CN104458669A

CN104458669A - 一种筛选蛋白激酶a抑制剂高通量筛选方法

Info

Publication number: CN104458669A
Application number: CN201310421024.XA
Authority: CN
Inventors: 严明; 张陆勇; 胡洁; 高鹏
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明发现了一种筛选蛋白激酶A抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)蛋白激酶A抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药IC₅₀；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NX^P自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。

Description

一种筛选蛋白激酶A抑制剂高通量筛选方法

技术领域

本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了蛋白激酶A(PKA)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对PKA激酶抑制活性的高通量检测。

背景技术

蛋白激酶A是细胞内第二信使的直接靶酶，可以通过磷酸化或脱磷酸化控制信号转导途径中其他酶或蛋白质的活性，介导cAMP的信号转导。PKA是一种别构酶，由两个催化亚基C和两个调节亚基R所构成。每个调节亚基上有2个cAMP结合位点，催化亚基催化底物蛋白质某些特定丝/苏氨酸残基磷酸化。调节亚基与催化亚基结合时PKA处于抑制状态；cAMP与调节亚基结合后改变调节亚基构型，使其与催化亚基解聚，PKA成为激活态。根据调节亚基的不同，PKA可以分为RI型、RII型两种，RI型、RII型又可以根据组织特异性的不同分为无组织特异性的α型和有组织特异性的β型。研究表明RI促进细胞生长、繁殖，RII型则与抑制细胞生长和促进细胞分化成熟有关。两者的正负调节平衡了细胞的生理功能。除调节代谢外，PKA还参与cAMP介导的转录水平调控。当PKA的催化亚基进入细胞核后，可催化反式作用因子——cAMP效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)中特定丝/苏氨酸残基磷酸化。磷酸化的CREB形成同源二聚体，与DNA上的cAMP应答元件(cAMP response element，CRE)结合，从而激活CRE调控的基因转录。另一方面，活化的PKA可以通过磷酸化Raf-1抑制其活化，封阻MAPK信号通路。因此，研究PKA激酶抑制剂具有重大意义。

时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

目前，已有多种PKA激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选PKA激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的PKA激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外PKA激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制PKA激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种PKA激酶抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：PKA激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：PKA激酶浓度梯度优化实验结果。

图2：PKA激酶温孵时间优化实验结果。

图3：PKA激酶底物浓度优化实验结果。

图4：PKA激酶ATP浓度优化实验结果。

图5：阳性药十字孢碱对PKA激酶的抑制曲线图。

图6：PKA激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。

图7：高通量筛选Z′值分布。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

1.PKA激酶抑制剂筛选方法建立

(1)实验材料

PKA激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、PKA激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Coming，美国)、枪头(Axygen，美国)。

(2)实验步骤

1)进行PKA激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。

2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol/L。

3)在反应容器中每孔加入PKA激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。室温反应1小时。

4)每孔加入Estradiol-XL6655μl，Anti-Estradiol-cryptate5μl，室温孵育1小时。

5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。

6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC₅₀值，见图5。

7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性，见图6，7。

2.数据处理

(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio 665/610)；

(2)根据公式计算各孔的相对抑制率

(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC₅₀。

实验结果

PKA激酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的PKA激酶为0.1ng/μl(见图1)，最佳温孵时间为30min(见图2)，最佳底物浓度为151nM(见图3)，最佳ATP浓度为0.1359μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC₅₀为16.3nM(见图5)，并通过信噪比和Z’值(见图6，7)验证表明采用本方法建立的PKA激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行PKA激酶抑制剂的高通量筛选。

Claims

1.一种蛋白激酶A抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：

(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化；

(2)阳性药验证模型可靠性；

(3)高通量筛选模型验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为蛋白激酶A。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行蛋白激酶A浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤(1)可得到蛋白激酶A最佳反应所需的浓度为0.1ng/μl，最佳温孵时间为30min，最佳底物浓度为151nM，最佳ATP浓度为0.1359μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km；将激酶和底物按1：2体积混合，每孔加入4μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，最后每孔加入2μll ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665和TK-Ab，将SA-XL665和TK Ab按体积比1：1混合，每孔加入10ul终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC₅₀为16.3nM。

6.权利要求1-5中所述任一方法在筛选蛋白激酶A抑制剂的应用。