KR20120104265A - 형광 검출 장치, 형광 검출 방법 및 형광 신호를 신호 처리하는 방법 - Google Patents

형광 검출 장치, 형광 검출 방법 및 형광 신호를 신호 처리하는 방법 Download PDF

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KR20120104265A
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히로노리 하야시
시게유키 나카다
가즈테루 호시시마
교지 도이
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미쯔이 죠센 가부시키가이샤
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Abstract

형광 검출 장치는, 소정의 주파수로 변조한 레이저광의 조사를 받아 발하는 측정 대상물의 형광을 수광 소자로 수광하고, 출력 레벨이 조정된 형광 신호를 수광 소자는 출력한다. 신호 처리부는, 출력한 형광 신호를 상기 주파수의 변조 신호와 믹싱함으로써, 위상 및 강도의 정보를 포함하는 형광 데이터를 생성한다. 분석 장치는, 측정 대상물이 발하는 형광의 상기 변조 신호에 대한 제1 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 제1 위상 어긋남에 대하여 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 하여 제2 위상 어긋남을 산출한다. 분석 장치는, 산출한 제2 위상 어긋남을 사용하여 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시간을 더 산출한다.

Description

형광 검출 장치, 형광 검출 방법 및 형광 신호를 신호 처리하는 방법{FLUORESCENCE DETECTION APPARATUS, FLUORESCENCE DETECTION METHOD, AND METHOD FOR PROCESSING FLUORESCENCE SIGNAL}
본 발명은, 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 처리하는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법과, 형광 신호를 처리하는 방법에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서는 플로 사이트 미터(flow sight meter)가 널리 사용되고 있다. 이 플로 사이트 미터는, 레이저광을 조사함으로써 측정 대상물이 발하는 형광을 광전자 증배관이나 애벌란시(avalanche) 포토 다이오드 등의 광전 변환기를 사용하여 수광하여, 세포나 유전자 등의 측정 대상물의 종류나 수, 그리고 측정 대상물의 특성을 분석한다.
구체적으로는, 플로 사이트 미터는 세포, DNA, RNA, 효소, 단백 등의 생체 물질 등의 분석 대상물을 형광 시약으로 라벨(label)화 하는 것에 의하여 만들어진 측정 대상물을, 압력을 부여하여 매초 대략 10m이내의 속도로 관로 내를 흐르는 시스(sheath)액에 흐르게 하여 라미나 시스 플로(laminar sheath flow)를 형성한다. 이 플로 중의 측정 대상물에 플로 사이트 미터가 레이저광을 조사함으로써, 플로 사이트 미터는 분석 대상물에 부착된 형광 색소가 발하는 형광을 수광하고, 이 형광을 분석 대상물의 라벨로 식별함으로써 분석 대상물을 특정한다.
이 플로 사이트 미터는, 예를 들어 세포 내의 DNA, RNA, 효소, 단백질 등의 세포 내 상대 양을 계측하고, 또한 이들 기능을 단시간에 해석할 수 있다. 또한, 플로 사이트 미터는, 소정의 타입의 세포나 염색체를 형광에 의해 판별하고, 판별한 세포나 염색체만을 셀 소터(cell sorter) 등을 사용하여 살아있는 상태로 단시간에 선별 수집한다.
이 플로 사이트 미터의 사용에는, 보다 많은 측정 대상물을 단시간에 정확하게 형광의 정보로부터 특정하는 것이 요구되고 있다.
예를 들어 레이저광의 조사에 의해, 측정 대상물 중의 형광 색소로부터 발해지는 형광의 형광 수명(형광 완화 시간)을 산출함으로써, 많은 측정 대상물을 단시간에 정확하게 특정할 수 있는 형광 검출 장치 및 방법이 알려져 있다(특허 문헌 1).
상기 형광 검출 장치에 의하면, 형광 검출 장치는 레이저광을 강도 변조하여 측정 대상물에 조사하고, 측정 대상물로부터의 형광을 광전 변환기로 수광하여, 광전 변환기가 출력한 형광 신호의 레이저광의 강도 변조에 사용한 변조 신호에 대한 위상 어긋남을 구하고, 이 위상 어긋남으로부터 형광 완화 시간을 산출한다.
(선행 기술 문헌)
특허 문헌 1: 일본 특허출원 공개번호 2006-226698호 공보
상기 형광 완화 시간의 산출에 사용하는 위상 어긋남은, 형광을 수광하는 광전 변환기 자체의 특성에 기인하는 위상 어긋남, 장치에서의 레이저광이나 형광의 광로 길이 외에 전기 회로 길이에 의한 위상 어긋남의 영향을 제외하고 산출된다. 그러나, 상기 형광 완화 시간의 산출에 사용하는 위상 어긋남은 광전 변환기로부터 출력되는 형광 신호의 출력 레벨에 따라 미묘하게 변화하므로, 반드시 정확한 형광 완화 시간의 값이 산출되지 않는 경우가 있었다. 특히, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)의 유무의 판정 등에 있어서는, 형광 완화 시간의 값을 정확하게 산출하는 것이 요구된다.
그래서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 측정 대상물이 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 발하는 형광의 형광 신호를 처리할 때, 정확한 형광 완화 시간을 산출할 수 있는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법과, 이 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 사용하는 형광 신호를 신호 처리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양은, 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 처리하는 형광 검출 장치이다. 상기 형광 검출 장치는,
레이저광을 소정의 주파수의 변조 신호로 강도 변조하여 출사하는 광원부,
상기 레이저광이 조사되어 발하는 측정 대상물의 형광을 수광하여 출력 레벨이 조정된 형광 신호를 출력하는, 상기 출력 레벨의 조정이 가능한 수광 소자를 구비하는 수광부,
상기 형광 신호를 상기 주파수의 변조 신호와 믹싱함으로써, 위상 및 강도의 정보를 포함하는 형광 데이터를 생성하는 제1 처리부,
상기 형광 데이터를 사용하여 상기 형광의 상기 변조 신호에 대한 제1 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제1 위상 어긋남에 대하여 상기 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 하여 제2 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제2 위상 어긋남을 사용하여 상기 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 제2 처리부를 가진다.
상기 수광부는 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값에 의해 상기 출력 레벨을 조정하는 조정부를 가지는 것이 바람직하다.
그때, 상기 제2 처리부는 상기 보정을 행할 때 상기 조정 파라미터 값에 따라 정해지는 보정식을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2 처리부는 상기 보정식에 사용하는 정수(定數)의 값을 미리 기억하고, 상기 보정을 행할 때 상기 정수의 값을 호출하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2 처리부는 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값을 미리 변경함으로써 상기 조정 파라미터 값과 상기 출력 레벨과의 관계를 구하고, 상기 관계가 상기 수광 소자의 출력 레벨의 포화를 나타내고 있지 않은 때 상기 보정식에 사용하는 상기 정수의 값을 추출하는 출력 레벨 조정부를 가지는 것이 바람직하다.
그때, 형광 완화 시간을 미리 알고 있는 기준 대상물을 측정 대상물로 사용하여 상기 제2 위상 어긋남으로부터 산출되는 형광 완화 시간이, 상기 보정에 의해 상기 기준 대상물의 기존의 형광 완화 시간에 근사하도록 상기 출력 레벨 조정부는 상기 정수의 값을 추출하는 것이 바람직하다.
상기 수광 소자는 예를 들어 광전자 증배관이며, 상기 조정 파라미터 값은 상기 광전자 증배관의 전극에 인가하는 전압이다.
그때, 상기 전극에 인가하는 전압을 V, 상기 제1 위상 어긋남을θmeas, 상기 제2 위상 어긋남을θτ로 했을 때, 상기 보정식은 하기 식에 의해 표현되는 것이 바람직하다.
θτ=X-θmeas-A?V(-1/2)
(X 및 A는 정수(定數))
또한, 상기 수광 소자의 수광면의 앞면에는 조정 가능한 감광 필터가 설치되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일 태양은, 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 처리하는 형광 검출 장치의 형광 검출 방법이다. 상기 방법은,
레이저광을 소정의 주파수의 변조 신호로 강도 변조하여 출사하는 단계,
상기 레이저광이 조사되어 발하는 측정 대상물의 형광을 수광 소자로 수광하여 출력 레벨이 조정된 형광 신호를 출력하는 단계,
상기 형광 신호를 상기 소정의 주파수의 변조 신호와 믹싱함으로써 위상 및 강도의 정보를 포함하는 형광 데이터를 생성하는 단계,
상기 형광 데이터를 사용하여, 상기 형광의 상기 변조 신호에 대한 제1 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제1 위상 어긋남에 대하여 상기 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 하여 제2 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제2 위상 어긋남을 사용하여 상기 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 단계를 가진다.
본 발명의 또 다른 일 태양은, 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 형광 완화 시간을 미리 알고 있는 기준 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 형광 검출 장치가 처리하는 방법이다. 상기 방법은,
레이저광을 소정의 주파수의 변조 신호로 강도 변조하여 출사하는 제1 단계,
상기 레이저광이 조사되어 발하는 기준 대상물의 형광을 수광 소자로 수광하여 출력 레벨의 조정된 형광 신호를 출력하는 제2 단계,
상기 형광 신호를 상기 소정의 주파수의 변조 신호와 믹싱함으로써 위상 및 강도의 정보를 포함하는 형광 데이터를 생성하는 제3 단계,
상기 형광 데이터를 사용하여 상기 형광의 상기 변조 신호에 대한 제1 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제1 위상 어긋남과 상기 출력 레벨을 조정하기 위하여 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값을 세트로 하여 기억하는 제4 단계,
상기 조정 파라미터 값을 변경하여 상기 제1 단계~상기 제4 단계를 반복함으로써 상기 제1 위상 어긋남과 상기 조정 파라미터 값의 세트를 복수 세트 기억하는 제5 단계,
기억한 상기 복수 세트를 호출하여, 상기 조정 파라미터 값과 상기 제1 위상 어긋남과의 관계를 정하는 회귀식을 호출한 상기 복수 세트의 관계에 근사화시킴으로써 상기 회귀식에 포함되는 미지의 정수(定數)의 값을 추출하는 제6 단계,
추출한 상기 정수의 값을 기억하는 제7 단계를 가진다.
그때, 상기 제1 단계~상기 제4 단계를 반복할 때마다 상기 출력 레벨이 감소하도록 상기 조정 파라미터 값을 변경하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 수광 소자에 수광되는 상기 형광은 상기 수광 소자가 출력하는 상기 형광 신호의 출력 레벨이 포화되지 않도록 상기 수광 소자에 수광되기 전에 감광 필터에 의해 감광되는 것이 바람직하다.
상기 태양의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에서는, 측정 대상물이 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 발하는 형광의 형광 신호를 처리할 때, 정확한 형광 완화 시간을 산출할 수 있다.
또한, 상기 일 태양의 형광 신호를 신호 처리하는 방법에서는, 정확한 형광 완화 시간을 산출하기 위한 보정식에 사용하는 정수(定數)의 값을 효율적으로 결정할 수 있다.
도 1은 본 실시예의 형광 검출 장치를 사용한 플로 사이트 미터(flow sight meter)의 개략 구성도이다.
도 2는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 레이저 광원부의 구성의 일례를 나타낸 도면이다.
도 3은 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 수광부의 일례의 개략의 구성을 나타낸 개략 구성도이다.
도 4는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 광전자 증배관의 개략의 구성을 나타낸 도면이다.
도 5는 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 제어 처리부의 개략의 구성을 나타낸 도면이다.
도 6은 도 1에 나타난 플로 사이트 미터에 사용하는 분석 장치의 개략의 구성을 나타낸 도면이다.
도 7a, 7b는 도 4에 나타난 광전자 증배관에 부여하는 컨트롤 전압과 형광의 위상 어긋남 각 θmeas와의 관계를 나타난 그래프이다.
도 8은 도 1에 나타난 플로 사이트 미터를 사용하여 보정식에 사용하는 정수(定數) X, A의 값을 결정하는 흐름의 예를 나타낸 도면이다.
도 9는 도 4에 나타난 광전자 증배관이 출력하는 형광 신호의 출력 레벨의 포화의 예를 설명하는 도면이다.
이하 본 발명의 형광 검출 장치, 형광 검출 방법, 및 형광 신호를 처리하는 방법을 상세하게 설명한다.
도 1은 본 실시예의 형광 검출 장치를 사용한 플로 사이트 미터(flow sight meter)(10)의 개략 구성도이다.
플로 사이트 미터(10)는 신호 처리 장치(20)와 분석 장치(컴퓨터)(80)를 가진다. 신호 처리 장치(20)는 측정 대상으로 하는 시료(12)에 레이저광을 조사하고, 시료(12)가 발하는 형광의 형광 신호를 검출하여 신호 처리를 한다. 분석 장치(컴퓨터)(80)는 신호 처리 장치(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 형광 강도나 형광 완화 시간을 산출한다. 시료(12)의 예로서, 형광 단백(형광 색소) X1을 붙인 세포(분석 대상물) X2에 의해 구성되는 측정 대상물을 사용하여 이하 설명한다. 본 실시예에서는, 형광 단백 이외의 형광 색소를 사용할 수도 있다. 분석 대상물도, 세포 이외에, DNA, RNA, 효소, 단백 등의 생체 물질 외에, 인공적으로 제작된 마이크로 비즈(beads) 등을 사용할 수도 있다. 그리고, 도 1에 나타난 시료(12)는 예를 들어 세포 X2내에 형광 단백 X1가 진입하여, 형광 단백 X1가 세포 X2 내에 받아들여져 분산한 구성이다. 세포 X2에 부착되는 형광 단백 X1은 1개에는 한정되지 않고, 복수개이어도 된다.
신호 처리 장치(20)는 레이저 광원부(22), 제1 및 제2 수광부(24, 26), 제어 처리부(28), 관로(30)를 가진다.
제어 처리부(28)는 레이저 광원부(22)로부터의 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조시키는 제어부 및 시료(12)가 발하는 형광의 형광 신호를 처리하는 신호 처리부를 포함한다. 관로(30),는 고속류를 형성하는 시스(sheath)액에 포함시키는 것에 의하여 시료(12)의 플로를 형성한다.
관로(30)의 출구에는 회수 용기(32)가 설치되어 있다. 플로 사이트 미터(10)에는 레이저광의 조사에 의해 단시간 내에 시료(12) 중의 소정의 세포 등의 생체 물질을 분리하기 위한 셀 소터(cell sorter)를 배치하여 별개의 회수 용기로 분리하도록 구성할 수도 있다.
레이저 광원부(22)는 소정의 파장의 레이저광을 출사하는 부분이다. 레이저광이 관로(30) 중의 소정의 위치에 집속(集束)하도록 렌즈계가 설치되고, 이 집속 위치에서 시료(12)의 측정점이 형성된다.
도 2는 레이저 광원부(22)의 구성의 일례를 나타낸 도면이다.
레이저 광원부(22)는 가시광선 대역의 파장을 가지며 강도 변조한 레이저광을 출사한다.
레이저 광원부(22)는 광원(22a)을 가진다. 광원(22a)은 형광 단백 X1을 여기하는 파장을 가지는 레이저광 L을 CW(연속파) 레이저광으로 출사하고, 또한 이 레이저광 L의 강도를 소정의 주파수 f의 변조 신호로 강도 변조하면서 출사한다.
또한, 레이저 광원부(22)는 렌즈계(23)와 레이저 드라이버(34)를 가진다. 렌즈계(23)는 레이저광 L을 관로(30) 중의 중심에 집속시켜 측정점을 형성한다. 레이저 드라이버(34)는 광원(22a)을 구동한다.
레이저광 L을 출사하는 광원으로, 예를 들어 반도체 레이저가 사용된다. 레이저광 L은 예를 들어 5~100mW 정도를 출력한다.
한편, 레이저광 L의 강도 변조에 사용하는 주파수(변조 주파수) f는, 그 주기가 형광 완화 시간에 비해 약간 길어서, 예를 들어 10~50MHz이다.
광원(22a)은 레이저광 L가 형광 색소를 여기하여 특정 파장 대역의 형광을 발하도록, 미리 정해진 파장 대역에서 발진한다. 레이저광 L에 의해 여기되는 시료(12)는 관로(30)의 측정점을 통과할 때, 측정점에서 레이저광 L의 조사를 받는다. 이때, 형광 단백 X1이 특정 파장으로 형광을 발한다.
제1 수광부(24)는 관로(30)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있다. 제1 수광부(24)는 측정점을 통과하는 시료(12)에 의해 전방 산란된 레이저광을 수광함으로써, 시료(12)가 측정점을 통과하는 것을 알리는 시료(12)의 검출 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 이 제1 수광부(24)로부터 출력되는 검출 신호는 제어 처리부(28) 및 분석 장치(80)에 공급되어, 시료(12)가 관로(30) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리며, 처리를 개시하는 트리거 신호, 처리 개시의 ON신호, OFF 신호로서 사용된다.
한편, 제2 수광부(26)은 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 수직 방향이고, 또한 관로(30) 중의 시료(12)의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있고, 측정점에 의해 조사된 시료(12)가 발하는 형광을 수광하는 광전자 증배관을 구비한다. 본 실시예에서는, 광전자 증배관 대신에 애벌란시(avalanche) 포토 다이오드 등의 공지의 광전 변환기를 사용할 수도 있다.
도 3은 제2 수광부(26)의 일례의 개략의 구성을 나타낸 개략 구성도이다.
도 3에 나타난 제2 수광부(26)은 시료(12)로부터의 형광 신호를 집속시키는 렌즈계(26a), ND 필터(26b), 밴드 패스 필터(band pass filter)(26c), 전압 조정부(26d), 광전자 증배관(수광 소자)(27)을 가진다.
렌즈계(26a)는 제2 수광부(26)에 입사한 형광을 광전자 증배관(27)의 수광면에 집속시키도록 구성되어 있다.
ND 필터(26b)는 제2 수광부(26)에 입사한 형광을 감광한다. 제2 수광부(26)가 ND 필터(26b)를 사용하는 것은, 후술하는 바와 같이 광전자 증배관(27)의 양극으로 인가되는 컨트롤 전압을 최대로 해도, 형광 신호의 출력 레벨이 포화되지 않도록 형광을 감광하기 위해서이다.
밴드 패스 필터(26c)는 광전자 증배관(27)의 수광면의 앞면에 설치되어, 소정의 파장 대역의 형광만을 투과시키는 필터이다.
광전자 증배관(27)은 광전면에서 수광한 광을 전기 신호로 변환하여, 형광 신호를 출력하는 수광 소자이다. 여기서 출력되는 형광 신호는 출력 레벨이 조정되어 있다. 광전자 증배관(27)이 수광하는 형광은 소정의 주파수로 강도 변조를 받은 레이저광에 기초하므로, 출력되는 형광 신호도 소정의 주파수로 강도가 변동한다. 이 형광의 수광에 의해 출력되는 형광 신호는 제어 처리부(28)에 공급된다.
도 4는 광전자 증배관(27)의 개략의 구성을 나타낸 도면이다. 광전자 증배관(27)은, 예를 들어 10-4 Pa정도의 진공 분위기를 유지하는 진공 용기 내에, 수광면을 표면에 가지는 음극(27a), 집속 전극(27b), 광전자 증배부(27c), 양극(27d1~27d11)을 가지고, 진공 용기의 외측에 줄기(27e)를 가진다.
음극(27a)에 광이 입사되면, 음극(27a)의 광전면으로부터 진공 용기 내의 진공 중에 광전자가 방출된다. 이 광전자는 집속 전극(27b)에 의해 광전자 증배부(27c)에 안내된다. 광전자는 양극 27d1에 의해 끌려가 광전자 증배부(27c)의 다이노드(dynode) 27c1에 충돌하여, 다이노드 27c1는 2차 전자를 방출한다. 또한, 다이노드 27c1에서 방출된 2차 전자는 다이노드 27c2의 앞면에 설치된 양극 27d2에 의해 끌려가 다이노드 27c2에 충돌하여, 다이노드 27c2는 또 2차 전자를 방출한다. 이렇게 하여, 양극 27dn(n은 2 이상 10 이하의 정수(整數))에 끌려가 다이노드 27c3~다이노드 27c10에 충돌하고, 또한 다이노드 27c3~다이노드 27c10로부터 2차 전자가 차례로 방출되어 전자가 증배된다. 증배된 전자는, 양극 27d11에 의해 끌려가 다이노드 27c11에 모여, 줄기(27e)를 통하여 형광 전류가 생성된다.
이때 양극 27d1~27d11에 인가되는 전압에 의해 전자의 이동 속도는 결정되고, 이 전자의 이동 속도에 의해 다이노드 27c1~다이노드 27c10에 충돌하는 전자의 에너지는 정해진다. 그러므로, 양극 27d1~27d11에 인가되는 전압에 의해, 다이노드 27c1~다이노드 27c10에서 방출되는 2차 전자의 양은 조정된다. 플로 사이트 미터(10)는 상기 양극 27d1~27d11에 인가하는 전압을 형광 신호(형광 전류)의 출력 레벨을 제어하는 컨트롤 전압으로서 사용한다.
전압 조정부(26d)(도 3참조)는 형광 신호의 출력 레벨을 제어하는 컨트롤 전압을 설정하여 광전자 증배관(27)에 인가한다. 전압 조정부(26d)는 후술하는 분석 장치(80)의 출력 레벨 조정부(94)의 지시에 따라 컨트롤 전압을 설정한다. 전압 조정부(26d)는 광전자 증배관(27)에 인가한 컨트롤 전압의 정보를 후술하는 위상 어긋남 보정부(88)(도 6참조)에 제공한다.
제어 처리부(28)는, 도 5에 나타낸 바와 같이 신호 생성부(40), 신호 처리부(42), 신호 제어부(44)를 가진다.
신호 생성부(40)는 레이저광 L의 강도를 소정의 주파수 f로 변조하기 위한 변조 신호를 생성한다.
구체적으로는, 신호 생성부(40)는 발진기(46), 파워 스플리터(48) 및 제1 및 제2 앰프(50, 52)를 가진다. 신호 생성부(40)는 생성되는 변조 신호를 레이저 광원부(22)의 레이저 드라이버(34)에 공급하는 동시에, 신호 처리부(42)에 공급한다. 신호 처리부(42)에 변조 신호를 공급하는 것은, 후술하는 바와 같이 광전자 증배관(27)으로부터 출력되는 형광 신호를 검파하기 위한 참조 신호로서 사용하기 대문이다. 그리고, 변조 신호는, DC 성분에 소정의 주파수의 정현파 신호가 실린 신호이며, 10~50MHz의 범위의 주파수로 설정된다.
신호 처리부(42)는 광전자 증배관(27)으로부터 출력되는 형광 신호를 사용하여, 레이저광의 조사에 의해 발하는 형광의 위상 어긋남 정보를 추출한다. 신호 처리부(42)는 제3 앰프(54), IQ 믹서(58), 로우 패스 필터(low pass filter)(62)를 가진다. 제3 앰프(54)는 광전자 증배관(27)으로부터 출력되는 형광 신호를 증폭한다.
IQ 믹서(58)는 광전자 증배관(27)으로부터 공급되는 형광 신호를, 신호 생성부(40)로부터 공급되는 변조 신호를 참조 신호로 하여 믹싱하는 장치이다. 구체적으로는, IQ 믹서(58)는 참조 신호를 형광 신호(RF(Radio Frequency)신호)와 곱하여, 변조 신호와 동상(同相)의 성분을 포함하는 형광 신호의 I 신호와, 변조 신호에 대하여 90도 위상을 시프트한 성분을 포함하는 형광 신호의 Q 신호를 생성한다. 동상의 성분을 포함하는 I 신호는, 변조 신호와 형광 신호를 믹싱함으로써 생성되고, 90도 위상의 시프트한 성분을 포함하는 Q 신호는, 90도 위상의 시프트한 변조 신호와 형광 신호를 믹싱함으로써 생성된다.
로우 패스 필터(62)는 IQ 믹서(58)에서 생성된 I 신호, Q 신호의 저주파 신호를 꺼낸다. 이 꺼내어짐에 의해, 변조 신호와 동상의 형광 신호의 성분(Re성분)과, 변조 신호에 대하여 90도 위상이 시프트된 형광 신호의 성분(Im성분)이 형광 데이터로서 꺼내어진다. 꺼내진 각 성분은 신호 제어부(44)에 보내진다. 이하에서는, IQ 믹서(58)에 의한 믹싱 처리와 로우 패스 필터(62)에 의한 필터링 처리를 포함하는 처리를 주파수 다운 변환 처리라 하고, 이 처리에 의해 얻어지는 데이터를 형광 데이터라 한다.
신호 제어부(44)는 신호 처리부(42)로부터 보내진 형광 신호의 Re성분 및 Im성분을 증폭하고, AD변환을 행한다.
구체적으로는, 신호 제어부(44)는 각 부분의 동작 제어를 위한 지시를 부여하고 플로 사이트 미터(10)의 전 동작을 관리하는 시스템 컨트롤러(60)와 신호 처리부(42)에서 생성된 Re성분 및 Im성분을 증폭하는 제4 앰프(64)와 증폭된 Re성분 및 Im성분을 샘플링하는 A/D 변환기(66)를 가진다. 제4 앰프(64) 및 A/D 변환기(66)는 후술하는 분석 장치(80) 내에서 행해질 수도 있다.
분석 장치(80)는, 신호 제어부(44)에 의해 AD 변환되어 얻어지는 Re성분, Im성분으로부터 레이저광에 대한 형광의 위상 어긋남 각을 구하고, 또한 이 위상 어긋남 각으로부터 형광 완화 시정수(형광 완화 시간)를 구한다. 또한, 분석 장치(80)는 Re성분, Im성분으로부터 형광 강도를 구한다. 도 6은, 분석 장치(80)의 개략의 구성을 나타낸 도면이다.
분석 장치(80)는, CPU(82) 및 메모리(84)를 구비하는 컴퓨터로 구성된다. 분석 장치(80)는 또한 위상 어긋남 산출부(86), 위상 어긋남 보정부(88), 형광 완화 시간 산출부(90), 형광 강도 산출부(92), 출력 레벨 조정부(94)를 가진다. 이들 각 부분은, 컴퓨터 상에서 소프트 웨어가 기동됨으로써 기능을 발휘하는 소프트 웨어 모듈이다. 물론, 이들 부분을 전용 회로로 구성할 수도 있다.
위상 어긋남 산출부(86)는 형광 단백 X1이 발하는 형광의 형광 데이터에 대하여, Re성분을 실수부로 하고 Im성분을 허수부로 하는 복소수의 편각(tan-1(형광 데이터의 Im성분/형광 데이터의 Re성분))을 위상 어긋남 각 θmeas로서 산출한다. 위상 어긋남 산출부(86)는 위상 어긋남 각 θmeas를 위상 어긋남 보정부(88)에 제공한다.
위상 어긋남 보정부(88)는 위상 어긋남 산출부(86)에서 산출한 위상 어긋남 각 θmeas에 대하여, 광전자 증배관(27)의 양극 27d1~d11에 인가한 컨트롤 전압(조정 파라미터 값)에 따른 보정, 즉 전압 조정부(26d)를 통한 형광 신호의 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 행함으로써, 형광 단백 X1이 발하는 형광에 유래한 위상 어긋남 각 θτ를 산출한다.
이 보정은, 광전자 증배관(27)에서의 광전자 및 2차 전자의 이동 속도가 변화함으로써 생기는 위상 어긋남 각 θ의 변화를 방지하고, 정확한 형광 완화 시간을 산출하기 위해 행해진다. 광전자 증배관(27)에서는, 컨트롤 전압에 의해 광전자 및 2차 전자의 이동 속도는 상이하다. 따라서, 위상 어긋남 각 θmeas에 대하여, 설정한 컨트롤 전압에 따른 보정이 행해진다.
광전자 증배관(27)에서 2차 전자가 생성되는 다이노드와 2차 전자가 끌려가는 양극 사이의 거리 l을 사용하여, 광전자 및 2차 전자가 이동하는 시간 t는 하기의 수식 (1)에 의해 표현된다.
수식 (1)
t=(2ml2/V/q)(1/2)
여기서 m은 전자의 질량, q는 전자의 전하량, V는 컨트롤 전압이다.
한편, 위상 어긋남 각 θ는 시간 t에 비례한다. 따라서, 광전자 증배관(27) 내를 전자가 이동하는 시간에 의해 생기는 위상 어긋남 각(광전자 증배관(27)에서 유래하는 위상 어긋남 각) θpmt는, 정수(定數) B를 부가하여θpmt=A?V(-1/2)+B에 의해 표현된다. 그리고, A, B는 정수(定數)이다.
한편, 위상 어긋남 산출부(86)에서 산출되는 위상 어긋남 각 θmeas는, 하기의 수식(2)로 나타내는 것이 가능하다.
수식 (2)
θmeas=θ0-(θpmt＋θd＋θτ)
상기 수식 (2)에 있어서, θ0은 기준으로 하는 위상 어긋남 각(정수(定數))이며, θpmt는 광전자 증배관(27)에서 유래하는 위상 어긋남 각이며, θd는 플로 사이트 미터(10)에서의 레이저광 및 형광의 경로 길이와 형광 신호의 전기 회로 길이에서 유래하는 위상 어긋남 각이며, θτ는 형광 단백 X1이 발하는 형광에 유래하는 위상 어긋남 각이다.
따라서, 형광 단백 X1이 발하는 형광에 유래하는 위상 어긋남 각 θτ은, 하기 수식(3)에 나타낸 바와 같이 표현된다.
수식 (3)
θτ=θ0-(θpmt＋θd＋θmeas)
상기 수식(3)에 θpmt=A?V(-1/2)+B를 대입하면, 하기의 수식 (4)가 된다.
수식 (4)
θτ=X-θmeas-A?V(-1/2)
단, X는 X=θ0-B-θd로 표현되고, 컨트롤 전압에 의존하지 않는 정수(定數)이다.
분석 장치(80)의 메모리(84)는 상기 정수(定數) X와 정수(定數) A의 값을 미리 기억하고 있다. 위상 어긋남 보정부(88)는 정수 X와 정수 A의 값을 메모리(84)로부터 호출하여 수식(4)에 부여하여 보정식을 준비한다. 이로써, 위상 어긋남 보정부(88)는 위상 어긋남 산출부(86)로부터 제공된 위상 어긋남 각 θmeas와 전압 조정부(26d)로부터 제공된 컨트롤 전압 V로부터, 준비된 보정식을 이용하여 위상 어긋남 각 θτ를 산출한다.
위상 어긋남 보정부(88)는 산출한 위상 어긋남 각 θτ를 형광 완화 시간 산출부(90)에 제공한다.
형광 완화 시간 산출부(90)는 위상 어긋남 보정부(88)에서 산출된 위상 어긋남 각 θτ를 사용하여, 형광 단백 X1의 형광 완화 시간 τ를 τ=1/(2πf)?tan(θτ)의 식에 따라 산출한다. 여기서, f는 레이저광 L의 강도 변조에 사용한 주파수이다. 형광 완화 시간 τ를 τ=1/(2πf)?tan(θτ)의 식에 따라 산출할 수 있는 것은, 형광 현상이 1차의 완화과정에 따른 변화를 나타내기 때문이다.
형광 강도 산출부(92)는, A/D 변환기(66)로부터 보내진 형광 데이터에 대하여, Re성분을 실수부로 하고 Im성분을 허수부로 하는 복소수의 절대값을 구함으로써, 형광 단백 X1이 발하는 형광의 형광 강도를 산출한다.
산출된 형광 단백 X1의 형광 강도, 위상 어긋남 각 θτ 및 형광 완화 시간 τ는 도시하지 않은 프린터나 디스플레이 등의 출력 장치에 결과 정보로서 출력된다. 또한, 이 결과 정보는 시료(12)가 관로(30)의 측정점을 통과할 때 얻어지는 측정 결과로서, 통계 처리의 대상으로 된다.
출력 레벨 조정부(94)는 광전자 증배관(27)에 인가하는 컨트롤 전압을 정하기 위한 제어 신호를 생성한다. 컨트롤 전압은 광전자 증배관(27)으로부터 출력되는 형광 신호의 출력 레벨이 포화하지 않는 범위에서 자유롭게 설정된다. 출력 레벨 조정부(94)는 적어도 광전자 증배관(27)에 인가하는 현재의 컨트롤 전압의 정보를 취득하고 있다. 또한, 출력 레벨 조정부(94)는 정수 X 및 정수 A의 값을 산출하기 위하여 후술하는 캘리브레이션(calibration)을 행한다.
도 7a는 정수 X 및 정수 A의 값이 부여되어 준비된 보정식으로부터 구해지는 형광 단백 Qdot555의 형광의 위상 어긋남 각 θmeas와 플로 사이트 미터(10)를 사용하여 분석 장치(80)가 산출한 실측의 위상 어긋남 각 θmeas를 비교한 그래프이다. 도 7b는 정수 X 및 정수 A의 값이 부여되어 준비된 보정식으로부터 구해지는 형광 단백 PerCP의 형광의 위상 어긋남 각 θmeas와 플로 사이트 미터(10)을 사용하여 분석 장치(80)가 산출한 실측의 위상 어긋남 각 θmeas를 비교한 그래프이다. 여기서, 형광 단백 Qdot555 및 PerCP의 형광 완화 시간 τ은 이미 알고 있으므로, 위상 어긋남 각 θτ는 θτ=tan-1(2πfτ)로 산출되는 값을 사용하였다. 도 7a, 7b 중의 곡선이 보정식에 의한 위상 어긋남 각 θmeas의 산출 결과이며, ● 및 ○가 위상 어긋남 각 θmeas의 실측 결과이다.
도 7a, 7b로부터 알 수 있듯이, 보정식은 실측 결과와 매우 일치하는 것을 알 수 있다. 이로부터, 보정식을 이용한 보정, 즉 수식 (4)에서 산출되는 위상 어긋남 각 θτ는 정밀도가 높은 형광 완화 시간을 산출할 수 있다.
이하 플로 사이트 미터(10)에서 행해지는 형광 검출 방법에 대하여 설명한다.
먼저, 플로 사이트 미터(10)는 소정의 주파수 f로 강도 변조한 레이저광을 조사광으로서 레이저 광원부(22)로부터 출사한다.
다음에, 제2 수광부(26)은 형광을 수광하여 형광 신호를 출력한다.
제어 처리부(28)는 출력한 형광 신호를 레이저광 L를 강도 변조하는 변조 신호와 믹싱함으로써, 변조 신호에 대한 형광 신호의 위상 어긋남 각과 강도 진폭을 포함하는 형광 데이터를 생성한다.
분석 장치(80)의 위상 어긋남 산출부(86)는, 생성한 형광 데이터로부터 위상 어긋남 각 θmeas를 산출한다. 위상 어긋남 보정부(88)는 산출한 위상 어긋남 각 θmeas를 정수 X 및 정수 A의 값이 부여된 보정식인 수식 (4)에 따라 위상 어긋남 각 θτ을 산출한다. 또한, 형광 완화 시간 산출부(90)는 위상 어긋남 각 θτ을 사용하여 형광 단백 X1의 형광 완화 시간 τ를 τ=tan(θτ)/(2πf)의 식에 따라 산출한다. 한편, 형광 강도 산출부(92)는 생성한 형광 데이터의 절대값을 구하여 형광 강도를 산출한다.
산출된 형광 완화 시간, 위상 어긋남 각 θτ 및 형광 강도는, 도시하지 않은 출력 장치로부터 출력된다.
도 8은 플로 사이트 미터(10)를 사용하여, 메모리(84)가 기억하는 정수 X, A의 값을 결정하는 캘리브레이션의 흐름의 예를 나타낸 도면이다. 정수 X, A의 값을 결정할 때, 플로 사이트 미터(10)에서 측정에 사용하는 형광 단백 X1은 형광 완화 시간 τ를 이미 알고 있는 것이다.
먼저, 분석 장치(80)의 출력 레벨 조정부(94)는, 광전자 증배관(이후, PMT라 함)(27)의 컨트롤 전압 V를 최대화시킨다(단계 S10). 컨트롤 전압 V의 최대화는, 미량인 형광이라도 고감도로 형광을 검출 가능하도록 하기 위함이다. 컨트롤 전압의 조정은, 전압 조정부(26d)를 통해 행해진다.
다음에, 분석 장치(80)의 출력 레벨 조정부(94)는 ND 필터(26b)를 적당히 조정한다(단계 S20). ND 필터에 의한 감광을 행하는 것은, PMT(27)의 컨트롤 전압을 최대화해 PMT(27)를 최고 감도의 상태로 하는 경우, 광량에 대한 PMT(27)의 형광 신호의 출력 레벨이 포화되지 않도록 하기 위해서이다. ND 필터(26b)는, 예를 들어 최대 감광과 최소 감광의 중간에 설정된다.
다음에, 광원(22a)은 주파수 f로 강도 변조한 레이저광 L를 조사한다(단계 S30). 이로써, 측정점을 통과했을 때 레이저광 L의 조사를 받은 시료(12)가 발하는 형광을 PMT(27)는 수광한다. 이로써, PMT(27)는 컨트롤 전압 V에 의해 조정된 출력 레벨로 형광 신호를 출력한다(단계 S40). 형광 신호는 신호 처리부(42) 및 신호 제어부(44)에서 처리되어 Re성분과 Im성분을 포함하는 형광 데이터가 생성된다(단계 S50). 다음에, 분석 장치(80)의 형광 강도 산출부(92)는 형광 데이터로부터 형광 강도를 산출한다(단계 S60). 형광 강도는 형광 데이터의 절대값에 의해 표현된다.
다음에, 설정되어 있는 컨트롤 전압 V가 소정의 전압 이하인지 아닌지를 출력 레벨 조정부(94)는 판정한다(단계 S70).
판정 결과가 부정인 경우, 출력 레벨 조정부(94)는 전압 조정부(26d)를 통하여 컨트롤 전압 V를 일정한 폭으로 저감시킨다(단계 S80). 이같이 하여, 저감한 컨트롤 전압을 사용하여 단계 S30~S70이 반복된다. 즉, 형광 신호의 레벨이 단계 S30~S70을 반복할 때마다 감소하도록 컨트롤 전압 V의 조정이 행해진다. 스텝 S70에서의 판정이 긍정인 경우, 출력 레벨 조정부(94)는 또한 PMT(27)가 출력하는 형광 신호의 포화의 유무를 컨트롤 전압 V에 대한 형광 강도의 변화를 사용하여 판정한다(단계 S90).
PMT(27)가 출력하는 형광 신호의 포화의 유무의 판정은, 도시하지 않은 디스플레이에 그래프로 표시한 특성 결과를 확인한 오퍼레이터의 입력에 따라 행해져도 된다. 또는, 분석 장치(80)가 도시하지 않은 디스플레이에 그래프로 표시한 특성 결과를 자동으로 해석하여 형광 신호의 포화의 유무를 판정해도 된다. 예를 들어, 도 9에 나타난 바와 같이 컨트롤 전압 V에 대하여 형광 강도 산출부(92)가 산출하는 형광 강도의 값을 그래프에 의해 특성 결과로서 표시했을 때, 컨트롤 전압 V에 대한 형광 강도의 특성이 컨트롤 전압의 상승에 따라 직선으로부터 굴곡되어 완만하게 변화하는 영역이 있는지 여부를, 오퍼레이터의 육안관찰에 의한 확인 결과에 따라 또는 분석 장치(80)의 해석 결과에 따라 형광 신호의 포화의 유무를 판정한다.
이 판정의 결과가 긍정인 경우, 단계 S20으로 복귀하여, 단계 S20~단계 S80이 반복된다.
단계 S90의 판정 결과가 부정인 경우, 즉 PMT(27)가 포화 상태가 아닌 경우, 출력 레벨 조정부(94)는 회귀식을 근사시켜 정수 X 및 정수 A의 값을 추출하여(단계 S100), 추출한 정수 X 및 정수 A의 값을 메모리(84)에 기억시킨다(단계 S110). 회귀식은 상기 수식 (4)를 변형한 하기 수식 (5)가 사용된다.
수식 (5)
θmeas=X-θτ-A?V(-1/2)
단, θτ=tan-1(2πfτ)이다.
여기서, f는 레이저광의 강도 변조의 주파수(기존)이며, τ는 측정에 사용하는 형광 단백 X1의 형광 완화 시간(기존)이다.
출력 레벨 조정부(94)는 상기 수식 (5)를 사용하여 예측된 위상 어긋남 각 θm e as가 실측의 위상 어긋남 각 θmeas에 근사되도록, 상기 수식 (5) 등의 회귀식을 이용하여 실측의 위상 어긋남 각 θmeas로부터 정수 X와 정수 A의 값을 추출한다. 바꾸어 말하면, 실측의 위상 어긋남 각 θmeas를 수식(4)를 사용하여 보정된 위상 어긋남 각(수식 (4)의 우변의 값)이 기존의 형광 완화 시간 τ에 의해 정해지는 위상 어긋남 각 θτ에 근사되도록, 다시 말하자면, 수식 (4)의 우변에 나타난 보정된 위상 어긋남 각으로부터 산출되는 형광 완화 시간이 기존의 형광 완화 시간 τ에 근사되도록, 정수 X와 정수 A의 값을 추출한다.
도 7a에 나타낸 예에서는, 정수 X의 값으로서 3.7584, 정수 A의 값으로서 0.6360이 추출된다. 정수 X 및 정수 A의 값은, 최소 제곱 근사법 등의 공지의 방법을 이용하여 추출된다. 정수 X 및 정수 A의 값은, 형광 단백 X1에 관계없이 장치 고유의 값이며, 형광 단백의 종류를 바꾸어도 사용할 수 있는 값이다.
분석 장치(80)는, 도 7a, 7b에 나타난 바와 같이, 설정된 회귀식을 이용하여 PMT(27)의 컨트롤 전압에 대한 위상 어긋남 각 θmeas의 변화를 정확하게 예측할 수 있다. 따라서, 분석 장치(80)는 이 회귀식에 사용하는 정수 X 및 정수 A의 값을 정한 보정식인 수식(4)를 사용하여, 실측된 위상 어긋남 각 θmeas로부터 형광 단백 X1에 유래하는 위상 어긋남 각 θτ를 산출할 수 있다. 즉, 위상 어긋남 각 θmeas를 보정할 수 있다.
따라서, 분석 장치(80)는 형광 단백 X1가 발하는 형광의 형광 완화 시간을 정확하게 산출할 수 있다.
이상, 본 발명의 형광 검출 장치, 형광 검출 방법 및 형광 신호를 신호 처리하는 방법에 대하여 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위에 있어서, 각종 개량이나 변경을 해도 되는 것은 물론이다.
10: 플로 사이트 미터
12: 시료
20: 신호 처리 장치
22: 레이저 광원 부
22a: 광원
23, 26a: 렌즈계
24, 26: 제1 및 제2 수광부
26d: 전압 조정부
27: 광전자 증배관
27a: 음극
27b: 집속 전극
27c: 전자 증배부
27c1~27c11: 다이노드
27d1~27d11: 양극
27e: 줄기
28: 제어 처리부
30: 관로
32: 회수 용기
34: 레이저 드라이버
40: 신호 생성부
42: 신호 처리부
44: 신호 제어부
46: 발진기
48: 파워 스플리터
50, 52, 54, 64: 제1 내지 제4 앰프
58: IQ믹서
60: 시스템 컨트롤러
62: 로우 패스 필터
66: A/D 변환기
80: 분석 장치
82: CPU
84: 메모리
86: 위상 어긋남 산출부
88: 위상 어긋남 보정부
90: 형광 완화 시간 산출부
92: 형광 강도 산출부
94: 출력 레벨 조정부

Claims (12)

  1. 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 처리하는 형광 검출 장치에 있어서,
    상기 레이저광을 소정의 주파수의 변조 신호로 강도 변조하여 출사하는 광원부;
    상기 레이저광이 조사되어 발하는 측정 대상물의 형광을 수광하여, 출력 레벨이 조정된 형광 신호를 출력하는, 상기 출력 레벨의 조정이 가능한 수광 소자를 구비하는 수광부;
    상기 형광 신호를 상기 주파수의 변조 신호와 믹싱함으로써, 위상 및 강도의 정보를 포함하는 형광 데이터를 생성하는 제1 처리부; 및
    상기 형광 데이터를 사용하여, 상기 형광의 상기 변조 신호에 대한 제1 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제1 위상 어긋남에 대하여 상기 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 하여 제2 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제2 위상 어긋남을 사용하여 상기 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 제2 처리부
    를 구비한 것을 특징으로 하는, 형광 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 수광부는, 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값에 의해 상기 출력 레벨을 조정하는 조정부를 가지는, 형광 검출 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제2 처리부는, 상기 보정을 행할 때 상기 조정 파라미터 값에 따라 정해지는 보정식을 이용하는, 형광 검출 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2 처리부는, 상기 보정식에 사용하는 정수(定數)의 값을 미리 기억하고, 상기 보정을 행할 때 상기 정수의 값을 호출하여 사용하는, 형광 검출 장치.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 제2 처리부는, 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값을 미리 변경함으로써 상기 조정 파라미터 값과 상기 출력 레벨과의 관계를 구하고, 상기 관계가 상기 수광 소자의 출력 레벨의 포화를 나타내고 있지 않은 경우, 상기 보정식에 사용하는 상기 정수의 값을 추출하는 출력 레벨 조정부를 가지는, 형광 검출 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    형광 완화 시간을 미리 알고 있는 기준 대상물을 측정 대상물로서 사용하여 상기 제2 위상 어긋남으로부터 산출되는 형광 완화 시간이 기 보정에 의해 상기 기준 대상물의 기존의 형광 완화 시간에 근사하도록, 상기 출력 레벨 조정부는 상기 정수의 값을 추출하는, 형광 검출 장치.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수광 소자는 광전자 증배관이며, 상기 조정 파라미터 값은 상기 광전자 증배관의 전극에 인가하는 전압인, 형광 검출 장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 전극에 인가하는 전압을 V, 상기 제1 위상 어긋남을 θmeas, 상기 제2 위상 어긋남을 θτ로 했을 때, 상기 보정식은 하기 수식에 의해 표현되는, 형광 검출 장치.
    θτ=X-θmeas-A?V(-1/2)
    (X 및 A는 정수(定數))
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수광 소자의 수광면의 앞면에는 조정 가능한 감광 필터가 설치되는, 형광 검출 장치.
  10. 레이저광의 조사를 받는 것에 의해 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 처리하는 형광 검출 장치의 형광 검출 방법에 있어서,
    레이저광을 소정의 주파수의 변조 신호로 강도 변조하여 출사하는 단계;
    상기 레이저광이 조사되어 발하는 측정 대상물의 형광을 수광 소자로 수광하여, 출력 레벨이 조정된 형광 신호를 출력하는 단계;
    상기 형광 신호를 상기 소정의 주파수의 변조 신호와 믹싱함으로써, 위상 및 강도의 정보를 포함하는 형광 데이터를 생성하는 단계; 및
    상기 형광 데이터를 사용하여, 상기 형광의 상기 변조 신호에 대한 제1 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제1 위상 어긋남에 대하여, 상기 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 하여 제2 위상 어긋남을 산출하고, 산출한 상기 제2 위상 어긋남을 사용하여 상기 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 단계
    를 포함한 것을 특징으로 하는, 형광 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 형광 신호의 출력은 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값에 의해 출력 레벨이 조정된 형광 신호의 출력이며,
    상기 제2 위상 어긋남을 산출할 때, 상기 조정 파라미터 값에 따라 정해지는 보정식으로서, 미리 기억한 정수(定數)의 값이 부여된 보정식을 사용하여 상기 출력 레벨의 조정 조건에 따른 보정을 하고,
    상기 보정식에 부여되는 상기 정수의 값은, 형광 완화 시간을 미리 알고 있는 기준 대상물을 측정 대상물로서 사용하여 상기 제2 위상 어긋남으로부터 산출되는 형광 완화 시간이, 상기 보정에 의해 상기 기준 대상물의 기존의 형광 완화 시간에 근사하도록 추출된 값이며,
    상기 정수의 값의 추출은, 상기 수광 소자에 부여하는 조정 파라미터 값을 미리 변경함으로써 구해지는 상기 조정 파라미터 값과 상기 출력 레벨과의 관계가 상기 수광 소자의 출력 레벨의 포화를 나타내고 있지 않은 경우에 행해지는, 형광 검출 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 수광 소자의 수광면의 앞면에는 조정 가능한 감광 필터가 설치되고, 상기 감광 필터는 상기 수광 소자의 출력 레벨이 포화되지 않도록 조정되는, 형광 검출 방법.
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