CN105445245A

CN105445245A - 一种基于荧光共振能量转移技术的多巴胺5受体抑制剂高通量筛选方法

Info

Publication number: CN105445245A
Application number: CN201510828236.9A
Authority: CN
Inventors: 何玲; 沈灵; 孙丹丹; 严明; 张陆勇
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明发现了一种筛选多巴胺5受体抑制剂高通量筛选方法，本发明中利用实验中利用多巴胺5受体和Gs蛋白耦联，激活AC，使cAMP含量增加，会产生带有荧光的产物，通过荧光强弱来判断多巴胺5受体的作用，从而得出化合物是否有多巴胺5受体抑制作用。包括以下步骤：(1)多巴胺5受体抑制剂筛选模型的建立与优化：确定多巴胺和多巴胺5受体细胞反应的最适浓度；(2)阳性药验证模型可靠性：阳性药IC₅₀与参考文献一致。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。

Description

一种基于荧光共振能量转移技术的多巴胺5受体抑制剂高通量筛选方法

技术领域

本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了多巴胺5受体抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对多巴胺5受体抑制活性的高通量检测。

技术背景

多巴胺受体属于G蛋白耦联受体(GPCR)，根据其药理学特征和信号转导通路的不同分为D1类和D2类多巴胺受体。D1类受体包括D1、D5两种亚型，D2类受体包括D2、D3、D4三种亚型。D1类受体与Gs蛋白耦联，激活AC，使cAMP含量增加，cAMP进而激活蛋白激酶A(PKA)并引发多种生理功能。目前发现，D5多巴胺受体拮抗剂可改善精神分裂症以及具有抗精神病症状的作用，所以筛选多巴胺受体拮抗剂具有重要应用价值。

时间分辨荧光技术(time-resolvedfluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

实验中利用多巴胺5受体和Gs蛋白耦联，激活AC，使cAMP含量增加，会产生带有荧光的产物，通过荧光强弱来判断多巴胺5受体的作用，从而得出化合物是否有抑制多巴胺5受体作用，可以实现对多巴胺5受体抑制剂的高通量筛选模型的建立。

目前，少有对于多巴胺5受体抑制剂的筛选方法，因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于荧光的多巴胺5受体抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用荧光方法建立体外多巴胺5受体抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制多巴胺5受体活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用荧光的方法建立了一种多巴胺5受体抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：多巴胺5受体抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：多巴胺5受体细胞浓度梯度优化实验结果。

图2：多巴胺浓度梯度优化实验结果。

图3：阳性药SCH39166对多巴胺5受体的抑制曲线图。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

一、多巴胺5受体抑制剂筛选方法建立

1、实验材料

d2-cAMP检测试剂盒(Cisbio，法国)、多巴胺(Sigma-aldrich，美国)、SCH39166(Sigma-aldrich，美国)、DMEM、FBS(Gibco，美国)384孔聚丙烯微孔板Cat#3573(Corning，美国)、一次性枪头(Axygen，美国)

2、实验步骤

1)多巴胺5受体细胞最适浓度确定

1)配制不同浓度的多巴胺5受体细胞，每孔加入5μl。

2)每孔加入5μl含多巴胺的1×反应buffer。

4)室温反应45分钟。

5)加入10μl×终止buffer，室温孵育1小时。检测荧光强度，确定最适多巴胺5受体细胞浓度(见图2)。

(2)多巴胺最适浓度确定

1)配制不同浓度的多巴胺，每孔加入5μl。

2)每孔加入5μl重悬多巴胺5受体细胞的1×反应buffer。

4)室温孵育45分钟。

5)加入10μl×终止buffer，室温孵育1小时。检测荧光强度，确定最适乙酰胆碱浓度(见图1)。

(3)阳性药(SCH39166)IC₅₀

1)配制不同浓度的SCH39166，每孔加入2.5μl。

2)配制最适浓度的多巴胺，每孔加入2.5μl(空白对照加5μl1×反应buffer)

3)配制给定浓度的多巴胺受体细胞，每孔加入5μl。

4)室温反应45分钟。

5)加入10μl×终止buffer，室温孵育1小时。检测荧光强度，计算得出SCH39166的IC₅₀(见图3)。

2.数据处理

1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610)；

2)根据公式计算各孔的相对抑制率

3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC₅₀。

实验结果

多巴胺5受体筛选模型优化结果：最佳反应所需的确定多巴胺的最适浓度是22μM(见图1)，多巴胺受体细胞的最适浓度是1200cells/μl(见图2)，阳性药抑制率IC₅₀为2.5×10^-3μM(见图3)，表明采用本方法建立的多巴胺5受体抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行多巴胺5受体抑制剂的高通量筛选。

Claims

1.一种多巴胺5受体抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：

(1)多巴胺5受体抑制剂筛选模型的建立与优化；

(2)阳性药验证模型可靠性；

(3)高通量筛选模型验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行确定多巴胺和多巴胺5受体细胞最适浓度的实验。

3.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，配制不同浓度的多巴胺，每孔加入5μl，再每孔加入5μl含多巴胺5受体细胞的1×反应buffer，室温孵育45分钟，检测荧光强度，确定最适多巴胺浓度为22μM；配制不同浓度的多巴胺5受体细胞，每孔加入5μl，再每孔加入5μl含多巴胺的1×反应buffer，室温孵育45分钟，检测荧光强度，确定最适多巴胺5受体细胞浓度为1200cells/μl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)配制不同浓度的阳性药SCH39166，每孔加入2.5μl，配制最适浓度的多巴胺，每孔加入5μl(空白对照加5μl1×反应buffer)，室温孵育45分钟，检测荧光强度，计算得出阳性药的IC₅₀为2.5×10^-3μM。

5.权利要求1-5中所述任一所述的方法在筛选多巴胺5受体抑制剂的应用。