CN104458673A

CN104458673A - 一种筛选p21活化的蛋白激酶2抑制剂高通量筛选方法

Info

Publication number: CN104458673A
Application number: CN201310421181.0A
Authority: CN
Inventors: 严明; 张陆勇; 胡洁; 高鹏
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明发现了一种筛选P21活化的蛋白激酶2抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)P21活化的蛋白激酶2抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药IC₅₀；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NX^P自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。

Description

一种筛选P21活化的蛋白激酶2抑制剂高通量筛选方法

技术领域

本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了P21活化的蛋白激酶2(PAK2)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对PAK2激酶抑制活性的高通量检测。

背景技术

p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho GTPase)Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白，参与许多重要的细胞活动。迄今为止，研究表明PAK家族共有6个成员，根据其结构特点及相似性，可分为两大类，I类PAK成员包括PAK1、PAK2和PAK3，II类包括PAK4、PAK5和PAK6。其中PAK2的结构与PAK1类似在大多数组织中均有表达。PAK2参与一系列的细胞生物学过程，既可以作为凋亡促进因子，也可作为凋亡抑制因子。PAK2也可以通过磷酸化MLC肌球蛋白轻链参与细胞骨架调控。因此，研究PAK2激酶抑制剂具有重大意义。

时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

目前，已有多种PAK2激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选PAK2激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的PAK2激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外PAK2激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制PAK2激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种PAK2激酶抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：PAK2激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：PAK2激酶浓度梯度优化实验结果。

图2：PAK2激酶温孵时间优化实验结果。

图3：PAK2激酶底物浓度优化实验结果。

图4：PAK2激酶ATP浓度优化实验结果。

图5：阳性药十字孢碱对PAK2激酶的抑制曲线图。

图6：PAK2激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。

图7：高通量筛选Z′值分布。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

1.PAK2激酶抑制剂筛选方法建立

(1)实验材料

PAK2激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、PAK2激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Coming，美国)、枪头(Axygen，美国)。

(2)实验步骤

1)进行PAK2激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。

2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol/L。

3)在反应容器中每孔加入PAK2激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。室温反应1小时。

4)每孔加入Estradiol-XL6655pi，Anti-Estradiol-cryptate5μl，室温孵育1小时。

5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。

6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC₅₀值，见图5。

7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性，见图6，7。

2.数据处理

(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610)；

(2)根据公式计算各孔的相对抑制率

(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC₅₀。

实验结果

PAK2激酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的PAK2激酶为0.2ng/μl(见图1)，最佳温孵时间为60min(见图2)，最佳底物浓度为581.8nM(见图3)，最佳ATP浓度为6.81μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC₅₀为6.143nM(见图5)，并通过信噪比和Z’值(见图6，7)验证表明采用本方法建立的PAK2激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行PAK2激酶抑制剂的高通量筛选。

Claims

1.一种P21活化的蛋白激酶2抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：

(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化；

(2)阳性药验证模型可靠性；

(3)高通量筛选模型验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为P21活化的蛋白激酶2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行P21活化的蛋白激酶2浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤(1)可得到最佳反应所需的P21活化的蛋白激酶2浓度为0.2ng/μ1，最佳温孵时间为60min，最佳底物浓度为581.8nM，最佳ATP浓度为6.81μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km；将激酶和底物按1：2体积混合，每孔加入4μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，最后每孔加入2μl ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665和TK-Ab，将SA-XL665和TKAb按体积比1：1混合，每孔加入10μl终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC₅₀为6.143nM。

6.权利要求1-5中所述任一方法在筛选P21活化的蛋白激酶2抑制剂的应用。