CN104458670A - 一种筛选血管生成素2受体激酶抑制剂高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明发现了一种筛选血管生成素2受体激酶抑制剂高通量筛选方法,包括以下步骤:(1)血管生成素2受体激酶抑制剂筛选模型的建立与优化:进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验;(2)阳性药验证模型可靠性:选用合适浓度的激酶,ATP Km,底物Km,激酶和底物每孔分别加入2μl,再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药,加入2ul ATP开始反应,按优化时间室温孵育;每孔加入10μl终止液终止反应,室温孵育1小时后检测,分析数据得阳性药IC50;(3)高通量筛选模型验证:按照上述步骤操作,使用Biomek NXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样,计算Z因子。本发明的优点主要有:1)简便快捷;2)灵敏度高;3)结果稳定可靠,重现性好,可用于高通量筛选。
Description
技术领域
本发明属于药理学领域,利用均相时间分辨荧光检测技术,构建了血管生成素2受体酪氨酸激酶(Tie-2)抑制剂的高通量筛选模型,用于待测样品对Tie-2激酶抑制活性的高通量检测。
背景技术
Tie-2,编码1124个氨基酸,属于酪氨酸激酶受体亚类。其细胞外结构域由多个功能区组成,包括一个表皮生长因子结构域,2个免疫球蛋白类似结构域,一个型纤溶酶重复序列,细胞内部分含有1个酪氨酸激酶结构域,在该结构域中含1个激酶插入结构域,其核心在羧基末端。Tie-2是表达于内皮细胞和部分造血干细胞的酪氨酸激酶型受体,在胚胎时期血管内皮呈均匀表达;在成年动物,Tie-2主要表达于肺血管内皮以及卵泡、创口肉芽组织等血管新生活跃的内皮细胞。Angs所传递的信息都要靠Tie-2来传达。缺乏Tie-2基因的小鼠往往死于胚胎期的血管发育障碍。因此,研究Tie-2激酶抑制剂具有重大意义。
时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm,且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时,则发生荧光共振能量转移,均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒),为了避免短暂的荧光干扰,Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体,受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰,供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此,能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比,而与供受体间的距离成反比,这种方法延长了荧光检测时间,降低了短暂荧光引起的背景干扰。
目前,已有多种Tie-2激酶抑制剂的筛选方法,多利用ELISA法来筛选Tie-2激酶抑制剂,但是此方法费时费力,难以做到高通量筛选。因此,建立方便快捷准确的检测方法,特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的Tie-2激酶抑制剂高通量筛选模型,具有信噪比高,使用安全,样品消耗量小的特点。
本发明的技术方案:采用均相时间分辨荧光方法建立体外Tie-2激酶抑制剂高通量筛选模型,初筛,复筛发现一类具有抑制Tie-2激酶活性的候选化合物。具体步骤如下:
本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种Tie-2激酶抑制剂高通量筛选模型。
步骤一:Tie-2激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
步骤二:阳性药验证模型可靠性。
步骤三:高通量筛选模型验证。
附图说明:
图1:Tie-2激酶浓度梯度优化实验结果。
图2:Tie-2激酶温孵时间优化实验结果。
图3:Tie-2激酶底物浓度优化实验结果。
图4:Tie-2激酶ATP浓度优化实验结果。
图5:阳性药十字孢碱对Tie-2激酶的抑制曲线图。
图6:Tie-2激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。
图7:高通量筛选Z′值分布。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式:
1.Tie-2激酶抑制剂筛选方法建立
(1)实验材料
Tie-2激酶检测试剂盒(Cisbio,法国)、Tie-2激酶(Invitrogen,美国)、ATP(生兴,中国)、十字孢碱(碧云天,中国)、384低体积白板(Corning,美国)、枪头(Axygen,美国)。
(2)实验步骤
1)进行Tie-2激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验,见图1-4。
2)待测化合物精确称量,加入DMSO溶剂成母液,然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度,初筛浓度约为1×10-3mol/L。
3)在反应容器中每孔加入Tie-2激酶溶液2μl,底物溶液2μl,缓冲液或待筛化合物4μl,ATP2μl。室温反应1小时。
4)每孔加入Estradiol-XL665 5μl,Anti-Estradiol-cryptate 5μl,室温孵育1小时。
5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。
6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC50值,见图5。
7)采集检测信号并绘图,通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性,见图6,7。
2.数据处理
(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610);
(2)根据公式计算各孔的相对抑制率
(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值,使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC50。
实验结果
Tie-2激酶筛选模型优化结果:最佳反应所需的Tie-2激酶为0.5ng/μl(见图1),最佳温孵时间为30min(见图2),最佳底物浓度为166.5nM(见图3),最佳ATP浓度为2.274μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC50为78.45nM(见图5),并通过信噪比和Z’值(见图6,7)验证表明采用本方法建立的Tie-2激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求,实验结果稳定可靠,可以用于进行Tie-2激酶抑制剂的高通量筛选。
Claims (6)
1.一种血管生成素2受体激酶抑制剂高通量筛选模型,其特征在于,包括步骤:
(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化;
(2)阳性药验证模型可靠性;
(3)高通量筛选模型验证。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的激酶为血管生成素2受体激酶。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中进行血管生成素2受体激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,由步骤(1)可得到最佳反应所需的血管生成素2受体激酶浓度为0.5ng/μl,最佳温孵时间为30min,最佳底物浓度为166.5nM,最佳ATP浓度为2.274μM。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶,ATP Km,底物Km;将激酶和底物按1:2体积混合,每孔加入4μl,再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药,最后每孔加入2μl ATP开始反应,按优化时间室温孵育;配制SA-XL665和TK-Ab,将SA-XL665和TK Ab按体积比1:1混合,每孔加入10μl终止反应,室温孵育1小时后检测,分析数据得阳性药半数抑制率IC50为78.45nM。
6.权利要求1-5中所述任一方法在筛选血管生成素2受体激酶抑制剂的应用。
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