CN105466897A - 一种基于荧光共振能量转移技术的血管活性肠肽i型受体抑制剂高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明发现了一种筛选血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选方法,本发明中利用实验中利用血管活性肠肽I型受体和Gs蛋白耦联,激活AC,使cAMP含量增加,会产生带有荧光的产物,通过荧光强弱来判断血管活性肠肽I型受体的作用,从而得出化合物是否有血管活性肠肽I型受体抑制作用。包括以下步骤:(1)血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化:确定VIP和血管活性肠肽I型受体细胞反应的最适浓度;(2)阳性药验证模型可靠性:阳性药IC50与参考文献一致。方法简便快捷;荧光检测值灵敏度高,提高检测精确度;结果稳定可靠,重现性好。
Description
技术领域
本发明属于药理学领域,利用荧光检测技术,构建了血管活性肠肽I型受体抑制剂的高通量筛选模型,用于待测样品对血管活性肠肽I型受体抑制活性的高通量检测。
技术背景
血管活性肠肽I型受体是神经多肽与血管活性肠肽的共同受体,介导多种重要的生物学功能,如血管活性肠肽I型受体介导神经多肽与血管活性肠肽抑制食欲和抗炎的生物学功能。血管活性肠肽I型受体在大脑和T细胞大量表达,能够调节神经元分化和T细胞活化。血管活性肠肽I型受体作为血管活性肠肽受体其中一种亚型,在多种肿瘤细胞表面高水平表达,而低表达或不表达于正常组织细胞,并在肿瘤的进展和血管生成中发挥重要作用,是一具潜在应用价值的分子影像诊断和治疗靶标,所以筛选血管活性肠肽I型受体拮抗剂具有重要应用价值。
时间分辨荧光技术(time-resolvedfluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm,且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时,则发生荧光共振能量转移,均相时间分辨荧光(homogeneoustime-resolvedfluorescence,HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒),为了避免短暂的荧光干扰,Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体,受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰,供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此,能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比,而与供受体间的距离成反比,这种方法延长了荧光检测时间,降低了短暂荧光引起的背景干扰。
实验中利用血管活性肠肽I型受体和Gs蛋白耦联,激活AC,使cAMP含量增加,会产生带有荧光的产物,通过荧光强弱来判断血管活性肠肽I型受体的作用,从而得出化合物是否有抑制血管活性肠肽I型受体作用,可以实现对血管活性肠肽I型受体抑制剂的高通量筛选模型的建立。
目前,少有对于血管活性肠肽I型受体抑制剂的筛选方法,因此,建立方便快捷准确的检测方法,特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于荧光的血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型,具有信噪比高,使用安全,样品消耗量小的特点。
本发明的技术方案:采用荧光方法建立体外血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型,初筛,复筛发现一类具有抑制血管活性肠肽I型受体活性的候选化合物。具体步骤如下:
本发明利用荧光的方法建立了一种血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型。
步骤一:血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化。
步骤二:阳性药验证模型可靠性。
步骤三:高通量筛选模型验证。
附图说明:
图1:血管活性肠肽I型受体细胞浓度梯度优化实验结果。(n=1,)
图2:VIP浓度梯度优化实验结果。(n=1,)
图3:阳性药VIP(1-7)-GRF(8-27)对血管活性肠肽I型受体的抑制曲线图。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式:
一、血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选方法建立
1、实验材料
d2-cAMP检测试剂盒(Cisbio,法国)、VIP(Sigma-aldrich,美国)、VIP(1-7)-GRF(8-27)(Sigma-aldrich,美国)、DMEM、FBS(Gibco,美国)384孔聚丙烯微孔板Cat#3573(Corning,美国)、一次性枪头(Axygen,美国)
2、实验步骤
1)血管活性肠肽I型受体细胞最适浓度确定
1)配制不同浓度的血管活性肠肽I型受体细胞,每孔加入5μl。
2)每孔加入5μl含VIP的1×反应buffer。
4)室温反应45分钟。
5)加入10μl×终止buffer,室温孵育1小时。检测荧光强度,确定最适血管活性肠肽I型受体细胞浓度(见图2)。
(2)VIP最适浓度确定
1)配制不同浓度的VIP,每孔加入5μl。
2)每孔加入5μl重悬血管活性肠肽I型受体细胞的1×反应buffer。
4)室温孵育45分钟。
5)加入10μl×终止buffer,室温孵育1小时。检测荧光强度,确定最适VIP浓度(见图1)。
(3)阳性药(VIP(1-7)-GRF(8-27))IC50
1)配制不同浓度的VIP(1-7)-GRF(8-27),每孔加入2.5μl。
2)配制最适浓度的VIP,每孔加入2.5μl(空白对照加5μl1×反应buffer)
3)配制给定浓度的血管活性肠肽I型受体细胞,每孔加入5μl。
4)室温反应45分钟。
5)加入10μl×终止buffer,室温孵育1小时。检测荧光强度,计算得出VIP(1-7)-GRF(8-27)的IC50(见图3)。
2.数据处理
1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610);
2)根据公式计算各孔的相对抑制率
3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值,使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC50。
实验结果
血管活性肠肽I型受体筛选模型优化结果:最佳反应所需的确定VIP的最适浓度是236μM(见图1),血管活性肠肽I型受体细胞的最适浓度是500cells/well(见图2),阳性药抑制率IC50为2980μM(见图3),表明采用本方法建立的血管活性肠肽I型受体抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求,实验结果稳定可靠,可以用于进行血管活性肠肽I型受体抑制剂的高通量筛选。
Claims (5)
1.一种血管活性肠肽I型受体抑制剂高通量筛选模型,其特征在于,包括步骤:
(1)血管活性肠肽I型受体抑制剂筛选模型的建立与优化;
(2)阳性药验证模型可靠性;
(3)高通量筛选模型验证。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中进行确定VIP和血管活性肠肽I型受体细胞最适浓度的实验。
3.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,配制不同浓度的VIP,每孔加入5μl,再每孔加入5μl含血管活性肠肽I型受体细胞的1×反应buffer,室温孵育45分钟,检测荧光强度,确定最适VIP浓度为236μM;配制不同浓度的血管活性肠肽I型受体细胞,每孔加入5μl,再每孔加入5μl含VIP的1×反应buffer,室温孵育45分钟,检测荧光强度,确定最适多血管活性肠肽I型受体细胞浓度为500cells/well。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)配制不同浓度的阳性药VIP(1-7)-GRF(8-27),每孔加入2.5μl,配制最适浓度的VIP,每孔加入5μl(空白对照加5μl1×反应buffer),室温孵育45分钟,检测荧光强度,计算得出阳性药的IC50为2980μM。
5.权利要求1-5中所述任一所述的方法在筛选血管活性肠肽I型受体抑制剂的应用。
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CN104458670A (zh) * | 2013-09-12 | 2015-03-25 | 中国药科大学 | 一种筛选血管生成素2受体激酶抑制剂高通量筛选方法 |
CN104458671A (zh) * | 2013-09-12 | 2015-03-25 | 中国药科大学 | 一种筛选原肌球蛋白相关激酶b抑制剂高通量筛选方法 |
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CN104458670A (zh) * | 2013-09-12 | 2015-03-25 | 中国药科大学 | 一种筛选血管生成素2受体激酶抑制剂高通量筛选方法 |
CN104458671A (zh) * | 2013-09-12 | 2015-03-25 | 中国药科大学 | 一种筛选原肌球蛋白相关激酶b抑制剂高通量筛选方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CISBIO: "HTRF® KinEASE™:A universal expanded platform to address Serine/Threonine & Tyrosine kinases", 《HTTP://WWW.CISBIO.COM》 * |
史育红 等: "血管活性肠肽受体研究现状", 《国外医学(放射医学核医学分册)》 * |
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