WO2011039953A1 - Ｆｒｅｔ測定方法及び装置 - Google Patents

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成幸 中田
弘能 林
一輝 星島
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三井造船株式会社
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Definitions

  • the controller 130 includes a low-pass filter 132, an amplifier 134, an A / D converter 136, and a system controller 138.
  • the low pass filter 132 removes the high frequency component from the signal including the cos component, the sin component, and the high frequency component of the fluorescence signal output from the signal processing unit 120.
  • the amplifier 134 amplifies the cos component and sin component processing signal of the fluorescence signal, which is a signal from which the high frequency component has been removed by the low pass filter 132, and outputs the amplified signal to the A / D converter 136.
  • the A / D converter 136 samples the processing signals of the cos component and the sin component of the fluorescence signal and supplies them to the analyzer 150.
  • the system controller 138 receives a trigger signal output from the measurement unit 40.
  • the system controller 138 controls the oscillator 112 and the A / D converter 136.
  • a living cell is irradiated with laser light having an output P (t) represented by the following expression.
  • P (t) represented by the following expression.
  • the wavelength region is limited by a band pass filter, and then measurement is performed by a photoelectric converter such as a photomultiplier tube.
  • a photoelectric converter such as a photomultiplier tube.
  • the fluorescence amount measured through the donor channel bandpass filter 53 and the photoelectric converter 55 is F DCh (j ⁇ )
  • the fluorescence amount measured through the acceptor channel bandpass filter 54 and the photoelectric converter 56 is F.
  • ACh (j ⁇ ) the following relational expression is established.
  • W D is the weighting factor by band-pass filter 53 of the donor channels
  • the W A is a weighting factor by band-pass filter 54 of the acceptor channel.
  • a sample in which only acceptor molecules are expressed is irradiated with laser light, and a fluorescence signal is measured.
  • Equation (36), Equation (37), and Equation (31) the fluorescence signal measured through the bandpass filter is expressed as follows.
  • the real part of the equations (38) and (39) corresponds to the cos component of the fluorescence signal.
  • the imaginary part of the equations (38) and (39) corresponds to the sine component of the fluorescence signal.
  • the observation matrix is obtained, the information on the fluorescence emitted by the donor molecule by the irradiation of the laser beam can be obtained from the measured fluorescence signal using the equation (31). Specifically, by multiplying F DCh (j ⁇ ) / P (j ⁇ ) and F ACh (j ⁇ ) / P (j ⁇ ), which are fluorescence signals obtained by measurement, by the inverse matrix of the observation matrix, a donor is obtained as follows.
  • the concentration C A [M] of the acceptor molecule at the time of occurrence of FRET is obtained as follows.
  • K exA is a real number
  • the phase of K exA obtained from the following equation (53) should be zero.
  • the dissociation constant K d can be obtained from the equations (20) and (21).
  • the dissociation constant K d is obtained by the dissociation constant calculating unit 172.
  • FIG. 10 is an example of a flowchart for measuring the maximum FRET efficiency E max and the shortest fluorescence lifetime ⁇ Dmin .
  • a plurality of samples 12 having different ratios ⁇ between the donor molecule concentration C D [M] and the acceptor molecule concentration C A [M] defined by the equation (16) are prepared (step S101). ).
  • the FRET efficiency E * defined by the equation (14) is measured for each sample 12 using the flow cytometer described with reference to FIG. 1 (step S102). Specifically, using the fluorescence lifetime calculated by the fluorescence lifetime calculation unit 158, the FRET efficiency calculation unit 160 calculates the FRET efficiency E * .
  • the ratio of the acceptor molecule concentration to the donor molecule concentration is affected.
  • the FRET measurement can be performed quantitatively.
  • a solution obtained by purifying donor molecules is prepared (step S201).
  • the donor molecule concentration CD [M] is measured (step S202).
  • the laser light source unit 30 emits laser light having a wavelength (for example, 407 nm) at which the donor molecule mainly absorbs energy, and the measurement unit 50 measures the fluorescence signal for each of the donor channel and the acceptor channel. (Step S203).
  • the analyzer 150 acquires the measured amplitude of the fluorescence signal (step S204).
  • step S305 If the analyzer 150 has not acquired a predetermined number (for example, 5 points) of the amplitude of the fluorescence signal, the concentration of the acceptor molecule is diluted (step S305), and the process returns to step S302. Thereafter, steps S302 to S305 are repeated until the analyzer 150 acquires a predetermined number of fluorescent signal amplitudes.
  • the observation matrix calculation unit 166 converts the amplitude of the fluorescence signal into the acceptor molecule concentration C A [M] as shown in FIGS. 9 (c) and 9 (d). And the components of the observation matrix are calculated from the slopes based on the equations (42) and (43) (step S306).
  • FIG. 12 is an example of a flowchart of sample measurement.
  • the fluorescence signal is measured for each of the donor channel and the acceptor channel by irradiating the sample 12 with laser light and measuring the fluorescence emitted by the sample 12 using the flow cytometer described with reference to FIG. (Step S401). This means that to measure the value of F DCh (j ⁇ ) / P of the formula (44) (j ⁇ ), F ACh (j ⁇ ) / P (j ⁇ ).
  • the fluorescence lifetime calculation unit 158 calculates the fluorescence lifetime ⁇ * D of the donor molecule (step S402). Specifically, the fluorescence lifetime calculation unit 158 calculates the fluorescence lifetime ⁇ * D of the donor molecule from the phase difference of the fluorescence signal output from the photoelectric converter 55 with respect to the modulation signal, based on the above equation (48). .
  • the second molecule concentration calculation unit 170 calculates the acceptor molecule concentration C A [M] of the sample 12 (step S405). Specifically, the second molecule concentration calculation unit 170 calculates the acceptor molecule concentration C A [M] of the sample 12 based on the equation (52) using the fluorescence information emitted by the acceptor molecule.
  • in the equation (52) is a fluorescence signal F DCh (j ⁇ ) / P (j ⁇ ), F ACh (j ⁇ ) obtained by measurement as shown in the equation (44). It is obtained by multiplying / P (j ⁇ ) by the inverse matrix of the observation matrix. As the observation matrix, the value obtained in the second prior measurement described above is used.
  • the dissociation constant K d which is a parameter relating to the strength of the binding between a donor molecule and an acceptor molecule that labels a living cell protein, which has not been conventionally known, can be measured. .
  • steps S401 to S406 is not limited to the order described with reference to FIG. 12, and the present invention can be implemented even if the order is appropriately changed.

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Abstract

【課題】測定対象となる生細胞のタンパク質を標識するドナー分子のうち、アクセプター分子と結合し、ＦＲＥＴが発生しているドナー分子の割合を求める。 【解決手段】第１分子の濃度と第２分子の濃度との比が異なる複数の事前測定サンプルに対して、第１分子の蛍光寿命を算出し、第１分子の蛍光寿命の最小値を算出する。強度が時間変調されたレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定サンプルが発する蛍光を計測する。計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する。第１分子の蛍光寿命の最小値と、算出された第１分子の蛍光寿命とを用いて、測定サンプル中の第１分子のうちＦＲＥＴが発生している第１分子の割合を算出する。

Description

ＦＲＥＴ測定方法及び装置
　本発明は、レーザ光の照射によってドナー分子（第１分子）がエネルギーを吸収し、ドナー分子からアクセプター分子（第２分子）へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を測定する方法及び装置に関する。具体的には、ドナー分子とアクセプター分子との対に関して、両分子の相互作用を蛍光によって測定するＦＲＥＴ測定技術に関する。
　現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
　蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用の解析が行われている。ＦＲＥＴ現象により生じる蛍光を測定することにより、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を測定することができる。
　例えば、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光寿命τ＊ ｄと、アクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τｄとを用いて、ドナー分子からアクセプター分子へのエネルギー移動の程度を示すＦＲＥＴ効率を求める技術が知られている（特許文献１）。
　上記特許文献１において、ＦＲＥＴ効率は、１－τ＊ ｄ／τｄにより求められる。
特開２００７－２４０４２４号公報
　しかし、上記ＦＲＥＴ効率は、ドナー分子の濃度に対するアクセプター分子の濃度の割合に影響を受けるため、上記技術を用いて細胞等に含まれるタンパク質の相互作用の強さを定量的に求めることは難しかった。
　そこで、本発明は、ドナー分子の濃度に対するアクセプター分子の濃度の割合に影響を受けることなく、ＦＲＥＴ測定を定量的に行うことのできるＦＲＥＴ測定方法及び装置を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明のＦＲＥＴ測定方法は、第１分子および第２分子で標識された測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定方法であって、第１分子の濃度と第２分子の濃度との比が異なる複数の事前測定サンプルに対して、第１分子の蛍光寿命を算出し、第１分子の蛍光寿命の最小値を算出する最短蛍光寿命算出ステップと、強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射する照射ステップと、前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測ステップと、前記計測ステップにおいて計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出するステップと、前記最短蛍光寿命算出ステップで算出された第１分子の蛍光寿命の最小値と、算出された前記第１分子の蛍光寿命とを用いて、前記測定サンプル中の第１分子のうちＦＲＥＴが発生している第１分子の割合を算出するＦＲＥＴ発生率算出ステップと、を有することを特徴とする。
　また、前記ＦＲＥＴ発生率算出ステップは、前記ＦＲＥＴ発生率算出ステップでは、第２分子が存在しないときの第１分子の蛍光寿命をさらに用いて、前記割合を求めることが好ましい。
　また、本発明のＦＲＥＴ測定方法は、前記計測ステップにおいて計測された蛍光信号から、前記照射ステップにおいてレーザ光が照射されることにより第１分子が発する蛍光の情報と第２分子が発する蛍光の情報を求めるための行列を算出する観測行列算出ステップを有し、前記観測行列算出ステップは、第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求める第１ステップと、第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求める第２ステップと、を有することが好ましい。
　また、本発明のＦＲＥＴ測定方法は、前記ＦＲＥＴ発生率算出ステップにおいて算出された前記割合を用いて、第１分子と第２分子との結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出ステップを有することが好ましい。
　また、前記第１分子の蛍光寿命を算出するステップは、前記計測ステップにおいて計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出することが好ましい。
　また、前記第１ステップは、第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測される蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求め、前記第２ステップは、第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測される蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求めることが好ましい。
　また、本発明のＦＲＥＴ測定方法は、第１分子が発する蛍光の情報を用いて、第１分子の濃度を算出する第１分子濃度算出ステップと、第２分子が発する蛍光の情報を用いて、第２分子の濃度を算出する第２分子濃度算出ステップと、を有し、前記解離定数算出ステップでは、前記第１分子濃度算出ステップにおいて算出された第１分子の濃度と、前記第２分子濃度算出ステップにおいて算出された第２分子の濃度と、を用いて、前記解離定数を算出することが好ましい。
　また、上記課題を解決するため、本発明のＦＲＥＴ測定装置は、第１分子および第２分子で標識された測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定装置であって、強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射するレーザ光源部と、前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測部と、前記計測部が計測した蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出部と、第１分子の濃度と第２分子の濃度との比が異なる複数の事前測定サンプルにおける第１分子の蛍光寿命を用いて、第１分子の蛍光寿命の最小値を算出する最短蛍光寿命算出部と、前記最短蛍光寿命算出部で算出された第１分子の蛍光寿命の最小値と、前記蛍光寿命算出部で算出された第１分子の蛍光寿命とを用いて、前記測定サンプル中の第１分子のうちＦＲＥＴが発生している第１分子の割合を算出するＦＲＥＴ発生率算出部と、を備えることを特徴とする。
　また、前記ＦＲＥＴ発生率算出部は、第２分子が存在しないときの第１分子の蛍光寿命をさらに用いて、前記割合を求めることが好ましい。
　また、本発明のＦＲＥＴ測定装置は、前記計測部で計測された蛍光信号から、前記測定サンプルにレーザ光が照射されることにより第１分子が発する蛍光の情報と第２分子が発する蛍光の情報を求めるための行列を算出する観測行列算出部を有し、前記観測行列算出部は、第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求め、かつ、第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求めることが好ましい。
　また、本発明のＦＲＥＴ測定装置は、前記ＦＲＥＴ発生率算出部において算出された前記割合を用いて、第１分子と第２分子との結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出部を有することが好ましい。
　また、前記蛍光寿命算出部は、前記計測部で計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出することが好ましい。
　また、前記観測行列算出部は、第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求め、かつ、第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求めることが好ましい。
　また、本発明のＦＲＥＴ測定装置は、第１分子が発する蛍光の情報を用いて、第１分子の濃度を算出する第１分子濃度算出部と、第２分子が発する蛍光の情報を用いて、第２分子の濃度を算出する第２分子濃度算出部と、を有し、前記解離定数算出部は、前記第１分子濃度算出部において算出された第１分子の濃度と、前記第２分子濃度算出部において算出された第２分子の濃度と、を用いて、前記解離定数を算出することが好ましい。
　本発明のＦＲＥＴ測定方法及び装置によれば、ドナー分子の濃度に対するアクセプター分子の濃度の割合に影響を受けることなく、ＦＲＥＴ測定を定量的に行うことができる。
本発明のＦＲＥＴ測定装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。 ドナー分子とアクセプター分子のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。 図１に示すフローサイトメータの計測部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの制御・処理部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの分析装置の一例を示す概略構成図である。 ＦＲＥＴの測定フローの一例を示す図である。 ＦＲＥＴ効率とαとの関係を示す図である。 ＦＲＥＴ発生時の蛍光発光のダイナミクスについて表したモデル図である。 観測行列の測定例を示す図である。 最大ＦＲＥＴ効率と最短蛍光寿命を測定するフローチャートの一例である。 観測行列を測定するフローチャートの一例である。 サンプル測定のフローチャートの一例である。
＜ＦＲＥＴ測定装置の概略構成＞
　以下、本発明のＦＲＥＴ測定方法及び装置について、詳細に説明する。
　図１は、本発明のＦＲＥＴ測定装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
　本発明のフローサイトメータ１０は、例えば、測定対象となる生細胞中のタンパク質をドナー分子とアクセプター分子で標識したサンプル１２（測定サンプル）にレーザ光を照射し、サンプル１２が発する蛍光を計測する。計測された蛍光信号を用いることにより、フローサイトメータ１０は、ドナー分子のうちＦＲＥＴが発生しているドナー分子の割合であるκＦＲＥＴを求める。さらに、フローサイトメータ１０は、κＦＲＥＴの他に、ドナー分子の濃度、アクセプター分子の濃度、解離定数Ｋｄの値等を求める。図１に示されるように、フローサイトメータ１０は、管路２０と、レーザ光源部３０と、計測部４０，５０と、制御・処理部１００と、分析装置１５０と、を備える。
　管路２０は、高速流を形成するシース液とともにサンプル１２を流す。管路２０の出口には、サンプル１２を回収する回収容器２２が設けられている。
　レーザ光源部３０は、サンプル１２に強度が時間変調されたレーザ光を照射する。サンプル１２にレーザ光が照射されることにより、ドナー分子とアクセプター分子はそれぞれエネルギーを吸収する。例えば、ドナー分子がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプター分子がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）である場合、ドナー分子が主にエネルギーを吸収する波長４０５ｎｍ～４５０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部３０は、例えば、半導体レーザである。レーザ光源部３０が出射するレーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ～１００ｍＷである。
　ここで、レーザ光源部３０が照射するレーザ光の波長と、ドナー分子及びアクセプター分子がエネルギーを吸収する波長との関係、及びＦＲＥＴの発生について説明する。
　図２は、ドナー分子がＣＦＰ、アクセプター分子がＹＦＰである場合のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルを示す図である。曲線Ａ１はドナー分子のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ａ２はドナー分子の蛍光放射スペクトルである。また、曲線Ｂ１はアクセプター分子のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ｂ２はアクセプター分子の蛍光放射スペクトルである。
　図２に示されるように、ドナー分子が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４０５ｎｍ～４５０ｎｍである。また、アクセプター分子が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４７０ｎｍ～５３０ｎｍである。
　一般に、ドナー分子とアクセプター分子との距離が２ｎｍ以下である場合、レーザ光の照射によりドナー分子が吸収したエネルギーの一部が、クーロン相互作用によりアクセプター分子へ移動する。アクセプター分子は、クーロン相互作用によりドナー分子から移動したエネルギーを吸収することにより励起され、蛍光を発する。この現象は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれる。
　ドナー分子としてＣＦＰを用い、アクセプター分子としてＹＦＰを用いた場合もＦＲＥＴが発生する。すなわち、クーロン相互作用によりドナー分子からアクセプター分子へエネルギーが移動することにより、アクセプター分子が励起されたことに起因する蛍光を発する。
　さらに、図２に示されるように、ドナー分子のエネルギー吸収スペクトルＡ１とアクセプター分子のエネルギー吸収スペクトルＢ１は、一部重複している。そのため、アクセプター分子は、レーザ光により直接励起されたことに起因する蛍光を発する。
　図１に戻り、計測部４０は、管路２０を挟んでレーザ光源部３０と対向するように配置されている。計測部４０は、測定点を通過するサンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、サンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。計測部４０から出力される信号は、制御・処理部１００に供給される。計測部４０から制御・処理部１００に供給される信号は、サンプル１２が管路２０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
　計測部５０は、測定点を通り、レーザ光源部３０から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交する平面と、測定点を通り、管路２０中のサンプル１２の移動方向に対して直交する平面との交線上に配置されている。計測部５０は、測定点にてレーザ光を照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光する光電子倍増管やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を備える。
　ここで、図３を参照して、計測部５０の構成の詳細を説明する。図３に示されるように、計測部５０は、レンズ系５１と、ダイクロイックミラー５２と、バンドパスフィルター５３，５４と、光電変換器５５，５６と、を備える。
　レンズ系５１は、サンプル１２が発する蛍光を集束させる。ダイクロイックミラー５２は、アクセプター分子が発する蛍光を透過し、ドナー分子が発する蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められている。
　バンドパスフィルター５３，５４は、光電変換器５５，５６の受光面の前面に設けられる。バンドパスフィルター５３，５４は、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させる。具体的には、バンドパスフィルター５３は、ドナー分子が主に蛍光を発する波長帯域（図２においてＡで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。また、バンドパスフィルター５４は、アクセプター分子が主に蛍光を発する波長帯域（図２においてＢで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。以下の説明では、図２においてＡで示される帯域を「ドナーチャンネル」、Ｂで示される帯域を「アクセプターチャンネル」と呼ぶ。
　なお、図２に示されるように、ドナー分子の蛍光放射スペクトルを示す曲線Ａ２はアクセプターチャンネルを通り、アクセプター分子の蛍光放射スペクトルを示す曲線Ｂ２はドナーチャンネルを通る。そのため、ドナーチャンネルの蛍光を透過するように設定されたバンドパスフィルター５３では、ドナー分子が発した蛍光だけでなく、アクセプター分子が発した蛍光がわずかに透過する。同様に、アクセプターチャンネルの蛍光を透過するように設定されたバンドパスフィルター５４では、アクセプター分子が発した蛍光だけでなく、ドナー分子が発した蛍光がわずかに透過する。後述するように、分析装置１５０は、観測行列を用いて、各チャンネルに漏れ込んだ蛍光を含む蛍光信号を補正し、ドナー分子が発する蛍光の情報とアクセプター分子が発する蛍光の情報を求める。
　光電変換器５５，５６は、受光した光を電気信号に変換する。光電変換器５５，５６は、例えば、光電子倍増管を備えたセンサである。光電変換器５５，５６が受光する蛍光は、強度変調されたレーザ光よりも位相が遅れている。そのため、光電変換器５５，５６は、強度変調されたレーザ光に対する位相差の情報を持った光信号を受光し、電気信号に変換する。光電変換器５５，５６から出力された信号（蛍光信号）は、制御・処理部１００に供給される。
　ここで、図４を参照して、制御・処理部１００の構成の詳細を説明する。図４に示されるように、制御・処理部１００は、信号生成部１１０と、信号処理部１２０と、コントローラ１３０と、を備える。
　信号生成部１１０は、レーザ光の強度を時間変調するための変調信号を生成する。変調信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号であり、１０ＭＨｚ～１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
　信号生成部１１０は、発振器１１２と、パワースプリッタ１１４と、増幅器１１６，１１８と、を備える。発振器１１２により生成された変調信号は、パワースプリッタ１１４により分けられ、レーザ光源部３０と信号処理部１２０とに供給される。信号生成部１１０が変調信号を信号処理部１２０に供給するのは、後述するように、変調信号に対する蛍光信号の位相差を測定するための参照信号として用いるためである。また、変調信号は、レーザ光源部３０が出射するレーザ光の振幅を変調するための信号として用いられる。
　信号処理部１２０は、光電変換器５５，５６から出力される蛍光信号を用いて、サンプル１２が発する蛍光の情報を抽出する。サンプル１２が発する蛍光の情報は、例えば、蛍光の強度に関する情報や、蛍光の寿命に関する情報である。信号処理部１２０は、増幅器１２２，１２４と、位相差検出器１２６と、を備える。
　増幅器１２２，１２４は、光電変換器５５，５６から出力される信号を増幅し、増幅した信号を位相差検出器１２６に出力する。
　位相差検出器１２６は、光電変換器５５，５６から出力された蛍光信号のそれぞれについて、変調信号（参照信号）に対する位相差を検出する。位相差検出器１２６は、不図示のＩＱミキサを備えている。ＩＱミキサは、参照信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。また、ＩＱミキサは、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。
　コントローラ１３０は、信号生成部１１０が所定の周波数の正弦波信号を生成するように、信号生成部１１０を制御する。また、コントローラ１３０は、信号処理部１２０により出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を求める。
　コントローラ１３０は、ローパスフィルタ１３２と、増幅器１３４と、Ａ／Ｄ変換器１３６と、システム制御器１３８と、を備える。ローパスフィルタ１３２は、信号処理部１２０から出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分と高周波成分を含む信号から、高周波成分を取り除く。増幅器１３４は、ローパスフィルタ１３２によって高周波成分が取り除かれた信号である、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅し、Ａ／Ｄ変換器１３６に出力する。Ａ／Ｄ変換器１３６は、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号をサンプリングし、分析装置１５０に供給する。システム制御器１３８は、計測部４０から出力されるトリガ信号の入力を受ける。また、システム制御器１３８は、発振器１１２とＡ／Ｄ変換器１３６を制御する。
　分析装置１５０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号から、蛍光寿命、ＦＲＥＴ効率、最短蛍光寿命、ＦＲＥＴ発生率、観測行列、ドナー分子の濃度、アクセプター分子の濃度、解離定数などを算出する。
　分析装置１５０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置である。分析装置１５０の概略構成図を図５に示す。図５に示されるように、分析装置１５０は、ＣＰＵ１５２と、メモリ１５４と、入出力ポート１５６と、蛍光寿命算出ユニット１５８と、ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０と、最短蛍光寿命算出ユニット１６２と、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４と、観測行列算出ユニット１６６と、第１分子濃度算出ユニット１６８と、第２分子濃度算出ユニット１７０と、解離定数算出ユニット１７２と、を備える。
　また分析装置１５０には、ディスプレイ２００が接続されている。
　ＣＰＵ１５２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサである。ＣＰＵ１５２は、蛍光寿命算出ユニット１５８、ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０、最短蛍光寿命算出ユニット１６２、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４、観測行列算出ユニット１６６、第１分子濃度算出ユニット１６８、第２分子濃度算出ユニット１７０、及び解離定数算出ユニット１７２の各種計算を実質的に実行する。
　メモリ１５４は、コンピュータ上で実行することにより、蛍光寿命算出ユニット１５８、ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０、最短蛍光寿命算出ユニット１６２、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４、観測行列算出ユニット１６６、第１分子濃度算出ユニット１６８、第２分子濃度算出ユニット１７０、及び解離定数算出ユニット１７２を形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力ポート１５６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備える。
　入出力ポート１５６は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を受ける。また、入出力ポート１５６は、各ユニットにより算出された処理結果をディスプレイ２００に出力する。
　ディスプレイ２００は、各ユニットにより求められた各種情報や処理結果などを表示する。
　蛍光寿命算出ユニット１５８は、計測部５０で計測された蛍光信号を用いて、ドナー分子の蛍光寿命を算出する。例えば、蛍光寿命算出ユニット１５８は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値から、変調信号に対する蛍光信号の位相差を求める。また、蛍光寿命算出ユニット１５８は、求めた位相差を用いて、ドナー分子の蛍光寿命、アクセプター分子の蛍光寿命を算出する。具体的に、蛍光寿命算出ユニット１５８は、位相差のｔａｎ成分を変調信号の角周波数で除算することにより、蛍光寿命を算出する。蛍光寿命は、レーザ光の照射により発せられる蛍光成分が、１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数で表される。
　さらに、蛍光寿命算出ユニット１５８は、後述するアクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τＤ、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の平均的な蛍光寿命τ＊ Ｄ、アクセプター分子の蛍光寿命τＡを算出する。
　ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０は、蛍光寿命算出ユニット１５８で算出されたアクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τＤ、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄを用いて、ＦＲＥＴによるエネルギー移動の程度を示すＦＲＥＴ効率Ｅ＊を算出する。具体的には、ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０は、後述する式（１４）により規定されるＦＲＥＴ効率Ｅ＊を算出する。
　最短蛍光寿命算出ユニット１６２は、ＦＲＥＴ効率Ｅ＊の最大値である最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘを算出する。後述するように、式（１６）により定義される、生細胞中のドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］とアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］との比αによりＦＲＥＴ効率Ｅ＊は変化する。ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０が複数のαに対してＦＲＥＴ効率Ｅ＊を算出した結果を用いて、最短蛍光寿命算出ユニット１６２は、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘを算出する。
　また、後述する式（１８）に示されるように、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘが決まれば、ドナー分子の蛍光寿命の最小値である最短蛍光寿命τＤｍｉｎも定まるため、最短蛍光寿命算出ユニット１６２は、算出した最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘを用いて、最短蛍光寿命算出ユニット１６２が最短蛍光寿命τＤｍｉｎを算出する。
　ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４は、後述する式（７）により定義される、生細胞中のドナー分子のうち、アクセプター分子と結合し、ＦＲＥＴが発生しているドナー分子の割合κＦＲＥＴを算出する。具体的には、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４は、アクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τＤ、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄ、最短蛍光寿命τＤｍｉｎを用いて、κＦＲＥＴを算出する。より具体的には、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４は、後述する式（４９）に基づいて、κＦＲＥＴを算出する。
　なお、ＦＲＥＴ効率Ｅ＊、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘ、ドナー分子の蛍光寿命τＤ、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄ、最短蛍光寿命τＤｍｉｎは、後述する式（１４）、式（１８）により示される関係がある。そのため、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４は、式（１４）、式（１８）の関係を満たす互いに等価な物理量を適宜用いて、κＦＲＥＴを算出することができる。
　観測行列算出ユニット１６６は、後述する式（３１）により定義される観測行列を算出する。具体的には、ドナー分子のみ発現させたサンプル、アクセプター分子のみ発現させたサンプルにレーザ光を照射し、蛍光信号を計測した結果に基づき、後述する式（４０）から式（４３）に基づいて、観測行列を算出する。観測行列算出ユニット１６６により算出された観測行列は、ドナーチャンネルを透過した蛍光信号、及びアクセプターチャンネルを透過した蛍光信号を補正することにより、ドナー分子が発する蛍光の情報、及びアクセプター分子が発する蛍光の情報を求めるために用いられる。
　第１分子濃度算出ユニット１６８は、ドナー分子が発する蛍光の情報を用いて、生細胞であるサンプル１２中のドナー分子の濃度を算出する。具体的には、第１分子濃度算出ユニット１６８は、後述する式（５１）に基づいて、ドナー分子の濃度を算出する。
　第２分子濃度算出ユニット１７０は、アクセプター分子が発する蛍光の情報を用いて、生細胞であるサンプル１２中のドナー分子の濃度を算出する。具体的には、第２分子濃度算出ユニット１７０は、後述する式（５２）に基づいて、アクセプター分子の濃度を算出する。
　解離定数算出ユニット１７２は、後述する式（１９）により定義される、ドナー分子とアクセプター分子の結合の強さに関するパラメータである解離定数Ｋｄを算出する。具体的には、解離定数算出ユニット１７２は、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４が算出したκＦＲＥＴ、第１分子濃度算出ユニット１６８が算出したドナー分子の濃度、第２分子濃度算出ユニット１７０が算出したアクセプター分子の濃度、を用いて、解離定数Ｋｄを算出する。より具体的には、解離定数算出ユニット１７２は、後述する式（２０）又は式（２１）に基づいて、解離定数Ｋｄを算出する。
＜ＦＲＥＴ測定方法の概要＞
　以下、ＦＲＥＴ測定で用いる各種定数について説明する。
　図６は、ＦＲＥＴ測定方法の一例を示す図である。図６に示されるように、まず、第１の事前測定において、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘと最短蛍光寿命τＤｍｉｎを測定する。また、第２の事前測定において、観測行列を測定する。次に、本測定であるサンプル測定において、生細胞である測定サンプル中のドナー分子のうち、ＦＲＥＴが発生しているドナー分子の割合であるκＦＲＥＴを測定する。次に、測定したκＦＲＥＴを用いて、ドナー分子とアクセプター分子の結合の度合を示す解離定数Ｋｄを測定する。
　まず、レーザ光の出力と、このレーザ光により励起される蛍光分子の電子数との関係について説明する。単位時間、単位体積あたりに励起される蛍光分子の電子数をＮ０［１／ｍ３ｓ］とすると、ランバート・ベールの法則より、Ｎ０は以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　ここで、ＪＬ［１／ｍ２ｓ］はレーザ光の単位面積あたり、単位時間あたりのエネルギー（光子数）、Ａ［ｍ２］はレーザ光が照射される面積、ε［１／Ｍｍ］は蛍光分子のモル吸光係数、Ｃ［Ｍ］は蛍光分子の濃度、ｌ［ｍ］は光路長、Ｖ［ｍ３］はレーザ光を照射される物体の体積である。
　蛍光分子の濃度が十分低い場合、式（１）は、以下のように近似できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　また、レーザ光の波長をλ［ｍ］，出力をＰ［Ｗ］とすると、以下の関係が成り立つ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　ここで、ｈ［Ｊ・ｓ］はプランク定数、ｃ［ｍ／ｓ］は光速度である。
　レーザ光の断面形状を楕円形とし、強度分布は２次元ガウス分布であると仮定する。このとき、直径がＤｃ［ｍ］である円形の生細胞がレーザ光を照射されることによって受ける平均的なパワーＪｅｘ［１／ｍ２ｓ］は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　ここで、ＫＣはレーザ光の断面全体のパワーに対して生細胞に照射されるパワーの割合である。ＫＣは、例えば、シンプソンの公式などの積分手法を用いて求められる。
　式（２）、式（４）より、レーザ光により励起される単位時間、単位体積当たりの蛍光分子電子数Ｎｅｘ（ｔ）は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 　ここで、上記のように定義されるＫｅｘＤ，ＫｅｘＡは、後述するように、第２の事前測定において、観測行列を求める際に用いられる。また、ＫｅｘＤ，ＫｅｘＡは、後述するように、ドナー分子の濃度、及びアクセプター分子の濃度を求める際に用いられる。ＫｅｘＤ，ＫｅｘＡは、定数としてメモリ１５４に記憶され、適宜、読み出される。
　なお、蛍光分子が光を吸収し、その電子が励起状態に遷移するのにかかる時間（１０－１５秒程度）は、発光遷移過程（１０－９秒程度）と比較して十分短いため、電子が励起状態に遷移するのにかかる時間は無視することができる。
（κＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ効率Ｅ＊、α）
　次に、励起された電子の遷移過程とκＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ効率Ｅ＊、αとの関係について説明する。最低次の励起状態にある電子数をＮ（ｔ）とすると、Ｎ（ｔ）は以下の関係式を満たす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 　ここで、ｋｆ［１／ｓ］は発光遷移の速度定数、ｋｎｒ［１／ｓ］は無輻射遷移の速度定数である。上述した式（６）の関係式は、ドナー分子、アクセプター分子のそれぞれについて成り立つ。以下の説明では、ドナー分子に関する変数や定数には、添字Ｄを付する。また、アクセプター分子に関する変数や定数には、添字Ａを付する。
　次に、生細胞であるサンプル１２中のドナー分子のうち、アクセプター分子と結合し、ＦＲＥＴが発生しているドナー分子の割合をκＦＲＥＴと定義する。すなわち、生細胞中のドナー分子の濃度をＣＤ［Ｍ］、ＦＲＥＴが発生している分子の濃度をＣＤＡ［Ｍ］とすると、κＦＲＥＴは以下の関係式を満たす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
 　平衡状態において、κＦＲＥＴは定数である。
　ＦＲＥＴが発生することによる共鳴エネルギー移動の速度定数をｋｔ［１／ｓ］、ドナー分子の最低次の励起状態にある電子数をＮＤ（ｔ）、アクセプター分子の最低次の励起状態にある電子数をＮＡ（ｔ）とする。式（６）に共鳴エネルギー移動の速度定数ｋｔを考慮すると、ＦＲＥＴが発生しているドナー分子、ＦＲＥＴが発生していないドナー分子の励起電子数は、それぞれ式（８）、式（９）のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
 　ここで、ｋｆＤ［１／ｓ］はドナー分子の発光遷移の速度定数、ｋｎｒＤ［１／ｓ］はドナー分子の無輻射遷移の速度定数、ＫｅｘＤＰ（ｔ）はレーザ光により励起される単位時間、単位体積当たりのドナー分子の電子数である。
　同様に、アクセプター分子全体の励起電子について、以下の関係式が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 　ここで、ｋｆＡ［１／ｓ］はアクセプター分子の発光遷移の速度定数、ｋｎｒＡ［１／ｓ］はアクセプター分子の無輻射遷移の速度定数、ＫｅｘＡＰ（ｔ）はレーザ光により励起される単位時間、単位体積当たりのアクセプター分子の電子数である。
　ｋＤ≡ｋｆＤ＋ｋｎｒＤ、ｋＡ≡ｋｆＡ＋ｋｎｒＡとすると、ドナー分子、アクセプター分子の励起状態にある電子数に関する微分方程式は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　ここで、ＦＲＥＴによるエネルギー移動の程度を示すＦＲＥＴ効率Ｅ＊を、以下のように定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 　τＤはアクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命である。τＤと速度定数との関係は、以下のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　ＦＲＥＴ効率Ｅ＊は、生細胞中のドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］とアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］との比によって変化する。ここで、生細胞中のドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］とアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］との比αを以下のように定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　図７に示されるように、ＦＲＥＴ効率Ｅ＊は、αが大きくなると飽和する。これは、αが大きくなると生細胞中のほとんど全てのドナー分子においてＦＲＥＴが発生すると考えられるためである。生細胞中の全てのドナー分子においてＦＲＥＴが発生することは、κＦＲＥＴが１であることを意味する。κＦＲＥＴ＝１のときのドナー分子の蛍光寿命を最短蛍光寿命τＤｍｉｎと呼ぶ。また、ＦＲＥＴ効率Ｅ＊が飽和する値を最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘと呼ぶ。式（１４）より、最短蛍光寿命τＤｍｉｎ、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘは、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
（解離定数Ｋｄ）
　次に、ドナー分子とアクセプター分子の結合の強さに関するパラメータとして、解離定数Ｋｄを以下のように定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
 　ここで、ＣＤｆｒｅｅ［Ｍ］はアクセプター分子と結合していないドナー分子の濃度、ＣＡｆｒｅｅ［Ｍ］はドナー分子と結合していないアクセプター分子の濃度である。式（７）と式（１６）を用いることにより、式（１９）は以下のように表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
 　解離定数Ｋｄの値が小さいほど、ドナー分子とアクセプター分子の結合が強いことを意味する。したがって、αが小さく、ドナー分子の濃度ＣＤやアクセプター分子の濃度ＣＡが小さいという条件においては、κＦＲＥＴが大きいほど、ドナー分子とアクセプター分子の分子間相互作用が強い。
　解離定数Ｋｄは、図６に示すように、サンプル測定において求められる。
（観測行列）
　観測行列は、上述したように、ドナーチャンネルとアクセプターチャンネルの蛍光信号から、ドナー分子が発する蛍光の情報、及びアクセプター分子が発する蛍光の情報を求めるために用いる行列である。
　まず、ドナー分子の蛍光量ＦＤ、アクセプター分子の蛍光量ＦＡは、励起状態にある電子数に発光遷移の速度定数を乗じることにより、以下の関係式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
 　式（２２）、式（２３）をラプラス変換し、式（１１）～式（１３）をラプラス変換したものを代入すると、ドナー分子の蛍光量ＦＤ、アクセプター分子の蛍光量ＦＡのラプラス方程式は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
 　ここで、アクセプター分子の蛍光寿命をτＡ≡１／ｋＡとし、式（１５）、式（１７）を用いると、式（２４）、式（２５）は以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
　本実施形態では、以下の式で表される出力Ｐ（ｔ）のレーザ光を生細胞に照射する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
 　このとき、式（２６）、式（２７）の微分方程式をラプラス変換し、ｓ＝ｊω（ｓはラプラス演算子）とすると、周波数応答は以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
　上述したように、蛍光を計測する際には、バンドパスフィルターで波長領域を限定した後、光電子倍増管などの光電変換器で計測を行う。図３において、ドナーチャンネルのバンドパスフィルター５３と光電変換器５５を通して計測される蛍光量をＦＤＣｈ（ｊω）、アクセプターチャンネルのバンドパスフィルター５４と光電変換器５６を通して計測される蛍光量をＦＡＣｈ（ｊω）とすると、以下のような関係式が成り立つ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000022
 　ここで、ＷＤはドナーチャンネルのバンドパスフィルター５３による重み係数、ＷＡはアクセプターチャンネルのバンドパスフィルター５４による重み係数である。また、ＷＡＤはアクセプター分子が発した蛍光のドナーチャンネルへの漏れ込み係数、ＷＤＡはドナー分子が発した蛍光のアクセプターチャンネルへの漏れ込み係数である。また、ＫＤＣｈはドナーチャンネルの光電変換器５５の感度を含むゲインであり、ＫＡＣｈはアクセプターチャンネルの光電変換器５６の感度を含むゲインである。ＦＲＥＴ発生時の蛍光発光のダイナミクスをモデル図に表すと図８に示されるようになる。式（３１）の２行２列の行列を、以下、観測行列と呼ぶ。
　式（３１）は、観測行列を用いることにより、計測されたドナーチャンネルとアクセプターチャンネルの蛍光信号からドナー分子やアクセプター分子が発した蛍光の情報を精度よく求めることが可能となることを意味する。
　以下、観測行列の求め方について説明する。
　まず、ドナー分子のみ発現させたサンプルにレーザ光を照射し、蛍光信号を計測する。このとき発せられる蛍光は、式（２９）、式（３０）において、κＦＲＥＴ＝０、ｋｆＡ＝ＫｅｘＡ＝０という条件で計測していることと等しいため、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000023
 　式（３２）、式（３３）と式（３１）を用いると、バンドパスフィルターを通して計測される蛍光信号は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000024
　同様に、アクセプター分子のみ発現させたサンプルにレーザ光を照射し、蛍光信号を計測する。このとき発せられる蛍光は、式（２９）、式（３０）において、ｋｔ＝０、ｋｆＤ＝ＫｅｘＤ＝０という条件で計測していることと等しいため、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000025
 　式（３６）、式（３７）と式（３１）を用いると、バンドパスフィルターを通して計測される蛍光信号は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000026
 　式（３８）、式（３９）の実数部は、蛍光信号のｃｏｓ成分に相当する。また、式（３８）、式（３９）の虚数部は、蛍光信号のｓｉｎ成分に相当する。
　ここで、ドナー分子の量子収率をφＤ、アクセプター分子の量子収率をφＡとすると、φＤ＝ｋｆＤτＤ、φＡ＝ｋｆＡτＡである。これと式（５）を用いると、式（３４）、式（３５）、式（３８）、式（３９）の振幅は、それぞれ以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000027
　量子収率φＤ、φＡは、文献値から求めることも可能であるし、計測により求めることも可能である。また、ドナー分子のモル吸光係数εＤ、アクセプター分子のモル吸光係数εＡは、文献値から求めることも可能であるし、計測により求めることも可能である。また、レーザ光の波長λも既知の値である。レーザ光の断面全体のパワーに対して生細胞に照射されるパワーの割合であるＫＣ、円形の生細胞の直径がＤｃも別途求めることができる。また、アクセプター分子が存在しないときのドナー分子の蛍光寿命τＤ、アクセプター分子の蛍光寿命τＡもフローサイトメータ１０を用いて求めることができる。これらの数値の情報は、メモリ１５４に記録される。
　図９は、ドナー分子のみ発現させたサンプル、アクセプター分子のみ発現させたサンプルにレーザ光を照射して、蛍光信号を計測した際に得られる結果の一例を示す図である。
　図９（ａ）は、ドナー分子のみ発現させたサンプルを用意し、異なるドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］に対してドナーチャンネルの蛍光信号を計測した結果を示すグラフである。図９（ａ）に示されるグラフの傾きを求めることにより、式（４０）からＫＤＣｈＷＤの値が求まる。また、図９（ｂ）は、ドナー分子のみ発現させたサンプルを用意し、異なるドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］に対してアクセプターチャンネルの蛍光信号を計測した結果を示すグラフである。図９（ｂ）に示されるグラフの傾きを求めることにより、式（４１）からＫＡＣｈＷＤＡの値が求まる。
　また、図９（ｃ）は、アクセプター分子のみ発現させたサンプルを用意し、異なるアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］に対してドナーチャンネルの蛍光信号を計測した結果を示すグラフである。図９（ｃ）に示されるグラフの傾きを求めることにより、式（４２）からＫＤＣｈＷＡＤの値が求まる。また、図９（ｄ）は、アクセプター分子のみ発現させたサンプルを用意し、異なるアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］に対してアクセプターチャンネルの蛍光信号を計測した結果を示すグラフである。図９（ｄ）に示されるグラフの傾きを求めることにより、式（４３）からＫＡＣｈＷＡの値が求まる。
　以上のようにして、観測行列を求めることができる。観測行列の値は、メモリ１５４に記憶されるとともに、サンプル測定時にメモリ１５４から読み出されて用いられる。
（ドナー分子の平均的な蛍光寿命τ＊ Ｄ、ドナー分子の濃度ＣＤ）
　次に、サンプル測定において求めるドナー分子の平均的な蛍光寿命τ＊ Ｄ、ドナー分子の濃度ＣＤについて説明する。
　観測行列が求まれば、式（３１）を用いて、計測された蛍光信号から、レーザ光の照射によりドナー分子が発した蛍光の情報を求めることができる。具体的には、計測により求まる蛍光信号であるＦＤＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω），ＦＡＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω）に観測行列の逆行列を乗じることにより、下記のように、ドナー分子が発した蛍光の情報ＦＤ（ｊω）／Ｐ（ｊω）を求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000028
 　ここで、式（２９）は以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
 　ここで、位相角成分は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000030
 　このとき、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の平均的な蛍光寿命τ＊ Ｄは、以下の関係式を満たす。
　τ＊ Ｄは、式（４８）を用いて、蛍光寿命算出ユニット１５８により求められる。なお、以下の説明では、ドナー分子の平均的な蛍光寿命τ＊ Ｄを単にドナー分子の蛍光寿命と呼ぶ。
　ここで、式（４６）～式（４８）をκＦＲＥＴについて解くと、以下の式が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000032
　また、式（４５）の振幅情報は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000033
 　ここで、ｋｆＤτＤ＝φＤと式（５）より、ドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］が以下のように求まる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000034
 　ＣＤは、式（５１）を用いて、第１分子濃度算出ユニット１６８により求められる。
（アクセプター分子の濃度ＣＡ）
　ドナー分子の濃度の算出と同様に、観測行列が求まれば、式（３１）を用いて、計測された蛍光信号から、レーザ光の照射によりアクセプター分子が発した蛍光の情報を求めることができる。具体的には、計測により求まる蛍光信号であるＦＤＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω），ＦＡＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω）に観測行列の逆行列を乗じることにより、式（４４）のように、アクセプター分子が発した蛍光の情報ＦＡ（ｊω）／Ｐ（ｊω）を求めることができる。式（３０）と式（５）より、ＦＲＥＴ発生時のアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］が以下のように求まる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000035
 　アクセプター分子の濃度ＣＡは、式（５２）を用いて、第２分子濃度算出ユニット１７０により求められる。ここで、ＫｅｘＡは実数であるから、下記式（５３）から求まるＫｅｘＡの位相は０となるはずである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000036
 　ＫｅｘＡの位相は０になるか否かを調べることにより、ＦＲＥＴを正しく評価できているか否かを確認することができる。
　式（５１）、式（５２）よりαが求まるため、式（２０）または式（２１）により、解離定数Ｋｄを求めることができる。解離定数Ｋｄは、解離定数算出ユニット１７２で求められる。
＜ＦＲＥＴ測定方法＞
　本実施形態のＦＲＥＴ測定方法では、サンプル１２の生細胞中のドナー分子のうち、アクセプター分子と結合し、ＦＲＥＴが発生しているドナー分子の割合κＦＲＥＴや、解離定数Ｋｄを測定するために、予めいくつかのパラメータを測定しておく必要がある。以下の説明では、サンプル１２のκＦＲＥＴや解離定数Ｋｄを求めるための測定を「サンプル測定」と呼び、サンプル測定を行うために予め行う測定を「事前測定」と呼ぶ。以下、まず、事前測定について説明する。
＜事前測定＞
（最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘ、最短蛍光寿命τＤｍｉｎの測定）
　まず、第１の事前測定として、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘと最短蛍光寿命τＤｍｉｎを測定する。図１０は、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘと最短蛍光寿命τＤｍｉｎを測定するフローチャートの一例である。
　まず、式（１６）により定義される、生細胞中のドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］とアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］との比αが異なる複数のサンプル１２を準備する（ステップＳ１０１）。
　次に、図１を参照して説明したフローサイトメータを用い、式（１４）で定義されるＦＲＥＴ効率Ｅ＊を各サンプル１２に対して測定する（ステップＳ１０２）。具体的には、蛍光寿命算出ユニット１５８が算出した蛍光寿命を用いて、ＦＲＥＴ効率算出ユニット１６０がＦＲＥＴ効率Ｅ＊を算出する。
　最短蛍光寿命算出ユニット１６２は、各サンプル１２に対するＦＲＥＴ効率Ｅ＊の測定結果を図７に示すようにプロットし、αを十分大きくした場合にＦＲＥＴ効率Ｅ＊が漸近する値から、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘを取得する（ステップＳ１０３）。
　次に、最短蛍光寿命算出ユニット１６２は、式（１８）から、最短蛍光寿命τＤｍｉｎを算出する（ステップＳ１０４）。具体的には、最短蛍光寿命算出ユニット１６２は、算出した最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘを用いて、最短蛍光寿命τＤｍｉｎを算出する。
　本実施形態によれば、第１の事前測定において、最大ＦＲＥＴ効率Ｅｍａｘと最短蛍光寿命τＤｍｉｎとを測定しておくことにより、ドナー分子の濃度に対するアクセプター分子の濃度の割合に影響を受けることなく、ＦＲＥＴ測定を定量的に行うことができる。
（観測行列の測定）
　次に、第２の事前測定として、観測行列を測定する。図１１は、観測行列を測定するフローチャートの一例である。図１１（ａ）は、ドナー分子を精製し、アクセプター分子を含まない溶液を用いた測定方法の一例を示し、図１１（ｂ）は、アクセプター分子を精製し、ドナー分子を含まない溶液を用いた測定方法の一例を示す。
　図１１（ａ）に示されるように、まず、ドナー分子を精製した溶液を準備する（ステップＳ２０１）。
　次に、不図示の吸光光度計を用いて、ドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］を測定する（ステップＳ２０２）。
　次に、レーザ光源部３０が、ドナー分子が主にエネルギーを吸収する波長（例えば、４０７ｎｍ）のレーザ光を照射し、計測部５０が、ドナーチャンネル、アクセプターチャンネルのそれぞれに対する蛍光信号を計測する（ステップＳ２０３）。
　次に、計測された蛍光信号の振幅を、分析装置１５０が取得する（ステップＳ２０４）。
　蛍光信号の振幅を分析装置１５０が所定数（例えば、５点）取得していない場合、ドナー分子の濃度を希釈し（ステップＳ２０５）、ステップＳ２０２に戻る。以後、蛍光信号の振幅を分析装置１５０が所定数取得するまで、ステップＳ２０２～Ｓ２０５を繰り返す。
　蛍光信号の振幅を分析装置１５０が所定数取得した場合、観測行列算出ユニット１６６は、図９（ａ），（ｂ）に示すように、蛍光信号の振幅をドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］に対してプロットし、その傾きから、式（４０）、式（４１）に基づき、観測行列の成分を算出する（ステップＳ２０６）。
　また、図１１（ｂ）に示されるように、アクセプター分子を精製した溶液を準備する（ステップＳ３０１）。
　次に、不図示の吸光光度計を用いて、アクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］を測定する（ステップＳ３０２）。
　次に、レーザ光源部３０が、ドナー分子が主にエネルギーを吸収する波長（例えば、４０７ｎｍ）のレーザ光を照射し、計測部５０が、ドナーチャンネル、アクセプターチャンネルのそれぞれに対する蛍光信号を計測する（ステップＳ３０３）。
　次に、計測された蛍光信号の振幅を、分析装置１５０が取得する（ステップＳ３０４）。
　蛍光信号の振幅を分析装置１５０が所定数（例えば、５点）取得していない場合、アクセプター分子の濃度を希釈し（ステップＳ３０５）、ステップＳ３０２に戻る。以後、蛍光信号の振幅を分析装置１５０が所定数取得するまで、ステップＳ３０２～Ｓ３０５を繰り返す。
　蛍光信号の振幅を分析装置１５０が所定数取得した場合、観測行列算出ユニット１６６は、図９（ｃ），（ｄ）に示すように、蛍光信号の振幅をアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］に対してプロットし、その傾きから、式（４２）、式（４３）に基づき、観測行列の成分を算出する（ステップＳ３０６）。
　本実施形態によれば、第２の事前測定において観測行列を測定しておくことにより、サンプル測定において測定されるドナーチャンネルとアクセプターチャンネルの各蛍光信号から、バンドパスフィルターによる重み係数や漏れ込み係数、光電変換器の感度を含むゲインの影響を低減し、サンプル１２が発した蛍光の情報をより精度よく求めることができる。
　事前測定により測定された値は、メモリ１５４に記憶され、サンプル測定時に適宜、読み出される。
＜サンプル測定＞
　事前測定が終了した後に、本測定であるサンプル測定を行う。図１２は、サンプル測定のフローチャートの一例である。
（κＦＲＥＴの測定）
　まず、図１を参照して説明したフローサイトメータを用い、サンプル１２にレーザ光を照射し、サンプル１２が発する蛍光を計測することにより、ドナーチャンネルとアクセプターチャンネルのそれぞれについて蛍光信号を計測する（ステップＳ４０１）。これは、式（４４）のＦＤＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω），ＦＡＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω）の値を計測することを意味する。したがって、式（４４）に示されるように、ＦＤＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω），ＦＡＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω）に観測行列の逆行列を乗じることにより、ドナー分子が発する蛍光の情報ＦＤ（ｊω）／Ｐ（ｊω）、及びアクセプター分子が発する蛍光の情報ＦＡ（ｊω）／Ｐ（ｊω）を求めることができる。
　次に、蛍光寿命算出ユニット１５８が、ドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄを算出する（ステップＳ４０２）。具体的には、蛍光寿命算出ユニット１５８が、光電変換器５５から出力された蛍光信号の変調信号に対する位相差から、上述した式（４８）に基づき、ドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄを算出する。
　次に、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４が、ステップＳ４０２で測定されたサンプル１２のドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄを用い、κＦＲＥＴを算出する（ステップＳ４０３）。具体的には、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４が、ドナー分子の蛍光寿命τ＊ Ｄを用いて、式（４９）に基づいて、κＦＲＥＴを算出する。式（４９）の最短蛍光寿命τＤｍｉｎは、上述した第１の事前測定において求められ、メモリ１５４から読み出された値を用いる。
　本実施形態によれば、事前測定において予め最短蛍光寿命τＤｍｉｎを測定しているため、κＦＲＥＴを求めることができる。また、本実施形態によれば、従来は測定する方法が知られていなかったκＦＲＥＴを測定することが可能となるため、κＦＲＥＴを用いて後述するように解離定数Ｋｄを求めることができる。
（ドナー分子の濃度ＣＤの測定）
　次に、第１分子濃度算出ユニット１６８が、サンプル１２のドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］を算出する（ステップＳ４０４）。具体的には、第１分子濃度算出ユニット１６８は、ドナー分子が発する蛍光の情報を用いて、式（５１）に基づいて、サンプル１２のドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］を算出する。式（５１）の｜ＦＤ（ｊω）／Ｐ（ｊω）｜は、式（４４）に示されるように、計測により求まる蛍光信号ＦＤＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω），ＦＡＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω）に、観測行列の逆行列を乗じることにより求まる。観測行列は、上述した第２の事前測定において求められた値を用いる。
（アクセプター分子の濃度ＣＡの測定）
　次に、第２分子濃度算出ユニット１７０が、サンプル１２のアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］を算出する（ステップＳ４０５）。具体的には、第２分子濃度算出ユニット１７０は、アクセプター分子が発する蛍光の情報を用いて、式（５２）に基づいて、サンプル１２のアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］を算出する。式（５２）の｜ＦＡ（ｊω）／Ｐ（ｊω）｜は、式（４４）に示されるように、計測により求まる蛍光信号ＦＤＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω），ＦＡＣｈ（ｊω）／Ｐ（ｊω）に、観測行列の逆行列を乗じることにより求まる。観測行列は、上述した第２の事前測定において求められた値を用いる。
　本実施形態によれば、事前測定において予め観測行列を測定しているため、ドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］、アクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］を精度よく求めることができる。また、本実施形態によれば、ドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］、アクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］を用いて、後述するように解離定数Ｋｄを求めることができる。
（解離定数Ｋｄの測定）
　次に、解離定数算出ユニット１７２が、サンプル１２の解離定数Ｋｄを算出する（ステップＳ４０６）。具体的には、解離定数算出ユニット１７２は、ＦＲＥＴ発生率算出ユニット１６４が算出したκＦＲＥＴ、第１分子濃度算出ユニット１６８が算出したドナー分子の濃度ＣＤ［Ｍ］、第２分子濃度算出ユニット１７０が算出したアクセプター分子の濃度ＣＡ［Ｍ］を用いて、式（２０）または式（２１）に基づき、解離定数Ｋｄを算出する。
　本実施形態によれば、従来は測定する方法が知られていなかった、生細胞のタンパク質を標識するドナー分子とアクセプター分子の結合の強さに関するパラメータである解離定数Ｋｄを測定することができる。
　なお、ステップＳ４０１～Ｓ４０６の順番は、図１２を参照して説明した順番に限られるものではなく、適宜、順番を入れ替えても本発明を実施することができる。
　以上、本発明のＦＲＥＴ測定方法及び装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、任意の時間変化を有する波形で強度変調されたレーザ光を測定サンプルに照射し、スペクトル解析法、フーリエ解析法、パラメータ推定法などにより、蛍光強度や蛍光寿命を求める手法を本発明に適用することもできる。
１０　フローサイトメータ
１２　サンプル
２０　管路
２２　回収容器
３０　レーザ光源部
４０，５０　計測部
５１　レンズ系
５２　ダイクロイックミラー
５３，５４　バンドパスフィルター
５５，５６　光電変換器
１００　制御・処理部
１１０　信号生成部
１１２　発振器
１１４　パワースプリッタ
１１６，１１８　増幅器
１２０　信号処理部
１２２，１２４　増幅器
１２６　位相差検出部
１３０　コントローラ
１３２　ローパスフィルタ
１３４　増幅器
１３６　Ａ／Ｄ変換器
１３８　システム制御器
１５０　分析装置
１５２　ＣＰＵ
１５４　メモリ
１５６　入出力ポート
１５８　蛍光寿命算出ユニット
１６０　ＦＲＥＴ効率算出ユニット
１６２　最短蛍光寿命算出ユニット
１６４　ＦＲＥＴ発生率算出ユニット
１６６　観測行列算出ユニット
１６８　第１分子濃度算出ユニット
１７０　第２分子濃度算出ユニット
１７２　解離定数算出ユニット
２００　ディスプレイ

Claims (14)

  1. 　第１分子および第２分子で標識された測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定方法であって、
    　第１分子の濃度と第２分子の濃度との比が異なる複数の事前測定サンプルに対して、第１分子の蛍光寿命を算出し、第１分子の蛍光寿命の最小値を算出する最短蛍光寿命算出ステップと、
    　強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射する照射ステップと、
    　前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測ステップと、
    　前記計測ステップにおいて計測された蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出するステップと、
    　前記最短蛍光寿命算出ステップで算出された第１分子の蛍光寿命の最小値と、算出された前記第１分子の蛍光寿命とを用いて、前記測定サンプル中の第１分子のうちＦＲＥＴが発生している第１分子の割合を算出するＦＲＥＴ発生率算出ステップと、
    を有することを特徴とするＦＲＥＴ測定方法。
  2. 　前記ＦＲＥＴ発生率算出ステップでは、第２分子が存在しないときの第１分子の蛍光寿命をさらに用いて、前記割合を求める、請求項１に記載のＦＲＥＴ測定方法。
  3. 　前記計測ステップにおいて計測された蛍光信号から、前記照射ステップにおいてレーザ光が照射されることにより第１分子が発する蛍光の情報と第２分子が発する蛍光の情報を求めるための行列を算出する観測行列算出ステップを有し、
    　前記観測行列算出ステップは、
    　　第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求める第１ステップと、
    　　第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求める第２ステップと、
    を有する、請求項１又は２に記載のＦＲＥＴ測定方法。
  4. 　前記ＦＲＥＴ発生率算出ステップにおいて算出された前記割合を用いて、第１分子と第２分子との結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出ステップを有する、請求項１乃至３のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定方法。
  5. 　前記第１分子の蛍光寿命を算出するステップは、前記計測ステップにおいて計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する、請求項１乃至４のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定方法。
  6. 　前記第１ステップは、第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測される蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求め、
    　前記第２ステップは、第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、計測される蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求める、請求項３に記載のＦＲＥＴ測定方法。
  7. 　第１分子が発する蛍光の情報を用いて、第１分子の濃度を算出する第１分子濃度算出ステップと、
    　第２分子が発する蛍光の情報を用いて、第２分子の濃度を算出する第２分子濃度算出ステップと、を有し、
    　前記解離定数算出ステップでは、前記第１分子濃度算出ステップにおいて算出された第１分子の濃度と、前記第２分子濃度算出ステップにおいて算出された第２分子の濃度と、を用いて、前記解離定数を算出する、請求項４に記載のＦＲＥＴ測定方法。
  8. 　第１分子および第２分子で標識された測定サンプルにレーザ光を照射し、第１分子から第２分子へエネルギーが移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を測定するＦＲＥＴ測定装置であって、
    　強度が時間変調されたレーザ光を前記測定サンプルに照射するレーザ光源部と、
    　前記レーザ光を照射された前記測定サンプルが発する蛍光を計測する計測部と、
    　前記計測部が計測した蛍光信号を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出部と、
    　第１分子の濃度と第２分子の濃度との比が異なる複数の事前測定サンプルにおける第１分子の蛍光寿命を用いて、第１分子の蛍光寿命の最小値を算出する最短蛍光寿命算出部と、
    　前記最短蛍光寿命算出部で算出された第１分子の蛍光寿命の最小値と、前記蛍光寿命算出部で算出された第１分子の蛍光寿命とを用いて、前記測定サンプル中の第１分子のうちＦＲＥＴが発生している第１分子の割合を算出するＦＲＥＴ発生率算出部と、
    を備えることを特徴とするＦＲＥＴ測定装置。
  9. 　前記ＦＲＥＴ発生率算出部は、第２分子が存在しないときの第１分子の蛍光寿命をさらに用いて、前記割合を求める、請求項８に記載のＦＲＥＴ測定装置。
  10. 　前記計測部で計測された蛍光信号から、前記測定サンプルにレーザ光が照射されることにより第１分子が発する蛍光の情報と第２分子が発する蛍光の情報を求めるための行列を算出する観測行列算出部を有し、
    　前記観測行列算出部は、
    　　第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求め、かつ、
    　　第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号を用いて、前記行列の成分の一部を求める、請求項８又は９に記載のＦＲＥＴ測定装置。
  11. 　前記ＦＲＥＴ発生率算出部において算出された前記割合を用いて、第１分子と第２分子との結合の度合いを示す解離定数を算出する解離定数算出部を有する、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定装置。
  12. 　前記蛍光寿命算出部は、前記計測部で計測された蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、第１分子の蛍光寿命を算出する、請求項８乃至１１のいずれかに記載のＦＲＥＴ測定装置。
  13. 　前記観測行列算出部は、
    　　第１分子を含むが第２分子を含まないサンプルであって、第１分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求め、かつ、
    　　第２分子を含むが第１分子を含まないサンプルであって、第２分子の濃度が異なる複数のサンプルに、強度を時間変調したレーザ光を照射し、前記計測部で計測された蛍光信号の振幅、及び、前記蛍光信号と前記レーザ光を変調する変調信号との位相差を用いて、前記行列の成分の一部を求める、請求項１０に記載のＦＲＥＴ測定装置。
  14. 　第１分子が発する蛍光の情報を用いて、第１分子の濃度を算出する第１分子濃度算出部と、
    　第２分子が発する蛍光の情報を用いて、第２分子の濃度を算出する第２分子濃度算出部と、を有し、
    　前記解離定数算出部は、前記第１分子濃度算出部において算出された第１分子の濃度と、前記第２分子濃度算出部において算出された第２分子の濃度と、を用いて、前記解離定数を算出する、請求項１１に記載のＦＲＥＴ測定装置。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019026413A1 (ja) * 2017-08-01 2019-02-07 シャープ株式会社 液体中微粒子分析システムおよび液体中微粒子分析方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4866964B2 (ja) * 2010-05-12 2012-02-01 三井造船株式会社 Ｆｒｅｔ測定方法及びｆｒｅｔ測定装置
AU2011269660B2 (en) * 2010-06-23 2015-08-13 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation An absorption probe for measuring dissolved organic carbon in an aqueous sample
JP5585973B2 (ja) * 2012-03-22 2014-09-10 三井造船株式会社 Ｆｒｅｔ計測装置及びｆｒｅｔ計測方法
FR3020874A1 (fr) * 2014-05-12 2015-11-13 Univ Bourgogne Procede de detection d'un transfert d'energie par resonance de fluorescence et cytometre en flux pour la mise en œuvre de ce procede
AU2015279009B2 (en) 2014-06-27 2020-01-30 Wallac Oy A device and a method for detecting a sample contained by a sample well
CN105548120B (zh) * 2016-01-27 2018-07-31 湖南君瀚信息技术有限公司 一种荧光共振能量转移多成分荧光寿命估计方法
CN105675568B (zh) * 2016-01-27 2018-11-23 湖南君瀚信息技术有限公司 一种用于时间相关单光子计数的多成分荧光寿命及成分比例估计方法
CN109557015B (zh) * 2016-11-01 2021-05-25 北京信息科技大学 流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法
CN106706587B (zh) * 2017-01-11 2019-03-29 华南师范大学 一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的fret定量检测修正方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002542453A (ja) * 1998-08-08 2002-12-10 インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド 生物学的系についての蛍光分析法
JP2007240424A (ja) 2006-03-10 2007-09-20 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd Ｆｒｅｔ検出方法および装置
WO2008078526A1 (ja) * 2006-12-26 2008-07-03 Olympus Corporation 蛍光共鳴エネルギー移動を用いたｄｎａとｄｎａ結合性タンパク質の相互作用の検出方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183066B2 (en) * 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
BRPI0414987A (pt) * 2003-10-01 2006-11-21 Wallac Oy ensaio aperfeiçoado homogêneo de transferência de energia com resolução no tempo

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002542453A (ja) * 1998-08-08 2002-12-10 インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド 生物学的系についての蛍光分析法
JP2007240424A (ja) 2006-03-10 2007-09-20 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd Ｆｒｅｔ検出方法および装置
WO2008078526A1 (ja) * 2006-12-26 2008-07-03 Olympus Corporation 蛍光共鳴エネルギー移動を用いたｄｎａとｄｎａ結合性タンパク質の相互作用の検出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENNIS E. EPPS ET AL.: "A Fluorescence Resonance Energy Transfer Method for Measuring the Binding of Inhibitors to Stromelysin", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 275, 1999, pages 141 - 147, XP008155282 *
NARIYUKI NAKATA ET AL.: "Development of fluorescence lifetime FRET flow cytometer", MITSUI ZOSEN TECHNICAL REVIEW, 2007, pages 54 - 60, XP008155331 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019026413A1 (ja) * 2017-08-01 2019-02-07 シャープ株式会社 液体中微粒子分析システムおよび液体中微粒子分析方法
JPWO2019026413A1 (ja) * 2017-08-01 2020-07-27 シャープ株式会社 液体中微粒子分析システムおよび液体中微粒子分析方法

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