提供了更加有利的支持，并且该系统结构简单紧凑，可靠性更好。

进一步地，光程调节装置60包括反射镜组，该反射镜组包括第一反射镜61和第二反射镜62，第一反射镜61设置于分束镜40的透射方向，第二反射镜62设置于第一反射镜61的反射方向，第一反射镜61和第二反射镜62相对成90°角设置，该反射镜组可移动，使反射荧光光路和透射荧光光路的光程差大小可调。通过反射镜组实现光程差的调节，结构简单，易于实施，可控精度高。

进一步地，在一种实施例中，上述光程调节装置60设置于透射光路上，在另一种实施例中，上述光程调节装置60设置于反射光路上。

进一步地，焦面调节装置70优选为透镜。在一种实施例中，焦面调节装置70设置于透射光路上，在另一种实施例中，焦面调节装置70设置于反射光路上。

更进一步地，在一种实施例中，焦面调节装置70和光程调节装置60同设置于透射光路上或反射光路上。在另一种实施例中，焦面调节装置70和光程调节装置60分别设置于透射光路上和反射光路上。

本发明实施例在光程调节装置60的第二反射镜62的反射光路上还设有第三反射镜120，第三反射镜120反射后的荧光与另一路荧光平行，使这两路荧光可以由同一成像透镜50收集，简化系统结构。

优选地，光程调节装置60、焦面调节装置70和第三反射镜120均设置于透射荧光光路上，第三反射镜120设置于第二反射镜62和焦面调节装置70之间。

在本实施例中，门控探测器90采用门控像增强器ICCD。分束镜40的反射和透射比例为1:1。准直扩束装置包括一准直镜和一扩束镜。

参考图3，本发明实施例进一步提供一种生物分子三维动态分析方法，该方法可以基于上述系统实现，具体包括下述步骤：

步骤S1、获取脉冲激光；

具体地，通过脉冲激光器10发射脉冲激光。该脉冲激光为皮秒脉冲激光或者飞秒脉冲激光。

步骤S2、将脉冲激光准直扩束后投射至样品100，使样品100发荧光；

具体地，通过准直扩束装置将脉冲激光进行准直扩束，并输出至双色镜20，通过双色镜20反射至样品100，使样品100发荧光。

步骤S3、将荧光分束为反射荧光和透射荧光；

具体地，通过双色镜20将荧光透射至分束镜40，分束镜40将50％的荧光反射，将另外50％的荧光透射，形成两个探测通道。

步骤S4、调节反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，调节反射荧光对应的焦面和透射荧光对应的焦面错位；

具体地，通过光程调节装置60调节反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，获得焦面错位的两条探测光路。

步骤S5、通过门控探测器90分别探测反射荧光信号和透射荧光信号，且控制门控探测器90开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；

具体地，通过时间同步装置80同步开放脉冲激光器10和门控探测器90，即控制门控探测器90开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间，使反射荧光和透射荧光先后被探测，获得反射荧光信号和透射荧光信号。

步骤S6、通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。

具体地，根据上述荧光寿命公式

计算荧光寿命，其中，τ为荧光寿命，Δt为反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间，I₁为光程较短的探测光路的荧光信号强度，I₂为光程较长的探测光路的荧光信号强度。利用双焦面图像进行分子三维定位，具体的定位原理如前述内容所述，此处不再重复说明。

可以理解，上述步骤的执行顺序仅是基于光路的传输方向定义的顺序，以便于理解本发明的工作原理，对于既定的系统，其在工作状态下，各光学器件是同时工作的，并无先后开启顺序。例如，时间同步装置80在系统运行期间，分时控制脉冲激光器10和门控探测器90，其和其他器件之间并不存在先后运行的关系，其他器件同理。

该生物分子三维动态分析方法基于同一系统实现了分子三维纳米荧光定位和荧光寿命的检测，进而同时实现了细胞内分子动态追踪和微环境变化监测，为细胞分子动态研究工作提供了更有利的支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.生物分子三维动态分析系统，其特征在于，包括

脉冲激光器，用于发射脉冲激光；

双色镜，设置于所述脉冲激光器的输出光路上，用于向样品反射脉冲激光并透射样品产生的荧光；

物镜，设置于所述双色镜的反射光路上，用于将所述脉冲激光投射于所述样品上，收集所述样品产生的荧光并将所述荧光向所述双色镜输出；

分束镜，设置于所述双色镜的透射光路上，用于将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；所述分束镜的反射和透射比例为1:1；

成像透镜，设置于所述反射荧光和透射荧光的光路上；

门控探测器，设置于所述成像透镜的输出光路上，用于探测反射荧光信号和透射荧光信号；

光程调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于控制反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，所述反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间为1～3纳秒；

焦面调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于使反射荧光光路和透射荧光光路对应的焦平面错位；

时间同步装置，设置于所述脉冲激光器和所述门控探测器之间，用于根据所述反射荧光和所述透射荧光的光程差控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间，所述门控探测器的开放时间间隔为1～3纳秒；

所述生物分子三维动态分析系统通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。

2.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，还包括光束调整装置，设置于所述脉冲激光器和所述双色镜之间，用于准直扩束。

3.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述脉冲激光器为皮秒脉冲激光器或者飞秒脉冲激光器。

4.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述光程调节装置包括可移动的反射镜组，所述反射镜组包括第一反射镜和第二反射镜，所述第一反射镜设置于所述分束镜的透射方向，所述第二反射镜设置于所述第一反射镜的反射方向，并与所述第一反射镜成90°角相对设置。

5.如权利要求4所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述第二反射镜和所述成像透镜之间还设有第三反射镜，所述第三反射镜反射的透射荧光与所述反射荧光平行。

6.如权利要求5所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述焦面调节装置为透镜，设置于所述第三反射镜和所述成像透镜之间。

7.基于权利要求1～6任一项所述的生物分子三维动态分析系统的生物分子三维动态分析方法，其特征在于，包括下述步骤：

获取脉冲激光；

将所述脉冲激光准直扩束后投射至样品，使所述样品发荧光；

将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；

调节反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，调节所述反射荧光对应的焦面和透射荧光对应的焦面错位；

通过门控探测器分别探测所述反射荧光信号和透射荧光信号，且控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；

通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。

8.如权利要求7所述的生物分子三维动态分析方法，其特征在于，所述荧光寿命为

其中，τ为荧光寿命，Δt为反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间，I₁为光程较短的探测光路的荧光信号强度，I₂为光程较长的探测光路的荧光信号强度。

9.如权利要求7或8所述的生物分子三维动态分析方法，其特征在于，根据所述反射荧光信号和透射荧光信号的双焦面图像获得分子三维定位信息的步骤具体为：

根据反射荧光信号和/或透射荧光信号的亮斑或亮环的位置确定所述分子的横向定位信息；

根据所述反射荧光信号和透射荧光信号的亮环直径确定所述分子的轴向定位信息。

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