JP2002071567A - 高速高スループット分光計および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光分光計を提供する。 【解決手段】 蛍光分光計はレーザ及びレーザ光ビーム
を複数の第１光ビームに分ける１以上のビームスプリッ
タを備える。ダイクロイックミラーが第１光ビームを或
る角度で反射する。サンプルを保持する複数の透過性チ
ャンバを設ける。対物レンズ系が反射ビームの経路に置
かれ、反射ビームを透過性チャンバ内の点に合焦する。
レンズは、透過性チャンバ内の検査用サンプルから蛍光
を受け、不透明パーティションのピンホールに合焦す
る。レンズは、対物レンズ系及びダイクロイックミラー
を戻る蛍光を受ける。光検出器はパーティションの１つ
の近くに置かれ、パーティションがレンズと光検出器の
間に置かれ、光検出器がピンホールを通る蛍光を検知す
る。各光検出器の信号を処理する電子回路を設ける。透
過性チャンバで多数のサンプルから高速でデータ収集す
る構造を設ける。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サンプルが放出す
る蛍光によって大量のサンプルを素早く分析可能なマル
チチャネル分光計の改善に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛍光を放出させこの蛍光を処理するには
多くの異なるシステムが使用可能であるが、現在好適な
方法の１つは、蛍光相関分光法（fluorescence correla
tion spectroscopy）として知られている（蛍光変動分
光法（fluorescence fluctuation spectroscopy）とし
ても知られている）。この技法の例は、シュロフ（Schr
of）その他による米国特許第５，８１５，２６２号に記
載されている。蛍光相互相関（cross-correlation）分
光法の別の例が、１９９８年２月の「ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス論文（Proceedings of Natio
nal Academy of Science）」、第９５巻、第１４２１〜
１４２６ページの、「二色蛍光相互相関分光法の統合に
よる迅速検査処理：酵素活動のための高スループット・
スクリーニング（Rapid Assay processing by Integrat
ion of Dual Color Fluorescence Cross-Correlation S
pectroscopy: High Throughput Screening for Enzyme
Activity）」と題するアンドレ・コルターマン（Andre
Koltermann）による論文、および１９９７年４月の
「バイオフィジカル・ジャーナル（Biophysical Journa
l）」、第７２巻、第１８７８〜１８８６ページの「多
コンポーネント拡散分析解法のための二色蛍光相互相関
分光法（Dual Color Fluorescence Cross-Correlation
Spectroscopy for Multi Component Diffusional Analy
sis Solution）」と題するペトラ・シュウィレ（Petra
Schwille）その他による論文に示されている。

【０００３】シュロフその他に対する特許第５，８１
５，２６２号では、励起レーザ・ビームが、直線状アレ
イに構成された一連のウェル（サンプル・チャンバ）を
通過する蛍光相関分光法（ＦＣＳ）について記載されて
いる。ビームは、各サンプル・チャンバに入射する前に
再度合焦されるので、蛍光は非常に小さなエリアで生ず
る。このエリアを監視し検知することによって、複数の
サンプルから同時に蛍光データを得る。

【０００４】このような技法では、レーザ・ビームが最
初のウェル即ちサンプル・チャンバを通過した後に、光
を再合焦するときに難問があった。また、レーザ光ビー
ムが種々の別個のサンプルを通過する際に、レーザ光ビ
ームに変化が生ずる可能性があり、このために、特に直
線状アレイにおける「下流側」のサンプルから得られる
データに影響を及ぼすおそれがある。また、二光子励起
は、先に引用した特許おいても用いられているように、
通常は非常に高価なレーザを必要とするが、一光子励起
は低価格のレーザを使用することができる。

【０００５】加えて、殆どの従来技術のシステムは、従
来からのハードウエアの相関器を用いて、蛍光相関分光
法においてマルチウェル・プレートから生データを受け
取る。ハードウエアの相関器からのデータは、コンピュ
ータ処理ユニットに渡され、対象のパラメータを判定す
る。このパラメータには、拡散係数や、成分の濃度が含
まれ得る。しかしながら、このようなハードウエアの相
関器の使用は、いくつかの制約によって阻害される。即
ち、分析する溶液内に粒子や凝集体があり、これが、合
焦されたレーザ・ビームによって照らされる小領域を通
過すると、データから得られた算出された自己相関関数
の全体を無効としなければならない。何故なら、それ
が、粒子や凝集体の一時的な存在によって変化させられ
るからである。その結果、データが得られたその特定の
ウェルに対する測定を無効としなければならず、更に可
能性として、マルチウェル・プレート全体の測定を再び
やり直さなければならないこととなる。

【０００６】また、生データは、有用な情報や特徴を含
むが、ハードウエアの相関器で一旦処理されると、完全
にかつ決定的に失われる。本発明のシステムによって、
ユーザは、生データを得た後に、これを検査することが
できる。即ち、分光計によって分析するサンプル溶液内
で生ずる分子相互作用を記述するには、高次の相関関数
の方が興味深いことがわかる場合がある。したがって、
生データを保持することができれば、望まれる場合に
は、ユーザは更に複雑な分析モデルを用いて更に分析す
ることができる。

【０００７】分析は、分光計、特に高スループットのス
クリーニング機器に適するように設計されたソフトウエ
アによって、自動的に容易に実施することができる。ま
た、蛍光相関分光法の一次自己相関関数は、典型的に、
時間モードを用いることによって決定される。これは、
この関数を計算する従来からの方法である。特に、ニュ
ーヨークのプレナム・プレス（Prenum Press）の１９９
１年の「蛍光分光法のトピックス（Topics in Fluoresc
ence Spectroscopy）」、第１巻（Ｊ．Ｒ．ラコウィク
ス（Lakowicz）、編集者）、第３３７〜４１０ページ
の、トンプソン（Thompson）の「蛍光相関分光法（Fluo
rescence Correlation Spectroscopy）」を参照すると
よい。時間モード動作は、濃度決定における精度に限界
があり、データ取得時間が増大する傾向がある。

【０００８】非常に高い分析レートで、薬剤およびその
他のスクリーニングを行なうことが望まれている。例え
ば、現行の技法では、１日に５０，０００ないし１０
０，０００の化合物をスクリーニングすることができ
る。しかしながら、高スループット・スクリーニングの
分野では、分光計の容量を著しく増大させ、大量の化合
物を処理することが望ましい。現行の高スループット・
スクリーニング装置の多くは、カリフォルニア州サニベ
ルのＬＪＬバイオシステムズ（L.J.L. Biosystems）、
カリフォルニア州サンディエゴのオーロラ・バイオサイ
エンシズ（Aurora Biosciences）、カリフォルニア州サ
ニベルのモルキュラー・デハイセス（Molecular Device
s）、およびコネチカット州メリデンのパッカード・イ
ンストルメンツ（Packard Instruments）によって製造
されている。

【０００９】このような高スループットの使用には、通
常は、吸収測定のような他の技術と比較して、全体的な
感度のために、蛍光放出が好適である。蛍光を用いるこ
との別の利点は、エキストリンジック・プローブ（extr
insic probe）として使用可能な、ある範囲の蛍光体に
対する検出方法の有効性にある。典型的に、蛍光技法を
用いる場合、５つのパラメータを測定することができ
る。即ち、励起スペクトルの強度、（選択した波長毎
の）放出スペクトルの強度、励起スペクトルの偏光、蛍
光の量子収量（quantum yield）、および励起レベルの
減衰時間である。

【００１０】蛍光相関分光法は、元々、マッジ（Madg
e）その他によって、「フィジカル・リビュー・レター
ズ（Physical Review Leters）」第２９巻（１９７
２）、第７０５〜７０８ページの「反応システムにおけ
る熱力学的変動：蛍光相関分光法による測定（Thermody
namic Fluctuations in a Reacting System: measurem
entsby Fluorescence Correlation Spectroscopy）」に
おいて提唱された。この技法では、検出した蛍光信号の
時間的変動（典型的に微小な観察体積における蛍光信号
の、時間依存性する自発的な強度の変動）を検出し、分
析することによって、分子スケールで発生するプロセス
に関する情報を得る。これらの強度変動および観察対象
の体積は、ブラウン運動、流れ、および化学反応から発
生する可能性がある。過去何年かの間、蛍光相関分光法
が、従来の拡散係数、回転拡散係数、運動率定数、分子
凝集体、および分子重量を測定するために利用されてき
た。トンプソンその他による論文は、この技法の再検討
を提示している（「蛍光分光法のトピックス」、第１巻
（Ｊ．Ｒ．ラコウィクス編集、プレナム・プレス、ニュ
ーヨーク、１９９１、第３３７〜４１０ページ）のトン
プソンその他の「蛍光相関分光法」）。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、典型的に蛍光
相関分光法を用いた、活性化合物の高スループット・ス
クリーニングを実行する装置および方法を提供するが、
本発明を利用することによって、他の技法も利用可能で
ある。一つの光子または複数の光子の励起プロセスによ
って、蛍光ブロープを励起させる。光源は、キセノン・
アークまたはジューテリウム・ランプのようなランプ、
あるいは連続波レーザのようなレーザ、即ち、アルゴン
・イオン、クリプトン・イオン、ヘリウム−ネオン、ヘ
リウム−カドミウムのようなレーザ、またはその他のレ
ーザとするとよい。また、窒素レーザまたはモード・ロ
ック・レーザ、ダイオード・レーザ、またはアレイ状に
配したレーザのような、パルス状レーザを用いることも
できる。可能な放射源の各々において、光源は、特定の
波長、あるいは一つの光子または複数の光子励起プロセ
スによって蛍光プローブを励起させる波長で、放射を行
えなければならない。典型的に、このような励起波長
は、２００ｍｍないし５，０００ｍｍの範囲とすること
ができる。

【００１２】本発明によって、レーザと、レーザからの
光ビームを受光し、このビームを複数の別個の第１光部
分に分割するように配置された少なくとも１つのビーム
・スプリッタ（プリズム型ビーム・スプリッタ、光ファ
イバ・システム、またはビーム分割機能を行なう同様の
デバイスとすることができる）とを備えた蛍光分光計を
提供する。これによって、典型的に互いに離間し平行に
延びる多数の第１光ビーム部分が得られる。

【００１３】ダイクロイック・ミラーが、第１光ビーム
部分を別々に受光し、第１光ビーム部分に対してある角
度、典型的には垂直に、ビーム部分を反射するように配
置されている。分析するサンプルを保持する複数の透過
性壁チャンバ（ウェル等）が設けられる。典型的に、従
来からの多数ウェル・サンプル・プレートを用いればよ
い。対物レンズ系、例えば、顕微鏡が設けられ（典型的
には共焦の使用のため）、この対物レンズ系は、反射さ
れた第１ビーム部分の各々の経路にそれぞれ配置され、
反射されたビーム部分のそれぞれを個別の透過性チャン
バの１つの中の１点にそれぞれ合焦し、チャンバ内の検
査のためのサンプルからの蛍光応答を誘発する。

【００１４】レンズが、検査用のサンプル（サンプルは
透過性チャンバ内にある）から蛍光を受光し、蛍光をそ
れぞれの不透明パーティションのピンホールにそれぞれ
合焦するように、それぞれ配置されている。レンズは、
対物レンズ系およびダイクロイック・ミラーを通じて戻
ってくる蛍光を受光し、次いで各ピンホールに各蛍光を
合焦するように、配置されている。ダイクロイック・ミ
ラーは、蛍光の少なくとも１つの波長に対して透過性を
呈するように選択される。

【００１５】光検出器は、各々、ピンホールの１つに隣
接してそれぞれ配置され、そのピンホールが特定のシス
テムの光検出器とレンズとの間にそれぞれ配置され、各
光検出器がピンホールを通る蛍光を検知することができ
る。更に、各光検出器から信号を受け取り処理する電子
回路が設けられる。

【００１６】本発明の分光計は、このような個々のシス
テムを複数個、典型的に４個または８個備え、個別のチ
ャンバまたはウェルにおいてサンプルを同時に処理し、
高スループット・システムに寄与する。

【００１７】典型的に、プレートは、前述の透過性チャ
ンバと、典型的に同プレートによって支持されるサンプ
ルを保持するための複数の他の透過性チャンバとを備え
る。ｘ−ｙ移動デバイスが、プレートを支持し、得られ
た蛍光の分析のために、チャンバの第１グループを個々
に且つ同時に第１光ビーム部分に露出させる。次いで、
ｘ−ｙデバイスを二次元平面的に移動させ、分析のため
に、プレートの別のグループのチャンバを第１光ビーム
部分に露出させる。

【００１８】好ましくは、対物レンズ系およびダイクロ
イック・ミラーを通過した各透過性チャンバからの蛍光
が、直線状に延び、対物レンズ系およびピンホールを更
に通過して、同じ直線上にある光検出器に達するよう
に、システムを設定する。

【００１９】したがって、多数の第１ビーム部分を制御
および処理する前述の構成物を備えるこのような検出シ
ステムのアレイを用いて、プレートの多数のチャンバの
内容を系統的かつ同時に分析することができ、続いて、
多数のチャンバ・プレート（３８４個まで又はそれ以上
のかかるチャンバ）を完全にかつ迅速に分析し終えるま
で、プレートを支持するｘ−ｙテーブルを並進して別の
組のチャンバを分析することができる。利点として、本
発明によって生成される第１ビーム部分の各々は、個々
の分析毎に１つのチャンバおよびサンプルのみを通過す
るので、先に引用した特許におけるような、多数のチャ
ンバを通過して蛍光応答を誘発する光ビームによって生
ずるチャンバのデータの相互汚染の可能性はない。

【００２０】好ましくは、本発明において用いる光励起
および検出方式は、顕微鏡法の共焦点設計に従う。デー
タを取得するには、検出器に達する光子の間の時間間隔
を測定し、検出したカウントのヒストグラムを作成す
る。光子を検出するサンプル内の体積は、非常に小さい
体積、例えば、約０．１ないし１０フェムトリットルと
することができ、これはバクテリアの体積程度である。
光子カウント・ヒストグラムは、溶液内に存在する分子
種の濃度、および各種が放出する光子数を提供する。ま
た、本発明は、同時に、自己相関関数、または高速高ス
ループットのために関心のあるパラメータの高次相関関
数を導出することもできる。約１ないし５秒の時間にわ
たって、このような小さな観察体積に対してスクリーニ
ングを行なうことができる。あらゆる所望の時間スケー
ルにわたり関与する単一分子および運動の直接測定を、
この技法によって行なうことができる。検出の下限は、
不純物およびバッファ汚染、ならびに不溶性化合物から
生ずる粒子に起因する。

【００２１】データ取得およびデータ分析は、電子的生
データの形態で、サンプルから経時的に蛍光測定値を取
得するステップを含むことができる。本発明によれば、
従来のハードウエア相関器を用いての手順とは対照的
に、この電子的生データを光検出器によってピックアッ
プし、プリアンプリファイヤ判別器に送り、次いでコン
ピュータに送り、そこで生データを格納することができ
る。

【００２２】次に、電子的に格納した元の生データを消
去することなく、第１アルゴリズムを用いて、その電子
的に格納した生データを処理する。次に、本発明の利点
として、そして本発明によって、格納した生データは、
１つ以上の更なるアルゴリズムを用いて再処理すること
もでき、あるいは、従来技術では必要であったように完
全な１組の新データを取得する必要もなく、第１アルゴ
リズムによってデータを再処理することもできる。

【００２３】蛍光相関分光法（ＦＣＳ）では、時間の関
数としての蛍光信号Ｆ（ｔ）を生データとして測定す
る。蛍光変動の時間的自己相関は、蛍光変動の平均時間
期間の測定値であり、これが判定される。典型的に、正
規化自己相関関数は、次のように定義される。

【００２４】

【数１】

【００２５】Ｇ（τ）は、時間で減衰する。減衰のレー
トおよび曲線の形状は、蛍光変動を生ずるプロセスの機
構およびレートに関する情報を含んでいる。蛍光信号の
観察された変動はポアソン統計に従い、平均変動の振幅
がＮ^1/2に比例する。ここでＮは観察体積内の分子数を
表す。ナノモル単位の濃度を検出することができる。二
光子励起のＦＳＣを用いる場合、観察体積は、典型的
に、０．１から１．０×１０^-15リットル（即ち、フェ
ムトリットル。「ｆｌ」と略する）の範囲を取る。この
小さな観察体積は、数百ナノ秒から秒または時間にまで
及ぶ時間スケール上で、関与する単一分子および運動の
直接測定を可能にする。検出の下限は、不純物およびバ
ッファ汚染、ならびに不溶性化合物から生ずる粒子の影
響に起因する。

【００２６】一般的に、時間モード技法よりも光子モー
ド技法を用いてデータを取得することが好ましいが、本
発明によれば何れの方法も用いることができる。光子モ
ード技法は、それ自体公知であるが、検出器は、検出器
に到達する蛍光からの１つの光子と次の光子との間の時
間遅れを記録する。このデータ取得の実施形態では、
「クロック」が、記録すべきイベントであり、光子は各
間隔を規定する開始−停止である。

【００２７】一方、時間モード技法では、検出器は、特
定の時間間隔においてサンプルから収集した光子の数を
カウントする。典型的に、機器は、約２５６の異なる時
間間隔を用いる。時間間隔の長さは、ユーザによって、
この動作を制御するソフトウエアを通じて指定される。
したがって、光子は、各時間間隔に記録される「イベン
ト」となる。「クロック」は、所望の各時間間隔を形成
するために電子回路によって規定される任意の開始およ
び終了ストップである。

【００２８】利点として、本発明の方法は、一光子励起
技法と共に用いることもできる。この場合、分子の励起
レベルは、サンプルにおいて蛍光を得るために必要な励
起を生成させるために２つ以上の光子を必要とする状況
とは異なり、１つの光子によって生成される。一光子励
起技法は、かなり安価なレーザを使用することができ
る。

【００２９】本発明では、データを処理するために用い
られるコンピュータに、データ取得カードを設けること
もできる。この場合、データ取得カードは、光検出器か
ら生データを取得し、コンピュータ・メモリ内にそれを
格納する手配をする。次に、コンピュータは、所望の自
己相関関数または高次相関関数を計算することができ
る。これによって、ハードウエア相関器の場合とは相対
的に、試験対照のサンプル・ウェルに関連するデータ・
セット全体を失うことなく、悪いデータを排除すること
ができるという利点が得られる。悪いデータは、蛍光の
ために試験される小体積における固体粒子の存在によっ
て生ずる場合がある。加えて、生データは、必要であれ
ば、高次相関関数に基づいての再計算のために、取得後
に再度処理することもできる。このようなデータ取得カ
ードは、また、時間モードまたは光子モードのいずれで
も、所望通りに、データを取得することが可能である。

【００３０】また、先に論じたように、大量スクリーニ
ング処理のために本発明にしたがってサンプル・チャン
バの迅速な多数の同時の分析を行なうことも可能であ
る。

【００３１】

【発明の実施の形態】図１を参照すると、ＦＣＳに用い
られるマルチチャネル高スループット・スクリーニング
（ＨＴＳ）分光計１０が概略的に示されている。

【００３２】レーザ１２は、蛍光サンプルに対する励起
放射源として機能する。レーザ１２からの光ビーム１４
は、従来の設計の１群のビーム・スプリッタ１８および
ミラー１７によって、４つの分離した第１光ビーム部分
１６に分割される。第１光ビーム部分１６は、それぞ
れ、異なる分光計ユニット２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２
０ｄに入射し、別個のサンプルを照射し、サンプルから
放出される蛍光を検知する。分光計ユニット２０ａ〜２
０ｄの詳細な構造は同一であり、その１つを図３に具体
的に示す。

【００３３】あるいは、ビーム・スプリッタ１８および
アングル・ミラー１７のシステムを、多数光ケーブル・
システムと置換してもよい。この場合、光は、ケーブル
・システムによってレーザから送られ、それぞれの分光
計ユニット２０ａ〜２０ｄに向けられる個々の第１光ビ
ーム部分を供給する。

【００３４】一つのレーザ１２で照射されることができ
る個々の分光計ユニット２０の数には本質的な制限はな
い。例えば、少なくとも８つの別個の分光計ユニットに
対してレーザ１２および光分散システム１７、１８（ま
たは光ケーブル）を用いることができ、レーザのパワー
に応じて、必要であれば、約１５０個までまたはそれ以
上の分光計ユニットも使用可能である。

【００３５】図２は、図１と基本的に同一のシステムの
平面図を示すが、それぞれの対応する分光計ユニット２
０ａ’、２０ｂ’、２０ｃ’、２０ｄ’が、光分散シス
テム１７、１８（または光ケーブル）の適当な変更によ
って、直線パターンではなく、正方形に配列されている
ところが異なる。分光計ユニットは、チャンバ２２の透
明な底面を指している。チャンバ２２は、市販の３８４
ウェル・プレート２４の一部として、チェッカーボード
・アレイ内にあり、３８４個の別個のサンプルを、本発
明の蛍光分光計によって分析することができる。プレー
ト２４は、底が開いたＸ−Ｙテーブル２６に支持されて
いる。Ｘ−Ｙテーブル２６は、両水平方向に正確な移動
ができるので、それぞれの分光計ユニット２０ａ’〜２
０ｄ’によって分析される４つのウェル２２の典型的な
１ないし５秒の照射の後、Ｘ−Ｙテーブル２６は、新た
な４つのウェル２２が４つの分光計ユニットによって検
査できるように、水平方向にシフトすることができる。
このように、本発明のシステムは、大量のサンプルのス
ペクトログラフ分析の大量生成が可能である。Ｘ−Ｙテ
ーブルは、公知の市販されているデバイスである。

【００３６】図３を参照すると、種々の分光計ユニット
２０の立面図、およびその設計を見ることができる。レ
ーザ１２は光ビーム１４を放出する。光ビーム１４は、
一連のビーム・スプリッタ１８を備える光分散システム
によって反復的に分割され、図１におけるような、それ
ぞれ別個の第１光ビーム部分１６を形成する。ビーム・
スプリッタ１８（および、望ましければ、対角のミラー
１７）を適切に配置することよって、第１光ビーム部分
１６は、望まれるあらゆるパターン、直線状、矩形、ま
たは分光計ユニット２０への転送のためのその他のパタ
ーンで、送られる。

【００３７】図示のように、ビーム部分１６の１つがユ
ニット２０へ入射し、ダイクロイック・ミラー２８に衝
突し、ビーム部分１６ａとして上方向に反射される。ダ
イクロイック・ミラー２８は、或る波長の光に対して反
射性を呈し、他の波長の光に対して透過性を呈する特性
を有する市販のミラーである。勿論、第１光ビーム部分
１６は、ダイクロイック・ミラー２８によって反射され
る波長を有するように選択されている。

【００３８】光ビーム１６ａは、一般に顕微鏡として機
能する対物レンズ３０を通過する。対物レンズ３０は、
マイクロウェル２２内およびその中に収容されているサ
ンプル内に位置する焦点３２に光ビームを合焦する。先
に述べたように、焦点３２における体積は、物質の非常
に小さい体積を対処範囲とすることができ、それはバク
テリアの体積に近い１フェムトリットル程度の体積であ
る。レーザ強度を調節し、過度なビーム強度から生ずる
サンプルのフォト・ブリーチング（photo bleaching）
を回避する。最適なビーム強度は、サンプル濃度、およ
びサンプル量子収量によって左右される。サンプル量子
収量とは、サンプルが放出する光子の数を、サンプル内
に入る光子数で除算した値である。蛍光体の中には、非
常に低い量子収量を有するものもあり、この場合、当
然、レーザ・ビーム強度を高める必要がある。

【００３９】微小な合焦された体積３２内の１つ以上の
分子から蛍光応答を得ることができる。蛍光は特性波長
であり、典型的に、レーザ・ビーム１６、１６ａの波長
とは異なる。この蛍光の一部が、対物レンズ３０を通過
して戻り、多くの反射を伴わずにダイクロイック・ミラ
ー２８を通過する。何故なら、これは異なる波長である
からである。ダイクロイック・ミラーは、特定の蛍光波
長に対して透過性を呈するように選択された形式のもの
である。蛍光は、照射された放射が１つの方向に通過す
るのと同じ対物レンズ３０を逆に通過することが望まし
い。何故なら、第２対物レンズを用いる場合に、第１対
物レンズ３０を合焦させるのと同じ体積３２に第２対物
レンズを整合して合焦するのが難しいからである。

【００４０】ダイクロイック・ミラー２８を通過した
後、フィルタ３４が所望の波長以外の波長の光を遮断す
る。蛍光の光はレンズ３６によって合焦され、特定の条
件下でレンズ３６の合焦点またはその近くにある、不透
明パーティション４０のピンホール３８を通過する。

【００４１】機器によって調べられるサンプルの体積の
量（典型的に、フェムトリットルの範囲）は、システム
の光学系、およびピン・ホール３８の直径によって決定
される。望まれる場合には、本発明を組み込んだ機器は
一連の異なるピンホールを備え、これらを図３に示す位
置に交互に配置し、こうして分光計ユニット２０によっ
て調べられるサンプル２２の体積を変化させるようにす
ることも可能である。

【００４２】従来からの設計の光検出器４２が、パーテ
ィション４０の他方側からピンホール３８を監視してい
る。光が検出された場合、これは、典型的に、サンプル
からの蛍光のみである。何故なら、他の波長の光はフィ
ルタ３４によって除去されているからである。光検出器
４２からの信号は、ケーブルまたはワイヤ４４を通っ
て、プリアンプリファイヤ判別器４６へ送られ、判別器
４６からの信号は、ケーブルまたはワイヤ４８を通って
コンピュータ５０へ送られる。コンピュータでは、時間
の関数として測定された蛍光信号を処理して、蛍光変動
の時間的自己相関を得る。これは、蛍光変動の平均時間
期間の測定値である。公知の正規化自己相関関数を用い
ると、数百ナノ秒から秒または時間までにわたる時間ス
ケール上で、単一分子の蛍光特性、および関与する運動
を直接に測定することが可能となる。

【００４３】図４を参照すると、前述の技法によってデ
ータは次のように処理される。前述のように、ウェル２
２で測定値を取得する（６０）。６２において、データ
は、データ・ストリームとしてコンピュータ５０に達す
る。数学アルゴリズムが生データを検査し、汚染物を示
す大きな信号変動の存在を確かめる（６４）。存在する
場合、ソフトウエア・フィルタによって、信号内の大き
な変動を除去し（６６）、データは再度数学アルゴリズ
ムを通過する（６４）。大きな信号変動が見つからない
場合、数学アルゴリズムが、取得したデータの自己相関
関数を計算する（６８）。拡散、係数、濃度、結合定数
などのような、関心のあるパラメータをソフトウエアに
よって決定する（７０）。

【００４４】フローチャートの判断点７２において、ア
ルゴリズムの所定の評価基準にしたがって、結果を受け
入れる（７３）か否かである。基準を満たしていない場
合、数学アルゴリズムは、コンピュータ・ソフトウエア
によって高次相関関数を計算する（７４）。そして再
度、判断点７６に達する。ここで結果がアルゴリズムの
評価基準に合った場合は受け入れられ（７８）、ユーザ
に提供される。さもなければ、取得したデータに対して
別の分析モデルを提供するように、アルゴリズムを予め
決めておいてもよい（８０）。この判断点７２、７６、
８２を含む判断の反復ループは、結果が所望の評価基準
に合うまで、またはデータを処理するために使用可能な
他のアルゴリズムまたは分析技法がプログラム内になく
なるまで、所望されるだけ継続することができる。

【００４５】このような技法によって、物体、生体およ
びその他ものの挙動の多種多様な研究を行なうことが可
能となる。ラテックス・ビーズ（latex beads）上の生
体細胞における細胞質の並進移動を決定することができ
る。加えて、化学錯体の存在およびそれらの比例濃度
を、別個の反応物と比較して、測定することができる。
薬剤およびその他の化学物質の有無をスクリーニングす
ることができる。また、物理化学などに対する多種多様
な理論的研究を行なうことができる。

【００４６】具体的には、前述の装置および方法の使用
は、以下に論ずるアルゴリズムによって最適化すること
ができる。高スループット・スクリーニング（ＨＴＳ）
用途では、重要なパラメータは、感度、ならびにバック
グラウンド信号および非生産的な種類のものから生産的
な種類のものを高速かつ効率的に分離する能力である。
最近まで、使用されていた方法の殆どは、遅いかあるい
は効率が非常に低かった。単一分子からの蛍光の分析
は、感度および選択性に新たな道を切り開くことができ
た。この分野における主要な概念は、異なる分子エンテ
ィティからどのように信号を分析するかということにあ
る。対象の分子が蛍光性である場合、単一分子の検出お
よび分析の方法が、分子毎にサンプルを分析する強力な
新方法を提供することができる。この目標を達成するた
めに、１）分析体積内に１つまたはせいぜい数個の分子
が存在するという条件に、分析体積を制限しなければな
らない。２）この小体積から発せられる蛍光を非常に効
率的に収集しなければならない。３）サンプル内に存在
する異なる分子個体群に応じて、蛍光信号を分析して結
果をソートする高速オンライン・アルゴリズムを考案し
なければならない。蛍光の特性は急過に分析されるの
で、原則的に、分離可能な異なる蛍光個体群の数に制限
はない。実際の制限は信号対ノイズ比によって賦課され
る。例えば、この分子の分類の原理を用いると、明るい
分子の濃度が暗い分子の濃度に比較して非常に低くて
も、１つの明るい分子を多数の暗い蛍光性分子から分離
することができる。ＨＴＳ装置に適用してデータ分析の
感度および速度を高めるのは、正にこの原理である。実
際には、蛍光性分子の濃度を、分析体積内に１つの分子
のみが存在する限界にまで減少させることは常に可能な
訳ではなく、観察した蛍光信号の統計分析は、複雑な数
学的方法を必要とする。しかしながら、数学的な複雑性
を、最新のコンピュータによって処理しオンライン分析
を可能にする単純な式へと引き下げることができた。以
下では、この新方法が機能するために、いかにいて先に
概説した３つの条件を達成するかについて述べる。

【００４７】小体積 共焦点の原理および／または多光子（マルチフォトン）
励起を利用して、回折制限した蛍光励起体積を達成し
た。現在の最先端の分光法対物レンズおよび一般的レー
ザを用いて得られる体積は、０．１ｆＬ程度である。こ
のサイズの体積は、平均して、１ｎＭの濃度でサンプル
に対して０．０６個の分子を含む。これらの濃度はＨＴ
Ｓ用途では典型的である。

【００４８】効率的な光の収集 ＨＴＳには、比較的高い開口数の対物レンズおよび特定
のセルを用い、作用距離が短い対物レンズの使用を可能
にした。また、用いる光検出器（アバランシェ・フォト
・ダイオード）は、ＨＴＳにおいて用いられる殆どのダ
イ（dye）のスペクトル領域において、非常に高い量子
効率を有する。また、比較的高い励起パワーを用いてダ
イの吸収を飽和させた。吸収の飽和は、一光子励起およ
び多光子励起の双方において従来のレーザを用いること
によって容易に得られる。その結果、１０００００カウ
ント／秒／分子を超えるカウンティング・レートを日常
的に得ることができた。ダイ分子が１ｍｓ程度またはそ
れより長く続くレーザ・ビーム下にあるときの蛍光バー
ストの間、ダイが高分子に付着していると仮定して、平
均約５０〜１００個の光子を収集した。この収集した光
子の数は、約２倍明るさが異なるダイ分子を分離するた
めの統計を得るには十分である。

【００４９】更なる考慮 組み立てた装置は、２つの光検出器を用いて蛍光信号の
同時測定を可能にする。従って、原理的には、分子の差
動波長放出および偏光というような、２つの別個の分光
特性を測定することができる。

【００５０】多数の種に対するＰＣＨ 多数の種を解明することは、多くの生物学的用途におい
て重要な課題である。生物学的高分子は他の分子と相互
作用し、この相互作用のネットワークの結果として、生
命の複雑な機構が維持される。ＦＣＳは、多数の種を解
明するために好都合に用いられてきた。しかしながら、
自己相関関数のみで２つの種を解明するには、それらの
拡散係数に２桁以上の差がなければならないことが、一
般に認められている。これは、多くの生物学的システム
に対する純粋な自己相関手法の応用に厳しい制約を課す
ることになる。何故なら、生分子の拡散係数間の差は、
多くの場合２倍未満であるからである。例えば、２つの
モノマ・サブユニット（monomer subunit）の連携によ
って二量体を形成することは、広く用いられている重要
な生物反応機構である。二量体に対する拡散係数の増加
は、モノマの値の約２５パーセントである。拡散係数
は、分子質量の立方根を用いて概算されるので、自己相
関関数のみで２つの成分を解明するには、約８倍の分子
重量の差が必要となる。この自己相関手法の本質的な欠
点に取り組むために、２つの別の方法が文献で紹介され
ている。一方のものは高次自己相関関数に基づき、他方
のものは高次モーメント分析に基づく。

【００５１】ここで、光子カウント・ヒストグラムに基
づいて蛍光の種を分離する新たな手法を紹介する。光子
カウントのヒストグラムは分子の輝度に敏感である。２
つの種がその分子輝度で相違する場合、観察体積に入る
輝度が高い方の種の分子は、他方の種よりも強い蛍光強
度変化を生ずる。これらの強度変化の統計を考慮するこ
とにより、それぞれの種の分子の輝度および平均数を導
き出すことができる。光検出プロセスによって生ずるシ
ョット・ノイズがこれらの強度変動に加えられる。多数
の種に対しての得られた光子カウント統計は、単一の種
の光子のカウント・ヒストグラムの連続的畳み込みによ
って与えられることが、示された。一つの種のヒストグ
ラムは２つのパラメータを必要とするが、ｒ個の種に対
するヒストグラムを記述するには、２ｒ個のパラメータ
が必要となる。即ち、各種毎に、分子の輝度ε_iおよび
粒子の平均数Ｎ_i￣（左記の記号「￣」は実際はＮの上
側に付される）が必要となる。以下に２つの種の解明に
ついて詳細に論ずる。

【００５２】２つの種の分解性 他の知識を全く用いずに、ヒストグラムのみで２つの種
を解明しなければならないという、最も難しい事例につ
いて論ずる。実用上の観点からは、所与の輝度の種を分
離するためには、どのようなデータ取得時間および濃度
を選択すべきかを知りたいであろう。この質問に対応す
るために、異なる条件に対しての論理的ヒストグラムを
計算し、経験的に好ましい濃度および輝度の条件を特定
した。次いで、単一種モデルおよび決定した低減された
χ²を想定して、理論的に決定した二種ＰＣＨ関数を嵌
め込んだ。単一種モデルで二種ヒストグラムの嵌め込み
を行なうと、うまく嵌め込みできないことになり、シス
テム的誤差を生じる。誤差の大きさは、単一種と多数種
の間の区別が可能か否かを示す。１以下の低減されたχ
²の値は、データ統計が種の分離には不十分であること
を示し、１よりも大きいχ²は、１つよりも多い種が存
在することを示す。どれ位の輝度差が分離可能かを解き
明かすことが望まれる。所与の種に対する輝度は、ヒス
トグラムの計算中に一定に保たれるが、濃度はシステム
的に変動する。固定の輝度比では、結果は、双方の種の
対数濃度の関数として、χ²表面の輪郭プロットの形態
で、グラフィック的に最も良く表される。各種の濃度
は、ＰＳＦ内の分子の数で表される。

【００５３】以上の説明は、例示の目的のみのために提
供したものであり、本願発明の範囲を限定することを意
図するものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲
に規定する通りである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＦＣＳのための蛍光分光計を平面図で
示す概略図である。

【図２】図２は、図１のユニットと同様であるが、直線
状配列ではなく、矩形状配列である４つの分光計ユニッ
ト、及びサンプルを保持するマイクロウェル・プレート
とそれらとの関係を示す一部概略底面図である。

【図３】図３は、図１または図２のデバイスにおいて他
の同様の分光計ユニットと共に同時に用いる一つの分光
計ユニットの概略立面図である。

【図４】図４は、図１ないし図３のデバイスによって得
られたデータのソフトウエア処理を示すフロー・チャー
トである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エンリコ・グラットン アメリカ合衆国イリノイ州61801，アーバ ナ，フォーン・ヒル・コート 3205 Ｆターム(参考） 2G020 AA07 BA02 CA16 CB04 CB23 CD11 CD22 CD56 2G043 AA01 AA03 BA16 CA03 DA06 EA01 EA10 FA01 GA07 GB01 HA01 HA09 JA03 LA01 MA01 2G057 AA04 AB04 BA03 DB05 DC01

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛍光分光計であって、 レーザと、前記レーザからの光ビームを受け、前記ビー
   ムを複数の個別の第１光ビーム部分に分割するように配
   置された少なくとも１つのビーム・スプリッタと、前記
   第１光ビーム部分を別々に受け、前記第１光ビーム部分
   に対して或る角度で前記ビーム部分を反射するように配
   置されたダイクロイック・ミラーと、サンプルを保持す
   る複数の透過性チャンバと、前記反射ビーム部分の経路
   にそれぞれ配置され、各反射ビーム部分を個別の前記透
   過性チャンバの１つの透過性チャンバ内の１点にそれぞ
   れ合焦する対物レンズ系と、前記透過性チャンバ内の検
   査のためのサンプルから蛍光を受け、前記蛍光を不透明
   パーティションのピンホールにそれぞれ合焦するように
   それぞれ配置されたレンズであって、前記対物レンズ系
   および前記ダイクロイック・ミラーを戻るように通過す
   る前記蛍光を受けるように配置されたレンズと、各々が
   前記パーティションの１つに隣接してそれぞれ配置され
   た光検出器であって、１つの前記パーティションが前記
   レンズおよび前記光検出器の各々の間にそれぞれ配置さ
   れ、各々の光検出器が前記ピンホールを通る蛍光を検知
   することを可能とした、光検出器と、各光検出器から信
   号を受け取り処理する電子回路とを備える蛍光分光計。
2. 【請求項２】 請求項１記載の分光計において、プレー
   トが、前記透過性チャンバと、サンプルを保持する複数
   の別の透過性チャンバとを備え、ｘ−ｙ移動デバイス
   が、前記プレートを支持し、前記チャンバの第１グルー
   プを、分光分析のために同時にそれぞれ前記第１光ビー
   ム部分に露出させ、それに続いて前記ｘ−ｙデバイスが
   動き、前記チャンバの別のグループをそれらの分光分析
   のために前記第１光ビーム部分に露出させることを可能
   にする、分光計。
3. 【請求項３】 請求項２記載の分光計において、複数の
   ビーム・スプリッタが前記光ビームを少なくとも４つの
   第１光ビーム部分に分割し、該第１光ビーム部分は、前
   記透過性チャンバの少なくとも４つへ同時に照射するた
   めに互いに離間され、それぞれの別個の第１光ビーム部
   分が前記透過性チャンバの１つのみを照射する、分光
   計。
4. 【請求項４】 請求項３記載の分光計において、前記第
   １光ビーム部分は互いに平行に延びる、分光計。
5. 【請求項５】 請求項４記載の分光計において、前記プ
   レートの前記チャンバは、開口ウェルを備え、前記第１
   光ビーム部分は、前記ウェルの底を通って前記チャンバ
   内へ送られる、分光計。
6. 【請求項６】 請求項５記載の分光計において、各チャ
   ンバの各サンプルからの蛍光が、前記対物レンズ系、前
   記ダイクロイック・ミラー、前記レンズ、および前記ピ
   ンホールを通る直線経路を通じて前記光検出器へ達す
   る、分光計。
7. 【請求項７】 請求項３記載の分光計において、各チャ
   ンバの各サンプルからの蛍光が、前記対物レンズ系、前
   記ダイクロイック・ミラー、前記レンズ、および前記ピ
   ンホールを通る直線経路を通じて前記光検出器に達す
   る、分光計。
8. 【請求項８】 請求項１記載の分光計において、複数の
   ダイクロイック・ミラーが前記光ビームを少なくとも４
   つの第１光ビーム部分に分割し、該第１光ビーム部分
   は、少なくとも４つの透過性チャンバへ同時に照射する
   ために互いに離間され、それぞれの別個の第１光ビーム
   部分が前記透過性チャンバの１つのみを照射する、分光
   計。
9. 【請求項９】 請求項８記載の分光計において、前記第
   １光ビーム部分は互いに平行に延びる、分光計。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の分光計において、各チ
    ャンバの各サンプルからの蛍光が、前記対物レンズ系、
    前記ダイクロイック・ミラー、前記レンズ、および前記
    ピンホールを通る直線経路を通じて前記光検出器に達す
    る、分光計。
11. 【請求項１１】 蛍光相関分光法を行う方法であって、 電子生データの形態で、サンプルから時間にわたっての
    蛍光測定値を取得するステップと、前記生データを電子
    的に格納するステップと、電子的に格納した前記生デー
    タを消去することなく、第１アルゴリズムを用いて前記
    生データを処理するステップとを備える方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の方法であって、続い
    て、前記第１アルゴリズムとは異なる第２アルゴリズム
    を用いて、前記格納した生データを再び処理するステッ
    プを備える方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の方法において、前記
    生データを光子モード技法を用いて獲得する、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１１記載の方法において、前記
    生データを光子モード技法を用いて獲得する、方法。
15. 【請求項１５】 蛍光相関分光法を行う方法であって、 時間にわたってサンプルから蛍光測定値を取得して光子
    カウントのヒストグラムを得るステップと、前記サンプ
    ルの少なくとも１つの分子種の分子輝度を導き出すステ
    ップと、前記種の濃度を決定するステップとを備える方
    法。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の方法において、複数
    の前記種の分子輝度を前記蛍光測定から決定する、方
    法。
17. 【請求項１７】 請求項１５記載の方法において、前記
    蛍光測定を１０フェムトリットル以下のサンプル体積か
    ら取る、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載の方法において、複数
    の前記種の分子輝度を前記蛍光測定から決定する、方
    法。
19. 【請求項１９】 蛍光分光計であって、 レーザと、 前記光ビームを受け、該光ビームに対して或る角度で光
    ビームの一部分を反射するように配置されたダイクロイ
    ック・ミラーと、 サンプルを保持する複数の透過性チャンバを備えるプレ
    ートであって、ｘ−ｙ移動デバイスが前記プレートを支
    持し、前記チャンバを分光分析のために順に前記光ビー
    ム部分に露出させ、続いて前記ｘ−ｙデバイスが動き、
    別のチャンバをそれらの分光分析のために前記光ビーム
    部分に露出させるものであり、対物レンズ系が、前記ビ
    ーム部分の経路に配置され、前記ビーム部分を合焦して
    個別の前記透過性チャンバ内を指し示すようにするもの
    である、プレートと、 前記透過性チャンバ内の検査のためのサンプルから蛍光
    を受け、前記蛍光を不透明パーティションのピン・ホー
    ルにそれぞれ合焦するように配置されたレンズ系であっ
    て、前記対物レンズ系および前記ダイクロイック・ミラ
    ーを通じて戻る前記蛍光を受けるように配置されたレン
    ズ系と、 前記パーティションに近接して配置された光検出器であ
    って、前記パーティションが前記レンズと前記光検出器
    の間に配置され、前記光検出器が前記ピンホールを通し
    て蛍光を検知するようにした、光検出器と、 各光検出器から信号を受け取り処理する電子回路とを備
    える蛍光分光計。