JP2003526077A

JP2003526077A - 分光学における信号分解能を向上させるための装置および方法

Info

Publication number: JP2003526077A
Application number: JP2000528201A
Authority: JP
Inventors: ダグラス・エヌ・モドリン; トッド・イー・フレンチ; ジョン・シー・オウィッキ
Original assignee: エルジェイエル・バイオシステムズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-01-26
Filing date: 1999-01-25
Publication date: 2003-09-02
Also published as: WO1999037203A2; WO1999037203A9; AU2344899A

Abstract

(57)【要約】本発明は、分光スペクトル分析における信号分解能を向上させるための装置および方法ならびに複合体に関するものである。本発明による装置は、（１）複合体を支持するためのステージと、（２）光源と、この光源からの光を複合体に向けて導くための第１光学リレー構造と、（３）検出器と、複合体からの光を検出器に向けて導くための第２光学リレー構造と、（４）複合体からの光が変換されることによって形成された信号を解析するためのプロセッサと、を具備している。プロセッサは、信号内に含まれた情報を使用することにより、信号の中から、分析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、分析対象をなさない非分析対象発光体によって放出された光に起因する第２部分とを、識別することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本出願は、１９９８年４月１７日付けで出願された米国特許出願第０９／０６
２，４７２号、１９９８年９月２４日付けで出願された米国特許出願第０９／１
６０，５３３号、１９９８年１０月３０日付けで出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ９
８／２３０９５号、の継続出願であり、これらの優先権を主張するものである。
これら出願は、参考のためここに組み込まれる。

【０００２】本出願は、１９９８年１月２６日付けで出願された米国特許予備出願第６０／
０７２，４９９号、１９９８年１月２７日付けで出願された米国特許予備出願第
６０／０７２，７８０号、１９９８年２月２４日付けで出願された米国特許予備
出願第６０／０７５，８０６号、１９９８年５月４日付けで出願された米国特許
予備出願第６０／０８４，１６７号、に基づくものであり、米国特許法第１１９
条によりこれら出願の権利を主張するものである。これら出願は、参考のためこ
こに組み込まれる。

【０００３】本出願には、参考のため、JOSEPH R. LAKOWICZ, PRINCIPLES OF FLUORESCENCE
SPECTROSCOPY (1983) という文献が組み込まれる。

【０００４】本発明は、分光学に関するものである。より詳細には、本発明は、分光学にお
ける信号分解能を向上させるための装置および方法ならびに複合体に関するもの
である。

【０００５】

【従来の技術】

分光学における分析においては、蛍光や燐光を使用することによって、分子系
の構成要素や性質を特性づけることが多い。例えば、分光学は、薬剤候補化合物
を認識するための高処理速度スクリーニング法において使用することができる。
蛍光を使用する分光分析には、蛍光偏光法（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー変換法
（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命法（ＦＬＴ）、蛍光による総内部反射（ＴＩＲ）、蛍光
相関分光法（ＦＣＳ）、光ブリーチ後における蛍光回復法（ＦＲＡＰ）、等があ
る。燐光を使用する分光分析には、燐光偏光法、燐光寿命法）、等がある。各分
析方法には、長所と短所とがある。例えば、蛍光偏光分析法および燐光偏光分析
法は、一様でありかつ比率計測的なものであって、そのため、濃度や体積やメニ
スカス形状形状という観点におけるサンプル間のばらつきに対しては、それほど
過敏ではない。

【０００６】分光分析においては、光を吸収しその後発光するという過程を行うことが多い
。典型的には、分析対象物は、フォトンを吸収することにより、基底状態から複
数の励起状態のうちの１つへと励起される。この過程に関連した励起状態エネル
ギーは、蛍光や燐光等の生成といったような様々なメカニズムを通して、放出さ
れる。蛍光や燐光の性質は、分析対象物の性質や、その環境の性質や、結合反応
や、分析対象物を含有した酵素活性度、等を究明するために使用することができ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】

分光分析は、分析対象物の見かけの発光を変更してしまうような、そのため、
分析の正確さや再現性や信頼性を変更してしまうような、要因の影響を受ける。
ある種の要因は、分析対象物の見かけの発光を増大させ、そのため、強度に基づ
く分析結果が、分析対象物による発光量が実際よりも多いものとして報告されて
しまう。そのような要因としては、背景がある。他の要因は、分析対象物の見か
けの発光を増大させ、そのため、強度に基づく分析結果が、分析対象物による発
光量が実際よりも少ないものとして報告されてしまう。そのような要因としては
、散乱や吸収がある。また、そのような要因には、反射係数の変化や表面張力の
変化といったような光学変換係数（収集フォトン数と放出フォトン数との比）の
変化をもたらすような組成変化がある。

【０００８】また、分光分析は、分析対象物の見かけの偏光を変えてしまうような要因の影
響を受ける。そのような要因としては、背景や散乱や吸収等があり、見かけの偏
光を増減させてしまう。

【０００９】分析対象物の見かけの発光を増大させつつ偏光を変えるような要因の中では、
背景が、特に重大である。背景とは、分析対象物に起因するものではない光や他
の信号のことであって、分析対象物に起因する光に影響を与えてしまうものであ
る。背景は、試料の中の非対象物をなす発光性化合物に起因することができる（
例えば、ライブラリー化合物、ターゲット分子、等）。また、背景は、試料容器
や検出システムの中の発光性化合物に起因することができる（例えば、マイクロ
プレート、光学系、光ファイバ、等）。また、背景は、光ファイバを通して漏れ
る、散乱した励起光に起因することができる。これは、ゼロ寿命の発光に等しい
。また、背景は、室内光に起因することができる。

【００１０】背景に起因する各発光源を除去する方法はない。よって、分光法においては、
分析対象物と背景とを識別しなければならない。分析対象物と背景とが互いに異
なるスペクトルを有するものである場合には、背景は、分析対象物からの光は通
過させかつ背景からの光は遮断するという適切な光学フィルタを使用して少なく
とも部分的に識別することができる。分析対象物と背景とのそれぞれのスペクト
ルがオーバーラップしていない場合には、背景は、次の２つの方法によって少な
くとも部分的に識別することができる。第１に、背景は、ブランクを使用して識
別することができる。この方法においては、例えば強度データといったようなデ
ータを、試料に関して、および、分析対象物だけが欠如しておりその他の状況は
試料と同じであるようなブランクに関して、収集する。背景は、試料に関して得
られたデータから、ブランクに関して得られたデータを差し引くことによって、
少なくとも部分的に識別することができる。第２に、背景は、ゲーティング（
gating）によって識別することができる。この方法においては、背景が小さいと
きにまた存在していないときに、試料についてのみデータを収集する。

【００１１】うまくないことに、背景を除去するための上記方法は、いくつもの欠点を免れ
ない。特に、分析対象物と背景とが、互いにオーバーラップしたスペクトルを有
しているときには、いくつもの欠点を免れない。すなわち、ブランクの使用は、
少なくとも各試料に関して背景が相異するものである場合には、各試料ごとに２
回の測定を必要とする。各試料が互いに異なる容器内に収容されている場合には
、また、各試料が、例えばペプチドやタンパク質や核酸等といったような様々な
本質的に発光性のターゲット分子を含有している場合には、背景は、各試料によ
って異なる。ゲーティングの利用には、背景の寿命や強度に関しての知識が必要
である。また、ゲーティングの利用には、所定時間にわたったデータ収集しか行
えない。そのためデータ収集が遅いものなり、潜在的に有効なデータが失われて
しまう。ゲーティングは、寿命の短い背景の場合には特に問題である。というの
は、分析対象物からの発光は、励起直後の短い時間において最も強く起こるから
である。

【００１２】分析対象物の見かけの発光を減少させつつ偏光を変えるような要因の中では、
拡散および吸収が、特に重大である。拡散は、分析対象物を含有した化合物が濁
っている場合に発生しやすい。その場合、励起光および／または発光が、光学経
路外へと散乱されてしまい、検出されなくなる。吸収は、化合物のうちの非分析
対象物成分が励起光および／または発光を吸収可能である場合に発生しやすい。
励起光の吸収は、発光を引き起こすのに利用可能な光量の大きさを減少させるこ
とにより、発光を間接的に低減させる。発光の吸収は、発光を直接的に低減させ
る。励起光の吸収と発光の吸収とは、合わせて『カラークエンチング』と総称さ
れる。散乱およびカラークエンチングは、試料どうしの間で相異し得るものであ
って、したがって、特性づけが困難である。

【００１３】散乱および吸収のそれぞれの原因を除去する方法はない。このことは、生化学
的分子を含有した化合物において、特に当てはまる。なぜなら、例えばタンパク
質や核酸といったような生化学的分子は、発光分析において使用される波長と共
通した波長領域の光を吸収し得るからである。

【００１４】背景、散乱、吸収、および、見かけの発光に影響を与えるような要因は、単一
測定に対してさえも、重大な欠点を有している。これらは、１日あたり数十個の
または数百個のまたは数千個の試料が分析されるような高処理スクリーニング応
用においては、潜在的に能力を減じさせるような欠点である。スクリーニング応
用においては、ブランクの使用は、反応薬剤の消費量や試料調製に要する時間や
データ収集に要する時間や関連コストを、倍増させかねない。さらに、スクリー
ニング応用においては、光を散乱させたり吸収したりするような生化学的分子を
頻繁に使用しなければならない。

【００１５】

【課題を解決するための手段】

本発明は、分光分析における信号分解能を向上させ得る装置および方法ならび
に複合体を提供することによって、上記の欠点および他の欠点を克服するもので
ある。

【００１６】本発明による装置は、複合体内の分析対象物によって放出された光を検出する
ための部材を具備することができる。これら部材は、（１）ステージと、（２）
光源と、この光源からの光を複合体に向けて導くための第１光学リレー構造と、
（３）検出器と、複合体からの光を検出器に向けて導くための第２光学リレー構
造と、（４）プロセッサと、を備えることができる。ステージは、複合体を支持
するために使用することができる。光源および第１光学リレー構造は、分析対象
物による発光を励起するために使用することができる。検出器および第２光学リ
レー構造は、複合体からの光を検出し、検出した光を信号へと変換するために使
用することができる。プロセッサは、信号の中から、分析対象物によって放出さ
れた光に起因する第１部分と、分析対象をなさない非分析対象発光体や信号変調
や擾乱に起因する第２部分とを、識別するために使用することができる。非分析
対象発光体としては、背景が挙げられる。また、非分析対象発光体は、散乱や吸
収等を補正するための参照化合物とすることもできる。

【００１７】プロセッサにおいては、様々なアルゴリズムを使用することができる。例えば
、プロセッサは、背景の寿命や強度を決定することなく、信号の第１部分と第２
部分とを識別することができる。また、プロセッサは、ブランクから得られる情
報を使用することなく、信号の第１部分と第２部分とを識別することができる。
また、プロセッサは、周波数ドメインにおいて、信号の第１部分と第２部分とを
識別することができる。プロセッサにおいては、他のアルゴリズムを使用するこ
ともできる。

【００１８】プロセッサは、様々な量を計算することができる。例えば、プロセッサは、分
析対象物の強度を計算することができる。また、プロセッサは、分析対象物の偏
光を計算することができる。また、プロセッサは、参照化合物の強度または偏光
の関数として分析対象物の強度または偏光を表現するような量を計算することが
できる。また、プロセッサは、他の量を計算することもできる。

【００１９】本発明による方法は、複合体内の分析対象物から放出された光を検出するため
のステップを具備することができる。本方法においては、（１）複合体を照光す
ることにより、分析対象物からの発光を引き起こし、（２）複合体からの光を検
出して、検出した光を信号へと変換し、（３）信号を処理することによって、信
号の中から、分析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、背景に起
因する第２部分とを、識別する。本発明による方法は、付加的なステップまたは
代替可能なステップを具備することができる。

【００２０】本発明による複合体は、第１および第２発光物質を含有することができる。こ
こで、第１および第２発光物質は、それぞれの発光スペクトルが互いに大幅にオ
ーバーラップしたものであるとともに、第１および第２発光物質のそれぞれの発
光は、寿命ごとに識別する方法を使用して識別可能とされている。第１発光物質
は、分析対象物とすることができ、第２発光物質は、参照化合物とすることがで
きる。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明の特質は、添付図面および好ましい実施形態に関しての以下の詳細な説
明を勘案することにより、明瞭に理解されるであろう。

【００２２】図１は、周波数ドメインにおける時間的測定を示す概略的なグラフであって、
位相角度（位相）φと復調因子（変調）Ｍとの定義を示している。図２は、本発明による複合体において分析対象物からの発光を検出するための
装置を概略的に示す図である。図３は、図２に示す装置の一部を概略的に示す斜視図である。図４は、図２の装置における各光学部材を概略的に示す図である。図５は、図２の装置のためのハウジングの一部を示す部分展開図である。図６は、本発明による複合体において分析対象物からの発光を検出するための
代替可能な装置を概略的に示す図である。図７は、分析対象物と背景とからなるシステムに関して、位相ベクトルと変調
ベクトルとを示すベクトル図である。図８は、式１３（ＬＤＩ、Ｍ_X ベース）、式１５（ＬＤＩ、φベース）、およ
び、式１６（ＬＲＩ）に記載されているような本発明における３つのゼロ次の実
施形態に関して、分析対象物と背景との本発明による識別方法を表しているシミ
ュレーション結果を示すグラフである。図９は、分析対象物濃度を一定としかつ背景濃度を増大させた場合に、長寿命
ルテニウム錯体化分析対象物と短寿命Ｒ−フィコエリトリン背景との本発明によ
る識別方法を表している実験結果を示すグラフである。結果は、図８に示す３つ
の実施形態に関して示されている。図１０は、背景濃度を一定としかつ分析対象物濃度を増大させた場合に、長寿
命ルテニウム錯体化分析対象物と短寿命Ｒ−フィコエリトリン背景との本発明に
よる識別方法を表している実験結果を示すグラフである。結果は、図８に示す３
つの実施形態に関して示されている。図１１は、０〜１００％の結合に関し、０％背景の場合に周波数ドメインにお
ける結合実験において、位相（図１１Ａ）と変調された異方性（図１１Ｂ）とに
対して結合が与える影響を表しているシミュレーション結果を示すグラフである
。図１２は、５０％背景の場合に図１１と同様の周波数ドメインにおける結合実
験において、位相（図１２Ａ）と変調された異方性（図１２Ｂ）とに対して結合
が与える影響を表しているシミュレーション結果を示すグラフである。図１３は、０〜１００％の結合に関し、図１１と同様の周波数ドメインにおけ
るを実験において、０％背景（実線）と５０％背景（破線）とについて、Ψωに
対して結合が与える影響を表しているシミュレーション結果を示すグラフである
。Ψωは、本発明によって定義され評価されている。図１４は、図１１と同様の周波数ドメインにおける実験において、０％背景（
実線）と９０％背景（破線）とについて、Ｋωに対して結合が与える影響を表し
ているシミュレーション結果を示すグラフである。Ｋωは、本発明によって定義
され評価されている。

【００２３】本発明は、分光学において信号分解能を向上させるための装置および方法なら
びに部材構成を提供するものである。一般に、本発明による装置および方法は、
ステージと、光源と、検出器と、プロセッサと、光源と複合体と検出器との間に
わたって光を導くための第１および第２光学的リレー構造と、を具備している。
一般に、複合体は、第１および第２発光物質を備えている。これら発光物質は、
かなりの部分にわたってオーバーラップする発光スペクトルを有するものであっ
て、第１および第２発光物質の発光は、寿命ごとに識別する方法を使用して識別
可能とされている。明瞭化のために、本発明に関しての以下の説明は、次の６個
の部分に分割されている。すなわち、（１）発光分析の概要、（２）発光装置に
ついての説明、（３）強度分析、（４）偏光分析、（５）参照化合物、（６）結
論、に分割されている。

【００２４】１．発光分析の概要発光分析においては、発光分析対象物からの発光を使用して、分析対象物の性
質や環境を研究する。また、分析対象物を含んでの、結合反応、酵素活性、等を
研究する。この意味で、分析対象物は、分析の焦点をなす他の材料すなわちター
ゲット物質に関しての情報をもたらす報告者として機能することができる。発光
としては、強度や偏光や寿命等といったような様々な発光形態を使用することが
できる。また、発光分析においては、時間に依存しない（定常状態での）および
／または時間に依存した（時間的な）発光の性質を使用することができる。定常
状態分析は、通常、時間的分析よりも簡便であるものの、得られる情報量は少な
い。

【００２５】［強度分析］発光強度分析においては、複合体からの発光の強度（または、発光量）を観測
する。発光強度は、消光係数、量子効率、複合体中の発光性分析対象物の数、等
に依存する。これら物理量は、消光物質やエネルギー変換パートナーの近接度合
いや効率といったような、分析対象物の置かれた環境等に依存する。よって、発
光強度分析は、様々な応用の中でも、結合反応を研究するために使用される。

【００２６】［偏光分析］発光偏光分析においては、偏光光が吸収されたり発光されたりする（偏光とは
、光の電界方向を意味している。この電界方向は、通常、光の伝搬方向とは垂直
である。）。発光偏光分析においては、複合体中の特定の分子が、１つまたは複
数の発光物質によってラベルづけされる。その後、複合体に対して、偏光された
励起光が照射される。励起光は、励起光の偏光に対して平行に揃えられた吸収ダ
イポールを有した発光物質を優先的に励起する。このような分子は、発光ダイポ
ールに対して平行に偏光された光を優先的に放出することによって減衰する。発
光されたすべての光の偏光度合いは、励起と発光との間の時間間隔における分子
の再配列度合いに依存する。そのような時間間隔は、発光寿命τと称される。分
子再配列度合いは、発光寿命や、再配列分子のサイズや形状や環境に依存する。
よって、発光偏光分析は、様々な応用の中でも、結合反応や酵素活性を定性化す
るために使用することができる。特に、分子は、回転相関時間τ_rot による拡散
を介して回転する。回転相関時間τ_rot は、分子サイズに比例する。よって、発
光寿命においては、比較的大きな分子は、それほど再配列することはなく、その
ため、発光全体は、比較的偏光される。これに対して、同じ時間間隔であっても
、比較的小さな分子は、かなり再配列され、そのため、発光全体は、比較的偏光
されない。

【００２７】偏光と強度との間の関係は、次の式１によって表される。

【数１】ここで、Ｐは偏光であり、Ｉ‖は励起光の偏光に対して平行な発光強度であり、
Ｉ⊥は励起光の偏光に対して垂直な発光強度である。励起と発光との間にわずか
の回転しかない場合には、Ｉ‖が比較的大きくＩ⊥が比較的小さくなり、Ｐが１
に近づく（Ｐは、たとえ回転がない場合であっても１よりも小さいものである。
例えば、Ｐは、吸収ダイポールと発光ダイポールとが平行でなければ、１よりも
小さい。）。これとは逆に、励起と発光との間にかなり大きな回転が存在する場
合には、Ｉ‖がＩ⊥と同等となり、Ｐが０に近づく。偏光は、ミリＰ単位（１０
００×Ｐ）で報告されることが多い。Ｐが０〜１の範囲であることから、ミリＰ
単位の場合には、０〜１０００の範囲にわたって変化する。

【００２８】また、偏光は、例えば異方性といったような他の同等の物理量によっても記述
することができる。異方性と強度との関係は、次の式２によって表される。

【数２】ここで、ｒは、異方性である。偏光と異方性とは、同じ情報を含んでいる。しか
しながら、異方性は、１つ以上の発光物質を含有しているシステムを、より単純
に表現することができる。以下の説明や請求範囲においては、これら用語を互換
的に使用する。これら用語の一方に対しての一般表現は、他方に関しての一般表
現をも包含することを理解されたい。

【００２９】偏光と回転との関係は、Perrin式をなす次の式３によって表される。

【数３】ここで、Ｐ₀ は、分子移動がない場合の偏光（真性偏光）であり、τは、上述の
発光寿命（減衰率の逆数）であり、τ_rot は、上述の回転相関時間（回転速度の
逆数）である。

【００３０】 Perrin式は、発光寿命と回転相関時間とが同等である場合に発光偏光分析が最
も敏感であることを示している。回転相関時間は、分子量に比例するものであり
、（球状分子においては）分子量が２４００（参考までに単位を付すとすれば２
４００ダルトン）増えるごとに、約１ナノ秒ずつ増大する。例えば発光寿命がほ
ぼ４ナノ秒であるようなフルオレセインといったような寿命の短い発光物質の場
合には、発光偏光分析は、約４０，０００（４０，０００ダルトン）よりも小さ
な分子量に対して、最も敏感となる。例えば発光寿命がほぼ４００ナノ秒である
ようなＲｕ（ｂｐｙ）２ｄｃｂｐｙ（ルテニウム，２，２’−ジピリジル，４，
４’−ジカルボニル−２，２’−ジビピリジン）といったような寿命の長いプロ
ーブの場合には、発光偏光分析は、約７０，０００（７０，０００ダルトン）〜
４，０００，０００（４，０００，０００ダルトン）という分子量に対して、最
も敏感となる。

【００３１】［時間的分析］時間的分析においては、発光の時間変化を測定する。時間的分析は、時間ドメ
インにおいて、または、周波数ドメインにおいて、行うことができる。両方とも
、機能的には等価である。時間ドメインにおける測定においては、発光の時間変
化が直接的に観測される。様々な手順が可能ではあるけれども、典型的には、発
光性分析対象物を含有した複合体に対して、光の短いパルスを照射し、結果とし
て得られる発光の強度の時間変化を観測する。単純な分子の場合には、発光は、
通常、単一の指数関数に従って減衰する。

【００３２】周波数ドメインにおける測定においては、周波数空間内において、発光の時間
変化が間接的に観測される。典型的には、複合体に対して、単一変調周波数ｆに
おいて強度が正弦的に変調されているような光を照射する。ただし、他の手法（
例えば、時間ドメインにおけるデータを周波数ドメインへと変換する）を使用す
ることもできる。結果として得られる発光強度は、励起光と同じ周波数で変調さ
れている。しかしながら、発光は、励起光よりも、位相角度（位相）φだけ遅延
しており、発光強度は、励起光強度と比較して、復調因子（変調）Ｍだけ復調さ
れている。

【００３３】図１は、単一周波数における周波数ドメインでの実験に関しての、発光と励起
との関係を示している。位相φは、励起と発光との間の位相差である。変調Ｍは
、発光におけるＡＣ強度とＤＣ強度との比の、励起光におけるＡＣ強度とＤＣ強
度との比に対しての、比である。位相および変調は、次式４，５によって、発光
寿命τと関係づけられている。

【数４】

【数５】ここで、ωは、変調の角周波数であり、変調周波数と２πとの積に等しい。最大
感度においては、変調角周波数は、おおよそ発光寿命の逆数である。高処理速度
型のスクリーニングにおける寿命は、１ナノ秒よりも小さな値から１０マイクロ
秒よりも大きな値にまでわたって変化する。したがって、高処理速度型のスクリ
ーニングのための器具は、２０ｋＨｚ〜２００ＭＨｚという変調周波数をカバー
し得るべきである。

【００３４】２．発光装置についての説明図２〜図５は、複合体内の分析対象物から放出される光を検出するための装置
９０を示している。装置９０は、（１）複合体を支持するためのステージと、（
２）複合体に対して光を供給するための１つまたは複数の光源と、（３）複合体
から伝達された光を受領して受領光を信号へと変換するための１つまたは複数の
検出器と、（４）光源と複合体と検出器との間にわたって光を導くための第１お
よび第２光学的リレー構造と、（５）検出器からの信号を解析するためのプロセ
ッサと、を具備している。装置９０は、限定するものではないが上述の分析とい
ったような、様々な発光分析や吸光分析を行うために使用することができる。

【００３５】この実施形態においては、装置９０は、連続型の光源１００と、時間変調光源
１０２と、を備えている。装置９０は、４つの光源のための光源スロット１０３
ａ〜１０３ｄを備えている。ただし、光源スロットの数、および、光源の数は、
他の数とすることもできる。光源スロット１０３ａ〜１０３ｄは、各光源の少な
くとも一部を被覆して放射や爆発からの保護をもたらすためのハウジングとして
機能する。発光システムにおける光の伝達方向は、矢印によって示されている。

【００３６】連続型光源１００は、発光強度分析および定常状態発光偏光分析のための光を
もたらす。連続型光源１００は、ランプや、レーザーや、レーザーダイオードや
、発光ダイオード、等とすることができる。好ましい連続型光源としては、例え
ば ILC Technology 社から入手可能な Model LX175F CERMAXキセノンランプとい
ったような、強度が大きくかつ色温度の大きなキセノンアークランプがある。色
温度とは、光源の色度と同じ色度の黒体放射体が動作する単位をケルビンとした
絶対温度のことである。色温度の大きなランプは、色温度の小さなランプよりも
、より多くの光を生成する。色温度の大きなランプは、多くの発光物質が吸収を
起こすような可視波長範囲や紫外波長範囲に向けてあるいはそれら波長範囲内に
、最大出力をシフトさせることができる。好ましい連続型光源は、５６００ケル
ビンという色温度を有している。これは、タングステンフィラメント光源におけ
る約３６００ケルビンという色温度をはるかに超えるものである。好ましい光源
は、フラッシュ型光源よりも単位時間あたりにより多くの光をもたらす。これに
より、感度が増大するとともに、読取時間が減少する。装置９０は、光源によっ
て生成された光の強度を変更することなく複合体に対する入射光強度を変更し得
るよう構成された変調機構を備えることができる。

【００３７】時間変調型光源１０２は、例えば発光寿命や時間的発光偏光分析といったよう
な時間的な発光分析のための光をもたらす。好ましい時間変調型光源としては、
例えば EG&G Electro-Optics社から入手可能な Model FX-l 160 キセノンフラッ
シュランプといったような、キセノンフラッシュランプがある。好ましい光源は
、信号検出前に短い時間間隔でもって光の『フラッシュ』を生成するものであっ
て、時間ドメインにおける測定に対して特に好適である。他の時間変調型光源に
は、パルス型レーザーや、ポッケルスセルまたはカーセル等の機構を使用して外
部的に強度を変調し得るものとされた連続型ランプ、がある。後者の光源は、周
波数ドメインにおける測定に対して特に好適である。

【００３８】装置９０においては、連続型光源１００と時間変調型光源１０２とは、多色の
かつ非偏光型のかつ非コヒーレントな光を生成する。連続型光源１００は、実質
的に連続型の発光を生成する。一方、時間変調型の光源１０２は、時間変調され
た発光を生成する。これら光源からの光は、修正を加えることなく試料に対して
供給することができる。あるいは、これら光源からの光に対してフィルタリング
を行って、強度やスペクトルや偏光や他の性質を変更した上で、試料に対して供
給することができる。

【００３９】光源によって生成された光は、励起光用の光学経路を通って試験サイトへと導
かれる。そのような光は、１つまたは複数の『スペクトルフィルタ』を通すこと
ができる。スペクトルフィルタは、一般に、試料に対して供給される光スペクト
ルを変更するための任意の機構を備えたものである。スペクトルとは、光の波長
分布のことである。スペクトルフィルタを使用することにより、多くの色の光を
有してなる白色光または多色光を、１色の光を有したまたはほんの数色の光だけ
を有した赤色光や青色光や緑色光やあるいは他の実質的な単色光へと、変換する
ことができる。装置９０においては、励起光干渉フィルタ１０４によって、スペ
クトルが変更される。フィルタ１０４は、予め選択された波長を有した光を選択
的に透過させ、かつ、他の波長の光を選択的に吸収する。簡単化のために、励起
光干渉フィルタ１０４は、励起光用フィルタホイール１０６内に収容することが
できる。フィルタホイール１０６は、予め選択されたフィルタを光学経路内へと
回転させることによって、励起光スペクトルを変更することができる。スペクト
ルフィルタは、波長によって光を空間的に分割することもできる。そのような例
としては、回折格子や、モノクロメーターや、プリズムがある。

【００４０】スペクトルフィルタは、単一波長の光だけを出力するような、ある種のレーザ
ーといったような単色光（『単一色の』）光源に対しては、不要である。したが
って、励起光用フィルタホイール１０６は、いくつかの光源スロット１０３ａ、
１０３ｂの光学経路に設置することができ、他の光源スロット１０３ｃ、１０３
ｄの光学経路には設置しなくても良い。

【００４１】光は、次に、励起光用光学シャトル（すなわち、スイッチ）１０８を通る。励
起光用光学シャトル１０８は、適切な光源の前に励起光用光ファイバケーブル１
１０ａ、１１０ｂを位置させるものであり、上側光学ヘッド１１２ａおよび下側
光学ヘッド１１２ｂのそれぞれに対して光を導く。両光学ヘッドは、検査容積内
に光を導くために、また、検査容積から伝達された光を受領するために、様々な
光学系を備えている。光は、水がホースを通って導かれるのと全く同様に、光フ
ァイバケーブルを通って導かれる。光ファイバケーブルは、光をコーナーに向け
るために、また、装置の不透明部材を迂回させるために、容易に使用することが
できる。さらに、光ファイバケーブルは、より一様な強度分布でもって光をもた
らす。好ましい光ファイバケーブルは、自動発光が小さい溶融シリコンケーブル
である。これら利点があるものの、光は、例えばミラーといったような他の機構
を使用して光学ヘッドへと導くこともできる。

【００４２】光学ヘッドへと到達した光は、１つまたは複数の励起光用『偏光フィルタ』を
通る。励起光用偏光フィルタは、一般に、光の偏光を変え得る任意の機構を備え
ている。励起光用偏光フィルタは、上側光学ヘッドおよび下側光学ヘッドの一方
または双方に備えることができる。装置９０においては、偏光は、励起光用偏光
子１１４によって変えることができる。この励起光用偏光子１１４は、上側光学
系１１２ａにおいてのみ設けられている。励起光用偏光子１１４は、ｓ−偏光光
だけを通過させるｓ−偏光子Ｓと、ｐ−偏光光だけを通過させるｐ−偏光子Ｐと
、実質的にすべての光を通過させるブランクＯと、を備えることができる。励起
光用偏光子１１４は、標準的なスイッチングシステムすなわち強誘電性液晶ディ
スプレイ（ＬＣＤ）における偏光スイッチングシステムを備えることもできる。
そのようなシステムは、機械的なスイッチよりも、より高速でありかつより経済
的である。励起光用偏光子１１４は、偏光分析における信号雑音比を向上させる
ために、同期検出機能付きの連続モードＬＣＤ偏光回転器を備えることもできる
。励起光用偏光子１１４は、ある種のレーザーといったような、本来的に偏光光
を生成するような光源内に設置することもできる。

【００４３】一方または双方の光学ヘッドにおける光は、励起光用『共焦光学部材』を通る
ことができる。励起光用共焦光学部材は、一般に、『検査容積』内に光を焦点合
わせするための任意の機構を備えたものである。装置９０においては、共焦光学
部材は、１組のレンズ１１７ａ〜１１７ｃと、図４に示すように検査容積に対し
て共役な仮想面内に配置された励起光用開口１１６と、を備えている。開口１１
６は、開口として直接的に形成することもでき、また、光ファイバケーブルの端
部として間接的に形成することもできる。レンズ１１７ａ、１１７ｂは、開口１
１６の像を、試料上に投影する。これにより、試料のうちの、予め選択された検
査容積だけが照射される。

【００４４】両光学ヘッドを通る光は、反射されてビームスプリッタ１１８を透過する。ビ
ームスプリッタ１１８は、反射光を複合体１２０へと導き、また、透過光を光モ
ニタ１２２に対して導く。反射光および透過光の双方は、ビームスプリッタ１１
８と複合体１２０との間において動作可能に配置されているレンズ１１７ｂを通
る。

【００４５】ビームスプリッタ１１８を使用することにより、励起光は、試料と光モニタと
に向けて導かれ、発光は、検出器に向けて導かれる。ビームスプリッタが交換可
能なものであることにより、ビームスプリッタは、様々な分析モードに応じてま
た様々な複合体に応じて、最適化することができる。多数のまたは多種類の発光
分子の研究に際しては、ビームスプリッタは、幅広い波長の光に適合し得るもの
である必要がある。この場合、波長にかかわらず入射光の半分を反射しかつ入射
光の半分を透過させるような『５０：５０』のビームスプリッタが、最適である
。そのようなビームスプリッタは、多くのタイプの分子と共に使用することがで
き、大部分の励起光を複合体上に導くとともに、大部分の発光を検出器に対して
透過させる。１つまたは少しの関連発光分子の研究に際しては、ビームスプリッ
タは、限られた波長領域の光に適合し得るだけで十分である。この場合、『二色
性』または『多色性』のビームスプリッタが、最適である。そのようなビームス
プリッタは、適切な組をなす分子に対しての遮断周波数を有するように構成する
ことができ、励起光および背景光の大部分または実質的にすべてを反射し、発光
の大部分または実質的にすべてを透過させる。これは、ビームスプリッタの反射
率および透過率を、波長に応じて変化させることができることにより、可能であ
る。

【００４６】光モニタを使用することにより、光源によってもたらされた光の強度に生じた
擾乱が補正される。このような補正は、検出器によって測定された発光強度の対
応倍と光モニタによって測定された励起光強度との比としての検出強度を報告す
ることにより、行われる。光モニタは、また、光源が停止したときに、使用者に
警告を発するようプログラムしておくことができる。好ましい光モニタは、自動
発光の小さな石英ウィンドウを有したシリコンフォトダイオードである。

【００４７】複合体（すなわち、試料）１２０は、ステージ１２３によって支持されている
試料ホルダ内に保持することができる。複合体は、化合物、混合物、表面、溶液
、エマルジョン、懸濁液、セルクラスタ、発酵クラスタ、セル、組織、分泌物、
および／または、それらの派生物および／または抽出物、とすることができる。
複合体の分析においては、そのような複合体中における発光分析対象物の存在、
濃度、物理的性質（相互作用を含む）を測定する。試料ホルダは、マイクロプレ
ート、バイオチップ、あるいは、公知のフォーマットとされた任意配列の試料と
することができる。装置９０においては、好ましい試料ホルダは、各複合体を保
持するための複数のマイクロプレート井戸１２６を有しているマイクロプレート
１２４である。複合体は、分析に応じて、単一のマイクロプレート井戸に入れる
ことも、あるいは、複数のマイクロプレート井戸に入れることも、できる。例え
ば携帯型の分析器といったようないくつかの実施形態においては、ステージは、
器具と一体化することができる。

【００４８】検査容積は、典型的には、砂時計形状とされていて、円錐角度は約２５°であ
り、最小直径は０．１ｍｍ〜２．０ｍｍとされている。９６個の井戸を有したマ
イクロプレートおよび３８４個の井戸を有したマイクロプレートの場合には、好
ましい最小直径は、約１．５ｍｍである。１５３６個の井戸を有したマイクロプ
レートの場合には、好ましい最小直径は、約１．０ｍｍである。試料容器のサイ
ズおよび形状は、検査容積のサイズおよび形状に適合することができる。

【００４９】検査容積の位置は、信号雑音比を最適化しかつ信号背景比を最適化し得るよう
、複合体内において精度良く移動させることができる。例えば、検査容積は、試
料ホルダ内の壁から離れたところに移動させることができる。これにより、壁に
固定されて不動化された発光材料に起因した偽の信号を低減させることができて
、信号雑音比が最適化され、信号背景比が最適化される。装置９０においては、
光学経路に垂直なものとされたＸ、Ｙ平面内における位置は、複合体を支持して
いるステージを移動させることにより制御され、光学経路に平行なものとされた
Ｚ軸に沿った位置は、図２および図３に示すようなＺ軸調節機構を使用して光学
ヘッドを移動させることにより制御される。しかしながら、検査容積を、適切な
複合体位置に対して位置合わせし得るような任意の機構を使用することができる
。

【００５０】上側光学系と下側光学系とを組み合わせることによって、分析どうしの次のよ
うな組合せが可能とされる。すなわち、（１）上側から照射して、上側において
検出すること、あるいは、（２）上側から照射して、下側において検出すること
、あるいは、（３）下側から照射して、上側において検出すること、あるいは、
（４）下側から照射して、下側において検出すること。同じ側から照射と検出を
行う方式（１）および（４）は、『エピ』モードと称され、発光分析において好
まれる。反対側において照射と検出を行う方式（２）および（３）は、『トラン
ス』モードと称され、吸光分析において好まれる。装置９０においては、エピモ
ードが支持されている。そのため、励起光と発光とは、光学ヘッド内の同じ経路
を移動する。ただし、移動の向きは、互いに逆向きであって逆平行である。しか
しながら、トランスモードを支持することもでき、吸光分析の場合には実質的に
そのようにされる。一般に、上側光学系は、上面開放型の試料ホルダに関して使
用することができ、一方、下側光学系は、例えばガラス底や薄いプラスチック底
といったような光学的に透明な底を有した試料ホルダに関してのみ使用すること
ができる。

【００５１】複合体からは、光は、多方向に放出される。放出光の一部が、検出器に向けて
の発光経路を通ることとなる。発光は、レンズ１１７ｃを通り、さらに、発光用
開口１３１および／または発光用偏光子１３２を通る。装置９０においては、発
光用開口は、検査容積と共役な仮想面内に配置されており、検査容積からの光を
実質的に排他的に透過させる。装置９０においては、上側光学系および下側光学
系の両発光用開口は、関連する（対応する）励起光用開口と同じサイズとされて
いる。ただし、他のサイズとすることもできる。発光用偏光子は、上側光学ヘッ
ド１１２ａに関してのみ、設けられている。発光用開口および発光用偏光子は、
それぞれ対応する励起光用のものと実質的に同様のものである。発光用偏光子１
３２は、本質的に光の偏光を検出するための検出器の場合には検出器内に包含さ
せることができる。

【００５２】励起光用偏光子１１４および発光用偏光子１３２は、ある種の背景信号を排除
するために、非偏光分析において一緒に使用することができる。試料ホルダから
の発光、および、試料ホルダに付着した発光性分子からの発光は、偏光している
ものと考えられる。というのは、これら分子の回転移動度が妨げられているはず
であるからである。そのような偏光した背景信号は、励起光用偏光子と発光用偏
光子とを『クロスさせること』によりすなわち透過軸回りに互いに９０°の角度
をなすように配置することにより、除去することができる。上述のように、その
ような偏光した背景信号は、また、検査容積を、試料ホルダの壁から遠ざけるこ
とによっても、低減させることができる。信号レベルを増大させるために、ビー
ムスプリッタ１１８は、ある偏光光は反射し他の偏光光は透過させるように、最
適化されているべきである。この方法は、分析対象をなす発光性分子が比較的偏
光度合いの小さな光を放出する場合に、有効である。これは、容積内の小さな発
光性分子の場合に当てはまる。

【００５３】光は、次に、発光用光ファイバケーブル１３４ａ、１３４ｂを通り、発光用光
学シャトル（すなわち、スイッチ）１３６のところへと到達する。このシャトル
は、適切な発光用光ファイバケーブルを、適切な検出器の前方に位置させる。装
置９０においては、これら部材は、対応する励起光用の部材と実質的に同様のも
のとされている。ただし、他の機構のものを使用することもできる。

【００５４】光ファイバケーブルを出た光は、１つまたは複数の発光用『強度フィルタ』を
通ることができる。強度フィルタは、一般に、光強度を減少させ得るような任意
の機構を備えたものである。強度は、単位面積あたりかつ単位時間あたりの光量
で表される。装置９０においては、強度は、発光用中性密度フィルタ１３８によ
って変更される。発光用中性密度フィルタ１３８は、波長に実質的に無関係に光
を吸収し、吸収したエネルギーを熱として放出する。発光用中性密度フィルタ１
３８は、大部分の入射光を吸収する高密度フィルタＨと、いくらかの入射光を吸
収する中間密度フィルタＭと、実質的に入射光を吸収しないブランクＯと、を備
えることができる。これらフィルタは、手作業で交換することができる。あるい
は、フィルタホイールといったような他の交換方法を使用することもできる。強
度フィルタは、吸収することなく、光の一部を、試料からは遠いところへと逸ら
すことができる。この例としては、いくらかの光をある経路に沿って導くととも
に他の光を他の経路に沿って反射させるビームスプリッタや、回折によって光を
様々な経路へと偏向させるポッケルスセルがある。

【００５５】光は、次に、発光用干渉フィルタ１４０を通る。発光用干渉フィルタ１４０は
、発光用フィルタホイール１４２内に収容することができる。装置９０において
は、これら部材は、対応する励起光用の部材と実質的に同様のものとされている
。ただし、他の機構のものを使用することもできる。発光用干渉フィルタは、反
射や散乱といったような様々な機構を介して発光用経路内へと入ってくる漂遊励
起光を遮断する。もし遮断を行わないと、そのような漂遊励起光が検出されてし
まい、発光として誤認されることとなってしまって、信号背景比を低減させてし
まう。発光用干渉フィルタは、関連する励起光よりも発光の方が長い波長を有し
ていることから、発光と励起光とを区別することができる。発光は、典型的には
、２００〜２０００ｎｍという波長を有している。

【００５６】この明細書中において例示されるスペクトルフィルタや強度フィルタや偏光フ
ィルタや他のフィルタの相対位置は、本発明の精神を逸脱することなく変更する
ことができる。例えば、強度フィルタのように、ここではある光学経路内におい
てのみ使用されているフィルタは、他の光学経路において使用することもできる
。加えて、偏光フィルタのように、ここでは上側または下側光学系の一方におい
てのみ使用されているフィルタは、他方の光学系において使用することもでき、
あるいは、双方の光学系において使用することもできる。特定の実験に際しての
複数のフィルタの最適配置および組合せは、分析モードや複合体や他の要因に依
存して決められるものである。

【００５７】光は、最後に、検出器へと到達する。検出器は、吸光分析および発光分析にお
いて使用される。装置９０においては、すべての発光モードからの光を検出する
ある１つの発光検出器１４４が設けられている。好ましい検出器は、光増倍管（
ＰＭＴ）である。装置９０においては、４つの検出器のための検出スロット１４
５ａ〜１４５ｄが設けられている。ただし、検出スロットの数や検出器の数は、
他の数とすることもできる。

【００５８】より一般的には、検出器は、検出された光によるエネルギーを、特にプロセッ
サといったような装置によって処理することができる信号へと変換し得るような
任意の機構を備えている。適切な検出器としては、光増倍管、アバランシェ型フ
ォトダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤｓ）、強化されたＣＣＤｓ、等がある。
検出器および分析モードに応じて、そのような検出器は、（１）フォトンカウン
トモードまたは連続モードで、また、（２）撮像モードまたは積分モードで、使
用することができる。

【００５９】図５は、図２〜図４の装置のための、ハウジング１５０と他の付属品とを示し
ている。ハウジング１５０は、実質的に装置を内包しており、連続型でありかつ
色温度の大きなキセノンアークランプの周囲に２つの保護層を形成している（光
源スロット１０３ａ〜１０３ｄと協働して）。ハウジング１５０は、自動試料導
入や、自動的な光源切換や自動的な検出器切換が可能なものであって、さらに、
キセノンアークランプや他のシステム構成部材から、操作者を保護するものであ
る。

【００６０】図６は、複合体１６２内の分析対象物からの発光を検出するための代替可能な
装置１６０を示している。装置１６０は、装置９０の実質部分を具備するもので
あって、光ファイバによって連結された光学ヘッド１６４と、励起光用フィルタ
１６６と、発光用フィルタ１６８と、２色性ビームスプリッタ１７０と、試料位
置制御および焦点合わせ制御のための機構と、を具備している。しかしながら、
装置１６０は、代替可能な光源１７２と、代替可能な試料用検出器（「Ｓ」検出
器）１７４と、代替可能な参照用検出器（「Ｒ」検出器）１７６と、代替可能な
検出用電子回路系１７８と、を具備することができる。図６においては、代替可
能な部材１７２〜１７８は、装置９０の外部に図示されているけれども、必要に
応じて、これら部材を装置９０のハウジング１５０内に組み込むことは容易であ
る。

【００６１】装置１６０は、例えばＬＥＤ光源を使用してとかレーザーダイオード光源を使
用してとかいった具合に様々な方法で、発光を励起することができる。例えば、
青色光を吸収する分析対象物に対しては、NICHIA社による高輝度青色ＬＥＤ（型
番 NSPB500; Mountvlle,ペンシルバニア州）を使用して励起することができる。
このＬＥＤは、幅広いスペクトル領域にわたる励起光を生成する。そのため、典
型的には、励起光用フィルタ１６６が使用されて、スペクトルの中の赤色帯が遮
蔽される。レーザーダイオードによって分析対象物を励起する場合には、励起光
用フィルタは、不要である。

【００６２】装置１６０は、発光を検出することができ、検出した発光を様々な方法で信号
に変換することができる。発光は、試料側ＰＭＴ１７４を使用して検出すること
ができる。ＰＭＴ１７４は、ＩＳＳ社によるゲイン変調型ＰＭＴ（Champaign,イ
リノイ州）とすることができる。高周波発光は、ヘテロダインと称される技法を
使用して低周波信号へと、周波数低減変換することができる。低周波信号の位相
および変調度は、例えば STANFORD RESEARCH SYSTEMS社によるロックインアンプ
（型番 SR830; Sunnyvale,カリフォルニア州）といったようなロックインアンプ
１８０を使用して決定することができる。ロックインアンプ１８０は、光源１７
２の変調周波数へと、位相ロックループ１８２を使用して位相ロックすることが
できる。光源のドリフトを補正するために、光源１７２の出力は、参照側ＰＭＴ
１７６を使用して観測することができる。参照側ＰＭＴ１７６は、HAMAMATSU 社
によるＰＭＴ（型番 H6780; Bridgewater,ニュージャージー州）とすることがで
きる。参照側ＰＭＴ１７６が高周波信号に応答できるものである場合には、ヘテ
ロダインステッは、外部ミキサー１８４を使用して行うことができる。参照側Ｐ
ＭＴ１７６の位相および変調度は、ロックインアンプ１８０によって得ることが
でき、試料側ＰＭＴ１７４からの信号を規格化するために使用することができる
。

【００６３】コンピュータまたはプロセッサが、外部部材も含めて、装置を制御する。コン
ピュータは、また、試料の取扱いおよびデータ収集を制御する。一般に、位相お
よび変調度に関するデータは、分析対象物の寿命にとって適切であるような１つ
または複数の周波数において収集される。後述の背景排除モードにおいては、位
相および変調度は、１つまたはいくつかの周波数において測定され、コンピュー
タまたはプロセッサによって処理されて、例えば寿命によって区別された強度と
いったような物理量が計算される。

【００６４】装置９０と装置１６０との双方は、様々な定常状態分析や様々な時間的発光分
析を行うために使用することができる。定常状態分析においては、連続型光源を
使用した一定照射のもとに、発光を測定する。時間的偏光分析においては、連続
型光源を適切に強度変調しつつ使用することにより、あるいは、時間によって変
化する光源を使用することによって、時間の関数として発光を測定する。

【００６５】強度分析は、複合体から放出された発光の強度を観測することによって行うこ
とができる。

【００６６】偏光分析は、以下のようにして行うことができる。連続型光源からの励起光は
、励起光用フィルタと低発光性の光ファイバケーブルと励起光用偏光フィルタと
を通して、導くことができる。その後、励起光は、ビームスプリッタへと導かれ
る。ビームスプリッタにいては、大部分の光が複合体に向けて反射され、励起光
のうちの残りのわずかな光が、光モニタ内へと導かれる。複合体からの発光は、
ビームスプリッタへと戻され、他の低発光性光ファイバケーブルと発光用フィル
タと偏光フィルタ（ＳまたはＰの向きとされている）とを通って導かれ、最終的
には、光増倍管１７４によって検出される。各複合体に対して、２つの測定が行
われる。１つの測定は、励起光用偏光子と発光用偏光子とを互いに向きを揃えた
状態で行われ、他の測定は、励起光用偏光子と発光用偏光子とを互いに向きをク
ロスさせた状態で行われる。各偏光子は、静的なものとも動的なものともするこ
とができ、各偏光子は、Ｓ向きともＰ向きともすることができる。ただし、典型
的には、励起光用偏光子がＳ向きにセットされる。

【００６７】ＦＲＥＴ、ＦＬＴ、ＴＩＲ、ＦＣＳ、ＦＲＡＰといったような他の発光分析や
、それらの燐光モードでの分析は、PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY
と題する上記文献に記載されており当業者には周知の手順を使用して行うことが
できる。

【００６８】３．強度分析本発明による装置および方法は、強度分析において分析対象物と背景とを識別
するために使用することができる。そのような強度分析から派生した背景補正済
み強度は、偏光や発光寿命といった物理量を決定するために、直接的または間接
的に、強度として使用することができる。一般的に言えば、本発明においては、
１つまたは複数の分析対象物と１つまたは複数の背景成分とを備えてなるシステ
ムに対して、背景補正済み強度を決定することができる。

【００６９】［２成分分析］例えば分析対象物と背景といったように２つの検出可能成分を有したシステム
においては、全強度に対する各部材の寄与は、単一の変調角周波数ωにおいて測
定したシステムの強度と位相と変調度とを使用して、決定することができる。本
発明のこの実施形態は、寿命によって区別された強度（ＬＤＩ）と称することが
できる。

【００７０】時間ドメインにおいては、複雑な発光物質の発光または発光物質混合体の発光
は、通常、複数の指数関数の和として減衰する（式６）。

【数６】ここで、Ｉ（ｔ）は、時間依存の発光強度であり、α_i は、指数関数の係数であ
り、τ_i は、第ｉ番目の成分の発光寿命である。各成分に起因する定常的発光強
度成分は、上記式６を時間にわたって積分することによって、得ることができる
（式７）。

【数７】ここで、ｆ_i は、第ｉ番目の成分の強度比率である。

【００７１】周波数ドメインにおいては、複雑な発光物質または発光物質混合体の位相と変
調度とからなるベクトルは、全強度に対しての個々の成分の寄与度合いによって
重みづけされた個々の成分の位相および変調度の合計ベクトルである。

【００７２】図７は、例えば分析対象物と背景といったような２つの発光物質を含有したシ
ステムにおける位相および変調度を示している。システムの位相および変調度は
、ベクトルのＸ、Ｙ成分でもって表すことができる（式８，９）。

【数８】

【数９】ここで、「ｓ」は、システムを表しており、「ｘ」および「ｙ」は、それぞれＸ
成分およびＹ成分を表している。システムのＸ成分およびＹ成分は、分析対象物
のＸ成分およびＹ成分と、背景のＸ成分およびＹ成分と、だけによって表すこと
ができる（式１０，１１）。

【数１０】

【数１１】ここで、「ａ」は、分析対象物を表しており、「ｂ」は、背景を表している。

【００７３】式１０，１１を解くことによって、分析対象物の強度比率および背景の強度比
率を求めることができる。分析対象物の強度比率ｆ_a は、式１２のように求めら
れる。

【数１２】ここで、「ｉ」は、Ｘ成分およびＹ成分に対応して、ｘまたはｙを表している。
式７を使用して強度比率を計算するためには、次の３つの量を知らなければなら
ない。すなわち、システムに対応したＭ_s,x と、分析対象物だけに対応したＭ_a, _x と、背景だけに対応したＭ_b,x と、を知らなければならない。Ｍ_s,x は、各試
料について測定を行うことにより、各試料に対して決定される。Ｍ_a,x は、（１
）背景を『含有せず』かつ分析対象物を含有した（可能であれば高濃度で分析対
象物を含有した）ブランクを使用して変調度を測定することにより、あるいは、
（２）式４，５を使用して変調度を計算するとともに背景なしで上記において測
定された分析対象物寿命を使用することにより、各試料に対してではなく各分析
対象物に対して決定される。分析対象物は、各試料に関して同一であり、背景は
、試料ごとに異なるものと仮定する。Ｍ_b,x は、各試料に対するブランクを測定
することにより、各試料に対して評価される。Ｍ_b,x は、典型的には、試料ごと
に変化する。というのは、背景は、複合体に起因するものと、複合体を取り囲ん
でいるホルダおよび光学系に起因するものと、の双方があるからである。Ｍ_b,x
は、ブランクに関して測定を行い、その測定値が各試料について適用可能である
ことを仮定することにより、評価することができる。

【００７４】本発明による装置および方法においては、ブランクを使用する必要がないよう
な、科学的精密さと簡素さを有した手法を行うことができる。式１０は、背景が
短い寿命を有している場合（ωτ_b ＜＜１）には、ωτ_b の累乗の和に展開する
ことができ（式１３）、背景が長い寿命を有している場合（１／ωτ_b ＜＜１）
には、１／ωτ_b の累乗の和に展開することができる（式１４）。

【数１３】背景が長い寿命を有している場合には、分析対象物の強度比率は、次のようにな
る。

【数１４】

【００７５】式１２，１３は、背景の寿命または強度を知る必要なく、寿命の違いに基づい
て、分析対象物からの光と短寿命または長寿命の背景からの光とを、区別する。
背景の寿命の値が未知である場合には、式１３においては、ωτ_b をゼロにセッ
トする（短寿命の場合）ことによって評価することができ、式１４においては、
ωτ_b を無限大にセットする（長寿命の場合）ことによって評価することができ
る。背景の寿命の値が既知である場合には、式１３，１４は、正確に評価するこ
とができ、改良されたｆ_a の値がもたらされる。

【００７６】式８，９，１１も、また、累乗の和の形式に展開することができる。このよう
にして、様々な等式を決定することができる。例えば、位相をベースとした形式
においては、背景が短寿命である場合には、分析対象物の強度比率は、次式１５
となる。

【数１５】

【００７７】背景の強度および寿命の変化は、ωτ_b が小さい限りにおいては（式１３，１
５）、あるいは、ωτ_b が大きい限りにおいては（式１４）、ｆ_a の決定に影響
を与えることはない。このことは、各成分の寿命が短い限りにおいては（式１３
，１５）あるいは長い限りにおいては（式１４）、背景が複数の成分を有してい
たにしても、当てはまる。この場合、評価式１３〜１５において背景の平均寿命
または実効寿命を使用することが適切である。

【００７８】様々な要因によって、分析対象物と背景との違いを識別するためにどの等式が
最適であるかが決まる。１つの要因は、背景の寿命である。背景の寿命が短けれ
ば、ωτ_b に関して展開された評価式が使用されるべきであり、背景の寿命が長
ければ、１／ωτ_b に関して展開された評価式が使用されるべきである。他の要
因は、背景の寿命が既知であるかどうかである。τ_b が未知であれば、式１３，
１４が寿命に関して２次（および高次）のものであって寿命の値に比較的鈍感で
あることから、一般に、式１３，１４が使用されるべきである。さらに他の要因
は、実験である。平均強度の記録を避けて検出電子回路をＡＣ動作に対して最適
化するためには、一般に、式１５が使用されるべきである。さらに他の要因は、
背景の性質である。背景が短寿命成分と長寿命成分との双方を有している場合に
は、式１３，１５では、長寿命の背景が分析対象物と混同されてしまうことによ
り、分析対象物の強度を過大評価することとなり、また、式１４では、短寿命の
背景が分析対象物と混同されてしまうことにより、分析対象物の強度を過小評価
することとなる。そのような状況においては、３成分分析を使用すべきである。

【００７９】［３成分分析］例えば分析対象物と短寿命背景と長寿命背景といったように３つの検出可能成
分を有したシステムにおいては、全強度に対する各部材の寄与は、２つの変調角
周波数（ω₁，ω₂）において測定したシステムの強度と位相と変調度とを使用し
て、決定することができる。この場合、分析対象物の強度比率は、次式で表され
る。

【数１６】

【数１７】

【数１８】ここで、「ｂｓ」および「ｂｌ」は、それぞれ短寿命背景および長寿命背景を表
している。式１７，１８は、単一の指数関数敵背系に対しては、３次まで正確で
ある。短寿命背景および長寿命背景の一方または双方が複数の成分を備えている
場合には、短寿命成分の平均寿命または実効寿命としてτ_bsを使用すべきであり
、長寿命成分の平均寿命または実効寿命としてτ_blを使用すべきである。本発明
のこの実施形態は、寿命ごとに認識された強度（ＬＲＩ）と称することができる
。

【００８０】［実用的考察］図８は、分析対象物と背景との本発明による区別能力を示すためのシミュレー
ション結果を示している。結果は、式１３（ＬＤＩ、Ｍ_X ベース）、式１５（Ｌ
ＤＩ、φベース）、および、式１６（ＬＲＩ）に記載されているような本発明に
おける３つのゼロ次の実施形態に関して、示されている。誤差は、周波数と分析
対象物寿命とを選択することにより、決定される。分析対象物の寿命と背景の寿
命とが、変調度のＸ成分をベースとした等式に関して１０倍以上相異している場
合には、誤差は、ＨＴＳ応用に際して十分に小さなものである（＜２％）。

【００８１】周波数の選択は、システム誤差を小さくするためにも重要である。寿命を識別
する場合（式１３）においては、周波数は、測定物理量（Ｍ_s、x ）が使用可能
であるように選択されなければならない。Ｍ_s,x における誤差は、決定された強
度比率における大きな不確定性をもたらしてはいけない。分析対象物の強度比率
が大きければ、分析対象物の測定に際して適切なすべての周波数が、使用可能と
なる。例えば、分析対象物が１００ナノ秒という寿命を有している場合には、３
００ｋＨｚ〜８ＭＨｚという範囲におけるすべての周波数が適切である（寿命の
逆数の１／５倍〜５倍）。

【００８２】しかしながら、分析対象物の強度比率が小さければ、周波数選択は、Ｍ_s,x が
短寿命背景によって支配されるということのために、制限される。周波数が小さ
すぎれば、Ｍの値は、上限値（１．０００）にかなり近づくこととなる。Ｍにお
ける誤差としての通常値は、０．００５であろう。誤差をこの程度であると仮定
すれば、Ｍの値が０．９８０よりも大きくなると、Ｍの測定の正確性が不合理な
ものとなってしまう。この上限値は、低周波数を使用不可能とする。３６０ナノ
秒という寿命を有したルテニウム複合化分析対象物と５ナノ秒未満という寿命を
有した背景とに対しては、合理的な周波数は、２〜３ＭＨｚである。

【００８３】寿命に依存するケース（式１６）においては、周波数の選択は、より困難であ
る。大まかに言えば、長い寿命と中間的な寿命とを区別するのに、１つの周波数
が必要であり、さらに、中間的な寿命と短い寿命とを区別するのに、１つの周波
数が必要である。各周波数は、２成分システムに対するものとして選択すること
ができる。しかしながら、周波数を選択するための最適化プログラムを使用すれ
ば、信頼性と確実性とを高めることができる。このプログラムは、短寿命成分の
寿命と長寿命成分の寿命との有限性に基づくシステム誤差を最小化するよう、ま
た、分析対象物の寿命の変化に基づく誤差を最小化するよう、周波数を最適化す
る。

【００８４】［実験的検証］分析対象物に基づく発光強度は、式１２（ＬＤＩ、Ｍ_X ベース）、式１４（Ｌ
ＤＩ、φベース）、および、式１５（ＬＲＩ）、等を使用して、総強度と強度比
率の計算値とを掛算することにより、求めることができる。総強度は、個別に実
験を行うことなく、発光強度の定常状態値から得られる。これらの基本思想を検
証するため、上述のようなマイクロプレート内の試料の測定を行い得る位相変調
度発光計を作製した。この器具は、エピルミネッセンス形態、強度変調された青
色ＬＥＤ、および、ゲイン変調されたＰＭＴを使用する。

【００８５】本発明による装置および方法の、分析対象物と背景との間の識別能力を検証す
るために、実験が行われた。分析対象物は、［Ｒｕ（ｂｐｙ）₃］Ｃｌ₂（ルテニ
ウム・トリ−２，２’−バイピリジル・クロライド）とされ、これは、緩衝液内
において長い寿命を有するものである（ｐＨ７．４の２０ミリモルＰＢＳ中にお
いて２６〜２８℃という温度において３３０ナノ秒と測定された）。背景は、試
料容器、および／または、Ｒ−フィコエリトリンに起因するものである。Ｒ−フ
ィコエリトリンは、意図的な背景汚染物質として使用された。なぜなら、Ｒ−フ
ィコエリトリンの励起スペクトルおよび発光スペクトルが、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ の
励起スペクトルおよび発光スペクトルとオーバーラップするからであり、さらに
、緩衝液内において短い寿命を有するものである（ｐＨ７．４の２０ミリモルＰ
ＢＳ中において２．９ナノ秒と測定された）からである。すべての試料は、２０
ｍＭのＰＢＳおよびｐＨ７．４という条件下で調製された。すべてのデータは、
COSTAR社によるフラットブラック９６個井戸型のマイクロプレートを使用して４
００ミリ秒という積算時間でもって収集された。

【００８６】ルテニウムは、次のようないくつかの理由のために、良好な長寿命プローブで
ある。第１に、ルテニウムが、長寿命を有していること。第２に、ルテニウムは
時に酸素センサとして使用されるけれども、ルテニウムの寿命が、酸素濃度にあ
まり敏感でないこと。このため、ルテニウムの寿命は、良好な酸素センサの割に
、短い。特に、ルテニウムの寿命は、空気平衡した緩衝液内の酸素濃度の通常的
な変動に対して、特に鈍感である。そのため、システムから酸素を除去するため
の特別な手段を講じる必要がない。第３に、ルテニウムが、原子状発光物質であ
ること。そのため、消光（フォトブリーチング）という共通の問題点を受けるこ
とがない。最後に、ルテニウム錯体が、好都合な励起スペクトル（４６０ｎｍピ
ーク）を有し大きな（１４０ｎｍ）ストークスシフト（ストークスシフトとは、
励起光における極大値と発光スペクトルにおける極大値との間の隔離度合いのこ
とである）を示すこと。

【００８７】背景濃度が大きすぎる場合には、背景強度の変動のためにまた試料どうしの間
のばらつきの大きさのために、従来的な背景を差し引くというやり方では、うま
くいかない。試料間における誤差が１％である場合には、背景信号のほんの１％
に過ぎないような強度を有した分析対象物を測定することはできない。信号の存
在を確認するために、３標準偏差ルールを使用することができる。識別可能な最
小信号は、平均背景よりも大きな３標準偏差をなす信号として定義される。背景
差引値の場合には、保証限界は、約４７％という誤差比率（あるいは、変動係数
、ＣＶ）となる（試料と背景との双方は、同じ誤差を有するものと仮定された。
この場合、差は、誤差の３倍となる。；ＣＶ＝３^1/2 ／２）。このような大きな
ＣＶは、定性測定においてのみ使用可能である。定量測定においては、より小さ
なＣＶが要望される。典型的な分散誤差と濃度誤差と器具ドリフトとを加算すれ
ば、数％の誤差となる。これら以外の誤差を考慮すれば、定量分析において１０
％のＣＶを有したものとしてデータを使用することが実用的である。このことは
、正確なデータの限界と見なされる。このような保証限界および精度限界は、背
景差引強度と、寿命によって区別された強度と、寿命ごとに認識された強度と、
からのデータの定量的比較が可能とされる。

【００８８】図９は、一定濃度とされたＲｕ（ｂｐｙ）₃ に対してＲ−フィコエリトリンの
濃度を増大させつつ添加することによって決定された、背景に対しての感度を検
証する実験結果を示している。結果は、分析対象物の強度を一定としつつ総強度
を増大させた一連の溶液に関するものである。すべての溶液は、全く同一に調製
され、それらの平均値における誤差が、予測値と比較された。図９は３つの曲線
を示している。ＬＤＩは、式１３に対応するものであって、２．８５ＧＨｚにお
いて評価された。ＬＲＩは、式１６に対応するものであって、ｆ₁ ＝０．３５Ｍ
Ｈｚおよびｆ₂ ＝４．３３ＭＨｚにおいて評価された。ＢＳＩは、背景を差し引
いた強度に対応するものであって、ブランクを使用して計算された。本方法にお
ける、分析対象物と背景との識別能力は、測定誤差が保証限界を超えるような分
析対象物強度比率によって与えられる。背景差引方法は、分析対象物の強度比率
が１７％を超えなければ、分析対象物と背景とを識別することができない。これ
に対して、ＬＤＩは、分析対象物の強度比率が２％を超えれば、分析対象物と背
景とを識別することができ、ＬＲＩは、分析対象物の強度比率が０．８％未満で
あっても、分析対象物と背景とを識別することができる。したがって、ＬＤＩお
よびＬＲＩは、背景差引方法と比較して、背景発光に対する応答性を１０分の１
未満しか受けることがない。このようにして応答性が低減されるのと同時に、実
験の複雑さも低減される。適切な条件下においては、ＬＤＩおよびＬＲＩでは、
寿命や強度といったような背景発光に関する実験を一切行う必要がない。測定強
度に対する背景の寄与は、背景発光の寿命が短いことのために、単純に除去され
る。

【００８９】図１０は、一定濃度（１ナノモル）とされたＲ−フィコエリトリンに対しＲｕ
（ｂｐｙ）₃ の濃度を増大させつつ添加することによって決定された、分析対象
物に対しての感度を検証する実験結果を示している。結果は、背景強度を一定と
しつつ総強度を増大させた一連の溶液に関するものである。この設定により、背
景中における分析対象物の最小の分析可能な濃度比率を求めることができる。す
べての溶液は、全く同一に調製され、それらの平均値における誤差が、予測値と
比較された。ＬＤＩについては、２．８５ＧＨｚにおいて測定し、ＬＲＩについ
ては、０．３５ＭＨｚと２．８５ＭＨｚとにおいて測定した。方法による差異は
、この場合にも明確である。背景差引方法であると、すぐに分析対象物を分析す
ることができなくなる（１３％という強度比率において、すなわち、１００マイ
クロモルというルテニウム複合体の濃度において）。これに対して、ＬＤＩであ
れば、１％（１０μＭ）という強度比率まで分析対象物強度を正確に報告し、Ｌ
ＲＩであれば、０．７％（５μＭ）未満においても分析対象物強度を正確に報告
する。つまり、ＬＤＩにおいても、ＬＲＩにおいても、分析対象物に対する感度
は、１０倍以上増大したことがわかる。これら一致した結果は、ＬＤＩおよびＬ
ＲＩ測定が、従来の背景差引法に対しての大幅の改良をもたらすことができるこ
とを示唆している。

【００９０】本発明は、確実であり単純でありさらに高速であり高処理速度型スクリーニン
グにとって理想的なものである。ＬＤＩにおいては、ただ１つの周波数における
位相と変調度とを使用することによって、短寿命成分と長寿命成分とを正確に識
別することができる。ＬＲＩにおいては、２つの周波数における位相と変調度と
を使用することによって、３つの寿命成分を正確に識別することができる。また
、さらに多数の成分に対しての拡張も可能である。ある１つの成分の寿命に関す
る知識を使用することによって、他の成分の寿命や強度を決定する必要なく、各
成分の強度を決定することができる。

【００９１】４．偏光分析本発明による装置および方法は、偏光分析において分析対象物と背景とを識別
するために使用することもできる。一般に、本発明においては、１つ以上の分析
対象物成分と１つ以上の背景成分とを有したシステムに関して、背景を補正した
偏光を決定することができる。

【００９２】背景補正済みの定常状態での偏光（あるいは、異方性）は、式１を使用して決
定することができる。この場合、Ｉ‖ およびＩ⊥ は、平行なおよび垂直な励起
光用および発光用の偏光子を適切に組み合わせるとともに背景補正強度の計算の
ために上述した本発明による装置および方法を使用することによって、決定する
ことができる。このような補正は重要である。なぜなら、定常状態での異方性は
、存在しているすべての成分の異方性についての、強度による重み付き平均であ
って、そのため、背景が、測定された異方性に直接的な影響を与えるからである
。

【００９３】背景を補正した時間的偏光（あるいは、異方性）は、時間ドメイン法を使用し
て、または、周波数ドメイン法において、行うことができる。時間ドメインにお
いては、背景補正偏光は、式１を使用して決定することができる。この場合には
、Ｉ‖ およびＩ⊥ は、それぞれ、Ｉ‖（ｔ）およびＩ⊥（ｔ）として取り扱
われる。周波数ドメインにおいては、背景補正偏光は、平行なおよび垂直な位相
φ_p 、および、平行なおよび垂直な変調度Ｍ_p の適切な組合せを使用することに
よって、決定することができる。ここで、「ｐ」は、平行成分または垂直成分に
対応して、平行または垂直を表している。φ_p およびＭ_p は、平行偏光子または
垂直偏光子を適切に使用したときのφおよびＭとして、同一の装置および方法を
使用して決定することができる。φ_p およびＭ_p は、ωおよびＩ（ｔ）を使用し
て次のように表すことができる（式１９〜２３）。

【数１９】

【数２０】

【数２１】

【数２２】

【数２３】

【００９４】実験結果は、偏光した発光の平行ＡＣ成分と垂直ＡＣ成分との間の、位相差Δ
ωおよび比Λωを使用して解析することができる（式２４，２５）。

【数２４】

【数２５】 Λωは、変調された異方性と称される周波数依存性物理量ｒωを決定するために
使用することができる（式２６）。

【数２６】ｒωは、高周波数においては異方性の基本成分ｒ₀ に近づき、低周波数において
は定常状態での異方性ｒ_ssに近づく。

【００９５】周波数ドメインにおける時間的偏光を使用することにより、定常状態での偏光
の場合よりも詳細に生物学的分子の動き特性を調べることができる。例えば、生
物物理学的モデルを使用することにより、寿命や回転相関時間といったようなパ
ラメータを使用してＩ‖（ｔ）およびＩ⊥（ｔ）の関数形態を生成することが
できる。このモデルを使用することにより、ΔωおよびΛωを予測することがで
きる。そして、実験を行って、１つまたは複数の変調周波数におけるΔωおよび
Λωを測定することができる。ΔωおよびΛωまたはｒωの予測値と観測値とを
最適に適合させるようにパラメータを調節することによって、例えば非線形最小
二乗法アルゴリズムを使用するといったようにしてパラメータを調節することに
よって、実験結果をモデルに適合させることができる。

【００９６】これに代えて、より単純な手法を使用することができる。つまり、１つまたは
数個の周波数において実験を行い、モデルの詳細な最適化を行うのではなく、実
験結果を解析するという、より単純な手法を使用することができる。この手法は
、分子移動度の重大な変化を、十分迅速に分析することができる。例えば結合時
に発生するような分子移動度の重大な変化を、十分迅速に分析することができる
。このような結合は、分析の一部としてのターゲット分子に対する結合や、試料
容器に壁に対する結合、等とすることができる。

【００９７】図１１は、背景が存在しない場合における、単純な結合システムの、Δω（図
１１Ａ）およびｒω（図１１Ｂ）のωに対する依存性を示している。ここで、ラ
ベル分子は、異方性の基本成分がｒ₀ ＝０．３であり、発光寿命がτ＝１００ナ
ノ秒であり、回転相関時間が、自由状態においてはτ_rot ＝１０ナノ秒であって
拘束状態においては１０００ナノ秒である。図１１は、０％、２５％、５０％、
７５％、および、１００％という結合度に関しての結果が示されている。ラベル
分子の結合の進み具合は、適切な単一の周波数（例えば、Δωに対しては約２０
ＭＨｚ、ｒωに対しては約１０ＭＨｚ未満）においてΔωおよびｒωを測定しそ
の後経験的校正曲線から結合度合いを読み取ることにより、迅速にかつ感度良く
決定することができる。これに代えて、結合によって分析対象物の寿命が変化す
る場合には、結合を、ＬＤＩやＬＲＩ等を使用して決定することができる。

【００９８】図１２は、背景が５０％存在する場合における、単純な結合システムの、Δω
（図１２Ａ）およびｒω（図１２Ｂ）のωに対する依存性を示している。ここで
、背景は、異方性の基本成分がｒ₀ ＝０．３であり、発光寿命がτ＝１ナノ秒で
あり、回転相関時間がτ_rot ＝０．１ナノ秒である。このような状況は、長寿命
の分析対象物と短寿命の背景とからなる複合体に対応している。この場合、背景
の実効的発光寿命は、通常は短く、おおよそ０．１〜１０ナノ秒である。うまく
ないことに、図１１と図１２とを比較すると、Δωについてもまたｒωについて
も、背景からの影響を受けないような周波数が存在しないことがわかる。このこ
とは、Δωまたはｒωの有用性を大幅に減少させる。特に、背景が試料ごとに変
化し、これを一般的に校正曲線内に包含させることができないことにより、Δω
またはｒωの有用性を大幅に減少させる。

【００９９】このような欠点は、本発明によって克服される。すなわち、本発明は、ブラン
クからの情報を必要とすることなくかつ背景の寿命や強度の決定を必要とするこ
となく、分析対象物と背景とを良好に識別するような代替可能な関数を提供する
。『正弦関数』および『カッパ関数』と称されるそのような２つの関数につき、
以下説明する。

【０１００】［正弦関数］正弦関数Ψωは、平行相の正弦および垂直相の正弦のそれぞれによって重みづ
けした水平ＡＣ強度と垂直ＡＣ強度との比である（式２７）。

【数２７】 Ψωは、関連する水平測定および垂直測定における強度減衰の正弦フーリエ変換
Ｎｐωの比として示すことができる。このために、単純な三角関数の関係φｐω
＝ｔａｎ^-1（Ｎｐω／Ｄｐω）を使用すれば、式２８が得られる。

【数２８】 Λωを規定する式２８を使用すれば、式２９が得られる。

【数２９】

【０１０１】図１３は、背景が０％および５０％存在した場合における、図１１および図１
２のシステムについての、Ψωのωに対する依存性を示している。一般に、周波
数が小さくなるほど、Ψωは、（短寿命）背景からの影響を受けにくくなる。特
に、ωが約１０ＭＨｚ以下のときには、Ψωは、Δωやｒωよりも、背景からの
影響をかなり受けにくい。しかしながら、ωが小さくなると、θ_p も小さくなり
、正弦測定が不正確となる。最適の変調周波数は、これら要因等のバランスによ
って決定されることとなる。

【０１０２】短寿命信号に対してのΨωの振舞いは、次のように理解することができる。各
々が単一の発光寿命τ_i と単一の回転相関時間τ_rot,i とを有したｎ個の分子成
分が存在しているものと仮定する。定常状態発光強度（偏光子なし）に対しての
各成分の寄与比率は、式７によって与えられる。時間ドメインにおいては、各成
分の異方性は、式３０によって与えられる。

【数３０】標準的な次式３１を考慮すれば、

【数３１】正弦フーリエ関数は、式（３２，３３）となる。

【数３２】

【数３３】ここで、Ｌ（ｘ）＝ｘ／（１＋ｘ²）である。｜ｘ｜＜＜１においては、Ｌ（ｘ
）〜ｘであり、また、Ｌ（０）＝０である。Ｌ（ｘ）は、ｘ＝１において最大値
１／２となる。｜ｘ｜＞＞１においては、Ｌ（ｘ）〜１／ｘであり、また、Ｌ（
∞）＝０である。回転相関時間は、次式３４によってのみシステムに組み込まれ
る。

【数３４】

【０１０３】ｍｉｎ（τ_i，θ_i）／２≦σ_i＜ｍｉｎ（τ_i，θ_i）であることにより、σは
、常に、τまたはσのいずれかよりも小さい。σ_i／τ_iという比は、σ_i／τ_i＝
θ_i／（τ_i＋θ_i）＜１である。Ψωは、Ｎの比を考慮しα_iτ_i＝ｆ_iΣα_jτ_j
という関係を適用することにより形成することができる（式３５）。

【数３５】ここで、和を規格化すれば、すべての項がキャンセルされる。

【０１０４】小さなｘに対してのＬ（ｘ）の振舞いに基づいて、Ψωは、ωτ_iまたはωσ_i 〜１という信号とは違って、短寿命種（ωτ_iまたはωσ_i＜＜１）からの信号に
対しては、小さな重みを与える。Ψωは、また、極度に短い回転相関時間を有し
た（すなわち、ωσ_i ＜＜１、σ_i／τ_i＜＜１）長寿命成分の異方性寄与に対し
ても、小さな重みを与える。

【０１０５】［カッパ関数］カッパ関数Ｋωは、平行相の余弦および垂直相の余弦のそれぞれによって部分
的に重みづけされた水平ＡＣ強度と垂直ＡＣ強度とを含んだ比である（式３６）
。

【数３６】Ｋωは、上記と同様に、関連する水平測定および垂直測定における寿命によって
区別された強度を含んだ比として示すことができる（式３７）。

【数３７】Ｋωに対しての式３７とｒに対しての式２とを比較すればわかるように、式３７
は、異方性の式と類似している。

【０１０６】図１４は、背景が０％（実線）および９０％（破線）存在した場合における、
図１１および図１２のシステムについての、Ｋωのωに対する依存性を示してい
る。ＫωがΨωよりも低周波数において敏感でなくまた大きな結合力に対して敏
感ではないことを除いては、Ｋωに対する結果は、Ψωに対する結果と同様であ
る。カッパ関数も正弦関数も背景の性質に依存することがなく、そのため、いず
れの関数においても、ブランクを使用する必要がなく、また、背景の寿命や強度
を決定する必要もない。

【０１０７】５．参照化合物本発明による装置および方法ならびに複合体を使用すれば、参照化合物を使用
することによって、分析対象物の信号を、散乱や吸収や、背景等の他の変動要因
に関して、修正することができる。このような修正は、強度や偏光等に影響を与
える。

【０１０８】本発明によって提供される複合体は、互いに大幅にオーバーラップした発光ス
ペクトルを有しているものの寿命ごとに認識するという方法を使用して各発光が
認識されるような第１および第２発光物質を備えることができる。第１および第
２発光物質は、分析対象物と参照化合物とを備えることができる。分析対象物は
、分析に関係するように構成することができ、参照化合物は、分析に関係するよ
うに構成することができ、参照化合物は、分析どうしの間において不活性である
とともに分析どうしの間において一定であるように構成することができる。

【０１０９】本発明による装置は、ステージと、光源と、検出器と、プロセッサと、第１お
よび第２光学的リレー構造と、を具備することができる。これら部材は、実質的
に上述のものと同じであり、特に、複合体の支持に関して、複合体からの発光の
誘導に関して、発光の検出や発光から信号への変換に関して、実質的に上述のも
のと同じである。発光には、蛍光と燐光とが含まれている。

【０１１０】プロセッサは、信号に含まれている情報を使用することによって、分析対象物
による発光強度と参照化合物による発光強度とを決定することができる。分析対
象物と参照化合物とは、寿命ごとに認識するという方法によって分析可能な発光
寿命を有している。そのため、分析対象物による発光強度と参照化合物による発
光強度とは、寿命ごとに認識するという方法によって決定することができる。こ
のような方法は、例えば分析対象物と背景との区別のための上述したものといっ
たような、周波数ドメイン法を含むことができる。

【０１１１】例えば散乱や吸収といったような信号変調の存在下においては、複合体から検
出される光の見かけの強度Ｉ_c’は、透過係数Ｔと、複合体による発光の真の強
度Ｉ_c と、の積に等しい（次式）。

【数３８】透過係数は、励起光の変動からの寄与と、発光の変動からの寄与と、を含んでい
る。透過係数は、典型的には（常にそうではないが）、０〜１の範囲である。

【０１１２】複合体が分析対象物と参照化合物との双方を含有している場合には、複合体の
見かけの強度は、透過係数と、分析対象物の真の強度Ｉ_a と参照化合物の真の強
度Ｉ_r の和と、の積に等しい（次式）。

【数３９】

【０１１３】分析対象物の見かけの強度Ｉ_a’は、複合体の見かけの強度と、参照化合物の
見かけの強度と、の差に等しい。同様に、参照化合物の見かけの強度Ｉ_r’は、
複合体の見かけの強度と、分析対象物の見かけの強度と、の差に等しい。

【０１１４】これら強度は、ＬＤＩやＬＲＩ法等を使用して計算することができる。例えば
、典型的な実験では、短寿命の分析対象物と、長寿命の参照化合物と、が使用さ
れる。ただし、他の組合せであっても使用可能である。この場合、分析対象物の
見かけの強度は、参照化合物を実質的に長寿命背景として取り扱って式１４を適
用することにより、計算することができる（次式）。

【数４０】

【０１１５】同様に、参照化合物の見かけの強度は、分析対象物をを実質的に短寿命背景と
して取り扱って式１３を適用することにより、計算することができる（次式）。

【数４１】

【０１１６】また、プロセッサは、信号に含まれている情報を使用することによって、参照
化合物の強度の関数として分析対象物の強度を表現するような量を計算すること
ができる。この量は、分析対象物による強度の、参照化合物等の強度に対しての
比である（次式）。

【数４２】

【０１１７】このような比は、試料内の変調度に無関係である。したがって、例えば各試料
が同一濃度の参照化合物を含んでいるならば、上記の比は、一連の試料をなす各
試料に対して同等となる。

【０１１８】また、プロセッサは、上記のような２つの周波数による寿命ごとに認識すると
いう方法を使用することによって（例えば、式１６）、３つのものが互いに異な
る寿命を有している場合には、分析対象物による発光と、参照化合物による発光
と、背景と、を識別することができる。

【０１１９】本発明による方法は、様々なステップからなるものであって、（１）分析対象
物と参照化合物とを含有した複合体を準備し、（２）複合体を照光し、これによ
り、分析対象物と参照化合物とからの発光を引き起こし、（３）分析対象物およ
び参照化合物からの発光を検出して、これを信号へと変換し、（４）信号を処理
することによって、分析対象物からの光の強度と参照化合物からの光の強度とを
決定し、（５）参照化合物からの光の強度の関数として分析対象物の強度を表現
するような量を計算する。本方法は、付加的なあるいは代替可能な複数のステッ
プを含有することができる。本方法は、上記の装置を使用して実施することがで
きる。

【０１２０】本発明は、多岐にわたる分析対象物や参照化合物や背景を取り扱うことができ
る。一般に、参照化合物の励起スペクトルおよび発光スペクトルは、分析対象物
の励起スペクトルおよび発光スペクトルと同一であるべきである。そのため、参
照化合物の強度は、分析対象物の強度と同じだけ変調されることとなる（発光の
検出を変調するような要因は、一般に、波長依存性であることにより、分析対象
物と異なるスペクトルを有した参照化合物は、部分的な解だけをもたらすことが
最良である）。最適な分析のためには、参照化合物の寿命は、分析対象物の寿命
よりも著しく大きいかあるいは著しく小さいかのいずれかであるべきであり、参
照化合物の寿命および分析対象物の寿命は、背景の寿命よりも大きいべきである
。また、最適な分析のためには、背景の特定の寿命が、ある範囲に制限されるべ
きである。このような状況は、商業的に興味のある大部分の分析に対して当ては
まる。例えば、たいていの高処理速度型分析においては、マイクロプレートおよ
び分析部材に起因する背景の寿命は、１０ｎｍ以下である。これらは、好ましい
状況である。上述の寿命ごとに認識するという方法が敏感であることにより、実
際に必要とされる複合体は、少量の参照化合物を含有しているだけで良く（大ま
かには、総強度の２％）、分析対象物の寿命と参照化合物の寿命と背景の寿命と
を、同様に分析することができる。

【０１２１】参照化合物は、様々なメカニズムを使用して複合体内に組み込むことができる
。参照化合物は、例えば複合体内に参照化合物を溶解させるあるいは（例えばミ
セルとして）懸濁させることによって、直接的に複合体内に組み込むことができ
る。参照化合物は、例えばビーズや他のキャリアやあるいは複合体に関連した試
料容器の内面や上面に参照化合物を組み込むことによって、間接的に複合体内に
組み込むことができる。

【０１２２】ビーズや他のキャリアに対して参照化合物を組み込むことは、多くの利点を有
している。キャリアは、複合体内に懸架することができる、あるいは、複合体を
収容している試料容器の底部に沈ませておくことができる。キャリアは、また、
例えばビオチン−ストレプタバジン（biotin-streptavadin）といったような化
学結合によって、試料容器の壁または底壁に対して取り付けることもできる。ま
た、キャリアは、磁化したものとすることもできる。その場合には、キャリアを
試料容器の一部（例えば、一方サイドや底部）に引きつけることができ、参照化
合物を含めた状態でまた参照化合物を含まない状態で、複合体を分析できるよう
になる。

【０１２３】試料容器に対して参照化合物を組み込むことは、多くの利点を有している。参
照化合物は、試料容器の表面上に層状として形成することができ、あるいは、試
料容器を形成するために使用されているプラスチックや他の材質内に形成するこ
とができる。そのような手段であると、複合体に対して参照化合物を添加する必
要がなく、参照化合物が複合体の成分と相互作用を起こすことを防止でき、関連
する分析に対して影響が出ることを防止することができる。

【０１２４】６．結論本発明は、分光分析における信号分解能を改良させ得るような、装置および方
法ならびに複合体を提供する。このような改良は、ブランクからの情報を使用し
なくてもまた背景の寿命や強度を決定しなくても、得ることができる。また、こ
れら改良は、分析対象物からの発光を検出するのと同時に検出器によってかなり
の量の背景が検出されるかどうかにかかわらずまた検出されたにしても、得るこ
とができる。したがって、本発明においては、単一の試料容器内において行われ
る測定において、分析対象物と背景と分析対象をなさない他の発光体とを、区別
することができる。本発明においては、また、光の検出と解析とを連続的に行う
ことができる。そのため、信号が無駄にならず、データ収集が遅れることがない
。

【０１２５】本発明につき好ましい形態に関して説明してきたけれども、ここで説明し例示
した本発明の特定の実施形態は、様々な変形が可能であって、本発明を制限する
ものではない。出願人は、本発明の主題を、ここで説明した様々な部材や特徴点
や機能や性質の、すべての新規なかつ非自明な組合せおよび部分的組合せを包含
するものとして捉えている。説明した実施形態の単一の特徴点や機能や部材や性
質は、重要ではない。請求範囲は、新規かつ非自明と見なされるような、特徴点
や機能や部材や性質のある種の組合せや部分的組合せを規定している。出願時点
での請求項を補正することによって、他の組合せや部分的組合せを主張すること
もできる。また、本出願においてあるいは関連出願において、新たな請求項を提
示することもできる。それら請求項は、当初請求範囲と比較してより広いかある
いはより狭いかあるいは同等であるかにかかわらず、本発明の主題内に包含され
るものと見なされる。

【図面の簡単な説明】

【図１】周波数ドメインにおける時間的測定を示す概略的なグラフであっ
て、位相角度（位相）φと復調因子（変調）Ｍとの定義を示している。

【図２】本発明による複合体において分析対象物からの発光を検出するた
めの装置を概略的に示す図である。

【図３】図２に示す装置の一部を概略的に示す斜視図である。

【図４】図２の装置における各光学部材を概略的に示す図である。

【図５】図２の装置のためのハウジングの一部を示す部分展開図である。

【図６】本発明による複合体において分析対象物からの発光を検出するた
めの代替可能な装置を概略的に示す図である。

【図７】分析対象物と背景とからなるシステムに関して、位相ベクトルと
変調ベクトルとを示すベクトル図である。

【図８】式１３（ＬＤＩ、Ｍ_X ベース）、式１５（ＬＤＩ、φベース）、
および、式１６（ＬＲＩ）に記載されているような本発明における３つのゼロ次
の実施形態に関して、分析対象物と背景との本発明による識別方法を表している
シミュレーション結果を示すグラフである。

【図９】分析対象物濃度を一定としかつ背景濃度を増大させた場合に、長
寿命ルテニウム錯体化分析対象物と短寿命Ｒ−フィコエリトリン背景との本発明
による識別方法を表している実験結果を示すグラフである。

【図１０】背景濃度を一定としかつ分析対象物濃度を増大させた場合に、
長寿命ルテニウム錯体化分析対象物と短寿命Ｒ−フィコエリトリン背景との本発
明による識別方法を表している実験結果を示すグラフである。

【図１１】０〜１００％の結合に関し、０％背景の場合に周波数ドメイン
における結合実験において、位相（図１１Ａ）と変調された異方性（図１１Ｂ）
とに対して結合が与える影響を表しているシミュレーション結果を示すグラフで
ある。

【図１２】５０％背景の場合に図１１と同様の周波数ドメインにおける結
合実験において、位相（図１２Ａ）と変調された異方性（図１２Ｂ）とに対して
結合が与える影響を表しているシミュレーション結果を示すグラフである。

【図１３】０〜１００％の結合に関し、図１１と同様の周波数ドメインに
おけるを実験において、０％背景（実線）と５０％背景（破線）とについて、Ψ
ωに対して結合が与える影響を表しているシミュレーション結果を示すグラフで
ある。

【図１４】図１１と同様の周波数ドメインにおける実験において、０％背
景（実線）と９０％背景（破線）とについて、Ｋωに対して結合が与える影響を
表しているシミュレーション結果を示すグラフである。

【符号の説明】

１００連続型の光源１０２時間変調光源１０４励起光干渉フィルタ１０６励起光用フィルタホイール１０８励起光用光学シャトル１１０ａ励起光用光ファイバケーブル１１０ｂ励起光用光ファイバケーブル１１２ａ上側光学ヘッド１１２ｂ下側光学ヘッド１１４励起光用偏光子１１８ビームスプリッタ１２０複合体１２２光モニタ１２３ステージ１３２発光用偏光子１３４ａ発光用光ファイバケーブル１３４ｂ発光用光ファイバケーブル１３６発光用光学シャトル１４４発光検出器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０７５，８０６ (32)優先日平成10年２月24日(1998．2．24) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／０６２，４７２ (32)優先日平成10年４月17日(1998．4．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０８４，１６７ (32)優先日平成10年５月４日(1998．5．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／１６０，５３３ (32)優先日平成10年９月24日(1998．9．24) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号ＵＳ９８２３０９５ (32)優先日平成10年10月30日(1998．10．30) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者トッド・イー・フレンチアメリカ合衆国・カリフォルニア・ 95014・カパティーノ・ブレンダ・コート・19975 (72)発明者ジョン・シー・オウィッキアメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94303・パロ・アルト・ノース・カリフォルニア・アベニュ・956 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 AA04 AA06 BA07 BA16 DA06 EA01 EA02 EA13 FA03 FA07 HA05 HA07 HA09 HA15 JA03 KA01 KA02 KA03 KA09 LA01 LA02 MA01 MA11 NA01 NA02 NA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための装
置であって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号内に含まれた情報を使用することにより、前記信号の中から、前記分
析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、分析対象をなさない非分
析対象発光体によって放出された光に起因する第２部分とを、前記非分析対象発
光体からの光の寿命や強度を決定することなく、識別することができるような、
プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項２】請求項１記載の装置において、前記非分析対象発光体の少なくとも一部が、前記検出器によって検出されるべ
き前記分析対象物からの光に寄与しないような光を引き起こす背景を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項３】請求項１記載の装置において、前記非分析対象発光体の少なくとも一部が、参照化合物を備え、前記プロセッサは、前記参照化合物の強度の関数として前記分析対象物の強度
を表現するような量を計算することを特徴とする装置。
【請求項４】請求項３記載の装置において、前記プロセッサは、さらに、前記信号の中から、背景を含んだ第２非分析対象
発光体に起因するような第３部分を識別することを特徴とする装置。
【請求項５】請求項３記載の装置において、前記参照化合物の強度が、光の吸収効果または散乱効果を示すものであること
を特徴とする装置。
【請求項６】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための装
置であって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号内に含まれた情報を使用することにより、前記信号の中から、前記分
析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、背景に起因する第２部分
とを、前記背景の寿命や強度を決定することなく、識別することができるような
、プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項７】請求項６記載の装置において、前記プロセッサは、ブランクから得られる情報を使用することなく、前記信号
の前記第１部分と前記第２部分とを識別することを特徴とする装置。
【請求項８】請求項６記載の装置において、前記プロセッサは、前記分析対象物からの発光を検出するのと同時に前記検出
器によってかなりの量の前記背景が検出されるかどうかにかかわらず、前記信号
の前記第１部分と前記第２部分とを識別することを特徴とする装置。
【請求項９】請求項６記載の装置において、前記プロセッサは、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別し、これ
により、前記分析対象物の発光寿命を計算することを特徴とする装置。
【請求項１０】請求項６記載の装置において、前記プロセッサは、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別し、これ
により、前記分析対象物からの光の強度を計算することを特徴とする装置。
【請求項１１】請求項６記載の装置において、前記第１光学リレー構造が、励起光用偏光子を備え、前記第２光学リレー構造が、発光用偏光子を備え、前記プロセッサは、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別し、これ
により、前記分析対象物からの光の偏光を計算することを特徴とする装置。
【請求項１２】請求項１１記載の装置において、前記分析対象物が、回転移動度によって互いに識別可能な２つの成分を備え、前記プロセッサは、前記分析対象物からの光の偏光を使用することによって、
前記分析対象物の中の異なる成分の発光に基づく各信号成分を識別することを特
徴とする装置。
【請求項１３】請求項６記載の装置において、前記プロセッサは、前記信号内に含まれている情報を使用することにより、周
波数ドメイン内において、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別する
ことを特徴とする装置。
【請求項１４】請求項１３記載の装置において、前記信号内に含まれている情報が、周波数ドメイン内における情報であること
を特徴とする装置。
【請求項１５】請求項１３記載の装置において、前記信号内に含まれている情報が、時間ドメイン内における情報であり、前記プロセッサは、前記時間ドメイン内の情報を周波数ドメイン内における情
報へと変換することを特徴とする装置。
【請求項１６】請求項１３記載の装置において、前記プロセッサは、位相情報あるいは変調度情報あるいはこれら両方の情報を
使用することにより、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別すること
を特徴とする装置。
【請求項１７】請求項６記載の装置において、前記分析対象物からの光の波長が、２００〜１０００ｎｍの範囲であることを
特徴とする装置。
【請求項１８】請求項６記載の装置において、前記分析対象物からの光が、蛍光および燐光のうちのいずれか一方を少なくと
も含んでいることを特徴とする装置。
【請求項１９】請求項６記載の装置において、前記分析対象物が、第１分析対象物であり、前記背景が、第２分析対象物であることを特徴とする装置。
【請求項２０】請求項６記載の装置において、前記複合体が、参照化合物を含有し、前記分析対象物と前記参照化合物との双方が、前記光源によって励起されて発
光し、前記プロセッサは、前記信号を使用することにより、前記参照化合物の強度の
関数として前記分析対象物の強度を表現するような量を計算することを特徴とす
る装置。
【請求項２１】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
装置であって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号内に含まれた情報を使用することにより、前記信号の中から、前記分
析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、背景に起因する第２部分
とを、ブランクから得られる情報を使用することなく、かつ、前記分析対象物か
らの発光を検出するのと同時に前記検出器によってかなりの量の前記背景が検出
されるかどうかにかかわらず、識別することができるような、プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項２２】請求項２１記載の装置において、前記プロセッサは、前記検出器から受け取った情報を使用することにより、周
波数ドメイン内において、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別する
ことを特徴とする装置。
【請求項２３】請求項２１記載の装置において、前記分析対象物の寿命が、前記背景の実効寿命の少なくとも２倍であることを
特徴とする装置。
【請求項２４】請求項２１記載の装置において、前記分析対象物の寿命が、前記背景の実効寿命の２分の１未満であることを特
徴とする装置。
【請求項２５】請求項２１記載の装置において、前記背景が、前記分析対象物の寿命よりも短い寿命および前記分析対象物の寿
命よりも長い寿命という２つの実効寿命によって特徴づけられていることを特徴
とする装置。
【請求項２６】請求項２５記載の装置において、前記分析対象物の寿命が、前記背景の短い方の実効寿命の少なくとも２倍であ
り、かつ、前記背景の長い方の実効寿命の２分の１未満であることを特徴とする
装置。
【請求項２７】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
装置であって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号内に含まれた情報を使用することにより、前記信号の中から、前記分
析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、背景に起因する第２部分
とを、前記背景の強度を決定することなく、周波数ドメインにおいて、識別する
ことができるような、プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項２８】請求項２７記載の装置において、前記プロセッサは、ただ１つの周波数に対応した周波数ドメイン情報を使用す
ることにより、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別することを特徴
とする装置。
【請求項２９】請求項２７記載の装置において、前記背景が、前記分析対象物の寿命よりも短い寿命および前記分析対象物の寿
命よりも長い寿命という２つの実効寿命によって特徴づけられており、前記プロセッサは、２つの周波数に対応した周波数ドメイン情報を使用するこ
とにより、前記信号の前記第１部分と前記第２部分とを識別することを特徴とす
る装置。
【請求項３０】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
装置であって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号内に含まれた情報を使用することにより、前記信号の中から、前記分
析対象物によって放出された光に起因する第１部分と、背景に起因する第２部分
とを、ブランクから得られる情報を使用することなく、周波数ドメインにおいて
、識別することができるような、プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項３１】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
装置であって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号の中から、前記分析対象物によって放出された光に起因する第１部分
と、背景に起因する第２部分とを、周波数ドメインにおいて識別することにより
、前記分析対象物からの光の強度を決定することができるような、プロセッサと
；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項３２】請求項３１記載の装置において、前記強度が、定常状態における強度であることを特徴とする装置。
【請求項３３】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
装置であって、前記複合体が、互いに異なる偏光を有した第１成分と第２成分とを有した前記
分析対象物を備えている場合に、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
を励起して発光させるための第１光学リレー構造であって励起光用偏光子を有し
た第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
であって発光用偏光子を有した第２光学リレー構造と；前記複合体からの光に関しての情報を使用することによって、前記第１成分お
よび前記第２成分に属する分子の相対比率に関連した量であって背景の存在によ
って影響を受けないような量を計算することにより、前記第１成分と前記第２成
分とを識別することができるような、プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項３４】請求項３３記載の装置において、前記プロセッサは、前記背景と、前記分析対象物の前記第１成分および前記第
２成分と、を識別することができることを特徴とする装置。
【請求項３５】請求項３３記載の装置において、前記偏光が、発光寿命に依存したものであり、前記プロセッサは、前記第１成分の発光寿命と前記第２成分の発光寿命との間
の相異に基づいて、前記第１成分からの光と、前記第２成分からの光と、を識別
することができることを特徴とする装置。
【請求項３６】請求項３３記載の装置において、前記偏光が、回転移動度に依存したものであり、前記プロセッサは、前記第１成分の回転移動度と前記第２成分の回転移動度と
の間の相異に基づいて、前記第１成分からの光と、前記第２成分からの光と、を
識別することができることを特徴とする装置。
【請求項３７】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
方法であって、前記複合体を照光することにより、前記分析対象物からの発光を引き起こし；前記複合体からの光を検出して、検出した光を信号へと変換し；信号を処理することによって、前記信号の中から、前記分析対象物によって放
出された光に起因する第１部分と、背景に起因する第２部分とを、前記背景の寿
命および強度を決定することなく、識別する；ことを特徴とする方法。
【請求項３８】請求項３７記載の方法において、信号を処理する前記ステップにおいては、寿命ごとに認識するという方法を使
用することを特徴とする方法。
【請求項３９】請求項３７記載の方法において、信号を処理する前記ステップにおいては、周波数ドメインにおける方法を使用
することを特徴とする方法。
【請求項４０】複合体内の分析対象物から放出された光を検出するための
方法であって、前記複合体を照光することにより、前記分析対象物からの発光を引き起こし；前記複合体からの光を検出して、検出した光を信号へと変換し；信号を処理することによって、前記信号の中から、前記分析対象物によって放
出された光に起因する第１部分と、背景に起因する第２部分とを、ブランクから
得られる情報を使用することなく、識別する；ことを特徴とする方法。
【請求項４１】発光性分析対象物と発光性参照化合物とを備えてなる複合
体の中の前記発光性分析対象物から放出された光の強度を決定するための装置で
あって、前記複合体を支持するためのステージと；光源と、該光源からの光を前記複合体に向けて導くことにより前記分析対象物
および前記参照化合物を励起して発光させるための第１光学リレー構造と；検出器と、前記複合体からの光を前記検出器に向けて導くことにより前記複合
体からの光を検出可能として信号へと変換可能とするための第２光学リレー構造
と；前記信号内に含まれた情報を使用して、寿命ごとに認識するという方法を使用
することによって、前記参照化合物からの光の強度の関数として、前記分析対象
物からの光の強度を決定することができるような、プロセッサと；を具備していることを特徴とする装置。
【請求項４２】請求項４１記載の装置において、前記プロセッサは、前記分析対象物からの光の強度の、前記参照化合物からの
光の強度に対しての比を計算することを特徴とする装置。
【請求項４３】請求項４１記載の装置において、前記プロセッサは、前記背景と、前記分析対象物および前記参照化合物からの
光と、を区別することができることを特徴とする装置。
【請求項４４】発光性分析対象物と発光性参照化合物とを備えてなる複合
体の中の前記発光性分析対象物から放出された光の強度を決定するための方法で
あって、前記複合体を調製し；前記複合体を照光することにより、前記分析対象物および前記参照化合物から
の発光を引き起こし；前記分析対象物および前記参照化合物からの光を検出して、検出した光を信号
へと変換し；前記信号を処理して、寿命ごとに認識するという方法を使用することによって
、前記参照化合物からの光の強度の関数として、前記分析対象物からの光の強度
を決定する；ことを特徴とする方法。
【請求項４５】請求項４４記載の方法において、信号を処理する前記ステップにおいては、前記分析対象物からの光の強度の、
前記参照化合物からの光の強度に対しての比を計算することを特徴とする方法。
【請求項４６】請求項４４記載の方法において、さらに、前記背景と、前記分析対象物および前記参照化合物からの光と、を区
別することを特徴とする方法。
【請求項４７】請求項４４記載の方法において、前記分析対象物の発光スペクトルと前記参照化合物の発光スペクトルとが、大
幅にオーバーラップしたものであることを特徴とする方法。
【請求項４８】請求項４４記載の方法において、前記分析対象物の励起スペクトルと前記参照化合物の励起スペクトルとが、大
幅にオーバーラップしたものであることを特徴とする方法。
【請求項４９】請求項４４記載の方法において、寿命ごとに認識するという前記方法においては、周波数ドメインにおける方法
を使用することを特徴とする方法。
【請求項５０】請求項４４記載の方法において、前記分析対象物からの光が、蛍光および燐光のうちのいずれか一方を少なくと
も含んでいることを特徴とする方法。
【請求項５１】第１および第２発光物質を含有した複合体であって、前記第１および第２発光物質は、それぞれの発光スペクトルが互いに大幅にオ
ーバーラップしたものであり、前記第１発光物質からの発光は、寿命ごとに識別する方法を使用して、前記第
２発光物質からの発光に対して識別可能とされていることを特徴とする複合体。
【請求項５２】請求項５１記載の複合体において、寿命ごとに認識するという前記方法においては、周波数ドメインにおける方法
を使用することを特徴とする複合体。
【請求項５３】請求項５２記載の複合体において、前記第２発光物質からの光が、光の吸収効果または散乱効果を示すものである
ことを特徴とする複合体。
【請求項５４】請求項５１記載の複合体において、前記第１発光物質が、分析対象物であり、前記第２発光物質が、参照化合物であることを特徴とする複合体。
【請求項５５】請求項５１記載の複合体において、さらに、反応剤を含有し、前記第１発光物質が、所定量のターゲット物質をもたらすように反応を起こし
、前記第２発光物質が、前記ターゲット物質の存在量にかかわらず、光の吸収効
果または散乱効果を示すものであることを特徴とする複合体。
【請求項５６】複合体内の分析対象物の回転移動度を決定するための方法
であって、共に発光性であって寿命ごとに識別するという方法によってそれぞれの発光寿
命が識別可能とされた前記分析対象物と参照化合物とを含有してなる前記複合体
を調製し；前記複合体を照光することにより、前記分析対象物および前記参照化合物から
の発光を引き起こし；前記分析対象物および前記参照化合物からの光を検出し；前記分析対象物および前記参照化合物からの前記光と、前記分析対象物および
前記参照化合物のそれぞれの発光寿命と、に基づいて、前記分析対象物からの光
の回転移動度、および、前記参照化合物からの光の回転移動度を計算し；前記分析対象物からの前記回転移動度を前記参照化合物の前記回転移動度に対
して相対的に表現するような関数を構築する；ことを特徴とする方法。
【請求項５７】請求項５６記載の方法において、さらに、前記分析対象物の前記回転移動度に基づいて、前記複合体内のターゲ
ット物質の量を計算することを特徴とする方法。