CN104280366B - 一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物化学领域，涉及一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法。本方法基于能量转移均相时间分辨荧光共振的高通量检测技术，用于快速寻找化合物靶蛋白。本方法无需质谱分析及蛋白纯化检测化合物与蛋白质结合的测量，达到了与高通量筛选兼容。与传统的利用亲和柱的药物蛋白靶检测技术比较，本方法中加入药物无需裂解细胞，不需经过洗涤过程，从而降低传统生化方法产生的假阳性。本方法具有灵敏度高、重复性好、操作相对简便的特点，可用于化合物的体外蛋白靶点的高通量筛选，以及医药产业界筛选疾病蛋白结合的化合物，及学术界对与待定蛋白功能结构域的化合物筛选等。

Description

一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法

技术领域

本发明属生物化学领域，涉及细胞水平的高通量筛选技术，特别涉及一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法。本方法基于能量转移均相时间分辨荧光共振的高通量检测技术，用于快速寻找化合物靶蛋白。

背景技术

生物信息学与制造科学相结合，是二十一世纪推动生命科学发展的最重要动力。现有技术公开了药物靶标（drug target）是指细胞内与药物相互作用，并产生药物效应的细胞内特定分子。98%以上的药物靶标属于蛋白质。研究显示，只要找到了药物作用的靶标分子就能根据其特点开发和设计药物，以及进行靶向治疗。近年来大量分子生物学技术的出现，尤其是基因组学、生物信息学、蛋白质组学、质谱联用技术及生物大分子相互作用分析技术（BIA）等推动了从纷繁复杂的细胞内生物大分子中发现特异性的药物作用靶标分子的进程。本领域研究中，通过发现药物靶标进行开发和设计特异性药物是创新性药物研发的重要途径。据了解，目前已发现药物中有接近一半并不清楚其药靶。在中国，绝大多数的有效中药的活性分子的药靶也未知。本领域技术人员知晓，明确药物药靶对明确其治疗机理、发现其新的适应症有着至关重要的作用。

均相时间分辨荧光（HTRF）是用于检测均相体系中待测物的一种最常用的技术，该技术结合荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨技术（TR），其基本原理是，当供体和受体相离很近时（小于10nm），在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰，最终得到的信号跟产物形成的量成比例。TR-FRET技术的应用加快了很多基于抗体的研究，包括GPCR（配体结合，受体二聚化，cAMP 和IP-1的检测，以及磷酸化ERK的定量），激酶，细胞因子和生物标志物，生物过程（抗体和蛋白生产），以及蛋白和蛋白，蛋白和多肽，蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。HTRF也是基于TR-FRET的化学技术，但它的许多特点把它与其他TR-FRET产品区分开来。其中一个特点就是由于使用了镧系元素，从而具有非常长的半衰期（铕和铽），镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其他所有TR-FRET产品使用的螯合技术相比能增加实验的稳定性，另外使用专利化的比值测量能矫正干扰因素。此外，HTRF技术还有以下优势：均质性（不需要洗板）、低背景、实验体积小型化和实验步骤简捷化、培养基的干扰小、与大部分酶标仪相兼容。

本申请的发明人拟提供一种为化合物的靶标发现提供新型快速、准确高效的高通量筛选手段。

发明内容

本发明的目的克服现有技术的缺陷，提供一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法。本方法基于能量转移均相时间分辨荧光共振的高通量检测技术，用于快速寻找化合物靶蛋白。

本发明方法基于：将蛋白和化合物标记后，利用HTRF技术高通量检测其相互作用，筛选药靶；其中，当特定蛋白和化合物想结合，通过HTRF产生荧光共振信号，被高通量识别，否则无信号；本发明方法采用与HTRF荧光标记结合的高通量筛选技术，在人类全基因表达库的基础上，能为化合物的靶标发现提供新型快速、准确高效的高通量筛选手段。

本发明方法主要步骤包括：（1）构建成加蛋白标签的文库（library），即先给单个基因表达序列加上标签A，之后构建全基因组的基因过表达质粒，形成library；（2）将目的化合物加可被识别的标签B；（3）将library中的基因表达质粒转染进高通量介质的细胞中，用加标签B的化合物进行处理，最后用HTRF进行筛选细胞中与之结合的化合物靶蛋白。

具体的，本发明的一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）构建携带荧光标签的蛋白文库；

（2）为待检测化合物增添可识别的标签；

（3）将构建的待测化合物与蛋白文库进行共孵育，使化合物与文库蛋白进行充分的结合；

（4）利用均相时间分辨荧光共振原理（HTRF）对加标签化合物和文库蛋白结合能力检测。

本发明中，将待测化合物标记后，与人类全基因组表达的蛋白文库进行亲和力检测。

本发明中，采用构建的人类全基因库，为每组基因增加荧光标签（例如HA-lag），构建全基因组的基因过表达质粒，形成蛋白文库；

本发明方法步骤（2）中，将根据待测试化合物的溶解性、极性和其他物理性质，选择与其匹配的标志物（例如生物素），根据标志物的特点选择孵育条件，得到携带可被识别标签的化合物；

本发明中，将构建的待测化合物与蛋白文库进行共孵育，使二者得到充分的结合，为后续的荧光共振能量转移提供反应条件；

本发明中，通过荧光共振能量转移的发生，对荧光强度进行筛选，在人类全基因组蛋白文库的基础上，通过高内涵检测设备的筛选，从而得到待测化合物结合的靶标蛋白。

更优选的，本发明通过以下技术方案实现：

（1）应用组建的携带特定蛋白标签的人类全基因库，在DNA组的XhoI和XbaI酶切位点之间插入HA标签，构建pcDNA/HA融合的表达载体，用限制性核酸内切酶分别消化纯化后的克隆产物和质粒pcDNA/HA，用T4连接酶连接后转化感受态菌，并挑选有氨苄青霉素抗性的中等大小的白色菌落在含Amp抗生素的液体LB培养基中摇动过夜，抽提质粒；重组质粒经双酶切及基因测序鉴定，进行表达得到人类全基因表达携带HA标签的蛋白；

（2）化合物进行生物素标记，联合铕联穴状化合物EuK，检测其与XL-665标记抗HA抗体的蛋白的亲和力，其原理是采用的均相时间分辨荧光免疫分析技术是基于两个荧光化合物EuK和XL-665之间的能量共振转移原理，如果化合物与蛋白之间存在结合，那么在反应过程中，标记XL-665的蛋白与结合了EuK并被生物素标记的化合物结合，使两个荧光基团间的距离小于10nm；铕联穴状化合物EuK作为能量供给基团在受到入射光340nm的激发后以能量共振的方式把能量转移给能量接受基团异藻蓝蛋白XL-665，后者接受能量后发射出的长寿命荧光670nm，可作为检测信号，而未结合的XL-665发射的短寿命荧光可通过延迟检测时间来排除对检测信号的干扰；另一方面，游离的EuK在入射光340nm的激发下发射612 nm的长寿命荧光，此信号作为背景信号；

（3）在96或384孔板中，利用点样机分别加入上述反应体系，37℃孵育24h后，在Thermo Fisher的高内涵扫描仪上进行荧光强度定量，反应结果能直接显示出化合物与何种蛋白的亲和力最强，为药物的靶点筛选提供技术支持。

本发明具有以下优点：

1，采用现有技术的已经构建的人类全基因组的蛋白表达库，能为已上市药物或新型先导化合物的靶点筛选和药效确认提供真正意义上的高通量筛选；

2，高内涵技术是高通量筛选中意义重大前景广泛的技术，设备和操作虽然相对复杂，但结果可靠，工作效率高；

3，HTRF均相时间分辨荧光免疫分析方法具有简洁高效的特点，未来将有可能取代ELISA等技术，成为新的检测手段。

本发明提供了无需质谱分析及蛋白纯化的检测化合物与蛋白质结合测量的新方法，并达到了与高通量筛选兼容。与传统的利用亲和柱的药物蛋白靶检测技术相比，其优势在于其加入药物时无需裂解细胞，也不需要经过洗涤的过程，从而降低传统生化方法产生的假阳性。本发明方法具有灵敏度高、重复性好、操作相对简便的特点，可用于化合物的体外蛋白靶点的高通量筛选，以及医药产业界筛选疾病蛋白结合的化合物，以及学术界对与待定蛋白功能结构域的化合物筛选等。

附图说明

图1是采用本发明方法高通量分析生物素分子偶联的目标蛋白的示意图，

结果显示，只有既被生物素标记，又能被目标蛋白抗体特异性结合的蛋白，才会产生荧光共振信号，根据荧光共振信号可以定量反映蛋白与候选化合物的亲和力。

具体实施方式

下面用具体的实施例结合附图进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 高通量筛选PTK激酶的抑制剂活性

实验以96孔板为反应底板，在每孔中一次加入20ul的HEPES缓冲液、10ul待测化合物（多种候选化合物）、10ul的蛋白激酶PTK，在37℃孵箱中孵育60min。然后依次加入20ul链激酶素标记的XL-665 及20ul的EuK标记的抗磷酸化的酪氨酸激酶抗体，室温反应60min。最后用赛默飞的Cellomics高内涵设备检测荧光信号，每孔检测16个视野，物镜放大X10倍，荧光参数设置如下 Em=670 nm，Ex1=670nm，Ex2=612nm，根据荧光强度自动设置曝光时间，反应设3复孔，设阴性对照及空白对照。96孔板扫描只需要60min即可完成，根据荧光结果可以分析待测化合物对蛋白激酶PTK的亲和力。

实施例2 高通量分析生物素分子偶联的目标蛋白

利用链霉亲和素（Streptavidin）和生物素（Biotin）具有特异性结合的性质，通过加入荧光基团标记了的链霉亲和素和目标蛋白抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理（HTRF），采用高内涵对被标记了的化合物与目标蛋白进行高通量、高精度、特异性的定量，从而准确地检测化合物对蛋白的亲和力。

在384孔板中加入含有一定量被生物素标记的蛋白样品，加入溶解在含400 mM氟离子缓冲液中的含有荧光受体D2标记的链霉亲和素（Streptavidin-D2，1.4 ng/μl）和铽穴状化合物（Terbium Cryptate）标记的目标蛋白特异性抗体（2B7-Tb，0.023 ng/μl），孵育1～2小时候后在高内涵仪器上检测荧光共振信号，结果显示，只有既被生物素标记，又能被目标蛋白抗体特异性结合的蛋白，才会产生荧光共振信号（如图1所示），根据荧光共振信号可以定量反映蛋白与候选化合物的亲和力。

实施案例3 抗肝癌活性的化合物高通量筛选

在联合药品库的基础上，对多种潜在的抗肝癌药物和其他先导化合物进行活性研究；将初步筛选出的化合物进行浓度稀释或配置，在实验过程中对化合物的浓度进行调整；目的蛋白通过基因克隆技术制备，增加HA标签，通过构建携带pcDNA的质粒，按Invitrogen公司Lipofectamine2000转染试剂盒说明书配制转染试剂/DNA混合液，按每孔4ul的Lipofeetamine2000试剂、2ul重组质粒及0.2 ml无血清培养基Opti-MEM配制，混匀后加入12孔板中，置37℃、5％CO2孵箱中培养48h，对获得的目的蛋白进行纯化，按照CisbioBioassay公司的HTRF试剂盒说明书，对蛋白进行荧光标记，在384孔板中，用自动加样器将以配置的生物素标记的化合物和目的蛋白依次加入，37℃孵育24h后，在高内涵设备上检测荧光信号，根据荧光强度反应，获得候选化合物对目的蛋白的结合作用。

Claims (5)

1.一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法，其特征在于，其包括将待测化合物标记后，与人类全基因组表达的蛋白文库进行亲和力检测，按下述步骤：

(1)构建携带荧光标签的蛋白文库，运用构建的人类全基因库，为每组基因增加荧光标签，构建全基因组的基因过表达质粒，形成蛋白文库，所述的荧光标签是HA-lag；

(2)为待检测化合物增添可识别的标签；

(3)将构建的步骤(2)待测化合物与步骤(1)的蛋白文库进行共孵育，使所述的化合物与文库蛋白充分的结合；

(4)利用均相时间分辨荧光共振原理(HTRF)检测加标签化合物和文库蛋白的结合能力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，根据待测试化合物的溶解性、极性和其他物理性质，选择与其匹配的标志物，根据标志物的特点选择孵育条件，获得携带可被识别标签的化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：选择与待测试化合物匹配的标志物是生物素。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将构建的待测化合物与蛋白文库进行共孵育，使二者得到充分的结合，为后续的荧光共振能量转移提供反应条件。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中通过荧光共振能量转移的发生，对荧光强度进行筛选后，得到待测化合物结合的靶标蛋白。