CN109799354A - 利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用Tag‑lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，属于腺苷A2A受体配体的筛选领域。利用Tag‑lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，该方法包括如下步骤：构建特定标签融合的目的细胞膜表面蛋白表达载体；使用HTRF荧光基团供体共价结合的标签特异性底物标记标签融合细胞膜表面蛋白；将标记的细胞或细胞膜与结合配体进行孵育，孵育后进行HTRF的检测，根据数据结果计算待测样品的Kd或Ki值。本发明的优点在于：信号强，结果可靠，运用了新的标记技术，使信号更强更稳定；基于细胞的均相检测体系，真实反应受体配体的结合情况，结果可靠。

Description

利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的 方法

技术领域

本发明属于腺苷A2A受体配体的筛选领域，具体涉及一种利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法。

背景技术

腺苷受体(Adenosine receptors,ARs)属于整合膜蛋白家族G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptors,GPCRs)的一员，可分为四个亚型：A1、A2A、A2B和A3。四类腺苷受体均由细胞外腺苷激活，在广泛的生理学过程中发挥重要作用，如睡眠调节、血管生成、免疫调节等。因此，腺苷受体在各种病理生理学研究中是十分重要的潜在靶点，例如睡眠障碍、癌症、炎症等。腺苷A2A受体在大脑的纹状体、脾脏内免疫细胞、胸腺、淋巴细胞和血小板中表达水平较高，在心脏、肺和血管中呈中等表达水平。腺苷受体为7次跨膜结构蛋白，其胞外部分通过与配体腺苷结合而被激活，进而胞内部分与Gs或Ggolf蛋白偶联，引发后续一系列信号传递。腺苷A2A受体激活后，与外周组织中的Gs蛋白或脑内的Ggolf蛋白偶联，激活cAMP-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路，从而参与多种生理过程。同时，它还能够通过cAMP-PKA磷酸化CREB(cAMP responsive element binding protein)，进而干扰核转录因子NF-κB(nuclear factor-κB),参与基因表达的调控。由于腺苷A2A受体具有以上所述重要病理和生理功能，使其成为现今国内外新药研发领域非常热门的靶点之一。

目前，常规筛选腺苷A2A受体配体的方法是建立在细胞培养基础上的同位素标记法。

同位素标记技术是选用适合的不同的同位素对腺苷A2A受体和配体分别进行标记。将标记好的腺苷A2A受体、配体、待测样品共同孵育一定时间后，选择合适的测量方法和工作条件进行检测。如果腺苷A2A受体和配体结合，则能检测到两种同位素信号靠近在一起或重叠；若两者没有结合或腺苷A2A受体与待测样品发生了结合，则两种同位素信号分散在不同位置。

同位素标记作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)放射性污染，对于操作环境的安全性级别要求高；2)对于操作人员的专业度要求高；3)样品预处理繁琐，实验步骤多，耗时长；4)无法达到高通量，难以解决待测样品多的难题；5)检测仪器精度要求较高、参数设置复杂；6)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差、不稳定；7)标记用同位素在反应过程中容易产生杂质影响直接影响结果准确性；8)放射性实验，实验过程或阶段性实验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，需要及时作去污染处理和放射性废物处理。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，用于腺苷A2A受体配体的筛选。通过本发明，无论是多肽、抗体、小分子化合物或者复合分子均可使用本方法进行检测。

利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一，构建特定标签融合的目的细胞膜表面蛋白表达载体，所述载体为SNAP-tag,CLIP-tag或HaloTag融合的目的蛋白中的一种；

步骤二，利用Tag-lite技术将构建好的载体转染细胞使其表达此融合蛋白，所述Tag-lite技术兼容瞬时转染细胞或稳转细胞株；

步骤三，使用HTRF荧光基团供体共价结合的标签特异性底物标记标签融合细胞膜表面蛋白；

步骤四，使用对应的HTRF荧光基团受体标记目的结合配体，利用Tag-lite技术对缩氨酸，非缩氨酸、复合物的配体结合，和抗体结合进行分析；

步骤五，进行生物分子的结合分析实验，将标记的细胞或细胞膜与结合配体进行孵育，孵育后进行HTRF的检测，根据数据结果计算待测样品的Kd或Ki值。

本发明的优点在于：与传统方法相比，基于细胞的Tag-lite结合分析实验的优势如下，

1)均相的、非放射性的检测形式，安全无污染，无需严苛的实验环境；

2)操作简单，实验人员只需简单培训即可进行；

3)简化了即时操作：无需使用新鲜培养的细胞，细胞为提前构建完成，冻存后可随时取用，提高了实验的灵活性，简化了分析实验部分操作步骤；

4)适用于所有激动剂、拮抗剂或反向激动剂的筛选，无论是抗体、蛋白、多肽、小分子化合物或复合分子均可检测；

5)小型化检测模式，极大提高了实验通量：简单安全的实验操作，从少量样品提高到384孔样品检测，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；

6)信号强，结果可靠：运用了新的标记技术，使信号更强更稳定；基于细胞的均相检测体系，真实反应受体配体的结合情况，结果可靠。

附图说明

图1为本发明提供的构建带有特定标签目的蛋白的基本流程图。

图2为本发明提供的Tag-lite结合分析实验检测抗体结合的三种可能反应形式示意图。

图3为本发明提供的饱和型结合实验(测定Kd值)基本原理图。

图4为本发明提供的竞争型结合实验(测定Ki值)基本原理图。

图5为本发明提供的使用1X TLB对化合物进行系列梯度稀释图。

图6为本发明提供的准备荧光标记配体操作流程图。

图7为本发明提供的进行结合分析实验操作基本实验步骤和加样体系示意图。

图8为本发明提供的利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法实验结果数据示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在本实施例中，Tag-lite技术是一种非放射性、基于细胞的实验技术，可应用于天然配体、小分子或抗体等与细胞膜表面受体结合的调查研究中，对于GPCR和RTK研究、治疗性抗体开发领域均有极大的帮助。本技术将HTRF和活细胞蛋白标记技术相结合，提供了一种精确标记目的细胞膜表面蛋白使其在特定位置带上HTRF荧光基团的新方法。

HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。HTRF基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移(FRET)两大技术。TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。FRET利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。较传统TR-FRET的能量供体包裹在螯合物中，HTRF的荧光能量的两种Donor——铕(Eu3+cryptate)和铽(Lumi4^TMTb)，它们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是APC铰链复合体，商业名称为XL665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2的激发光与Donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。因此信噪比高，均一性好。通过计算665nm/620nm比值的方式，排除了系统背景和未结合受体的影响，使结果更准确。

HTRF作为BRET和FRET之外的另一选择，克服了传统方法低信噪比、FRET供体和受体光谱重叠等不足，利用HTRF技术的的特点和优势，消除了细胞背景和未结合受体信号的干扰，使得到的数据更加准确。活细胞蛋白标记技术，克服了传统单一标签或常用荧光蛋白(如GFP绿色荧光蛋白)融合标记信号弱的不足；采用了将特定标签蛋白与目的蛋白融合，再利用标签蛋白降解偶联了新型荧光基团(铕或铽的穴状化合物)的底物使其带上荧光基团标记，从而构建了信号更强且稳定的标记蛋白，并且膜表面蛋白的结构功能基本不受影响，可更真实地体现蛋白的天然构象和性质。

Tag-lite结合分析实验提供了一种简单直接的实验技术，帮助相关人员来鉴定分析待测样品的结合能力和特性。这一分析技术不受待测样品本身结构或组成的影响，无论是多肽、抗体、小分子化合物或者复合分子均可使用本方法进行检测。本技术既可以检测分析激动剂，也可分析拮抗剂或反向激动剂。

如图1所示，Tag-lite结合分析实验技术的主要流程包括：

构建特定标签融合的目的细胞膜表面蛋白表达载体，所述载体为SNAP-tag,CLIP-tag或HaloTag融合的目的蛋白中的一种；

利用Tag-lite技术将构建好的载体转染细胞使其表达此融合蛋白，所述Tag-lite技术兼容瞬时转染细胞或稳转细胞株；

使用HTRF荧光基团供体共价结合的标签特异性底物标记标签融合细胞膜表面蛋白；

使用对应的HTRF荧光基团受体标记目的结合配体，利用Tag-lite技术对缩氨酸，非缩氨酸、复合物的配体结合，和抗体结合进行分析；

进行生物分子的结合分析实验，将标记的细胞或细胞膜与结合配体进行孵育，孵育后进行HTRF的检测，根据数据结果计算待测样品的Kd或Ki值。

如图2所示，Tag-lite技术的特点如下：

1)通量高，易小型化：384孔板操作；

2)信号稳定：可连续多次检测，重复性好；

3)基于细胞分析平台；

4)均相的、非放射性的检测形式；

5)直接检测特定膜表面蛋白与配体或可溶性蛋白之间的结合反应；

6)针对特定目标细胞膜表面蛋白，在确定位置进行原位细胞标记的技术；

7)可提供已构建好的表达特定标记膜表面蛋白的细胞系或单独的试剂直接用于实验；

8)具有多种结合反应形式，可根据样品特点进行选择。

实施例一

饱和型结合实验(测定Kd值)：

饱和型结合分析实验测定结果是反应平衡状态下，随着配体浓度的升高，非特异性结合信号和总信号的变化。

如图3所示，进行此类实验时，将荧光标记配体进行浓度梯度稀释，并与固定总量的标记细胞进行孵育，使反应达到平衡，此时获得的HTRF信号比值为总的结合信号。使用无标记配体作为阴性对照，来衡量标记配体与受体、非受体分子、微型板之间的非特异性结合信号。将荧光标记配体稀释在含有固定总量的标记细胞和标记配体100倍摩尔浓度的非标记配体的溶液中，使其反应达到平衡，此时获得的HTRF信号比值为非特异性结合的信号。在总信号中减去对应的非特异性结合信号，即可获得特异性结合信号。

实施例二

竞争型结合实验(测定Ki值)：

如图4所示，竞争型结合分析实验用于测定样品的解离常数Ki。进行此类实验时，需要将待测样品(小分子化合物、抗体、多肽等)进行系列梯度稀释，并将其和固定浓度的荧光配体和固定数量的细胞进行孵育反应。

利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，以小分子化合物样品为例，具体步骤如下：

(一)、准备1X Tag-lite工作缓冲液(1X TLB，商品化试剂)：根据实验需求计算所需缓冲液量，使用蒸馏水稀释5X Tag-lite工作缓冲液至1X，混合均匀。

(二)、如图5所示，准备化合物(待测样品)：使用1X TLB对化合物进行系列梯度稀释，最高浓度为4.E-4M，1/10梯度稀释，共11个浓度梯度。

(三)、准备荧光标记配体(腺苷A2A受体拮抗剂，商品化试剂)：为获得较好的竞争性剂量反应结果，经优化的荧光配体浓度应使50-80％(Kd)的受体被结合。在本反应中，腺苷A2A受体拮抗剂推荐使用的反应终浓度为20nM(工作液浓度为80nM)。使用1X TLB配制适量80nM的腺苷A2A受体拮抗剂工作液。

(四)、如图6所示，准备细胞(腺苷A2A标记细胞)：

1)在离心管内准备5mL预冷的1X TLB；

2)在37℃水浴中温和振荡冻存的标记细胞，使其完全解冻(1-2分钟)；

3)使用移液器将细胞快速转移至含有预冷1X TLB的离心管中；

4)300G，4℃离心5分钟(细胞沉淀可能不明显可见)；

5)小心地移除上清(切勿让上清回流)；

6)用1mL的1X TLB重悬细胞，使用移液器轻柔吹吸数次使混合均匀；

7)再加入1.7mL的1X TLB，使用移液器轻柔吹吸数次使混合均匀，室温备用。

(五)、如图7和图8所示，进行结合分析实验操作(所有样品作三复孔，单块384孔微型板可检测10个化合物)：

1)在待测孔内加入10μL标记细胞；

2)在对应的孔内加入5μL化合物梯度稀释液(C1-C11)或1X TLB；

3)在所有待测孔中加入5μL标记配体；

4)室温孵育1小时；

5)使用HTRF适配的读板仪进行读值；

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.利用Tag-lite结合分析实验技术筛选腺苷A2A受体配体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

步骤一，构建特定标签融合的目的细胞膜表面蛋白表达载体，所述载体为SNAP-tag,CLIP-tag或HaloTag融合的目的蛋白中的一种；

步骤二，利用Tag-lite技术将构建好的载体转染细胞使其表达此融合蛋白，所述Tag-lite技术兼容瞬时转染细胞或稳转细胞株；

步骤三，使用HTRF荧光基团供体共价结合的标签特异性底物标记标签融合细胞膜表面蛋白；

步骤四，使用对应的HTRF荧光基团受体标记目的结合配体，利用Tag-lite技术对缩氨酸，非缩氨酸、复合物的配体结合，和抗体结合进行分析；

步骤五，进行生物分子的结合分析实验，将标记的细胞或细胞膜与结合配体进行孵育，孵育后进行HTRF的检测，根据数据结果计算待测样品的Kd或Ki值。