CN106706587A

CN106706587A - 一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的fret定量检测修正方法

Info

Publication number: CN106706587A
Application number: CN201710020313.7A
Authority: CN
Inventors: 陈同生; 杜孟艳
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: Normal University Rayleigh Optoelectronic Technology (Qingyuan) Co.,Ltd.
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2037-01-11
Also published as: CN106706587B

Abstract

本发明公开一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法，属于FRET定量检测技术领域。该方法包括以下步骤：测量参照样本的激发发射光谱；将参照样本的激发发射光谱按照S_D和S_A，以及S_S进行线性分离得到三个权重因子；利用三个权重因子计算ExEm‑spFRET定量检测的系统修正因子，然后用于待测样本的表观FRET效率的测量。利用本发明获得的系统修正因子修正后的ExEm‑spFRET方法即m‑ExEm‑spFRET方法测量结果更加准确，而且适用于不同的检测系统。因此本发明必将极大地推动ExEm‑spFRET方法的应用范围，进而提高FRET检测技术在细胞生物学中的应用范围。

Description

一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法

技术领域

本发明属于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)定量检测技术领域，具体涉及一种基于激发光谱和发射光谱同时分离(以下简称激发发射(ExEm)光谱分离)的FRET定量检测(ExEm-spFRET)修正方法。

背景技术

基于荧光蛋白的FRET技术已经成为研究活细胞内基本生化事件的有力工具。FRET定量检测是学术交流和不同实验室检测结果相互比较的必然要求。FRET效率(E，供体转移给受体的能量与供体吸收总能量的比值)是表征FRET定量化的一个重要指标。FRET的发生需要供体的发射谱与受体的激发谱有较大的重叠。由于荧光蛋白激发谱在短波有较长的拖尾，这就使得激发供体的时候不可避免地会激发受体从而带来受体激发串扰(简称激发串扰)。同样的，荧光蛋白的发射谱在长波波段有较长拖尾，这就使得收集受体荧光的时候不可避免地收集到供体的荧光从而带来了供体发射串扰(简称发射串扰)。基于激发发射光谱分离的定量FRET测量技术(ExEm-spFRET)能够同时克服受体激发串扰和供体发射串扰。

Mustafa等人[S.Mustafa,et al.“Quantitativeresonance energytransfer efficiency measurements using simultaneous spectral unmixing ofexcitation and emission spectra,”J.Biomed.Opt.18(2),026024(2013)]已经在共聚焦显微镜上实现了双波长激发的定量ExEm-spFRET检测。最近，我们采用液晶可调滤波器(LCTF)将宽场显微镜与emCCD连接起来建立了可实现多波长激发的宽场光谱显微成像系统，并在该系统上实现了基于四个激发波长激发的定量ExEm-spFRET检测[Mengyan Du,etal.“Wide-field microscopic FRET imaging using simultaneous spectral unmixingof excitation and emission spectra,”Opt.Express 24(14),16037-16051(2016)]。我们的测量结果表明利用ExEm-spFRET方法测量FRET效率值普遍偏大。而且我们后续的实验研究结果表明ExEm-spFRET方法测量结果的偏差主要与系统的具体设置参数有关。

发明内容

为了利用ExEm-spFRET方法进行准确的FRET定量测量，必须针对特定的测量系统对ExEm-spFRET方法进行修正。本发明的目的在于提供一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法。首次提出引入一个系统修正因子(f_sc)来修正ExEm-spFRET技术的概念。对于一个给定的受体-供体对和特定的光学检测系统，该系统修正因子不变。通过将f_sc引入ExEm-spFRET方法从而得到经过系统修正的ExEm-spFRET方法即m-ExEm-spFRET方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法，包括如下步骤：

(1)系统修正因子(f_sc)的测量：

利用一个FRET效率(E_app(ref))已知的FRET参照样本测量f_sc；测量参照样本的激发发射光谱(S_DA(ref))，将S_DA(ref)按照三个激发发射光谱基矢(供体的激发发射光谱基矢(S_D)、受体的激发发射光谱基矢(S_A)、以及供受体敏化的激发发射光谱基矢(S_S))进行线性分离得到三个权重因子W_D(ref)(供体激发发射光谱所占权重)，W_A(ref)(受体激发发射光谱所占权重)和W_S(ref)(供受体敏化激发发射光谱所占权重)；将测得的W_D(ref)、W_A(ref)、W_S(ref)、E_app(ref)和受供体量子产额之比r_Q代入公式(1)，得到f_sc；

(2)待测样本的表观FRET效率

测量待测样本的激发发射光谱(S_DA)，将S_DA按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子W_D，W_A和W_S；将测得的f_sc、W_D、W_A、W_S和受供体量子产额之比r_Q代入公式(2)，得到待测样本的表观FRET效率；

其中，W′_S＝W_S/f_sc，W′_D＝W_D；或者W′_S＝W_S，W′_D＝W_Df_sc。

步骤(1)中所述的参照样本的表观FRET效率既可以利用文献测量结果，也可以采用寿命测量法、通道敏化强度测量法以及受体光漂白方法等FRET定量检测技术测量得到。

ExEm-spFRET方法和修正的ExEm-spFRET方法(m-ExEm-spFRET)

将系统修正因子f_sc引入如下的ExEm-spFRET公式(Du et al.,2016)

得到如下修正的m-ExEm-spFRET公式

其中，W′_S＝W_S/f_sc，W′_D＝W_D；或者W′_S＝W_S，W′_D＝W_Df_sc，E_app表示样本的表观FRET效率(本文所说FRET效率均表示表观FRET效率)，W_D表示供体激发发射光谱所占权重，W_A表示受体激发发射光谱所占权重，W_S表示供受体敏化激发发射光谱所占权重；r_Q表示受体量子产额(Q_A)与供体量子产额(Q_D)之比。

整理(4)式得到：

f_sc可以借助一个FRET效率已知的FRET参照样本得到。

一种系统修正因子(f_sc)的测量方法，包括如下步骤：

(1)单独转染供体样本和受体样本，经过测量和计算得到供体的激发发射光谱基矢(S_D)，受体的激发发射光谱基矢(S_A)，以及供受体敏化的激发发射光谱基矢(S_S)；

(2)用一个FRET效率已知的参照样本，测量该FRET参照样本的激发发射谱(S_DA(ref))，并将S_DA(ref)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子W_D(ref)，W_A(ref)和W_S(ref)；

S_DA(ref)＝W_D(ref)·S_D+W_S(ref)·S_S+W_A(ref)·S_A (5)

(3)将得到的W_D(ref)、W_A(ref)、W_S(ref)和该参照样本的FRET效率以及受供体量子产额之比r_Q代入公式(1)得到系统修正因子(f_sc)：

为了更好的阐述本发明，下面以一个测量的实例进行说明：

供体和受体：供体为Cerulean(简称C)，受体为Venus(简称V)。

FRET参照样本C32V：由32个氨基酸的连接序列(TSGLETRDIRSENLYFQGPREFPGGTAGPVAT)将C和V链接组成的FRET串联质粒结构。

具体测量过程如下：

(1)在人的肝癌细胞(HepG2细胞)中单独转染并表达供体C(简称单转C)和受体V(简称单转V)。

(2)用宽场荧光显微镜和相机测量C和V的激发谱和发射谱。选择405±10nm、436±10nm，470±10nm和480±10nm四个激发波段作为激发光；选择470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六发射波段作为探测通道。经过测量和计算可以得到归一化的C的激发谱和发射谱以及归一化的V的激发谱和发射谱

(3)根据和的外积得到供体的激发发射光谱基矢(S_D)，和的外积得到受体的激发发射光谱基矢(S_A)，以及和的外积得到供受体敏化的激发发射光谱基矢(S_S)：

(4)测量C32V参照样本的激发发射谱(S_DA(C32V))。用405±10nm和436±10nm两个激发波段的激发光分别激发C32V参照样本，分别得到发射通道470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm下C32V样本的荧光强度；再用470±10nm和480±10nm两个激发波长的激发光分别激发C32V参照样本，分别得到发射通道510±10nm、530±10nm、550±10nm和585±20nm下C32V样本的荧光强度；从而得到C32V的激发发射谱(S_DA(C32V))。

(5)根据公式(5)将S_DA(C32V)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子W_D(C32V)、W_A(C32V)和W_S(C32V)。

(6)将步骤(5)得到W_D(C32V)，W_A(C32V)和W_S(C32V)以及C32V的FRET效率和受供体的量子产额之比(r_Q)带入公式(1)得到系统修正因子(f_sc)：

本发明的基本原理如下：

测量得到一个FRET效率已知的参照样本的激发发射谱(S_DA(ref))，并将S_DA(ref)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子W_D(ref)，W_A(ref)和W_S(ref)：

S_DA＝W_D(ref)·S_D+W_S(ref)·S_S+W_A(ref)·S_A (5)

将得到的W_D(ref)、W_A(ref)、W_S(ref)、该参照样本的FRET效率以及受供体量子产额之比r_Q代入公式(1)得到系统修正因子(f_sc)：

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

利用本发明测量的系统修正因子对ExEm-spFRET方法修正后得到的m-ExEm-spFRET方法不仅测量结果更加准确，而且适用于不同的检测系统。因此本发明必将极大地推动ExEm-spFRET方法的应用范围，进而提高FRET检测技术在细胞生物学中的应用范围。

附图说明

图1是供体(S_D)和受体(S_A)以及供受体敏化(S_S)的激发发射光谱基矢；其中，(a)左图为单转C和V的激发光谱图像；白色区域为所选发荧光的细胞区域(Cell)，灰色区域为所选背景区域(BG)；(a)右图为根据(a)左图白色区域对应的单转C和V的归一化激发谱；(b)左图为单转C和V的发射光谱图像；白色区域为所选发荧光的细胞区域(Cell)，灰色区域为所选背景区域(BG)；(b)右图为根据(b)左图白色区域对应的单转C和V的归一化发射谱；(c)左图是归一化的供体和受体的激发谱的统计结果(的获得统计了32个表达了C的HepG2细胞，的获得统计了24个表达了V的HepG2细胞)；(c)右图是归一化的供体和受体的发射谱的统计结果(的获得统计了32个表达了C的HepG2细胞，的获得统计了24个表达了V的HepG2细胞)；(d)是供体(S_D)、受体(S_A)和供受体敏化(S_S)激发发射光谱基矢。

图2是利用C32V参照样本测量系统修正因子(f_sc)；其中，(a)是表达C32V的HepG2细胞的激发发射光谱图像；(b)是图(a)对应的系统修正因子(f_sc)的伪彩图和柱形图。

图3是利用ExEm-spFRET和m-ExEm-spFRET测量待测CVC质粒的FRET效率(E)值；其中，(a)表达CVC的HepG2细胞的激发发射光谱图像；(b)上图是利用ExEm-spFRET方法测量图(a)的FRET效率(E)的伪彩图和柱形图；(b)下图是利用m-ExEm-spFRET方法测量得到的图(a)的FRET效率(E)的伪彩图和柱形图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.质粒来源

供体荧光基团为基因编码荧光蛋白Cerulean(简称C)，受体为基因编码荧光蛋白Venus(简称V)，参照串联C32V质粒由32个氨基酸的连接序列(TSGLETRDIRSENLYFQGPREFPGGTAGPVAT)将C和V链接组成的，参照串联CTV质粒即Cerulean-TRAF-Venus，其中TRAF是一个包括229个氨基酸的长链肿瘤坏死因子的受体相关因子域；待测串联质粒CVC(Cerulean-5-Venus-5-Cerulean)包含两个供体C和一个受体V，C和V之间由5个氨基酸序列连接，这些质粒都购于美国addgene质粒库[Koushik S V,Blank P S,Vogel S S.Anomalous surplusenergy transfer observed with multiple FRET acceptors[J].PloS one,2009,4(11):e8031]。

2.宽场光谱显微成像系统

宽场荧光显微镜产自日本奥林巴斯公司，型号为IX73。光源是日本奥林巴斯HGLGPS系列的氙灯。物镜是放大倍数为40、数值孔径为1.3(40×1.3NA)的油镜，一个装有四个激发片的激发转轮，一个装有八个cube(每个cube中可安装激发片、分光片、发射片各一个)的转轮，一个装有六个发射片的发射转轮，外接一个CCD相机。激发光波长通过转动激发转轮进行选择。

3.细胞培养以及质粒转染

HepG2细胞来自中国广州中山大学，用DMEM培养基加入10％的新生牛血清放在含有5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养。细胞用胰蛋白酶消化，转到细胞培养皿中，培养24小时后，当细胞生长至70～90％时，用体外转染试剂Turbofect^TM将质粒短暂转入细胞。

质粒转染的具体步骤：(1)取两只灭菌的EP管，每个EP管中先加入40μL无血清的DMEM。然后向一只EP管中加入1～2μL的转染试剂，另一只EP管中加入1～2μL(500～600ng/μL)的质粒，静置5分钟；(2)5分钟后，将两只EP管混匀，轻轻吹打6～8次后静置20分钟，(3)20分钟后，将420μL的无血清的DMEM加入到刚刚混匀的EP管中，轻轻混匀；(4)用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，主要洗去死细胞等脏污，然后把上述的(3)中的混合物移到培养皿中，把培养皿重新放回培养箱中4～6小时；(5)4～6小时后，吸去转染液，然后用用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，再往培养皿中加入含有新生牛血清的DMEM培养基，培养24～48小时即可用于实验。

4.FRET样本的测量过程

4.1.通过分别单转C样本和单转V样本以及C32V参照样本测量系统修正因子(f_sc)

测量三个激发发射光谱基矢。将载有单独表达供体C和受体V的HepG2细胞的培养皿置于载物台，选择405±10nm、436±10nm、470±10nm和480±10nm四个激发波段作为激发光，470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六个发射波段作为探测通道，测得归一化的C和V的激发谱(图1(a))以及C和V的发射谱(图1(b))。统计六个视野32个细胞得到平均的归一化的C的激发谱(图1(c)左)和发射谱(图1(c)右)；统计六个视野24个细胞得到平均的归一化的V的激发谱(图1(c)左)和发射谱(图1(c)右)。将和代入公式(6)计算出供体的激发发射光谱基矢(S_D)，受体的激发发射光谱基矢(S_D)和供受体敏化的激发发射光谱基矢(S_S)，如图1(d)所示。

利用C32V参照样本测量系统修正因子(f_sc)。测出C32V参照样本的激发发射光谱(S_DA(C32V))图像(图2(a))，将S_DA(C32V)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子W_D(C32V)，W_A(C32V)和W_S(C32V)。将得到的W_D(ref)，W_A(ref)，W_S(ref)，该参照样本的FRET效率E＝0.3以及从文献查到的受供体量子产额之比r_Q＝0.57/0.62代入公式(1)得到系统修正因子(f_sc)。图2(b)为图2(a)对应的f_sc的伪彩图和柱形图。统计10个视野大概120个细胞得到f_sc＝1.7153±0.0249。

4.2.分别用ExEm-spFRET和m-ExEm-spFRET方法测量待测样本CVC的FRET效率

测出CVC的激发发射光谱(S_DA(CVC))图像(图3(a))，将S_DA(CVC)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，计算得到三个权重因子W_D(CVC)，W_A(CVC)和W_S(CVC)。将测得的W_D(CVC)、W_A(CVC)、W_S(CVC)和从文献查到的受供体量子产额之比r_Q＝0.57/0.62代入公式(3)得到ExEm-spFRET方法测量的CVC的FRET效率。将测得的f_sc、W_D(CVC)、W_A(CVC)、W_S(CVC)和从文献查到的受供体量子产额之比r_Q＝0.57/0.62代入公式(2)得到m-ExEm-spFRET方法测量的CVC的FRET效率。图3(b)上图为用ExEm-spFRET方法测得的(图3(a))对应的FRET效率(E)的伪彩图和柱形图，图3(b)下图为用m-ExEm-spFRET方法测得的(图3(a))对应的FRET效率(E)的伪彩图和柱形图。统计6个视野大概100个细胞用ExEm-spFRET方法测得的CVC的FRET效率E＝0.5478±0.0053，而用m-ExEm-spFRET方法测测得的CVC的FRET效率E＝0.4072±0.0045。用m-ExEm-spFRET方法测量的CVC的FRET效率(E)与文献报道的CVC的FRET效率E＝0.40±0.01[H.Chen et al.,“Measurements of FRET Efficiency and Ratio of Donorto Acceptor Concentration in living Cells,”Biophys.J.91(5),L39-L41(2006)]一致。

另外，参照样本的FRET效率也可以采用寿命测量法、通道敏化强度测量法以及受体光漂白方法等FRET定量检测技术测量得到。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)系统修正因子f_sc的测量：

利用一个FRET效率E_app(ref)已知的FRET参照样本测量f_sc；测量参照样本的激发发射光谱S_DA(ref)，将S_DA(ref)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子W_D(ref)，W_A(ref)和W_S(ref)；将测得的W_D(ref)、W_A(ref)、W_S(ref)、E_app(ref)和受供体量子产额之比r_Q代入公式(1)，得到f_sc；

f_{s c} = \frac{W_{S} (r e f) - W_{S} (r e f) E_{a p p} (r e f)}{E_{a p p} (r e f) W_{D} (r e f) r_{Q}} - - - (1)

(2)待测样本的表观FRET效率

测量待测样本的激发发射光谱S_DA，将S_DA按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离得到三个权重因子W_D，W_A和W_S；将测得的f_sc、W_D、W_A、W_S和受供体量子产额之比r_Q代入公式(2)，得到待测样本的表观FRET效率；

E_{a p p} = \frac{W_{S}^{'}}{W_{D}^{'} r_{Q} + W_{S}^{'}} - - - (2);

其中，W′_S＝W_S/f_sc，W′_D＝W_D；或者W′_S＝W_S，W′_D＝W_Df_sc；

步骤(1)中所述的三个激发发射光谱基矢为供体的激发发射光谱基矢S_D、受体的激发发射光谱基矢S_A、以及供受体敏化的激发发射光谱基矢S_S；

步骤(1)中所述的W_D(ref)为供体激发发射光谱所占权重，W_A(ref)为受体激发发射光谱所占权重，W_S(ref)为供受体敏化激发发射光谱所占权重。

2.根据权利要求1所述的基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法，其特征在于：

一种系统修正因子f_sc的测量方法，包括如下步骤：

(1)单独转染供体样本和受体样本，经过测量和计算得到供体的激发发射光谱基矢S_D，受体的激发发射光谱基矢S_A，以及供受体敏化的激发发射光谱基矢S_S；

(2)用一个FRET效率已知的参照样本，测量该FRET参照样本的激发发射谱S_DA(ref)，并将S_DA(ref)按照三个激发发射光谱基矢进行线性分离，得到三个权重因子W_D(ref)，W_A(ref)和W_S(ref)；

S_DA(ref)＝W_D(ref)·S_D+W_S(ref)·S_S+W_A(ref)·S_A (5)

(3)将得到的W_D(ref)、W_A(ref)、W_S(ref)和该参照样本的FRET效率以及受供体量子产额之比r_Q代入公式(1)得到系统修正因子f_sc：

f_{s c} = \frac{W_{S} (r e f) - W_{S} (r e f) E_{a p p} (r e f)}{E_{a p p} (r e f) W_{D} (r e f) r_{Q}} - - - (1) .

3.根据权利要求1或2所述的基于激发光谱和发射光谱同时分离的FRET定量检测修正方法，其特征在于：

所述的参照样本的表观FRET效率既能利用文献测量结果，也能采用寿命测量法、通道敏化强度测量法以及受体光漂白方法测量得到。