WO2011083754A1 - 蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法 - Google Patents

蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011083754A1
WO2011083754A1 PCT/JP2011/000004 JP2011000004W WO2011083754A1 WO 2011083754 A1 WO2011083754 A1 WO 2011083754A1 JP 2011000004 W JP2011000004 W JP 2011000004W WO 2011083754 A1 WO2011083754 A1 WO 2011083754A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescence
phase shift
signal
output level
light receiving
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/000004
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
林　弘能
成幸 中田
一輝 星島
土井　恭二
Original Assignee
三井造船株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 三井造船株式会社 filed Critical 三井造船株式会社
Priority to EP11731752A priority Critical patent/EP2522987A1/en
Priority to US13/520,830 priority patent/US20120282649A1/en
Priority to JP2011500401A priority patent/JP4818481B2/ja
Priority to CN201180005407.8A priority patent/CN102713574A/zh
Publication of WO2011083754A1 publication Critical patent/WO2011083754A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1429—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for processing a fluorescence signal of fluorescence emitted from an object to be measured by receiving irradiation of laser light, and a method for processing a fluorescence signal.
  • flow cytometers In the medical and biological fields, flow cytometers are widely used. This flow cytometer receives the fluorescence emitted from the object to be measured by irradiating a laser beam using a photoelectric converter such as a photomultiplier tube or an avalanche photodiode to select the type of object to be measured such as cells or genes. Analyze the characteristics of the object to be measured, number, and further.
  • a photoelectric converter such as a photomultiplier tube or an avalanche photodiode
  • a flow cytometer applies pressure to an object to be measured, which is produced by labeling an analyte such as cells, DNA, RNA, enzymes, biological substances such as proteins, etc. with a fluorescent reagent.
  • the sheath fluid flowing in the conduit is flowed at a velocity of about 10 m or less to form a laminar sheath flow.
  • the flow cytometer irradiates laser light to the measurement object in this flow, the flow cytometer receives the fluorescence emitted from the fluorescent dye attached to the analysis object, and identifies this fluorescence as a label of the analysis object To identify the subject of analysis.
  • This flow cytometer can measure, for example, the relative amounts of intracellular DNA, RNA, enzymes, proteins, etc., and analyze their function in a short time. Also, the flow cytometer discriminates predetermined types of cells and chromosomes by fluorescence, and selects and collects only the discriminated cells and chromosomes in a short time in a living state using a cell sorter or the like. In the use of this flow cytometer, it is required to identify more measurement objects from fluorescence information accurately in a short time.
  • the fluorescence detection apparatus intensity-modulates the laser light and irradiates the measurement object, receives the fluorescence from the measurement object by the photoelectric converter, and outputs the fluorescence signal of the photoelectric converter The phase shift with respect to the modulation signal used for intensity modulation of laser light is determined, and the fluorescence relaxation time is calculated from this phase shift.
  • the phase shift used to calculate the fluorescence relaxation time is the phase shift due to the characteristics of the photoelectric converter itself that receives fluorescence, and the effects of the phase shift due to the electric circuit length as well as the optical path length of laser light and fluorescence in the device Calculated.
  • the phase shift used to calculate the fluorescence relaxation time slightly varies depending on the output level of the fluorescence signal output from the photoelectric converter, the value of the fluorescence relaxation time may not necessarily be calculated.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • An object of the present invention is to provide a detection device and a fluorescence detection method, and a method of processing a fluorescence signal, which is used in the fluorescence detection device and the fluorescence detection method.
  • the fluorescence detection device is A light source unit for emitting a laser beam by intensity modulation with a modulation signal of a predetermined frequency; A light receiving unit including a light receiving element capable of adjusting the output level, which receives the fluorescence of the object to be measured emitted by the laser light and emits the fluorescence signal whose output level is adjusted; A first processing unit that generates fluorescence data including phase and intensity information by mixing the fluorescence signal with the modulation signal of the frequency; A first phase shift of the fluorescence relative to the modulation signal is calculated using the fluorescence data, and the calculated first phase shift is corrected according to the adjustment condition of the output level. And a second processing unit that calculates the phase shift of 2 and calculates the fluorescence relaxation time of the fluorescence using the calculated second phase shift.
  • the light receiving unit includes an adjusting unit that adjusts the output level according to an adjustment parameter value given to the light receiving element.
  • the second processing unit uses a correction formula determined according to the adjustment parameter value when performing the correction.
  • the second processing unit stores in advance a value of a constant used in the correction formula, and when performing the correction, recall and use the value of the constant.
  • the second processing unit obtains in advance the relationship between the adjustment parameter value and the output level by changing in advance the adjustment parameter value given to the light receiving element, and the relationship is saturation of the output level of the light receiving element. It is preferable to have an output level adjustment part which extracts the value of the said constant used for the said correction formula, when not representing. At that time, the fluorescence relaxation time calculated from the second phase shift using the reference object whose fluorescence relaxation time is known as the measurement object approximates the known fluorescence relaxation time of the reference object by the correction. Preferably, the output level adjustment unit extracts the value of the constant.
  • the light receiving element is, for example, a photomultiplier
  • the adjustment parameter value is a voltage applied to an electrode of the photomultiplier.
  • the first phase shift is ⁇ meas
  • the second phase shift is ⁇ ⁇
  • an adjustable light reduction filter is provided in front of the light receiving surface of the light receiving element.
  • Another aspect of the present invention is a fluorescence detection method of a fluorescence detection apparatus for processing a fluorescence signal of fluorescence emitted from a measurement object upon receiving irradiation of laser light.
  • the method is Intensity-modulating and emitting laser light with a modulation signal of a predetermined frequency; Receiving the fluorescence of the object to be measured emitted from the laser light and emitted by the light receiving element, and outputting the fluorescence signal whose output level is adjusted; Generating fluorescence data including phase and intensity information by mixing the fluorescence signal with the modulation signal of the predetermined frequency; A first phase shift of the fluorescence relative to the modulation signal is calculated using the fluorescence data, and the calculated first phase shift is corrected according to the adjustment condition of the output level. Calculating the phase shift of 2 and calculating the fluorescence relaxation time of the fluorescence using the calculated second phase shift.
  • Yet another aspect of the present invention is a method in which a fluorescence detection apparatus processes a fluorescence signal of fluorescence emitted from a reference object whose fluorescence relaxation time is known by being irradiated with laser light.
  • the method is A first step of intensity-modulating and emitting laser light with a modulation signal of a predetermined frequency; A second step of receiving the fluorescence of the reference object emitted by the laser light and emitted by the light receiving element, and outputting the fluorescence signal of which the output level is adjusted; A third step of generating fluorescence data including phase and intensity information by mixing the fluorescence signal with the modulation signal of the predetermined frequency; An adjustment parameter given to the light receiving element to calculate the first phase shift of the fluorescence with respect to the modulation signal using the fluorescence data, and adjust the calculated first phase shift and the output level A fourth step of storing values in pairs; A fifth step of storing a plurality of sets of the first phase shift and the adjustment parameter value by changing the adjustment parameter value and repeat
  • the adjustment parameter value so that the output level decreases each time the first step to the fourth step are repeated. Further, the fluorescence received by the light receiving element is reduced by the light reduction filter before being received by the light receiving element so that the output level of the fluorescence signal output from the light receiving element is not saturated. Is preferred.
  • the accurate fluorescence relaxation time can be calculated. Further, in the method of processing the fluorescence signal according to the above aspect, the value of the constant used in the correction equation for calculating the accurate fluorescence relaxation time can be efficiently determined.
  • (A), (b) is a graph which shows the relationship between the control voltage given to a photomultiplier shown in FIG. 4, and the phase shift angle (theta) meas of fluorescence. It is a figure which shows the example of the flow which determines the value of the constants X and A used for correction
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using the fluorescence detection device of the present embodiment.
  • the flow cytometer 10 has a signal processing device 20 and an analysis device (computer) 80.
  • the signal processing apparatus 20 irradiates laser light to the sample 12 to be measured, detects a fluorescence signal of fluorescence emitted by the sample 12, and performs signal processing.
  • the analysis device (computer) 80 calculates the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time from the processing result obtained by the signal processing device 20. Examples of the sample 12 will be described in later by using the configured measurement object by fluorescent protein (fluorescent dye) cells with a X 1 (analyte) X 2. In the present embodiment, fluorescent dyes other than fluorescent proteins can also be used.
  • a fluorescent protein X 1 enters into the cell X 2, a configuration in which the fluorescent protein X 1 are dispersed is taken up into cells X 2.
  • the fluorescent protein X 1 attached to the cell X 2 is not limited to one, and may be plural.
  • the signal processing device 20 includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, a control / processing unit 28, and a pipeline 30.
  • the control and processing unit 28 includes a control unit that causes the laser light from the laser light source unit 22 to be intensity-modulated at a predetermined frequency, and a signal processing unit that processes a fluorescence signal of fluorescence emitted by the sample 12.
  • the conduit 30 forms a flow of the sample 12 by being included in a sheath fluid that forms a high-speed flow.
  • a recovery container 32 is provided at the outlet of the conduit 30, a recovery container 32 is provided.
  • a cell sorter for separating a biological substance such as a predetermined cell in the sample 12 in a short time by irradiating a laser beam is arranged to be separated into separate collection containers. It can also be done.
  • the laser light source unit 22 is a portion that emits laser light of a predetermined wavelength.
  • a lens system is provided to focus the laser light at a predetermined position in the conduit 30, at which the measurement point of the sample 12 is formed.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the configuration of the laser light source unit 22.
  • the laser light source unit 22 has a wavelength in the visible light band, and emits intensity-modulated laser light.
  • the laser light source unit 22 has a light source 22a.
  • the light source 22a emits a laser beam L having a wavelength for exciting the fluorescent protein X 1 as a CW (continuous wave) laser beam, and emits the laser beam L while modulating the intensity of the laser beam L with a modulation signal of a predetermined frequency f Do.
  • the laser light source unit 22 has a lens system 23 and a laser driver 34.
  • the lens system 23 focuses the laser light L at the center of the conduit 30 to form a measurement point.
  • the laser driver 34 drives the light source 22a.
  • a semiconductor laser is used as a light source for emitting the laser light L.
  • the laser light L outputs, for example, about 5 to 100 mW.
  • the frequency (modulation frequency) f used for intensity modulation of the laser light L has a period slightly longer than the fluorescence relaxation time, for example, 10 to 50 MHz.
  • the light source 22a oscillates in a predetermined wavelength band so that the laser light L excites the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band.
  • the sample 12 excited by the laser beam L passes the measurement point of the conduit 30, the sample 12 is irradiated with the laser beam L at the measurement point.
  • the fluorescent protein X 1 emits fluorescence at a specific wavelength.
  • the light receiving unit 24 is disposed to face the laser light source unit 22 with the conduit 30 interposed therebetween.
  • the light receiving unit 24 includes a photoelectric converter for outputting a detection signal of the sample 12 notifying that the sample 12 passes the measurement point by receiving the laser light forward scattered by the sample 12 passing the measurement point.
  • the detection signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control / processing unit 28 and the analyzer 80, and is notified of the timing at which the sample 12 passes the measurement point in the conduit 30, and starts processing. It is used as a start ON signal and an OFF signal.
  • the light receiving unit 26 is disposed perpendicular to the emission direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the conduit 30. And a photomultiplier that receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
  • a known photoelectric converter such as an avalanche photodiode can be used instead of the photomultiplier tube.
  • FIG. 3 is a schematic configuration view showing a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26. As shown in FIG.
  • the light receiving unit 26 shown in FIG. 3 includes a lens system 26a for focusing the fluorescence signal from the sample 12, an ND filter 26b, a band pass filter 26c, a voltage adjusting unit 26d, and a photomultiplier tube (light receiving element) 27. And.
  • the lens system 26 a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surface of the photomultiplier tube 27.
  • the ND filter 26 b attenuates the fluorescence incident on the light receiving unit 26.
  • the reason why the light receiving unit 26 uses the ND filter 26b is, as described later, that the fluorescence is reduced so that the output level of the fluorescence signal is not saturated even if the control voltage applied to the anode of the photomultiplier tube 27 is maximized. It is for.
  • the band pass filter 26 c is provided on the front surface of the light receiving surface of the photomultiplier tube 27 and is a filter that transmits only fluorescence of a predetermined wavelength band.
  • the photomultiplier tube 27 is a light receiving element which converts the light received by the photoelectric surface into an electric signal and outputs a fluorescence signal.
  • the output level of the fluorescence signal output here is adjusted. Since the fluorescence received by the photomultiplier tube 27 is based on the laser light that has been intensity-modulated at a predetermined frequency, the intensity of the output fluorescence signal also fluctuates at the predetermined frequency.
  • the fluorescence signal output by receiving the fluorescence is supplied to the control and processing unit 28.
  • FIG. 4 is a view showing a schematic configuration of the photomultiplier tube 27.
  • the photomultiplier tube 27 is, for example, a cathode 27a having a light receiving surface on the surface, a focusing electrode 27b, a photomultiplier 27c, and anodes 27d 1 to 27 in a vacuum vessel maintaining a vacuum atmosphere of about 10 -4 Pa. and 27d 11, have, have a stem 27e outside the vacuum vessel.
  • photoelectrons are emitted from the photoelectric surface of the cathode 27a into the vacuum in the vacuum chamber.
  • the photoelectrons are guided to the photomultiplier 27c by the focusing electrode 27b.
  • Photoelectrons is pulled by the anode 27d 1 collides with the dynodes 27c 1 of the photomultiplier portion 27c, dynodes 27c 1 emits secondary electrons. Furthermore, the secondary electrons emitted by the dynode 27c 1 is dynodes 27c 2 collide is pulled by the anode 27d 2 provided on the front surface of the dynode 27c 2 dynode 27c 2 is further emits secondary electrons.
  • anode 27 d n (n is an integer of 2 or more and 10 or less) and collides with the dynode 27 c 3 to the dynode 27 c 10 , and further secondary electrons are sequentially emitted from the dynode 27 c 3 to the dynode 27 c 10 Is multiplied. Multiplied electrons by being collected in the dynode 27c 11 is pulled by the anode 27d 11, fluorescent current is generated through the stem 27e.
  • the moving velocity of electrons is determined by the voltage applied to the anodes 27d 1 to 27d 11, and the energy of electrons colliding with the dynodes 27c 1 to 27c 10 is determined by the moving velocity of the electrons. Therefore, the amount of secondary electrons emitted from the dynodes 27c 1 to 27c 10 is adjusted by the voltage applied to the anodes 27d 1 to 27d 11 .
  • the flow cytometer 10 uses the voltage applied to the anodes 27d 1 to 27d 11 as a control voltage for controlling the output level of the fluorescence signal (fluorescence current).
  • the voltage adjustment unit 26d sets a control voltage for controlling the output level of the fluorescence signal and applies the control voltage to the photomultiplier tube 27.
  • the voltage adjustment unit 26d sets a control voltage in accordance with an instruction of the output level adjustment unit 94 of the analysis device 80 described later.
  • the voltage adjustment unit 26d provides information on the control voltage applied to the photomultiplier tube 27 to a phase shift correction unit 88 (see FIG. 6) described later.
  • the control / processing unit 28 includes a signal generation unit 40, a signal processing unit 42, and a signal control unit 44, as shown in FIG.
  • the signal generator 40 generates a modulation signal for modulating the intensity of the laser light L at a predetermined frequency f.
  • the signal generation unit 40 includes an oscillator 46, a power splitter 48, and amplifiers 50 and 52.
  • the signal generation unit 40 supplies the generated modulation signal to the laser driver 34 of the laser light source unit 22 and also to the signal processing unit 42.
  • the reason for supplying the modulation signal to the signal processing unit 42 is to use it as a reference signal for detecting a fluorescence signal output from the photomultiplier tube 27 as described later.
  • the modulation signal is a signal in which a sine wave signal of a predetermined frequency is placed on the DC component, and is set to a frequency in the range of 10 to 50 MHz.
  • the signal processing unit 42 uses the fluorescence signal output from the photomultiplier tube 27 to extract phase shift information of the fluorescence emitted by the irradiation of the laser light.
  • the signal processing unit 42 includes an amplifier 54, an IQ mixer 58, and a low pass filter 62.
  • the amplifier 54 amplifies the fluorescence signal output from the photomultiplier tube 27.
  • the IQ mixer 58 is a device that mixes the fluorescence signal supplied from the photomultiplier tube 27 with the modulation signal supplied from the signal generation unit 40 as a reference signal. Specifically, the IQ mixer 58 multiplies the reference signal by the fluorescence signal (RF signal), and shifts the phase of the modulation signal by 90 degrees with respect to the I signal of the fluorescence signal, which includes a component in phase with the modulation signal. And the Q signal of the fluorescence signal containing the component.
  • the I signal containing the in-phase component is generated by mixing the modulation signal and the fluorescence signal, and the Q signal containing the 90 ° phase shifted component is mixing the fluorescence signal with the 90 ° phase shifted modulation signal Generated by
  • the low pass filter 62 filters low frequency signals of the I signal and the Q signal generated by the IQ mixer 58. By this filtering, the component (Re component) of the fluorescence signal and the component (Im component) of the fluorescence signal shifted in phase by 90 degrees with respect to the modulation signal are extracted as fluorescence data. The extracted components are sent to the signal control unit 44.
  • processing including mixing processing by the IQ mixer 58 and filtering processing by the low pass filter 62 is referred to as frequency down conversion processing, and data obtained by this processing is referred to as fluorescence data.
  • the signal control unit 44 amplifies the Re component and the Im component of the fluorescence signal sent from the signal processing unit 42, and performs AD conversion. Specifically, the signal control unit 44 gives an instruction for operation control of each part, and a system controller 60 that manages all operations of the flow cytometer 10, an Re component generated by the signal processing unit 42, and It has an amplifier 64 for amplifying the Im component, and an A / D converter 66 for sampling the amplified Re component and Im component.
  • the amplifier 64 and the A / D converter 66 can also be implemented in the analysis device 80 described later.
  • the analyzer 80 obtains the dephasing angle of fluorescence with respect to the laser light from the Re component and the Im component obtained by AD conversion in the signal control unit 44, and further determines the fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) from this dephasing angle Ask for). Further, the analyzer 80 obtains fluorescence intensity from the Re component and the Im component.
  • FIG. 6 is a diagram showing a schematic configuration of the analysis device 80. As shown in FIG. The analysis device 80 is configured by a computer including a CPU 82 and a memory 84.
  • the analyzer 80 further includes a phase shift calculating unit 86, a phase shift correcting unit 88, a fluorescence relaxation time calculating unit 90, a fluorescence intensity calculating unit 92, and an output level adjusting unit 94.
  • a phase shift calculating unit 86 phase shift correcting unit 88
  • a fluorescence relaxation time calculating unit 90 fluorescence intensity calculating unit 92
  • an output level adjusting unit 94 output level adjusting unit 94.
  • Each of these parts is a software module that exhibits functions by activating software on the computer. Of course, these parts can also be configured by dedicated circuits.
  • the phase shift calculation unit 86 sets the declination of the complex number with the Re component as the real part and the Im component as the imaginary part of the fluorescence data of the fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1 (tan -1 (Im component of fluorescence data / fluorescence data The Re component) is calculated as the phase shift angle ⁇ meas .
  • the phase shift calculation unit 86 provides the phase shift correction unit 88 with the phase shift angle ⁇ meas .
  • the phase shift correction unit 88 corrects the phase shift angle ⁇ meas calculated by the phase shift calculation unit 86 according to the control voltage (adjustment parameter value) applied to the anodes 27 d 1 to d 11 of the photomultiplier tube 27. by performing, i.e., by performing the correction according to the output level of the adjustment condition of the fluorescence signal through the voltage adjusting unit 26 d, and calculates a phase shift angle theta tau derived from the fluorescence fluorescent protein X 1 is emitted.
  • This correction is performed to prevent a change in the phase shift angle ⁇ caused by a change in moving speeds of photoelectrons and secondary electrons in the photomultiplier tube 27, and to calculate an accurate fluorescence relaxation time.
  • the moving speeds of photoelectrons and secondary electrons differ depending on the control voltage. Therefore, the phase shift angle ⁇ meas is corrected in accordance with the set control voltage.
  • the time t for which the photoelectrons and secondary electrons move is represented by the following formula (1) .
  • t (2 ml 2 / V / q) (1/2) (1)
  • m is the mass of the electron
  • q is the charge amount of the electron
  • V is the control voltage.
  • the phase shift angle ⁇ is proportional to time t.
  • phase shift angle phase shift angle derived from the photomultiplier tube 27
  • ⁇ pmt A ⁇ V ( ⁇ 1 / 2) It is represented by + B.
  • a and B are constants.
  • phase shift angle ⁇ meas calculated by the phase shift calculation unit 86 can be expressed by the following equation (2).
  • ⁇ meas ⁇ 0- ( ⁇ pmt + ⁇ d + ⁇ ⁇ ) (2)
  • ⁇ 0 a reference dephasing angle (constant)
  • ⁇ pmt is a dephasing angle derived from the photomultiplier tube 27
  • ⁇ d is laser light and fluorescence in the flow cytometer 10
  • ⁇ ⁇ is the dephasing angle derived from the electric circuit length of the fluorescence signal.
  • phase shift angle ⁇ ⁇ derived from the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 is expressed as shown in the following formula (3).
  • ⁇ ⁇ ⁇ 0- ( ⁇ pmt + ⁇ d + ⁇ meas ) (3)
  • ⁇ ⁇ X ⁇ meas ⁇ A ⁇ V ( ⁇ 1/2) (4)
  • the memory 84 of the analyzer 80 stores the values of the constant X and the constant A in advance.
  • the phase shift correction unit 88 calls the values of the constant X and the constant A from the memory 84 and gives them to the equation (4) to prepare a correction equation.
  • the phase shift correction unit 88 generates the phase shift angle ⁇ using the prepared correction formula from the phase shift angle ⁇ meas provided from the phase shift calculation unit 86 and the control voltage V provided from the voltage adjustment unit 26 d. Calculate ⁇ .
  • the phase shift correction unit 88 supplies the calculated phase shift angle ⁇ ⁇ to the fluorescence relaxation time calculation unit 90.
  • f is a frequency used for intensity modulation of the laser light L.
  • Fluorescence intensity calculation unit 92 the fluorescence data sent from the AD converter 66, by obtaining the absolute value of a complex number to the imaginary part Im component and the real part of the Re component, fluorescence of the fluorescence fluorescent protein X 1 is emitted Calculate the strength.
  • the fluorescence intensity of the calculated fluorescent protein X 1, the phase shift angle theta tau and fluorescence relaxation time tau, is output as the result information to the output device as a printer or a display or the like (not shown).
  • the result information is also subjected to statistical processing as a measurement result obtained each time the sample 12 passes the measurement point of the conduit 30.
  • the output level adjustment unit 94 generates a control signal for determining a control voltage to be applied to the photomultiplier tube 27.
  • the control voltage is freely set in the range in which the output level of the fluorescence signal output from the photomultiplier tube 27 is not saturated.
  • the output level adjustment unit 94 acquires at least information on the current control voltage applied to the photomultiplier tube 27. Further, the output level adjustment unit 94 performs calibration, which will be described later, in order to calculate the values of the constant X and the constant A.
  • FIG. 7A shows the analysis of the fluorescence dephasing angle ⁇ meas of the fluorescent protein Qdot 555 and the flow cytometer 10 using the flow cytometer 10, which is obtained from the correction equation prepared by adding the values of the constant X and the constant A.
  • 6 is a graph comparing the calculated actual phase shift angle ⁇ meas .
  • FIG. 7B shows the analysis of the fluorescence dephasing angle ⁇ meas of the fluorescent protein PerCP and the flow cytometer 10 using the flow cytometer 10, which is obtained from the correction equation prepared by adding the values of the constant X and the constant A. It is the graph which compared with calculated actual phase shift angle theta meas .
  • Curves in FIGS. 7A and 7B are calculation results of the phase shift angle ⁇ meas according to the correction formula, and ⁇ are actual measurement results of the phase shift angle ⁇ meas .
  • the correction equation is extremely consistent with the measurement result. From this, the correction using the correction equation, that is, the phase shift angle ⁇ ⁇ calculated by equation (4) can calculate the fluorescence relaxation time with high accuracy.
  • the flow cytometer 10 emits laser light, which is intensity-modulated at a predetermined frequency f, from the laser light source unit 22 as irradiation light.
  • the light receiving unit 26 receives the fluorescence and outputs a fluorescence signal.
  • the control and processing unit 28 generates the fluorescence data including the phase shift angle and the intensity amplitude of the fluorescence signal with respect to the modulation signal by mixing the outputted fluorescence signal with the modulation signal for modulating the intensity of the laser light L.
  • the phase shift calculating unit 86 of the analyzer 80 calculates the phase shift angle ⁇ meas from the generated fluorescence data.
  • the phase shift correction unit 88 calculates the phase shift angle ⁇ ⁇ as the calculated phase shift angle ⁇ meas according to the equation (4), which is a correction equation to which the values of the constant X and the constant A are given.
  • the fluorescence intensity calculator 92 calculates the fluorescence intensity by obtaining the absolute value of the generated fluorescence data. The calculated fluorescence relaxation time, the phase shift angle ⁇ ⁇ and the fluorescence intensity are output from an output device (not shown).
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the flow of calibration for determining the values of the constants X and A stored in the memory 84 using the flow cytometer 10.
  • the fluorescent protein X 1 used for measurement in the flow cytometer 10 is one whose fluorescence relaxation time ⁇ is known.
  • the output level adjustment unit 94 of the analyzer 80 maximizes the control voltage V of the photomultiplier tube (hereinafter referred to as PMT) 27 (step S10).
  • the maximization of the control voltage V is to enable high sensitivity detection of fluorescence even with a small amount of fluorescence.
  • Adjustment of the control voltage is performed through the voltage adjustment unit 26d.
  • the output level adjustment unit 94 of the analysis device 80 appropriately adjusts the ND filter 26b (step S20).
  • the light reduction by the ND filter is performed so that the output level of the fluorescence signal of the PMT 27 with respect to the light amount is not saturated when the control voltage of the PMT 27 is maximized to make the PMT 27 in the highest sensitivity state.
  • the ND filter 26 b is set, for example, in the middle of the maximum attenuation and the minimum attenuation.
  • the light source 22a emits the laser light L whose intensity is modulated at the frequency f (step S30).
  • the PMT 27 receives fluorescence emitted from the sample 12 that has been irradiated with the laser light L.
  • the PMT 27 outputs the fluorescence signal at the output level adjusted by the control voltage V (step S40).
  • the fluorescence signal is processed by the signal processing unit 42 and the signal control unit 44 to generate fluorescence data including the Re component and the Im component (step S50).
  • the fluorescence intensity calculator 92 of the analyzer 80 calculates the fluorescence intensity from the fluorescence data (step S60).
  • the fluorescence intensity is represented by the absolute value of the fluorescence data.
  • the output level adjustment unit 94 determines whether the set control voltage V is equal to or less than a predetermined voltage (step S70). If the determination result is negative, the output level adjustment unit 94 reduces the control voltage V by a constant width through the voltage adjustment unit 26d (step S80). Thus, steps S30 to S70 are repeated using the reduced control voltage. That is, adjustment of the control voltage V is performed so that the level of the fluorescence signal decreases each time steps S30 to S70 are repeated. If the determination in step S70 is affirmative, the output level adjustment unit 94 further determines the presence or absence of saturation of the fluorescence signal output by the PMT 27 using a change in fluorescence intensity with respect to the control voltage V (step S90).
  • Determination of the presence or absence of saturation of the fluorescence signal which PMT 27 outputs may be performed according to the operator's input which confirmed the characteristic result graph-displayed on the display which is not shown in figure.
  • the analysis device 80 may automatically analyze the characteristic result graphically displayed on the display (not shown) to determine the presence or absence of saturation of the fluorescence signal. For example, as shown in FIG.
  • the characteristic of the fluorescence intensity with respect to the control voltage V is The presence or absence of saturation of the fluorescence signal is determined based on the result of visual confirmation by the operator or based on the analysis result of the analysis device 80 to determine whether or not there is a region that changes gently from a straight line as the temperature rises. judge. If the result of this determination is affirmative, the process returns to step S20, and steps S20 to S80 are repeated.
  • step S90 If the determination result in step S90 is negative, that is, if the PMT 27 is not in a saturated state, the output level adjustment unit 94 approximates the regression equation and extracts the values of constant X and constant A (step S100)
  • the values of X and constant A are stored in the memory 84 (step S110).
  • the regression equation the following equation (5) obtained by modifying the above equation (4) is used.
  • ⁇ meas X ⁇ ⁇ ⁇ A ⁇ V ( ⁇ 1/2) (5)
  • ⁇ ⁇ tan -1 (2 ⁇ f ⁇ )
  • f the laser light intensity modulation frequency (known)
  • tau the fluorescence relaxation time of the fluorescent protein X 1 used for measurement
  • the output level adjustment unit 94 uses a regression equation such as the equation (5) or the like such that the phase deviation angle ⁇ meas predicted using the equation (5) is approximated to the phase deviation angle ⁇ meas measured.
  • the values of the constant X and the constant A are extracted from the measured phase shift angle ⁇ meas .
  • the dephasing angle ⁇ ⁇ determined by the known fluorescence relaxation time ⁇ is the dephasing angle (the value on the right side of the formula (4)) corrected using the above equation (4) for the actually dephasing angle ⁇ measn.
  • the fluorescence relaxation time calculated from the corrected dephasing angle shown on the right side of the equation (4) approximates the known fluorescence relaxation time .tau.
  • the values of constant X and constant A are extracted using a known method such as least squares approximation.
  • the values of the constant X and the constant A are device-specific values regardless of the fluorescent protein X 1 and can be used even if the type of fluorescent protein is changed.
  • the analyzer 80 can accurately predict a change in the phase shift angle ⁇ meas with respect to the control voltage of the PMT 27 using the set regression equation, as shown in FIGS. 7 (a) and 7 (b). Therefore, the analyzer 80 is derived from the fluorescent protein X 1 from the measured phase shift angle ⁇ meas using the equation (4) which is a correction equation that defines the values of the constant X and the constant A used in this regression equation.
  • the phase shift angle ⁇ ⁇ can be calculated. That is, the phase shift angle ⁇ meas can be corrected.
  • the analyzer 80 can accurately calculate the fluorescence relaxation time of fluorescence fluorescent protein X 1 is emitted.
  • the fluorescence detection apparatus, the fluorescence detection method, and the method of processing a fluorescence signal according to the present invention have been described in detail above, but the present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications can be made within the scope of the present invention. Of course, it may be improved or changed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

　蛍光検出装置は、所定の周波数で変調したレーザ光の照射を受けて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を受光素子は出力する。信号処理部は、出力した蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する。分析装置は、測定対象物が発する蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した第１の位相ずれに対して、出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出する。分析装置は、さらに、算出した第２の位相ずれを用いて測定対象物が発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。

Description

蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法
　本発明は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置及び蛍光検出方法と、蛍光信号を処理する方法に関する。
　医療、生物分野では、フローサイトメータが広く用いられている。このフローサイトメータは、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や数、さらには、測定対象物の特性を分析する。
　具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等の分析対象物を蛍光試薬でラベル化することにより作られた測定対象物を、圧力を与えて毎秒略１０ｍ以内の速度で管路内を流れるシース液に流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にフローサイトメータがレーザ光を照射することにより、フローサイトメータは、分析対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光を分析対象物のラベルとして識別することで分析対象物を特定する。
　このフローサイトメータは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、フローサイトメータは、所定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって判別し、判別した細胞や染色体のみを、セル・ソータ等を用いて、生きた状態で短時間で選別収集する。
　これのフローサイトメータの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
　例えば、レーザ光の照射により、測定対象物中の蛍光色素から発せられる蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を算出することにより、多くの測定対象物を、短時間に正確に特定することができる蛍光検出装置および方法が知られている（特許文献１）。
　上記蛍光検出装置によると、蛍光検出装置は、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光を光電変換器で受光し、光電変換器が出力した蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相ずれを求め、この位相ずれから、蛍光緩和時間を算出する。
特開２００６－２２６６９８号公報
　上記蛍光緩和時間の算出に用いる位相ずれは、蛍光を受光する光電変換器自体の特性に起因する位相ずれ、装置におけるレーザ光や蛍光の光路長の他、電気回路長による位相ずれの影響を除いて算出される。しかし、上記蛍光緩和時間の算出に用いる位相ずれは、光電変換器から出力される蛍光信号の出力レベルに応じて微妙に変化するので、必ずしも、正確な蛍光緩和時間の値が算出されない場合があった。特に、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）の有無の判定等においては、蛍光緩和時間の値を正確に算出することが望まれる。
　そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を処理するとき、正確な蛍光緩和時間を算出することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法と、この蛍光検出装置および蛍光検出方法に用いる、蛍光信号を信号処理する方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置である。当該蛍光検出装置は、
　レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する光源部と、
　前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する、前記出力レベルの調整が可能な受光素子、を備える受光部と、
　前記蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
　前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有する。
　前記受光部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値により、前記出力レベルを調整する調整部を有する、ことが好ましい。
　その際、前記第２の処理部は、前記補正を行うとき、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式を用いる、ことが好ましい。
　さらに、前記第２の処理部は、前記補正式に用いる定数の値を予め記憶し、前記補正を行うとき、前記定数の値を呼び出して用いる、ことが好ましい。
　また、前記第２の処理部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することにより、前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係を求め、前記関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、前記補正式に用いる前記定数の値を抽出する出力レベル調整部を有する、ことが好ましい。
　その際、蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により、前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、前記出力レベル調整部は前記定数の値を抽出する、ことが好ましい。
　前記受光素子は、例えば光電子増倍管であり、前記調整パラメータ値は、前記光電子増倍管の電極に印加する電圧である。
　そのとき、前記電極に印加する電圧をＶ、前記第１の位相ずれをθmeas、前記第２の位相ずれをθτ、としたとき、前記補正式は、下記式で表される、ことが好ましい。
　　　θτ＝　Ｘ－θmeas－Ａ・Ｖ(-1/2)　
（ＸおよびＡは定数。）
　また、前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられる、ことが好ましい。
　本発明の他の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置の蛍光検出方法である。当該方法は、
　レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射するステップと、
　前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力するステップと、
　前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成するステップと、
　前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有する。
　本発明のさらに他の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより、蛍光緩和時間が既知の基準対象物が発する蛍光の蛍光信号を蛍光検出装置が処理する方法である。当該方法は、
　レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する第１のステップと、
　前記レーザ光に照射されて発する基準対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する第２のステップと、
　前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
　前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれと、前記出力レベルを調整するために、前記受光素子に与える調整パラメータ値とを組にして記憶する第４のステップと、
　前記調整パラメータ値を変更して、前記第１のステップ～前記第４のステップを繰り返すことにより、前記第１の位相ずれと前記調整パラメータ値の組を複数組記憶する第５のステップと、
　記憶した前記複数組を呼び出し、前記調整パラメータ値と前記第１の位相ずれとの関係を定める回帰式を、呼び出した前記複数組の関係に近似させることにより、前記回帰式に含まれる未知の定数の値を抽出する第６のステップと、
　抽出した前記定数の値を記憶する第７のステップと、を有する。
　その際、前記第１のステップ～前記第４のステップを繰り返す度に、前記出力レベルが減少するように、前記調整パラメータ値を変更する、ことが好ましい。
　また、前記受光素子に受光される前記蛍光は、前記受光素子の出力する前記蛍光信号の出力レベルが飽和しないように、前記受光素子に受光される前に、減光フィルタにより減光される、ことが好ましい。
　上記態様の蛍光検出装置および蛍光検出方法では、測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を処理するとき、正確な蛍光緩和時間を算出することができる。
　また、上記一態様の蛍光信号を信号処理する方法では、正確な蛍光緩和時間を算出するための補正式に用いる定数の値を効率よく決定することができる。
本実施形態の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータに用いるレーザ光源部の構成の一例を示す図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる受光部の一例の概略の構成を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる光電子増倍管の概略の構成を示す図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる制御・処理部の概略の構成を示す図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる分析装置の概略の構成を示す図である。 （ａ），（ｂ）は、図４に示す光電子増倍管に与えるコントロール電圧と蛍光の位相ずれ角θmeasとの関係を示すグラフ図である。 図１に示すフローサイトメータを用いて、補正式に用いる定数Ｘ，Ａの値を決定するフローの例を示す図である。 図４に示す光電子増倍管が出力する蛍光信号の出力レベルの飽和の例を説明する図である。
　以下、本発明の蛍光検出装置、蛍光検出方法、および蛍光信号を処理する方法を詳細に説明する。
　図１は、本実施形態の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
　フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置（コンピュータ）８０とを有する。信号処理装置２０は、測定対象とする試料１２にレーザ光を照射し、試料１２が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。分析装置（コンピュータ）８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する。試料１２の例として、蛍光蛋白（蛍光色素）Ｘ1を付けた細胞（分析対象物）Ｘ2により構成される測定対象物を用いて以降説明する。本実施形態では、蛍光蛋白以外の蛍光色素を用いることもできる。分析対象物も、細胞以外に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質の他、人工的に作製されたマイクロビーズ等を用いることもできる。なお、図１に示す試料１２は、例えば、細胞Ｘ2内に蛍光蛋白Ｘ1が進入し、蛍光蛋白Ｘ1が細胞Ｘ2内に取り込まれて分散した構成である。細胞Ｘ2に付着する蛍光蛋白Ｘ1は１つには限定されず、複数であってもよい。
　信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を有する。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２が発する蛍光の蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませることで試料１２のフローを形成する。
　管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の所定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
　レーザ光源部２２は、所定の波長のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点が形成される。
　図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
　レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する。
　レーザ光源部２２は、光源２２ａを有する。光源２２ａは、蛍光蛋白Ｘ1を励起する波長を有するレーザ光ＬをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのレーザ光Ｌの強度を所定の周波数ｆの変調信号で強度変調しながら出射する。
　さらに、レーザ光源部２２は、レンズ系２３と、レーザドライバ３４と、を有する。レンズ系２３は、レーザ光Ｌを管路３０中の中心に集束させ測定点を形成させる。レーザドライバ３４は、光源２２ａを駆動する。
　レーザ光Ｌを出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光Ｌは、例えば５～１００ｍＷ程度を出力する。
　一方、レーザ光Ｌの強度変調に用いる周波数（変調周波数）ｆは、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長く、例えば１０～５０ＭＨｚである。
　光源２２ａは、レーザ光Ｌが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌによって励起される試料１２は管路３０の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｌの照射を受ける。このとき、蛍光蛋白Ｘ1が特定の波長で蛍光を発する。
　受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されている。受光部２４は、測定点を通過する試料１２によって前方散乱したレーザ光を受光することにより、試料１２が測定点を通過することを知らせる試料１２の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される検出信号は、制御・処理部２８および分析装置８０に供給され、試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせて処理を開始するトリガ信号、処理開始のＯＮ信号、ＯＦＦ信号として用いられる。
　一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電子増倍管を備える。本実施形態では、光電子倍増管の代わりにアバランシェフォトダイオード等の公知の光電変換器を用いることもできる。
　図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
　図３に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ＮＤフィルタ２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃと、電圧調整部２６ｄと、光電子増倍管（受光素子）２７と、を有する。
　レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電子増倍管２７の受光面に集束させるように構成されている。
　ＮＤフィルタ２６ｂは、受光部２６に入射した蛍光を減光する。受光部２６がＮＤフィルタ２６ｂを用いるのは、後述するように、光電子増倍管２７の陽極に印加するコントロール電圧を最大にしても、蛍光信号の出力レベルが飽和しないように蛍光を減光するためである。
　バンドパスフィルタ２６ｃは、光電子増倍管２７の受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させるフィルタである。
　光電子増倍管２７は、光電面で受光した光を電気信号に変換し、蛍光信号を出力する受光素子である。ここで出力される蛍光信号は、出力レベルが調整されている。光電子増倍管２７が受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光に基づくので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する。この蛍光の受光によって出力される蛍光信号は、制御・処理部２８に供給される。
　図４は、光電子増倍管２７の概略の構成を示す図である。光電子増倍管２７は、例えば１０-4Ｐａ程度の真空雰囲気を維持する真空容器内に、受光面を表面に持つ陰極２７ａと、集束電極２７ｂと、光電子増倍部２７ｃと、陽極２７ｄ1～２７ｄ11と、を有し、真空容器の外側にステム２７ｅを有する。
　陰極２７ａに光が入射されると、陰極２７ａの光電面から真空容器内の真空中に光電子が放出される。この光電子は集束電極２７ｂによって光電子増倍部２７ｃに導かれる。光電子は陽極２７ｄ1により引っ張られて光電子増倍部２７ｃのダイノード２７ｃ1 に衝突して、ダイノード２７ｃ1 は二次電子を放出する。さらに、ダイノード２７ｃ1で放出された二次電子はダイノード２７ｃ2 の前面に設けられた陽極２７ｄ2により引っ張られてダイノード２７ｃ2 に衝突してダイノード２７ｃ2 は更に二次電子を放出する。こうして、陽極２７ｄn(ｎは２以上１０以下の整数)に引っ張られてダイノード２７ｃ3～ダイノード２７ｃ10 に衝突し、さらに、ダイノード２７ｃ3～ダイノード２７ｃ10 から二次電子が順次放出されて、電子が増倍される。増倍された電子は、陽極２７ｄ11により引っ張られてダイノード２７ｃ11に集められることにより、ステム２７ｅを介して蛍光電流が生成される。
　このとき陽極２７ｄ1～２７ｄ11に印加される電圧によって電子の移動速度は決定され、この電子の移動速度によって、ダイノード２７ｃ1～ダイノード２７ｃ10に衝突する電子のエネルギーは定まる。このため、陽極２７ｄ1～２７ｄ11に印加される電圧によって、ダイノード２７ｃ1～ダイノード２７ｃ10で放出される二次電子の量は調整される。フローサイトメータ１０は、上記陽極２７ｄ1～２７ｄ11に印加する電圧を、蛍光信号（蛍光電流）の出力レベルを制御するコントロール電圧として用いる。
　電圧調整部２６ｄ（図３参照）は、蛍光信号の出力レベルを制御するコントロール電圧を設定して光電子増倍管２７に印加する。電圧調整部２６ｄは、後述する分析装置８０の出力レベル調整部９４の指示に応じてコントロール電圧を設定する。電圧調整部２６ｄは、光電子増倍管２７に印加したコントロール電圧の情報を後述する位相ずれ補正部８８（図６参照）に提供する。
　制御・処理部２８は、図５に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、信号制御部４４と、を有する。
　信号生成部４０は、レーザ光Ｌの強度を所定の周波数ｆで変調するための変調信号を生成する。
　具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有する。信号生成部４０は、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４に供給するとともに、信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、ＤＣ成分に所定の周波数の正弦波信号が載った信号であり、１０～５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
　信号処理部４２は、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により発する蛍光の位相ずれ情報を抽出する。信号処理部４２は、アンプ５４と、ＩＱミキサ５８と、ローパスフィルタ６２と、を有する。アンプ５４は、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号を増幅する。
　ＩＱミキサ５８は、光電子増倍管２７から供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号としてミキシングする装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８は、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、変調信号と同相の成分を含む、蛍光信号のＩ信号と、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分を含む蛍光信号のＱ信号とを生成する。同相の成分を含むＩ信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、９０度位相のシフトした成分を含むＱ信号は、９０度位相のシフトした変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。
　ローパスフィルタ６２は、ＩＱミキサ５８で生成されたＩ信号、Ｑ信号の低周波信号をろ過する。このろ過により、変調信号と同相の、蛍光信号の成分（Ｒｅ成分）と、変調信号に対して９０度位相のシフトした、蛍光信号の成分（Ｉｍ成分）が、蛍光データとして取り出される。取り出された各成分は、信号制御部４４に送られる。以降では、ＩＱミキサ５８によるミキシング処理とローパスフィルタ６２によるフィルタリング処理を含む処理を周波数ダウン変換処理といい、この処理により得られるデータを蛍光データという。
　信号制御部４４は、信号処理部４２から送られた蛍光信号のＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅し、ＡＤ変換を行う。
　具体的には、信号制御部４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステムコントローラ６０と、信号処理部４２で生成されたＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅するアンプ６４と、増幅されたＲｅ成分およびＩｍ成分をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。アンプ６４およびＡ／Ｄ変換器６６は、後述する分析装置８０内で行われることもできる。
　分析装置８０は、信号制御部４４にてＡＤ変換されて得られるＲｅ成分、Ｉｍ成分から、レーザ光に対する蛍光の位相ずれ角を求め、さらに、この位相ずれ角から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求める。また、分析装置８０は、Ｒｅ成分、Ｉｍ成分から蛍光強度を求める。図６は、分析装置８０の概略の構成を示す図である。
　分析装置８０は、ＣＰＵ８２およびメモリ８４を備えるコンピュータで構成される。分析装置８０は、さらに、位相ずれ算出部８６と、位相ずれ補正部８８と、蛍光緩和時間算出部９０と、蛍光強度算出部９２と、出力レベル調整部９４と、を有する。これらの各部分は、コンピュータ上でソフトウェアが起動されることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
　位相ずれ算出部８６は、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光データについて、Ｒｅ成分を実数部としＩｍ成分を虚数部とする複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相ずれ角θmeasとして算出する。位相ずれ算出部８６は、位相ずれ角θmeasを位相ずれ補正部８８に提供する。
　位相ずれ補正部８８は、位相ずれ算出部８６において算出した位相ずれ角θmeasに対して、光電子増倍管２７の陽極２７ｄ1～ｄ11に印加したコントロール電圧（調整パラメータ値）に応じた補正を行うことにより、すなわち、電圧調整部２６ｄを介した蛍光信号の出力レベルの調整条件に応じた補正を行うことにより、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光に由来した位相ずれ角θτを算出する。
　この補正は、光電子増倍管２７における光電子および二次電子の移動速度が変化することによって生じる位相ずれ角θの変化を防止し、正確な蛍光緩和時間を算出するために行われる。光電子増倍管２７では、コントロール電圧により、光電子および二次電子の移動速度は異なる。したがって、位相ずれ角θmeasに対して、設定したコントロール電圧に応じた補正が行われる。
　光電子増倍管２７において二次電子が生成されるダイノードと二次電子が引っ張られる陽極間の距離ｌを用いて、光電子および二次電子が移動する時間ｔは下記式（１）で表される。
　　ｔ　＝　（２ｍｌ2／Ｖ／ｑ）(1/2)　　　　　　　　　　　　　　　（１）
　ｍは電子の質量、ｑは電子の電荷量、Ｖはコントロール電圧。
　一方、位相ずれ角θは、時間ｔに比例する。したがって、光電子増倍管２７内を電子が移動する時間により生じる位相ずれ角（光電子倍増管２７に由来する位相ずれ角）θpmtは、定数Ｂを付加してθpmt＝Ａ・Ｖ(-1/2)＋Ｂで表される。なお、Ａ、Ｂは定数である。
　一方、位相ずれ算出部８６で算出される位相ずれ角θmeasは、下記式（２）で表すことができる。
　　θmeas 　＝　θ0　－（θpmt　＋　θd　＋　θτ）　　　　　　　　（２）
　上記式（２）において、θ0は基準とする位相ずれ角（定数）であり、θpmtは光電子倍増管２７に由来する位相ずれ角であり、θdはフローサイトメータ１０におけるレーザ光および蛍光の経路長と蛍光信号の電気回路長に由来する位相ずれ角であり、θτは蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光に由来する位相ずれ角である。
　したがって、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光に由来する位相ずれ角θτは、下記式（３）に示すように表される。
　　θτ　＝　θ0　－（θpmt　＋　θd　＋　θmeas）　　　　　　　　（３）
　上記式（３）にθpmt＝Ａ・Ｖ(-1/2)＋Ｂを代入することにより、下記式（４）となる。
　　θτ　＝Ｘ－θmeas－Ａ・Ｖ(-1/2)　　　　　　　　　　　　　　　　（４）
ただし、Ｘは、Ｘ＝θ0－Ｂ－θdで表され、コントロール電圧に依存しない定数である。
　分析装置８０のメモリ８４は、上記定数Ｘと定数Ａの値を予め記憶している。位相ずれ補正部８８は、定数Ｘと定数Ａの値をメモリ８４から呼び出して式（４）に付与して補正式を用意する。これにより、位相ずれ補正部８８は、位相ずれ算出部８６から提供された位相ずれ角θmeasと電圧調整部２６ｄから提供されたコントロール電圧Ｖから、用意された補正式を用いて位相ずれ角θτを算出する。
　位相ずれ補正部８８は、算出した位相ずれ角θτを蛍光緩和時間算出部９０に提供する。
　蛍光緩和時間算出部９０は、位相ずれ補正部８８で算出された位相ずれ角θτを用いて、蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θτ）の式にしたがって算出する。ここで、ｆは、レーザ光Ｌの強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θτ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
　蛍光強度算出部９２は、ＡＤ変換器６６から送られた蛍光データについて、Ｒｅ成分を実数部としＩｍ成分を虚数部とする複素数の絶対値を求めることで、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度を算出する。
　算出された蛍光蛋白Ｘ1の蛍光強度、位相ずれ角θτおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイ等の出力装置に結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料１２が管路３０の測定点を通過する度に得られる測定結果として、統計処理の対象とされる。
　出力レベル調整部９４は、光電子増倍管２７に印加するコントロール電圧を定めるための制御信号を生成する。コントロール電圧は、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号の出力レベルが飽和しない範囲で自在に設定される。出力レベル調整部９４は、少なくとも光電子増倍管２７に印加する現在のコントロール電圧の情報を取得している。また、出力レベル調整部９４は、定数Ｘおよび定数Ａの値を算出するために、後述するキャリブレーションを行う。
　図７（ａ）は、定数Ｘおよび定数Ａの値が付与されて用意された補正式から求まる、蛍光蛋白Qdot555の蛍光の位相ずれ角θmeasと、フローサイトメータ１０を用いて分析装置８０が算出した実測の位相ずれ角θmeasとを比較したグラフである。図７（ｂ）は、定数Ｘおよび定数Ａの値が付与されて用意された補正式から求まる、蛍光蛋白PerCPの蛍光の位相ずれ角θmeasと、フローサイトメータ１０を用いて分析装置８０が算出した実測の位相ずれ角θmeasとの比較したグラフである。ここで、蛍光蛋白Qdot555およびPerCPの蛍光緩和時間τは既知であるので、位相ずれ角θτは、θτ＝ｔａｎ-1（２πｆτ）で算出される値を用いた。図７（ａ），（ｂ）中の曲線が補正式による位相ずれ角θmeasの算出結果であり、●が位相ずれ角θmeasの実測結果である。
　図７（ａ），（ｂ）から判るように、補正式は、実測結果に極めて一致していることがわかる。これより、補正式を用いた補正、すなわち、式（４）で算出される位相ずれ角θτは、精度の高い蛍光緩和時間を算出することができる。
　次に、フローサイトメータ１０で行われる蛍光検出方法について説明する。
　まず、フローサイトメータ１０は、所定の周波数ｆで強度変調したレーザ光を照射光としてレーザ光源部２２から出射する。
　次に、受光部２６は、蛍光を受光して蛍光信号を出力する。
　制御・処理部２８は、出力した蛍光信号を、レーザ光Ｌを強度変調する変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相ずれ角と強度振幅を含む蛍光データを生成する。
　分析装置８０の位相ずれ算出部８６は、生成した蛍光データから、位相ずれ角θmeasを算出する。位相ずれ補正部８８は、算出した位相ずれ角θmeasを、定数Ｘ及び定数Ａの値が付与された補正式である式（４）に沿って位相ずれ角θτを算出する。さらに、蛍光緩和時間算出部９０は、位相ずれ角θτを用いて、蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間τをτ＝ｔａｎ（θτ）／（２πｆ）の式にしたがって算出する。一方、蛍光強度算出部９２は、生成した蛍光データの絶対値を求めて蛍光強度を算出する。
　算出された蛍光緩和時間、位相ずれ角θτ及び蛍光強度は、図示されない出力装置から出力される。
　図８は、フローサイトメータ１０を用いて、メモリ８４に記憶する定数Ｘ，Ａの値を決定するキャリブレーションのフローの例を示す図である。定数Ｘ，Ａの値を決定する際、フローサイトメータ１０で測定に用いる蛍光蛋白Ｘ1は蛍光緩和時間τが既知のものである。
　まず、分析装置８０の出力レベル調整部９４は、光電子増倍管（以降、ＰＭＴという）２７のコントロール電圧Ｖを最大化させる（ステップＳ１０）。コントロール電圧Ｖの最大化は、微量な蛍光であっても高感度に蛍光を検出できるようにするためでる。コントロール電圧の調整は、電圧調整部２６ｄを通して行われる。
　次に、分析装置８０の出力レベル調整部９４は、ＮＤフィルタ２６ｂを適宜調整する（ステップＳ２０）。ＮＤフィルタによる減光を行うのは、ＰＭＴ２７のコントロール電圧を最大化してＰＭＴ２７を最高感度の状態にするとき、光量に対するＰＭＴ２７の蛍光信号の出力レベルが飽和しないようにするためである。ＮＤフィルタ２６ｂは、例えば、最大減光と最小減光の中間に設定される。
　次に、光源２２ａは、周波数ｆで強度変調したレーザ光Ｌを照射する（ステップＳ３０）。これにより、測定点を通過したとき、レーザ光Ｌの照射を受けた試料１２が発する蛍光をＰＭＴ２７は受光する。これにより、ＰＭＴ２７はコントロール電圧Ｖによって調整された出力レベルで、蛍光信号を出力する（ステップＳ４０）。蛍光信号は、信号処理部４２および信号制御部４４で処理されて、Ｒｅ成分とＩｍ成分を含む蛍光データが生成される（ステップＳ５０）。次に、分析装置８０の蛍光強度算出部９２は、蛍光データから蛍光強度を算出する（ステップＳ６０）。蛍光強度は、蛍光データの絶対値で表される。
　次に、設定されているコントロール電圧Ｖが、所定の電圧以下であるか否かを出力レベル調整部９４は判定する（ステップＳ７０）。
　判定結果が否定である場合、出力レベル調整部９４は、電圧調整部２６ｄを通して、コントロール電圧Ｖを一定の幅で低減させる（ステップＳ８０）。こうして、低減したコントロール電圧を用いてステップＳ３０～７０が繰り返される。すなわち、蛍光信号のレベルが、ステップＳ３０～７０を繰り返す度に減少するように、コントロール電圧Ｖの調整が行われる。ステップＳ７０における判定が肯定である場合、出力レベル調整部９４は、さらに、ＰＭＴ２７が出力する蛍光信号の飽和の有無を、コントロール電圧Ｖに対する蛍光強度の変化を用いて判定する（ステップＳ９０）。
　ＰＭＴ２７が出力する蛍光信号の飽和の有無の判定は、図示されないディスプレイにグラフ表示した特性結果を確認したオペレータの入力に従って行われてもよい。あるいは、分析装置８０が、図示されないディスプレイにグラフ表示した特性結果を自動的に解析して、蛍光信号の飽和の有無を判定してもよい。例えば、図９に示すように、コントロール電圧Ｖに対して、蛍光強度算出部９２が算出する蛍光強度の値をグラフにより特性結果として表示したとき、コントロール電圧Ｖに対する蛍光強度の特性が、コントロール電圧の上昇に伴って直線から屈曲してなだらかに変化する領域があるか否かを、オペレータの目視による確認結果に基づいて、あるいは分析装置８０の解析結果に基づいて、蛍光信号の飽和の有無を判定する。
　この判定の結果が肯定の場合、ステップＳ２０に戻り、ステップＳ２０～ステップＳ８０が繰り返される。
　ステップＳ９０の判定結果が否定の場合、すなわち、ＰＭＴ２７が飽和状態でない場合、出力レベル調整部９４は、回帰式を近似して定数Ｘ及び定数Ａの値を抽出し（ステップＳ１００）、抽出した定数Ｘ及び定数Ａの値をメモリ８４に記憶させる（ステップＳ１１０）。回帰式は、上記式（４）を変形した下記式（５）が用いられる。
　　θmeas　＝Ｘ－θτ－Ａ・Ｖ(-1/2)　　　　　　　　　　　　　　　　（５）
　ただし、θτ＝ｔａｎ-1（２πｆτ）
　ここで、ｆはレーザ光の強度変調の周波数（既知）であり、τは測定に用いる蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間（既知）である。
　出力レベル調整部９４は、上記式（５）を用いて予測された位相ずれ角θmeasが、実測の位相ずれ角θmeasに近似されるように、上記式（５）等の回帰式を用いて、実測の位相ずれ角θmeasから、定数Ｘと定数Ａの値を抽出する。言い換えると、実測の位相ずれ角θmeasnを上式（４）を用いて補正された位相ずれ角（式（４）の右辺の値）が、既知の蛍光緩和時間τによって定まる位相ずれ角θτに近似するように、更に言うと、式（４）の右辺に示す補正された位相ずれ角から算出される蛍光緩和時間が、既知の蛍光緩和時間τに近似するように、定数Ｘと定数Ａの値を抽出する。
　図７（ａ）に示す例では、定数Ｘの値として３．７５８４、定数Ａの値として０．６３６０が抽出される。定数Ｘおよび定数Ａの値は、最小二乗近似法等の公知の方法を用いて抽出される。定数Ｘ及び定数Ａの値は、蛍光蛋白Ｘ1に関わらず、装置固有の値であり、蛍光蛋白の種類を変えても用いることのできる値である。
　分析装置８０は、図７（ａ），（ｂ）に示すように、設定された回帰式を用いて、ＰＭＴ２７のコントロール電圧に対する位相ずれ角θmeasの変化を正確に予測することができる。したがって、分析装置８０は、この回帰式に用いる定数Ｘ及び定数Ａの値を定めた補正式である式（４）を用いて、実測された位相ずれ角θmeasから蛍光蛋白Ｘ1に由来する位相ずれ角θτを算出することができる。すなわち、位相ずれ角θmeasを補正することができる。
　したがって、分析装置８０は、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光緩和時間を正確に算出することができる。
　以上、本発明の蛍光検出装置、蛍光検出方法および蛍光信号を信号処理する方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
１０　フローサイトメータ
１２　試料
２０　信号処理装置
２２　レーザ光源部
２２ａ　光源
２３，２６ａ　レンズ系
２４，２６　受光部
２６ｄ　電圧調整部
２７　光電子増倍管
２７ａ　陰極
２７ｂ　集束電極
２７ｃ　電子増倍部
２７ｃ1～２７ｃ11　ダイノード
２７ｄ1～２７ｄ11　陽極
２７ｅ　ステム
２８　制御・処理部
３０　管路
３２　回収容器
３４　レーザドライバ
４０　信号生成部
４２　信号処理部
４４　信号制御部
４６　発振器
４８　パワースプリッタ
５０，５２，５４，６４　アンプ
５８　ＩＱミキサ
６０　システムコントローラ
６２　ローパスフィルタ
６６　Ａ／Ｄ変換器
８０　分析装置
８２　ＣＰＵ
８４　メモリ
８６　位相ずれ算出部
８８　位相ずれ補正部
９０　蛍光緩和時間算出部
９２　蛍光強度算出部
９４　出力レベル調整部

Claims (13)

  1. 　レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置であって、
    　レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する光源部と、
    　前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する、前記出力レベルの調整が可能な受光素子、を備える受光部と、
    　前記蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
    　前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
  2. 　前記受光部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値により、前記出力レベルを調整する調整部を有する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
  3. 　前記第２の処理部は、前記補正を行うとき、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式を用いる、請求項２に記載の蛍光検出装置。
  4. 　前記第２の処理部は、前記補正式に用いる定数の値を予め記憶し、前記補正を行うとき、前記定数の値を呼び出して用いる、請求項３に記載の蛍光検出装置。
  5. 　前記第２の処理部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することにより、前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係を求め、前記関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、前記補正式に用いる前記定数の値を抽出する出力レベル調整部を有する、請求項３または４に記載の蛍光検出装置。
  6. 　蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により、前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、前記出力レベル調整部は前記定数の値を抽出する、請求項５に記載の蛍光検出装置。
  7. 　前記受光素子は光電子増倍管であり、前記調整パラメータ値は、前記光電子増倍管の電極に印加する電圧である、請求項２～６のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  8. 　前記電極に印加する電圧をＶ、前記第１の位相ずれをθmeas、前記第２の位相ずれをθτ、としたとき、前記補正式は、下記式で表される、請求項７に記載の蛍光検出装置。
    　　　θτ＝　Ｘ－θmeas－Ａ・Ｖ(-1/2)　
    （ＸおよびＡは定数。）
  9. 　前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられる、請求項１～８のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  10. 　レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置の蛍光検出方法であって、
    　レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射するステップと、
    　前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力するステップと、
    　前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成するステップと、
    　前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
  11. 　レーザ光の照射を受けることにより、蛍光緩和時間が既知の基準対象物が発する蛍光の蛍光信号を蛍光検出装置が処理する方法であって、
    　レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する第１のステップと、
    　前記レーザ光に照射されて発する基準対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する第２のステップと、
    　前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
    　前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれと、前記出力レベルを調整するために、前記受光素子に与える調整パラメータ値とを組にして記憶する第４のステップと、
    　前記調整パラメータ値を変更して、前記第１のステップ～前記第４のステップを繰り返すことにより、前記第１の位相ずれと前記調整パラメータ値の組を複数組記憶する第５のステップと、
    　記憶した前記複数組を呼び出し、前記調整パラメータ値と前記第１の位相ずれとの関係を定める回帰式を、呼び出した前記複数組の関係に近似させることにより、前記回帰式に含まれる未知の定数の値を抽出する第６のステップと、
    　抽出した前記定数の値を記憶する第７のステップと、を有する蛍光信号を処理する方法。
  12. 　前記第１のステップ～前記第４のステップを繰り返す度に、前記出力レベルが減少するように、前記調整パラメータ値を変更する、請求項１１に記載の蛍光信号を処理する方法。
  13. 　前記受光素子に受光される前記蛍光は、前記受光素子の出力する前記蛍光信号の出力レベルが飽和しないように、前記受光素子に受光される前に、減光フィルタにより減光される、請求項１１または１２に記載の蛍光信号を処理する方法。
     
PCT/JP2011/000004 2010-01-06 2011-01-05 蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法 WO2011083754A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11731752A EP2522987A1 (en) 2010-01-06 2011-01-05 Fluorescence detection apparatus, fluorescence detection method, and method for processing fluorescence signal
US13/520,830 US20120282649A1 (en) 2010-01-06 2011-01-05 Fluorescence detecting apparatus, fluorescence detecting method, and fluorescence signal processing method
JP2011500401A JP4818481B2 (ja) 2010-01-06 2011-01-05 蛍光検出装置および蛍光検出方法
CN201180005407.8A CN102713574A (zh) 2010-01-06 2011-01-05 荧光检测装置、荧光检测方法以及荧光信号的信号处理方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010001257 2010-01-06
JP2010-001257 2010-01-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011083754A1 true WO2011083754A1 (ja) 2011-07-14

Family

ID=44305490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/000004 WO2011083754A1 (ja) 2010-01-06 2011-01-05 蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20120282649A1 (ja)
EP (1) EP2522987A1 (ja)
JP (1) JP4818481B2 (ja)
KR (1) KR20120104265A (ja)
CN (1) CN102713574A (ja)
WO (1) WO2011083754A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014215037A (ja) * 2013-04-22 2014-11-17 タツタ電線株式会社 表面プラズモン増強蛍光測定装置
JP2019113568A (ja) * 2019-04-18 2019-07-11 浜松ホトニクス株式会社 分光測定装置および分光測定方法
WO2022270009A1 (ja) * 2021-06-25 2022-12-29 ソニーグループ株式会社 生体試料分析装置

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2870474T3 (es) 2015-05-26 2021-10-27 Incelldx Inc Métodos de evaluación de muestras celulares de mama y composiciones para uso en practicar los mismos
GB2542802A (en) * 2015-09-30 2017-04-05 Cambridge Display Tech Ltd Organic-based fluorescence sensor with low background signal
JP7026337B2 (ja) * 2017-08-29 2022-02-28 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 光観測装置
CN112771365A (zh) * 2018-06-28 2021-05-07 贝克顿·迪金森公司 集成式前置放大光检测系统及其使用方法
JP2022532496A (ja) * 2019-05-14 2022-07-15 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー イメージングフローサイトメトリーのための位相キャリブレーション
EP3977103A4 (en) * 2019-05-30 2023-06-28 Becton, Dickinson and Company Phase-correction of radiofrequency-multiplexed signals
US11635375B2 (en) 2019-11-20 2023-04-25 Becton, Dickinson And Company Light detection module with adjustable sensitivity
KR102430669B1 (ko) * 2021-01-22 2022-08-16 주식회사 인텍메디 형광수명을 이용한 체외진단 방법 및 장치

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6291826A (ja) * 1985-10-18 1987-04-27 Hamamatsu Photonics Kk 透過形高速光検出管
JP2008256380A (ja) * 2007-03-30 2008-10-23 Hamamatsu Photonics Kk 光計測装置及び光計測装置の調整方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0515211A3 (en) * 1991-05-23 1993-04-07 Becton Dickinson And Company Apparatus and method for phase resolved fluorescence lifetimes of independent and varying amplitude pulses
JPH09329548A (ja) * 1996-06-11 1997-12-22 Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk 蛍光寿命測定装置
US6043880A (en) * 1997-09-15 2000-03-28 Becton Dickinson And Company Automated optical reader for nucleic acid assays
US6540895B1 (en) * 1997-09-23 2003-04-01 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials
EP2369326B1 (en) * 2005-02-15 2013-09-04 Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method
US8140141B2 (en) * 2006-05-17 2012-03-20 University Of Utah Research Foundation Devices and methods for fluorescent inspection and/or removal of material in a sample
EP2196794A4 (en) * 2007-08-30 2014-04-02 Mitsui Shipbuilding Eng DEVICE AND METHOD FOR DETECTING FLUORESCENCE ENERGY TRANSFER (FRET)
US20110266462A1 (en) * 2009-01-09 2011-11-03 Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6291826A (ja) * 1985-10-18 1987-04-27 Hamamatsu Photonics Kk 透過形高速光検出管
JP2008256380A (ja) * 2007-03-30 2008-10-23 Hamamatsu Photonics Kk 光計測装置及び光計測装置の調整方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Hamamatsu Photonics Kabushiki Kaisha Henshu Iinkai", HIKARI DENSHI ZOBAIKAN SONO KISO TO OYO, 1 July 2007 (2007-07-01), pages 48 - 53, XP008168672 *
SHIGEYUKI NAKADA ET AL.: "Development of fluorescence lifetime FRET flow cytometer", MITSUI ZOSEN TECHNICAL REVIEW, no. 190, 31 March 2007 (2007-03-31), pages 54 - 60, XP008155331 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014215037A (ja) * 2013-04-22 2014-11-17 タツタ電線株式会社 表面プラズモン増強蛍光測定装置
JP2019113568A (ja) * 2019-04-18 2019-07-11 浜松ホトニクス株式会社 分光測定装置および分光測定方法
WO2022270009A1 (ja) * 2021-06-25 2022-12-29 ソニーグループ株式会社 生体試料分析装置

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2011083754A1 (ja) 2013-05-13
EP2522987A1 (en) 2012-11-14
US20120282649A1 (en) 2012-11-08
JP4818481B2 (ja) 2011-11-16
CN102713574A (zh) 2012-10-03
KR20120104265A (ko) 2012-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011083754A1 (ja) 蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法
US7822558B2 (en) Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method
KR101200397B1 (ko) 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법
US8885165B2 (en) Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method
US8772739B2 (en) Fluorescence detection device and fluorescence detection method
US8642976B2 (en) Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method
US8817244B2 (en) Fluorescence measurement device and fluorescence measurement method
US8450702B2 (en) Fluorescence detecting method and fluorescence detecting device
WO2010143367A1 (ja) 蛍光検出装置および蛍光検出方法
KR101248874B1 (ko) 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법
JP4620786B2 (ja) 蛍光検出方法、蛍光検出装置及びプログラム
US9052288B2 (en) Fluorescence measuring apparatus and fluorescence measuring method
WO2010092752A1 (ja) 蛍光検出装置及び蛍光検出方法
JP5324487B2 (ja) 蛍光検出用較正装置、蛍光検出用較正方法、および蛍光検出装置

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011500401

Country of ref document: JP

Ref document number: 201180005407.8

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11731752

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20127016501

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13520830

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011731752

Country of ref document: EP