JPH06217779A - アポエクオリンをコードするヌクレオチド配列、該配列を含む組換えベクター及び該ベクターを含む組換え微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アポエクオリンをコードするヌクレオチド配
列、該配列を含む組換えベクター及び該ベクターを含む
組換え微生物。 【効果】 天然アポエクオリンの活性によく似たペプチ
ドを実験室での合成により又は微生物により製造でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は遺伝子工学分野に係り、より特定
的には、アポエクオリンタンパク質遺伝子を組換えベク
ターＤＮＡ内に挿入すること、及び微生物である受容菌
株に於いてアポエクオリンを産生することに係る。

【０００２】アポエクオリン（ａｐｏａｅｑｕｏｒｉ
ｎ）は発光性クラゲであるエクオレア・ヴイクトリア
（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）から単離され
うる１本のポリペプチド鎖から成るタンパク質である。
このタンパク質が腔腸動物門のルシフェリン−分子を非
共有結合で結合し含有すると、それはエクオリンとして
知られているものになる。エクオリンはカルシウムイオ
ンの存在下で酸化され、可視光を発する。一度光が発せ
られると、使用されたタンパク質（アポエクオリン）を
酸化ルシフェリンから精製し得、その後適当な条件下で
天然又は合成ルシフェリンを用いて再び（電子と）結合
される。この再結合されたエクオリンにカルシウムイオ
ンを加えてやることで、再び光を発するようになる。従
って、アポエクオリンは様々な化学及び生物アッセイに
於けるマーカーとして使用することができるものであ
る。

【０００３】天然のアポエクオリンは単一化合物ではな
くて、数種の分子の混合物を表わしている。数千にも及
ぶ個々のエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のエクオリン
を表わしているところの純粋な天然エクオリンを電気泳
動にかけると（ 0.1ｍＭ ＥＤＴＡを全ての緩衝液に含
有させて、非変性条件下のアルカリ性緩衝液中、オー・
ガブリエル（Ｏ．Ｇａｂｒｉｅｌ），メソド・エンザイ
モロジイー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、22
巻、 565〜578 頁、1971年参照）、少なくとも６つの明
瞭な青色ルミネッセンスのバンドが、用いたゲル（ 0.5
cm×10cm）を 0.1Ｍ ＣａＣｌ₂ 中に浸すと見えるよう
になる。この観察は、同様な抽出物を等電点電気泳動に
かけ12本ものルミネッセンスバンドを観察したジェイ・
アール・ブリンクス（Ｊ・Ｒ・Ｂｌｉｎｋｓ）及びジー
・シー・ハーレス（Ｇ・Ｃ・Ｈａｒｒｅｓ）、（フエド
・プロス（Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ）、34巻、 474頁、1975
年）の結果と一致している。等電点電気泳動は電気泳動
よりも分離能が高いのでブリンクス及びハーレスはより
多くの種類（バンド）を観察したのである。しかしなが
ら、これらのバンドのどれも純粋なペプチドとして単離
されなかった。

【０００４】更に、生物ルミネッセンスアッセイに使用
する為に必要とされる量を供給し得るだけ充分量のエク
オリン又はアポエクオリンをクラゲ又は他の天然資源か
ら生産することは困難である。従って、産業上利用し得
るだけの充分な量のアポエクオリンを生産する改良方法
が強く望まれている。

【０００５】近年の発達した技術によって、大量に早く
増殖する微生物を使用して、産業上有用なタンパク質及
びペプチドをその天然に於ける由来源にかかわらず合成
することが可能になった。これらの技術は、或る適当な
微生物に、通常は別の生物で作られているタンパク質又
はペプチドを合成する能力を遺伝子的に付与することを
可能にする。

【０００６】上記の技術は、全ての生物に於いて、遺伝
物質（普通はＤＮＡ）とその生物によって合成されるタ
ンパク質との間に存在する基本的な関係を利用するもの
である。この関係とは、タンパク質のアミノ酸配列がＤ
ＮＡのヌクレオチド配列中に反映されているというよう
なことである。タンパク質中で最も共通して見られる20
種のアミノ酸の各々に特異的に対応している３ヌクレオ
チド配列のグループが１つ以上ある。各々の或る３ヌク
レオチド配列とそれに対応するアミノ酸との間の特異的
な関係は遺伝暗号を構成する。この遺伝暗号は全ての生
物にとって同一又は類似しているものと考えられてい
る。その結果、全てのタンパク質又はペプチドのアミノ
酸配列は、良く理解されている関係に従って、対応する
ヌクレオチド配列に反映されている。更に、原則的に
は、このヌクレオチド配列はどの生物によっても翻訳さ
れ得るものである。

【０００７】

【表１】 第１表 遺伝暗号 フェニルアラニン(Phe) TTK ヒスチジン(His) CAK ロイシン(Leu) XTY グルタミン(Gln) CAJ イソロイシン(Ile) ATM アスパラギン(Asn) AAK メチオニン(Met) ATG リジン(Lys) AAJ バリン(Val) GTL アスパラギン酸(Asp) GAK セリン(Ser) QRS グルタミン酸(Glu) GAJ プロリン(Pro) CCL システイン(Cys) TGK トレオニン(Thr) ACL トリプトファン(Try) TGG アラニン(Ala) GCL アルギニン(Arg) WGZ チロシン(Tyr) TAK グリシン(Gly) GGL 終結シグナル TAJ 終結シグナル TGA 暗号：各々の３文字連鎖（３−ｌｅｔｔｅｒ ｔｒｉｐ
ｌｅｔ）は左側に５′末端及び右側に３′末端を持つＤ
ＮＡの３ヌクレオチドを表わしている。この文字はヌク
レオチド配列を形成するプリン又はピリミジンを塩基を
表わしている。

【０００８】Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ，Ｔ，Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ，Ｃ又はＴ Ｔ＝チミン Ｘ＝ＹがＡ又はＧの場合、Ｔ又はＣ Ｘ＝ＹがＣ又はＴの場合、Ｃ Ｙ＝ＸがＣの場合、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ Ｙ＝ＸがＴの場合、Ａ又はＧ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ又はＡ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ Ｚ＝ＷがＧの場合、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ Ｚ＝ＷがＡの場合、Ａ又はＧ ＱＲ＝ＳがＡ，Ｇ，Ｃ又はＴの場合、ＴＣ ＱＲ＝ＳがＴ又はＣの場合、ＡＧ Ｓ＝ＱＲがＴＣの場合、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ Ｓ＝ＱＲがＡＧの場合、Ｔ又はＣ 表１の３ヌクレオチドはコドンと呼称され、生物の遺伝
物質中に存在する時、ＤＮＡ３ヌクレオチドとして表わ
される。これらコドンのタンパク合成に於ける発現には
伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の中間形成が必要とされ、これ
に関しては以下により詳細に述べる。ｍＲＮＡコドンは
チミンの代りにウラシルがあることを別にすると表１の
ＤＮＡコドンと同じ配列を持ったものである。当分野に
於いては、反対の鎖極性（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｓｔｒａ
ｎｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を持った相補的な３ヌクレオ
チドＤＮＡ配列は機能的には表１のコドンと同等のもの
と理解されよう。遺伝暗号に関して重要で良く知られて
いる特徴に、その遺伝暗号の持つ冗長性（ｒｅｄｕｎｄ
ａｎｃｙ）があり、それによって、タンパク質を構成す
るアミノ酸の殆んどについて、１つ以上のヌクレオチド
３連鎖コードが使用されている。

【０００９】従って、或るアミノ酸配列をコードしてい
る幾つかの異なるヌクレオチド配列があり得る。このよ
うなヌクレオチド配列は、或る菌株がその中のある配列
を他の配列より効率良く翻訳することはあっても、それ
らが全ての生物に於いて同じアミノ酸配列を産生し得る
ので機能的に同等のものと考えられている。時には、或
る一定のヌクレオチド配列中にプリン又はピリミジンの
メチル化された変異体（ｖａｒｉａｎｔ）が見つかるこ
とがある。このようなメチル化によってもコードの関係
は全く影響を受けることはない。

【００１０】基本的な概略に於いて、微生物に新規なタ
ンパク質を合成する能力を付与する方法は次の３ステッ
プを含むものである。(1) 所望タンパク質のアミノ酸配
列に関する遺伝的にコードされた情報を含む特定遺伝子
またはヌクレオチド配列を単離及び精製（又は化学合
成）し、(2) この単離したヌクレオチド配列を適当なベ
クター、典型的にはバクテリオファージ又はプラスミド
のＤＮＡと組換え、そして(3) このベクターを適当な微
生物に移し、該所望の遺伝情報を含む受容微生物の株を
選択する。

【００１１】上記のプロセスを産業上利用しようとする
際に遭遇する基本的に困難な点は第一段階、つまり所望
の特定遺伝情報を単離し精製することである。全ての生
物細胞に於いて、ＤＮＡは非常に高分子量のヌクレオチ
ド鎖の形態で存在している。細胞中には、各々の遺伝子
が数百のヌクレオチド長を持ち、10,000以上の特定タン
パク質のアミノ酸配列をコードしている10,000以上もの
構造遺伝子が含まれている。その殆んどの場合、４種類
のヌクレオチド塩基によって全ての現存する配列が形成
されている。この４種類のヌクレオチド塩基とはアデニ
ン(A) 、グアニン(G) 、シトシン(C) 及びチミン(T) で
ある。その結果、特定タンパク質の構造遺伝子を含有す
る長い配列は、全体として化学的組成及び物理特性に於
いて非常に良く似ている。このような配列の１つを、単
離したＤＮＡ中に存在する他の非常に多くの配列から分
離することは、従来の物理的、化学的調製方法では通常
達成され得ないものである。

【００１２】先行技術に於いて、上記の一般的な操作方
法の第一段階を達成する為に二つの一般的な方法が用い
られてきた。第一の方法はしばしばショットガン法と呼
ばれるものである。この方法では、或る生物のＤＮＡは
所望のヌクレオチド配列よりも通常長い断片に分断され
る。上記(1) の段階は本質的に迂回されている。該ＤＮ
Ａ断片は、特定配列をあらかじめ精製することなく、直
ちに所望のベクターと組換えられる。粗分画段階は適宜
その間に行ない得る。全ての可能性を持った菌株の中か
ら、所望の遺伝情報を含む微生物の株を選択するのに微
生物遺伝学の選択技術を用いて行なうことができる。こ
のショットガン法には二つの重要な欠点がある。

【００１３】このうち特に重要な点は、この操作によっ
て数百もの未知の遺伝子が受容微生物中に取込まれるこ
とになり、実験中に未知の遺伝素性を持った新規な株が
創り出されることである。従って、この操作を用いると
実験従事者と環境に対して災害をもたらす恐れがある。

【００１４】ショットガン法の第二の欠点というのは、
所望株を産生する点で非常に効率が悪く、第一段階に於
ける分画の欠如を補償するに充分な検出力のある選択技
術を用い得るかどうかにかかっていることである。しか
しながら、本明細書の後段で明らかにされるように、前
記欠点を解消する方法が存在する。

【００１５】第二の一般的方法は、細胞内の全遺伝情報
がある特定の時に発現されるということは、たとえある
としても極めてまれであるという事実を利用している。
特に、高等生物の分化した組織はある一時期に産生し得
るタンパク質のうちのほんの少しの部分しか合成してい
ないことがてるある。極端な場合には、このような細胞
は主に一種類のタンパク質を合成していることがある。
このような極端な場合には、適当な細胞から対応する伝
令ＲＮＡを単離することによって、問題の該タンパク質
をコードしているヌクレオチド配列を単離することが可
能であった。

【００１６】伝令ＲＮＡはＤＮＡのヌクレオチド配列情
報をタンパク質のアミノ酸配列構造に変換する過程に於
いて機能する。この過程の第一段階（転写）に於いて
は、産生すべきタンパク質を特定しているヌクレオチド
配列を持ったＤＮＡの局部断片がＲＮＡ中に写し取られ
る。ＲＮＡは、デオキシリボースの代りにリボースが用
いられていること及びチミンの代りにウラシルが使用さ
れていること以外はＤＮＡに類似しているポリヌクレオ
チドである。ＲＮＡ中のヌクレオチド塩基はＤＮＡの相
補的鎖間に存在するものとして良く知られている塩基対
合関係と同種の関係を形成することができる。Ａ及びＵ
(T)は相補的であり、Ｇ及びＣが相補的である。ＤＮＡ
ヌクレオチド配列のＲＮＡ転写体は写し取られた配列に
対して相補的になる。このようなＲＮＡは、細胞の遺伝
装置（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ）とタンパ
ク質合成装置との間の媒介手段としての役割から伝令Ｒ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼称される。一般的には、細胞中で
ある特定の時に存在しているｍＲＮＡのみがその時に活
発に合成されているタンパク質に対応しているものであ
る。従って、主にある一種のタンパク質を合成すること
にその機能が従事しているような分化細胞はそのタンパ
ク質に対応しているＲＮＡ種を主に含んでいるものであ
る。これがうまくいきそうな場合には、分化細胞に於け
るこうしたタンパク質の特別な合成を利用して或る所定
のタンパク質をコードしている適当なヌクレオチド配列
を精製・単離することができる。

【００１７】上記操作の主要な欠点は、細胞が主に単一
のタンパク質を合成しているものと確認できるような比
較的まれな場合にのみしかこの操作を適用し得ないとい
うことである。産業上関心が持たれているタンパク質の
多くはこのような特別な方法では合成されていないもの
である。所望のタンパク質は、或る一定の時期に或る組
織又は器官の細胞によって産生される百いくつもの様々
なタンパク質のうちの一つかも知れない。それにもかか
わらず、細胞中に存在するＲＮＡ種の組は通常ＤＮＡ中
に存在している全配列のうちの一部分にすぎないのであ
るから、ｍＲＮＡ単離技術は有用であり、したがって初
期精製手段を提供していることになるのである。

【００１８】極く最近の発展によると、ある配列がｍＲ
ＮＡ配列の異種集団のうちの２％という低い頻度で存在
するような場合に於ても、該ヌクレオチド配列を単離・
精製できる操作が米国特許第4,363,877 号に開示されて
いる。更に、最初に単離された全ＲＮＡ集団中もっと低
い頻度で存在する配列を単離・精製する為に、この操作
をｍＲＮＡを分画する公知の方法と組み合せることも可
能である。この方法は一般に、実際上どんな生物から抽
出したｍＲＮＡ種に対しても適用し得、それ故に産業上
及び研究上興味のあるタンパク質を最終的に役に立つだ
けの量生産する為の強力な基本的な手段を提供するもの
である。

【００１９】上記の方法はｍＲＮＡ及びＤＮＡの或る構
造上の特徴を利用し、或る種の酵素によって触媒される
反応を使用するものである。先行技術に於いて理解され
ているところの上記反応の性質及び構造上の詳細な点に
ついては本明細書中に記載し、上記米国特許に於いて更
に詳細に述べられるものである。

【００２０】本明細書中で用いられる符号及び略号を次
表に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】天然の形態では、ＤＮＡは直鎖ポリヌクレ
オチド対の形態で存在する。前述の相補的塩基対合関係
というのは一方のストランドの各ヌクレオチド塩基が他
方のストランド上にあるそれと相補的な塩基と対峙して
在るように一対の鎖相互間に存在しているものである。
一方のストランドの全配列は他方のストランド上の相補
的配列によって鏡面反映させられている。一対の鎖（ス
トランド）が分離した時に、適当な前駆体モノマーから
新しいパートナーであるストランドを合成することが可
能である。一端から始まるモノマーの添加による配列は
元の完全なままのポリヌクレオチド鎖配列に相補的にな
るようにそれによって決定される。つまりこのポリヌク
レオチド鎖配列がその相補的パートナー合成に対する鋳
型として働くものである。ＤＮＡの特定ヌクレオチド配
列に対応するｍＲＮＡの合成に関してもこれと同様な原
理に従うものと理解されている。従って、転写された領
域に於いて、ある特定のｍＲＮＡ分子はＤＮＡの一本の
鎖に相補的であり、他方のＤＮＡ鎖と同一の配列を持つ
ことになる。生細胞中には、ある特定のタクパク質に対
するヌクレオチド配列を含む特定のＤＮＡ断片を選択的
に転写させるような酵素による機構が存在する。従っ
て、ある特別なタンパク質のアミノ酸配列をコードして
いるヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを単離することは
ＤＮＡそれ自体から同じ配列、すなわち遺伝子を単離す
ることと等価なものである。もし、ｍＲＮＡが再転写さ
れそれに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成すると、そ
れによって正確なＤＮＡ配列が再構成されたことにな
り、適当な方法によって他の生物の遺伝物質中にこのＤ
ＮＡ配列を挿入することができる。従って、ある一定の
配列のこの二つの相補版は相互に変換し得、機能的に互
いに同等なものである。

【００２３】ＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオチドサブユニ
ットは一つのヌクレオチド糖の５′位とそれと隣接して
いるものの３′位との間をリン酸ジエステル結合によっ
て互いに結び付けられている。このような結合の繰り返
しにより、一方の末端が他方の末端と区別され得るよう
な意味で極性を持った直鎖状ポリヌクレオチドが生じ
る。３′末端は遊離３′−ヒドロキシであり得、又はこ
のヒドロキシはリン酸塩（エステル）又はより複雑な構
造で置換されている場合もある。５′末端についても同
様である。真核生物、すなわち明確な核と有糸分裂装置
をもっている生物に於いては、機能ｍＲＮＡの合成は通
常そのｍＲＮＡの３′末端にポリアデニル酸を付加する
ことを含むものである。従って、伝令ＲＮＡは、ポリチ
ミジル酸を付着させたセルロースのカラムクロマトグラ
フィによって、真核生物から単離した他のクラスのＲＮ
Ａから分離することができる。アビブ・エイチ（Ａｖｉ
ｖ，Ｈ．）及びレーダー・ピー（Ｌｅｄｅｒ，ｐ．）、
プロス・ナト・アカド・サイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，），69巻、1408頁（1972年）を参照の
こと。オリゴｄＴ、ポリＵ、又はポリＴ及びポリＵの組
合せを含むクロマトグラフィ充填用物質、例えばポリＵ
−セファロース（ｐｏｌｙ Ｕ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
に対するポリＡの塩基対合親和性（ｂａｓｅ−ｐａｉｒ
ｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を利用した他のクロマトグ
ラフィ手段も同様に用いることができる。

【００２４】逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅ）はＲＮＡ鋳型の存在下でＲＮＡ鋳型
鎖に相補的なＤＮＡの合成を触媒するもので、この際に
はプライマーである３′−ヒドロキシを持っている相補
的なオリゴ又はポリヌクレオチドと四種のデオキシヌク
レオシド３リン酸、つまりｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ及びｄＴＴＰを存在させる。この反応はｍＲＮＡの
３′末端近傍にオリゴデオキシヌクレオチドプライマー
が非共有結合的に会合することにより開始され、続いて
ｍＲＮＡヌクレオチド配列との塩基対合関係で決められ
ている如くに、成長している鎖の３′末端への適当なデ
オキシヌクレオチドの付加が段階的に行なわれる。生成
分子はヘアピン構造として記述でき、元のＲＮＡは、一
部分が一端に於いてそれ自身に対し折り畳まれているＤ
ＮＡの相補鎖と水素結合によって対になっている。ＤＮ
ＡとＲＮＡとの鎖は互いに共有結合によって結合してい
るものではない。逆転写酵素は一本鎖ＤＮＡ鋳型を用い
た類似の反応を触媒することもでき、そのような場合、
得られる生成物は一端が一本鎖ＤＮＡのループによって
結びつけられている二本鎖ＤＮＡのヘアピンである。ア
ビブ・エイチ（Ａｖｉｖ，Ｈ．）及びレーダー・ピー
（Ｌｅｄｅｒ，Ｐ．），プロス・ナト・アカド・サイ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ），69巻、1408頁（1972年）及び、エフストラティア
ディス・エー（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ．Ａ．）；カ
ファトス・エフ・シー（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．），
マキシアム・エー・エム（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．）及び
マニアティス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）細胞
（Ｃｅｌｌ），７巻、279 頁（1976年）。

【００２５】制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ中のリン
酸ジエステル結合を加水分解することのできる酵素であ
り、ＤＮＡ鎖の連がり（ｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ）に切れ
目を生起せしめる。もしもＤＮＡが閉じたループの形状
である場合には、そのループは線状構造に変換させられ
る。制限酵素の主な特徴は、その加水分解作用がある特
定のヌクレオチド配列の箇所だけで生起するということ
である。

【００２６】このような配列箇所はその制限エンドヌク
レアーゼに対する制限部位と呼ばれる。様々な生物源か
ら制限エンドヌクレアーゼが単離され、それらの制限部
位のヌクレオチド配列によって特徴づけられてきた。二
本鎖ＤＮＡに作用する時に、制限エンドヌクレアーゼの
幾種類かは同じ箇所で両鎖のリン酸ジエステル結合を加
水分解し、平滑末端を生じる。他のものは数ヌクレオチ
ド分だけ離れて結合を加水分解し、切断分子の各末端に
於ける遊離状態の一本鎖領域を生じる。このような一本
鎖末端は自己相補的で接着性（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）であ
るから、加水分解されたＤＮＡを再結合させるのに用い
ることができる。このような酵素の１種によって切断さ
れるＤＮＡはどれでも同じ認識部位を含んでいるにちが
いないから、同じ接着末端が生じることになり、制限エ
ンドヌクレアーゼ処理したＤＮＡの異種配列を同様に処
理した他の配列に結合させることが可能である。ロバー
ト・アール・ジェイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．），ク
リト・レブ・バイオケム（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ），４巻、123 頁（1976年）を参照のこと。

【００２７】或る酵素に対する制限部位は比較的まれで
あり、不均一に分布している。或る特定の制限部位が一
定の断片内に存在するかどうかということは実験的に決
定すべきことである。しかしながら、様々な生物源から
多様な部位特異性を持った制限エンドヌクレアーゼが数
多単離また単離されつつあるので、千個のヌクレオチド
のある一定の断片が１つ以上の制限部位を含有している
可能性があると考えるのは道理にかなったことである。

【００２８】一般的な技術的背景に関しては、ワトソン
・ジェイ・ディー（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．），遺伝分
子生物学（ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ），３版、ベンジャミン（Ｂ
ｅｎｊａｍｉｎ），メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒ
ｋ），カリフ（Ｃａｌｉｆ），1976年；ダビッドソン・
ジェイ・エヌ（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．），核酸の
生化学（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）、８版，アダムス
・アール・エル・ピー（Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．Ｐ．），
バードン・アール・エイチ（Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．
Ｈ．），キャンベル・エー・エム（Ｃａｍｂｅｌｌ，
Ａ．Ｍ．），及びスメリエ・アール・エム・エス（Ｓｍ
ｅｌｌｉｅ，Ｒ．Ｍ．Ｓ．）改訂版、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1976年；及びヘイズ・ダヴリュー
・（Ｈａｙｅｓ，Ｗ．）、バクテリア及びそのウイルス
の遺伝学、基礎遺伝学及び分子生物学の研究（Ｔｈｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ
Ｂａｓｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２版、ブラックウェル科学
出版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕ
ｂ．），オクスフォード，1968年を参照のこと。

【００２９】従って、本発明の目的は有用量のアポエク
オリンを供給し得るだけの微生物を提供することに在
る。

【００３０】更に、本発明は微生物の中に挿入されてア
ポエクオリンを発現し得るような組換えＤＮＡベクター
を提供することを目的とするものである。

【００３１】また更に、所望の組換えＤＮＡベクターを
生産する際に使用され得る、合成で製造されるか又は天
然源から単離し得るか特定構造を持ったＤＮＡ断片を提
供することも本発明のもう一つの目的である。

【００３２】そうして更に、天然アポエクオリンの活性
によく似たペプチドを実験室での合成により又は微生物
により製造できるようにすることも本発明のもう一つの
目的である。

【００３３】以上の本発明の目的およびその他の目的
は、本明細書中以下で直により明確になるであろうが、
以下の第１〜４式の化合物(1) およびその塩(2) から選
択される均一なペプチドを提供することによって達成し
得たものである。

【００３４】

【化１６】

【００３５】上式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、
Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニル
アラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロ
イシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、
Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒ
はアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリ
ン、Ｗはトリプトファン、及びＹはチロシンである。

【００３６】(b) 第２式として、第１式のＰ₅ の代りに
Ｓ、Ｎ₈ の代りにＤ、Ｋ₁₁の代りにＲ、Ｄ₇₈の代りに
Ｅ、Ａ₈₁の代りにＥ、Ｋ₈₈の代りにＲ、Ｄ₉₂の代りにＣ
又はＥ、Ｅ₉₅の代りにＫ、Ｋ₉₆の代りにＲ、Ａ₉₈の代り
にＳ、Ｑ₁₀₁ の代りにＥ、Ｉ_{10 2} の代りにＰ、Ｉ₁₀₇ の
代りにＬ、Ｉ₁₁₆ の代りにＶ、Ｓ₁₂₇ の代りにＤ、Ｓ
₁₃₅ の代りにＡ、Ｔ₁₄₁ の代りにＳ、Ｅ₁₄₄ の代りにＤ
になったもの（ここで、下付き番号は第１式のアミノ末
端から数えたアミノ酸位置を表わしている）。

【００３７】(c) 第３式として、前記第１式又は第２式
に於いて、アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれ
か、又はその両末端の１から15個のアミノ酸が欠如した
もの。

【００３８】(d) 第４式として、前記第１式又は第２式
に於いて、アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれ
か、又はその両末端に１から10個の付加アミノ酸を連続
的に結合したもの。

【００３９】(2) 前記式を有する化合物の塩類。

【００４０】以上のペプチドは腔腸動物門のルシフェリ
ンを結合しＣａ²⁺の存在下で光を放出することができ
る。

【００４１】

【化１７】

【００４２】

【化１８】

【００４３】

【化１９】

【００４４】［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオ
キシグアニル、Ｃはデオキシシトシル、Ｔはデオキシチ
ミジル、ＪはＡ又はＧ；ＫはＴ又はＣ；ＬはＡ，Ｔ，Ｃ
又はＧ；ＭはＡ，Ｃ又はＴ；Ｘはそれに続くＹがＡ又は
ＧのときはＴ又はＣ、それに続くＹがＣ又はＴのときは
Ｃ；Ｙはそれに先立つＸがＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又は
Ｔ、それに先立つＸがＴのときはＡ又はＧ；Ｗはそれに
続くＺがＧ又はＡのときはＣ又はＡ、それに続くＺがＣ
又はＴのときはＣ；Ｚはそれに先立つＷがＣのときは
Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ、それに先立つＷがＡのときはＡ又は
Ｇ；ＱＲはそれに続くＳがＡ，Ｇ，Ｃ又はＴのときはＴ
Ｃ、それに続くＳがＴ又はＣのときはＡＧ；Ｓはそれに
先立つＱＲがＴＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ、それに先
立つＱＲがＡＧのときはＴ又はＣ；であり、下付き番号
は遺伝暗号によってこのヌクレオチド配列が対応するア
ポエクオリンのアミノ酸位置を示し、アミノ酸位置はア
ミノ末端から数えたものである］のヌクレオチド配列又
は前記のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を
含むＤＮＡ分子、組換えＤＮＡベクター、及び修飾微生
物もまた、遺伝子工学技術による上述のようなペプチド
の製造に関係する本発明の好適な一面の実施用として提
供される。

【００４５】図面の簡単な説明 添付図面により特定の実施例で得られた結果を示す。前
記実施例は本発明を示すものであって、本発明を限定す
るものではない。

【００４６】第１図は、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅ
ａ ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）から単離されたポリ（Ａ⁺ ）
ＲＮＡを用いてイン・ビトロで翻訳されたタンパクをオ
ートラジオグラフィー分析した結果を示す写真である。
翻訳は、オワンクラゲ ポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡの非存在下
（レーン１）、存在下（レーン３）で行なった。２種の
反応からの抗エクオリン免疫沈降タンパクを夫々、レー
ン２および４に示した。図の右側に、タンパク分子量標
準のホスホリラーゼｂ、ＢＳＡ、卵アルブミン、炭酸脱
水酵素、ＳＢＴ１およびリソチームの位置を示す。天然
エクオリンの位置も図示している。

【００４７】第２(a) 図は、アポエクオリンをコードす
るＤＮＡ配列を含むオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ
ｖｉｃｔｏｒｉａ ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）から単離した
遺伝子の制限地図であり、第２(b) 図は、ｌａｃプロモ
ーターの下流でプラスミドに挿入された第２(a) 図のセ
グメントの制限地図である。

【００４８】第３図は、 _pＡＥＱ１抽出物中のＣａ²⁺−
依存性発光タンパク活性の時間および酸素依存性を示す
グラフである。使用した条件は次の通りである。

【００４９】(a) 曲線１および２では、活性画分0.5m
l をβ−メルカプトエタノール２ｍＭおよび腔腸動物の
ルシフェリン0.1 ｍＭに調製し、４℃でインキュベート
した。適当な時間間隔で５μｌを抜き取り、発光タンパ
ク活性を調べた。

【００５０】(b) 曲線２では、Ａｒガスを泡立てて溶
解Ｏ₂ レベルを低下させ、混合物を表示した時に酸素と
接触させた。

【００５１】(c) 曲線３では、 _pＡＥＱ１抽出物の代
りに培養混合物中に天然アポエクオリンを用いた。

【００５２】第４図は、 _pＡＥＱ１抽出物から生ずるＣ
ａ²⁺−依存性発光タンパク活性のゲル濾過プロフィール
のグラフである。 _pＡＥＱ１抽出物からの部分精製され
たアポエクオリン活性分を用いて、第３図に記載したよ
うにＣａ²⁺−依存性発光タンパク活性を発生された。次
いで、この発光タンパク画分（50μｌ）を、10ｍＭＥＤ
ＴＡ、15ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ7.5 および100 ｍＭ Ｋ
Ｃｌを用いて平衡化させたＧ−75−40スーパーファイン
（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）カラム（ベッド容量30.7ml）に
充填した。各種分子量標識物質の溶離位置を示す。

【００５３】好ましい具体例の記載 本発明者は、微生物中でタンパクアポエクオリンを発現
し得る組換えＤＮＡベクターを初めて得、次いでアポエ
クオリンのアミノ酸配列を初めて同定した。これによ
り、均質なアポエクオリンの入手が可能となる。この情
報を用いて適量の均質アポエクオリンを入手することが
できる。各種組換えＤＮＡベクターが得られる。一般的
な組換えＤＮＡ技法を用いて別の組換えＤＮＡベクター
を産生することができる。アポエクオリンを発現する形
質転換体もこの技術の例として産生された。

【００５４】アポエクオリンのアミノ酸配列を表３に示
す。

【００５５】

【表３】

【００５６】各アミノ酸を１文字で表記してアポエクオ
リンのアミノ酸配列を示す。配列中の微不均一性の位置
を括弧内の文字で示す。表示したアミノ酸置換全てで生
物学的機能性を有するエクオリンを表わす。上記配列中
の文字に対応するアミノ酸は次の通りである。

【００５７】Ａ：アラニン，Ｃ：システイン，Ｄ：アス
パラギン酸，Ｅ：グルタミン酸，Ｆ：フェニルアラニ
ン，Ｇ：グリシン，Ｈ：ヒスチジン，Ｉ：イソロイシ
ン，Ｋ：リシン，Ｌ：ロイシン，Ｍ：メチオニン，Ｎ：
アスパラギン，Ｐ：プロリン，Ｑ：グルタミン，Ｒ：ア
ルギニン，Ｓ：セリン，Ｔ：トレオニン，Ｖ：バリン，
Ｗ：トリプトファン，Ｙ：チロシン ペプチドのアミノ酸とペプチドをコードするＤＮＡ配列
との間に明確な対応関係があることは知られているの
で、アポエクオリン（或いは後記する変性ペプチド）を
コードするＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は
このアミノ酸配列から容易に誘導され得る。アポエクオ
リンＤＮＡの一本の鎖のヌクレオチド配列を表４に示
す。表中、数字はタンパクのアミノ末端で開始するアミ
ノ酸配列および対応するＤＮＡコドン配列を示す。ｍＲ
ＮＡではＵがＴに代わっている点を除いてＤＮＡ配列は
ｍＲＮＡ配列に対応している。

【００５８】

【表４】

【００５９】

【表５】

【００６０】

【表６】

【００６１】

【表７】

【００６２】

【表８】

【００６３】

【表９】

【００６４】遺伝子のＤＮＡ配列は十分に同定されてい
るので、ＤＮＡ遺伝子を全くの化学的合成によって産生
することができる。その後、遺伝子を公知の組換えＤＮ
Ａ技法を用いて多くの入手可能なＤＮＡベクターに挿入
することができる。従って、本発明は、本願出願当時一
般に自由に入手できる試薬、プラスミドおよび微生物を
用いて実施されうる。

【００６５】例えば、塩基長さが100 以上のヌクレオチ
ド配列は、アプライドバイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル 380 Ａ ＤＮＡ合
成装置を用いて容易に合成されうる。

【００６６】なお同装置については、例えばジェネティ
ックエンジニアリングニュース（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ）、Ｎｏｖ／Ｄｅｃ．19
84ｐ．３に広告されている如く周知のものである。前記
オリゴヌクレオチドを後記する技術を用いてスプライス
すると本明細書に記載されているヌクレオチド配列が得
られる。

【００６７】更に、本明細書に記載されているペプチド
類を容易に直接合成しうる自動化装置も入手可能であ
る。上記ジェネティックエンジニアリングニュースの同
じ号には、99％を超える結合効率を有する市販の自動ペ
プチド合成装置の広告が掲載されている（ｐ．34）。前
記装置を用いると、直接合成により或いは他の公知の方
法で結合されうる一連の断片を合成することにより本発
明のペプチドを簡単に得ることができる。

【００６８】表３に示した特定のペプチド配列の他に、
これらの配列をベースとし僅かな変更を加えた他のペプ
チドもアポエクオリンの生物化学的活性を有する。例え
ば、配列末端の一方もしくは両方から最高15個のアミノ
酸が欠けていても、ルシフェリンおよびカルシウム結合
能は失なわれない。同様に、末端の一方もしくは両方に
最高10個のアミノ酸が更に付加されていてもよい。こう
した変更（修正）は、ルシフェリンおよびカルシウム結
合部位が上記配列の中央のアミノ酸にあるから可能なの
である。例えば、アミノ酸40−100 にルシフェリン結合
部位があるようである。末端は生物学的活性に比較的重
要な影響を及ぼさないので、付加アミノ酸の本質は重要
でなく、かつ上記アミノ酸のいずれでもよい。

【００６９】アミン末端の付加アミノ酸が生物発光に大
した影響を有しないことを立証する実験データもある。
しかしながら、上記した特定式により極めて近似したも
の、特にいずれかの末端の10個あるいはそれ以下好まし
くは５個あるいはそれ以下のアミノ酸を欠くか、もしく
はいずれかの末端に７個あるいはそれ以下、好ましくは
４個あるいはそれ以下のアミノ酸が付加されている化合
物が好ましい。

【００７０】分子の中央部分のアミノ酸を置換すること
は、生物学的活性を維持するためにより限定される。し
かしながら、表３または表４に示した微不均一性の全ゆ
る部分が生物学的機能を有する置換を示し、指示した置
換をいかように組合わせても機能性分子を表わすであろ
う。表３および表４中、メインライン（表３中かっこで
くくってない配列）または第１エントリー（表４のかっ
こ内の最初のもの）はその位置でより広く用いられてい
るアミノ酸またはヌクレオチドを示しより好ましいもの
である。

【００７１】更に前記ペプチドおよびＤＮＡ分子を僅か
に変更させたものも、当業者には明らかなようにより詳
細に述べるペプチドおよびＤＮＡ分子と同等のものとし
てみなされる。例えば、特に置換が結合部位のアミノ酸
に関連していないならば、ロイシンをイソロイシンまた
はバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、トレオ
ニンをセリンで単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）置換しても、
或いはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で同様に置
換しても、得られた分子の生物学的活性に重大な影響は
ないことは予想される。機能性ペプチドに変化が生じる
かどうかは得られたペプチドをルシフェリンとインキュ
ベートし、次いでカルシウムイオンと接触させることに
より簡単に調べることができる。この方法についての詳
細は後記する。光が発すれば置換は実体的ではなく、被
験分子は表３の分子と同等である。１個あるいはそれ以
上の置換が行なわれているペプチドも同様にして容易に
試験されうる。

【００７２】前記ペプチドをコードするＤＮＡ分子は、
表１に示したコドンのリストから容易に決定され、これ
も同様に表４のＤＮＡ配列と同等のものとみなされる。
実際ペプチド内のＤＮＡコドンとアミノ酸とは１：１で
対応しているので、ペプチドでの置換あるいは他の変化
に関する本明細書中の議論は対応するＤＮＡ配列や、そ
の配列を含むＤＮＡ分子、組換えベクターまたは形質転
換微生物（およびその逆）にも均等にあてはめることが
できる。

【００７３】表４に示した特定のヌクレオチドに加え
て、本発明のＤＮＡ（或いは対応するＲＮＡ）分子は前
記特定のヌクレオチドの前後いずれに追加のヌクレオチ
ドを有していてもよい。例えば、ポリＡを３′末端に付
加することもできる。何れかの末端に短い（例えば20よ
り少ないヌクレオチド）配列を付加して、制限酵素部位
に対応する末端配列としてもよい。停止コドンをペプチ
ド配列に続けて、転写を終止させてもよい。更に、遺伝
子の上流にプロモータ領域或いは他のコントロール領域
を含むＤＮＡ分子を生成することもできる。本発明の配
列を含むＤＮＡ分子は全て細かく断片化されて本明細書
に後記する種類のオリゴヌクレオチドプローブを産生す
ることができるので、前記ＤＮＡ分子は全て少なくとも
１つの目的に対して有用である。

【００７４】本発明のペプチドは、直接合成により或い
は本明細書に記載されているクローン化遺伝子を用いる
ことにより初めて均質物として作成されうる。ここで
“均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）”とは、ペプチド或
いはＤＮＡ配列について言及するときには、当該組成物
中に存在する実質的に全ての分子の一次分子構造（即ち
アミノ酸もしくはヌクレオチド配列）が同一であること
を意味する。前記した“実質的に”という用語は少なく
とも95重量％、より好ましくは少なくとも99重量％、最
も好ましくは少なくとも99.8重量％を意味する。均質ペ
プチドあるいはＤＮＡ配列の全分子に由来する断片が存
在する場合、そのような断片が５重量％以下、好ましく
は１重量％、より好ましくは0.2 重量％以下存在してい
るならば均質性（ｈｏｍｏｇｅｉｔｙ）を調べるときに
考慮しなくともよい。何故ならば、（天然アポエクオリ
ン中に存在する混合物のように）一次分子構造が異なる
分子量の類似した幾つかの分子が存在する混合物とは対
照的に、単一の一定した構造を有する全分子（およびそ
の断片）の存在を“均質”という用語が指しているから
である。本明細書で使用した“単離された（ｉｓｏｌａ
ｔｅｄ）”という用語は、夫々他のペプチド類、ＤＮＡ
類またはＲＮＡ類から分離されかつこの生化学的溶液中
に通常存在する溶媒、緩衝液、イオン或いは他の成分の
みの存在下でみとめられる純粋なペプチド、ＤＮＡ或い
はＲＮＡを指す。“単離された”の中に、天然の（ｎａ
ｔｉｖｅ）状態の天然物質、或いは（例えばアクリルア
ミドゲル中で）成分に分離されているが純粋な物質また
は溶液としては得られていない天然物質は含まれない。
本明細書中“純粋”という用語は上記した“実質的に”
と同じ数値制限を有するのが好ましい。本明細書中“…
…により置換される”或いは“置換”というフレーズ
は、指示した“置換”アミノ酸が別の式中に存在するこ
とが指示されているアミノ酸と同じ位置に存在する場合
（例えばセリンがプロリンの代りに５の位置に存在する
場合）存在するペプチドを指すのであって行なわれる作
用そのものを指すとは限らない。

【００７５】本明細書に記載のペプチドの塩類とは、該
ペプチドが各種ｐＨの水溶液中に存在する（或いは前記
水溶液から単離された）ときに天然に存在するものであ
る。上記した生物学的活性を有するペプチドの塩類は全
て本発明の範囲内にあるとみなされる。カルボン酸残基
のアルカリ、アルカリ土類および他の金属塩、アミノ残
基の酸付加塩（例えばＨＣｌ）および同一分子内のカル
ボン酸残基とアミノ残基との反応により形成される両性
イオンが例示される。

【００７６】本発明は特に、表３および表４にリストさ
れているアミノ酸やコドンの可能な選択に基づく組合せ
を選択することによってなされうる種々のヌクレオチド
またはペプチドの可能な変形の各々および全てを包含し
ており、これら全ての変種も特に開示されたものとみな
される。

【００７７】本発明の好ましい具体例では、ｍＲＮＡと
してコードされる遺伝情報はオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏ
ｒｅａ ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）から得られ、ＤＮＡ遺伝
子の構成に使用される。続いて前記ＤＮＡ遺伝子を用い
て本発明ペプチドが産生される。

【００７８】オワンクラゲの光発光器官からの細胞抽出
物を使用することが好ましい。ただし、全体細胞抽出物
を使用することも可能である。典型的には、クラゲまた
はその一部を小片に切断し（切り刻み）、小片をすり砕
して初期の粗細胞懸濁液を形成する。細胞懸濁液に音波
処理あるいはその他の処理を加えて細胞膜を破壊し、粗
な細胞抽出物を得る。所望により、公知の生化学的手法
（例えばタンパクの選択的沈殿）を用いて初期精製する
こともできる。粗の細胞抽出物あるいはそれからの部分
精製ＲＮＡ部分を処理して更にＲＮＡを分離する。例え
ば粗な細胞抽出物を、１インチ× 3.5インチのニトロセ
ルロースチューブ中の 5.7Ｍ ＣｓＣｌ、10ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ7.5 、１ｍＭ ＥＤＴＡの５mlクッ
ションの頂部に重層し、ＳＷ27ローター（ベックマン・
インストルメント社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．），フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔ
ｏｎ），カリホルニア）を用いて15℃、27000rpmで16時
間遠心分離することができる。遠心分離後、チューブ内
容物をデカントし、チューブから水を流去させ、澄明な
ＲＮＡペレットを含む底 1/3cmをレーザー刃で切断す
る。ペレットをフラスコに移し、10ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ7.5 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％サルコシル
（ｓａｒｃｏｓｙｌ）および５％フェノール20ml中に溶
解させる。次いで溶液をＮａＣｌ 0.1Ｍに調整し、フェ
ノール−クロロホルム混合物（１：１）40mlを加えて振
盪させる。ＲＮＡが、 0.2Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ5.5 の
存在下でエタノールを用いて処理すると水性相から沈殿
し、これを遠心分離により回収する。この方法の代り
に、細胞源からＲＮＡを単離する別のいずれの方法を使
用することも可能である。

【００７９】配列および分子サイズの点で不均質な、ポ
リアデニル化された、粗なあるいは部分的に精製された
ｍＲＮＡのような各種形態のＲＮＡも使用されうる。Ｒ
ＮＡ単離方法の選択性は、単離されたｍＲＮＡの不均一
分散相中に所望のｍＲＮＡを多く含ませることになるあ
らゆる方法によって影響される。上記のような使用した
予備的精製方法によってｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ
開裂（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａ
ｇｅ）を招かなければ、本発明の遺伝子の作成にどんな
精製方法も使用しうる。

【００８０】所望のｍＲＮＡ配列を豊富にするための予
精製は、ＲＮＡを細胞から単離後ＲＮＡを分画化するた
めの従来方法を用いて行うこともできる。ＲＮＡを分解
することのないあらゆる技術が使用できる。ショ糖勾配
での調製用沈降法およびゲル電気泳動法が特に適当であ
る。

【００８１】ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解を妨ぐ条件下
で源細胞から単離しなければならない。ＲＮａｓｅ酵素
はＲＮＡヌクレオチド配列を加水分解する能力を有して
いるので、これら酵素の作用は特に避けなければならな
い。細胞からの抽出中にＲＮａｓｅを阻害する適切な方
法としては、細胞破壊段階で４Ｍグアニジニウムチオシ
アネートおよび１Ｍメルカプトエタノールを使用するこ
とが適当である。加えて、単離されたＲＮＡのＲＮａｓ
ｅ分解を抑えるには低温度および5.0 に近いｐＨが有用
である。

【００８２】一般に、ｍＲＮＡは汚染タンパク、ＤＮ
Ａ、ポリサッカライドおよび脂質を本質的に含まずに作
成される。このように精製するための標準的な方法は当
業界で公知である。こうして単離されたＲＮＡは非メッ
センジャーおよびメッセンジャーＲＮＡを含む。真核生
物のｍＲＮＡを分離するには、真核生物ｍＲＮＡの３′
末端にポリアデニル酸が存在するためにもたらされる水
素結合特異性を利用して、オリゴーｄＴセルロースある
いは他のオリゴヌクレオチド置換カラム材料例えばポリ
Ｕ−セファロースのカラムを用いるクロマトグラフィー
にかけるのが一般的である。

【００８３】通常の次の工程は、単離されたｍＲＮＡの
不均質配列に相補的なＤＮＡを形成することにある。こ
の反応のために原則的にはｍＲＮＡ鋳型の相補的ＤＮＡ
コピーを正確に形成しうる酵素であれば使用しうるが、
逆転写酵素が選択される。反応は先行技術に記載された
条件下で、鋳型としてｍＲＮＡおよびＤＮＡ鎖の前駆物
質として４種のデオキシヌクレオシド トリフォスフェ
ート、即ちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴ
Ｐの混合物を用いて実施される。反応過程をモニター
し、クロマトグラフィーや電気泳動等で分離後生成物を
回収するための目印（ｔａｇ）を与えるために、かつ回
収率を定量評価する目的で、ヂオキシヌクレオシド ト
リフォスフェートの１種のアルファ位を放射性同位元素
例えば³²Ｐで標識することが好都合である。上記したエ
フストラティアディス、エー（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉ
ｓ，Ａ．）らの文献を参照されたい。

【００８４】逆転写酵素反応により生成されるｃＤＮＡ
転写物は、ｍＲＮＡ鋳型に対する各転写物の開始点およ
び終結点が異なっているために５′末端並びに３′末端
の配列が幾分異質である。５′末端の変異性は、合成を
開始するために使用されるオリゴ−ｄＴプライマーはｍ
ＲＮＡのポリアデニル化領域に沿った各種地点で結合し
得るためと考えられる。

【００８５】ｃＤＮＡ転写物はポリ−Ａ領域の中間点で
合成が開始され、各種長さのポリ−Ａ領域がオリゴ−ｄ
Ｔプライマーの初期結合サイトに応じて転写される。こ
の不確実性は、オリゴ−ｄＴトラクト（ｔｒａｃｔ）に
加えてＲＮＡ配列それ自体のヌクレオチド１個あるいは
２個を含むプライマーを使用すれば避けられ、転写反応
を開始するのに好ましくかつ一定の結合サイトを有する
プライマーが生成される。

【００８６】ｃＤＮＡ転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）
の３′末端の不確実性は、逆転写酵素反応に影響を及ぼ
す各種因子およびＲＮＡ鋳型の部分的分解の恐れによる
ものである。最大長さを有する特定のｃＤＮＡ転写物
は、逆転写酵素反応条件を十分な長さ（ｆｕｌｌ ｌｅ
ｎｇｔｈ）の合成に好都合でありＤＮＡ短鎖の合成を抑
制するように選択すれば極めて容易に単離される。トリ
骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素のための好ましい反応条
件は、米国特許第4,363,877 号明細書の実施例に記載さ
れており、前記明細書は本明細書中に緩用される。長鎖
ＤＮＡ転写物を高い確実度で最大に生成すべく変更され
うる特殊パラメーターは反応温度、塩濃度、酵素量、鋳
型に対するプライマー濃度および反応時間である。

【００８７】温度および塩濃度条件は、オリゴ−ｄＴプ
ライマーとＲＮＡ鋳型のポリアデニル化部分との間の特
殊な塩基対合（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ）を最適にす
るように選択される。適切に選択された条件下で、プラ
イマーはＲＮＡ鋳型のポリアデニル化領域で結合し、短
かいＡ−リッチ配列のような鋳型上の別の位置でのプラ
イマー結合による非特異的開始反応は実質的に避けられ
る。温度および塩濃度の影響は相互依存性である。温度
を高くし塩濃度を低くすると、特異的な塩基対合相互作
用の安定性が低下する。反応時間は、非特異的開始反応
を回避しかつ分解の機会を最小限にするために出来る限
り短く保たれる。反応時間は温度と相関関係にあり、温
度が低ければ反応時間は長時間を要する。42℃では１〜
10分の反応時間が適当である。プライマーはＲＮＡ鋳型
に対して50〜500 倍モル過剰に存在させなければなら
ず、酵素もＲＮＡ鋳型に対して同様にモル過剰で存在さ
せなければならない。過剰の酵素およびプライマーを使
用すると開始反応およびｃＤＮＡ鎖の成長が促進され、
長鎖のｃＤＮＡ転写物が限られた短いインキュベーショ
ン時間内に効率よく産生される。

【００８８】多くの場合、ｍＲＮＡから転写された一本
鎖ｃＤＮＡを使用して該ｃＤＮＡをさらに精製すること
が可能であろう。しかし下記に論ずるように、所望の制
限酵素が２本鎖ＤＮＡに対してしか作用しない場合があ
る。この場合、前記のようにして調製されたｃＤＮＡ
は、例えばリバーストランスクリプターゼのようなＤＮ
Ａポリメラーゼ及び１本鎖ＤＮＡを加水分解できるヌク
レアーゼを使用して、２本鎖ＤＮＡ合成用の鋳型として
使用できる。この方法による２本鎖ＤＮＡの調製方法は
先行文献に記載されている。例えば、ウルリッチ（Ｕｌ
ｌｒｉｃｈ）．Ａ．，シャイン（Ｓｈｉｎｅ）．Ｊ．，
チャーグゥイン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）．Ｊ．，ピクテッ
ト（Ｐｉｃｔｅｔ），Ｒ．，ティシエー（Ｔｉｓｃｈｅ
ｒ）、Ｅ．，ルター（Ｒｕｔｔｅｒ）、Ｗ．Ｊ．及びグ
ッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ），Ｈ．Ｍ．サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）196 ，1313（1977）を参照されたい。必
須ではないが所望により米国特許第4,363,877 号の方法
によりｃＤＮＡを更に精製することも可能である。この
方法においては、不均一ｍＲＮＡ配列の転写により調製
された不均一ｃＤＮＡを、１種あるいは２種の制限エン
ドヌクレアーゼにより処理する。使用するエンドヌクレ
アーゼの選択はまず第１に、単離したいｃＤＮＡ配列中
に存在する酵素認識部位の予備測定に依る。この方法は
２つのそのような部位の存在に左右される。該部位が同
一である場合、一つの酵素で十分である。所望配列は両
部位で開裂され、所望ｃＤＮＡ配列に関する限りサイズ
の不均一性が取り除かれ、所望配列を含み長さが均一な
フラグメント（断片）と指称する分子の数が増大する。
制限部位が異なる場合は、所望の長さの均一なフラグメ
ントを生成するために２つの酵素が必要である。

【００８９】所望のタンパク質の全体あるいは一部をコ
ードする最適長さのヌクレオチド配列フラグメントを生
成できる制限酵素の選択は経験的に成されなければなら
ない。所望のタンパク質のアミノ酸配列が既知である場
合は、制限エンドヌクレアーゼ開裂により生成された統
一された長さのフラグメントのヌクレオチド配列を、そ
れがコードするアミノ酸配列と、全ての生物の形態に共
通な遺伝子コード（遺伝暗号）の公知の関係を使用して
比較することができる。しかしながら、部分的な配列に
基いて必要程度に正確な同定ができるので、所望タンパ
ク質の完全なアミノ酸配列は必要ではない。所望タンパ
ク質のアミノ酸配列が既に判明していない場合、制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂によって生成された統一長のポリ
ヌクレオチドは、適当なｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質
合成系において所望タンパク質の合成を検知し得るプロ
ーブとして使用し得る。あるいは、ｍＲＮＡはアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製し得る。当業者に
より考えられ得るその他の技術も本目的に適当なものと
なろう。

【００９０】使用に適した制限酵素の数は、一本鎖ｃＤ
ＮＡを使用するか２本鎖ｃＤＮＡを使用するかに依る。
好ましい酵素は一本鎖ＤＮＡに対して作用できるもので
あり、一本鎖ＤＮＡはｍＲＮＡ逆転写の直接の反応生成
物である。現在知られている一本鎖ＤＮＡに作用し得る
制限酵素の数は限られている。酵素ＨａｅIII ，Ｈｈａ
Ｉ及びＨｉｎ（ｆ）Ｉが現在知られている適したもので
ある。さらに、酵素ＭｂｏIIも一本鎖ＤＮＡに作用し得
る。さらに研究されて他の制限酵素が一本鎖ＤＮＡに作
用し得ることが判明した場合は、そのような酵素も好ま
しい酵素の一端に加えられるであろう。２本鎖ｃＤＮＡ
に特異的なものも適した酵素に加えられる。このような
酵素は、２本鎖ｃＤＮＡを生成するために付加的な反応
を必要とし、長い配列のロス及び不完全な回収によるそ
の他のロスの機会を増加させるので好ましくない。二本
鎖ｃＤＮＡを使用すると更に、事後の配列分析がより複
雑で労力を要するという技術的不利を招く。これ等の理
由から一本鎖ｃＤＮＡが好ましいが、２本鎖ＤＮＡの使
用も可能である。実際、本発明は当初２本鎖ｃＤＮＡを
用いて実施されたものである。

【００９１】制限エンドヌクレアーゼ処理のために調製
されるｃＤＮＡは、放射活性標識をして後の分離段階で
検知し得るようにしてもよい。好ましい方法は³²Ｐのよ
うな放射活性標識を４つのデオキシヌクレオシドトリフ
ォスフェート前駆体のうちの１つのα位置に結合するも
のである。最高の活性は、放射活性前駆体の濃度が非放
射活性形状のものの濃度に対して高い時に得られる。し
かしどのようなデオキシヌクレオシドトリフォスフェー
トの全濃度も、逆転写酵素反応において得られるｃＤＮ
Ａの長さを最大にするために30μＭよりも大きくなけれ
ばならない。エフストラティアディス（Ｅｆｓｔｒａｔ
ｉａｄｉｓ）、Ａ．，マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）、Ｔ．，カファトス（Ｋａｆａｔｏｓ）、Ｆ．
Ｃ．，ジェフリー（Ｊｅｆｆｒｅｙ）、Ａ．及びボーナ
キス（Ｖｏｕｒｎａｋｉｓ）、Ｊ．Ｎ．，セル（Ｃｅｌ
ｌ）４，367 （1975）を参照されたい。ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列を決定する目的で、ポリヌクレオチドキナ
ーゼ酵素により触媒される反応において³²Ｐで５′末端
を標識するのが便利である。マキザム（Ｍａｘａｍ）、
Ａ．Ｍ．及びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｗ．，ブ
ロク・ナトル・アカド・スシ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ 74，560 （1977）を参照さ
れたい。

【００９２】一つの制限酵素あるいは２つの制限酵素の
組合せの作用により生成されたフラグメントは、異なる
長さに基いてポリヌクレオチドを分離できる何等かの方
法により、お互いに及び認識部位を欠く不均一分散配列
（ｈｅｔｅｒｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ）から分離し得る。そのような方法としては様々な電
気泳動法及び超遠心を使用した沈降法が含まれる。ゲル
電気栄導は、ポリヌクレオチド長に基いて最良の分解能
が得られるので好ましい。さらに該方法では分離物質の
定量的回収が容易である。便利な電気泳動法がディング
マン（Ｄｉｎｇｍａｎ）、Ｃ．Ｗ．及びピーコック（Ｐ
ｅａｃｏｃｋ）、Ａ．Ｃ．，バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７，659 （1968）及びマニア
ティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．，ジェフリー（Ｊｅ
ｆｆｒｅｙ）、Ａ．及びバンドサンド（ｖａｎ ｄｅ
Ｓａｎｄｅ）、Ｈ．，バイオケミストリー、14、3787
（1975）に開示されている。

【００９３】種々のソースから得られたｃＤＮＡ転写物
の殆どは、制限エンドヌクレアーゼ処理に先立ち、長さ
において不均一分散であることが判明するであろう。適
当に選択された制限エンドヌクレアーゼあるいはエンド
ヌクレアーゼ対の作用により、所望の配列を含むポリヌ
クレオチド鎖が各制限部位で開裂され、統一長のポリヌ
クレオチドフラグメントを生成する。ゲル電気泳動にお
いてこれ等は異なるバンドを形成することが観察され
る。他の配列における制限部位の有無により、他の分離
したバンドが同様に形成され得るが、それは所望配列の
ものとは異なる長さのものであろう。従って制限エンド
ヌクレアーゼ作用の結果により、ゲル電気泳動パターン
は１つ以上の分離したバンドを見せるが、残りのｃＤＮ
Ａは不均一分散のままになるであろう。所望のｃＤＮＡ
配列が、存在する主要なポリヌクレオチドの種から成る
場合は、電気泳動パターンはこのｃＤＮＡの殆どが分離
バンド中に存在するということを示すであろう。

【００９４】２つの異なる配列が制限酵素により開裂さ
れて殆ど同じ長さのフラグメントを生成するということ
はありそうにもないが、規定長のフラグメントの純度検
定法は望ましいものである。電気泳動バンドの配列分析
は、バンド中の物質の10％以上の不純物の検出には使用
できる。最初の単離方法に適用したのと同じ一般的原理
に基いて、低レベルの不純物を検知する方法が研究され
て来た。該方法においては、所望ヌクレオチド配列フラ
グメントが最初の単離においては使用されなかった制限
エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含んでいること
が必要である。ゲル電気泳動バンドから溶出されたポリ
ヌクレオチド材料を所望配列に内的に作用し得る制限エ
ンドヌクレアーゼで処理すると、所望配列が殆どは非等
長の２つのサブフラグメントに開裂される。これ等のサ
ブフラグメントは電気泳動においてそれぞれの長さに対
応する位置に別々のバンドを形成し、それ等の合計は開
裂前のポリヌクレオチドの長さに等しいはずである。制
限酵素に対して敏感でない最初のバンド中の不純物は最
初の位置に移動するであろうと考えられる。前記酵素に
対する１つ以上の認識部位を含む不純物は２つ以上のサ
ブフラグメントを生成すると考えられる。認識部位の分
布は本質的にランダムであると考えられるので、不純物
が所望配列のフラグメントと同じ大きさのサブフラグメ
ントを生成する可能性は極めて低い。放射活性標識ポリ
ヌクレオチドバンドに存在する材料の量は、各バンドに
存在する放射活性の量の定量測定、あるいはその他の適
当な方法により測定できる。所望配列のフラグメントの
純度の定量的測定は、所望配列のサブフラグメントを示
すバンド中に存在する材料の量を材料総量と比較して得
ることができる。

【００９５】前記の分離、あるいは所望の遺伝子を単離
するその他の方法の後、該配列を再結合し得る。ＤＮＡ
フラグメントの末端と末端との結合を触媒する酵素ＤＮ
Ａリガーゼをこの目的に使用し得る。所望配列のサブフ
ラグメントを示すゲル電気泳動バンドを別々に溶出し、
適当な条件下でＤＮＡリガーゼを存在させて一緒にす
る。スガラメラ（Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ）、Ｖ．，バン
デサンデ（Ｖａｎ ｄｅＳａｎｄｅ）、Ｊ．Ｈ．及びコ
ラナ（Ｋｈｏｒｏｎａ）、Ｈ．Ｇ．，プロク・ナトル・
アカド・スシ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ）、ＵＳＡ 67、1468（1970）を参照されたい。結合
する配列が平滑末端でない場合は、Ｅ．ｃｏｌｉより得
られたリガーゼが使用し得る（モドリッチ（Ｍｏｄｒｉ
ｃｈ）、Ｐ．及びレーマン（Ｌｅｈｍａｎ）、Ｉ．
Ｒ．，ジェイ・バイオル・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、245 、3626（1970））。

【００９６】制限エンドヌクレアーゼ処理により生成さ
れたサブフラグメントからのオリジナル配列再結合の効
率は、不適当な配列の再結合を防ぐ方法を使用すること
により非常に増大する。この望ましくない結果は、制限
エンドヌクレアーゼによる均一（均質）ｃＤＮＡの開裂
の前にｃＤＮＡ上の５′−末端リン酸基を除去し得る試
薬で所望配列の均一長ｃＤＮＡフラグメントを処理して
おくことによって防止できる。酵素アルカリフォスファ
ターゼが好ましい。５′末端リン酸基は、後の開裂サブ
フラグメントの再結合に使用されるＤＮＡリガーゼの結
合作用において構造的必要条件である。従って、５′−
末端リン酸を欠く末端は共有結合され得ない。ＤＮＡサ
ブフラグメントは、単離ＤＮＡフラグメントについて成
される制限エンドヌクレアーゼによる開裂によって生成
される５′−リン酸を含む末端においてのみ結合され
る。

【００９７】上述の条件下では、ｃＤＮＡ転写体の大部
分は、ｍＲＮＡ鋳型の５′−末端を含むｍＲＮＡ領域か
ら同じ鋳型に対して制限エンドヌクレアーゼ開裂により
得られたフラグメントを特異的なプライマーとすること
によって得られる。このようにして、前記の方法は、所
望タンパク質に関連する特異的ヌクレオチド配列フラグ
メントだけでなく、当該タンパク質をコードした全ヌク
レオチド配列を得るのにも使用し得る。化学的に合成さ
れたオリゴヌクレオチドリンカーであって、制限エンド
ヌクレアーゼの認識配列を有する２本鎖リンカーを単離
ｃＤＮＡの末端に付けて、後のベクターＤＮＡからの遺
伝子部分の酵素的除去を容易化することができる。シェ
ラー（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ）、Ｒ．Ｈ．等、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）196 、177 （2977）を参照された
い。ベクターＤＮＡは適当な制限エンドヌクレアーゼに
よる処理により、連続ループから直鎖形状に変換され
る。それによって形成された末端はアルカリフォスファ
ターゼで処理して５′−リン酸末端基を除去し、ベクタ
ーＤＮＡがＤＮＡリガーゼ反応において第１にアポエク
オリンＤＮＡセグメントを取り込むことなしに連続ルー
プを形成しないようにする。リンカーオリゴヌクレオチ
ドを伴なうｃＤＮＡと処理済ベクターＤＮＡをＤＮＡリ
ガーゼ酵素と混合し、ｃＤＮＡをベクターＤＮＡに結合
してｃＤＮＡを取り込んでその中に有する組換ベクター
ＤＮＡの連続ループを形成する。プラスミドベクターを
使用する場合、通常該閉鎖ループがバクテリアの形質転
換を行える唯一の形となる。形質転換とは、当該分野で
理解され本明細書でも使用されているように、微生物の
それ自身の遺伝子構造内に細胞外ＤＮＡを取り込む工程
を指すものである。閉鎖ループ形状のプラスミドＤＮＡ
は適当な環境条件下でそのように取り込まれる。取り込
まれた閉鎖ループプラスミドは形質転換細胞中で複製を
受け、その複製コピーは細胞分裂が起きると子細胞にも
伝えられる。その結果、プラミドを含有しその遺伝子デ
ターミナントを持った新規なセルラインが樹立される。
プラスミドの複製によりプラスミド遺伝子がセルライン
中に維持されるようなこの方法におけるプラスミドによ
る形質転換は、形質転換プラスミドＤＮＡが閉鎖ループ
形状であると高い確率で起り、直鎖状のプラスミドＤＮ
Ａを使用すると全く起らないか、あるいはまれにしか起
らない。一旦組換えベクターが形成されると、適当な微
生物の形質転換は単純な工程であり、当業者に理解され
るような適当な選択技術を使用してアポエクオリン遺伝
子を含む新規な微生物を容易に単離できる。

【００９８】要約すると下記のようにして、Ａｅｑｕｏ
ｒｅａクラゲから遺伝子情報を得、ｃＤＮＡに変換し、
ベクターに挿入し、宿主微生物の形質転換に使用し、ア
ポエクオリンを発現できる。

【００９９】１．Ａｅｕｏｒｅａクラゲからポリ
（Ａ⁺ ）ＲＮＡを単離する。

【０１００】２．ｉｎ ｖｉｔｒｏで１本鎖ｃＤＮＡを
合成し、その後逆転写酵素を使用して２本鎖ｃＤＮＡを
合成する。

【０１０１】３．Ｓ１ヌクレアーゼにより１本鎖部分を
消化する。

【０１０２】４．ゲル濾過で２本鎖ｃＤＮＡをサイズに
より分画化する。

【０１０３】５．ターミナルトランスフェラーゼ及びｄ
ＣＴＰを使用してｃＤＮＡをテイリングする。

【０１０４】６．Ｐｓｔ１によりｐＢＲ322 を消化し
て、ターミナルトランスフェラーゼ及びｄＧＴＰにより
直鎖状ＤＮＡをテイリングする。

【０１０５】７．ｄＣ−テイリングｃＤＮＡフラグメン
トとｄＧ−テイリングｐＢＲ322 をアニーリングする。

【０１０６】８．Ｅ．ｃｏｌｉＳＫ1592を形質転換す
る。テトラサイクリン耐性コロニーを選択する。

【０１０７】９．アンピシリン感受性に形質転換された
ものをスクリーニングする。ｔｅｔ^Rａｍｐ^S コロニー
は組換えプラスミドを含有する。それ等を−80℃で保存
する。

【０１０８】10．オリゴヌクレオチド混合プローブ（既
知アミノ酸配列より演繹した配列を使用）を放射活性で
標識する。

【０１０９】11．ニトロセルロースフィルター上でＡｅ
ｑｕｏｒｅａｃＤＮＡバンクの各構成員を培養する。コ
ロニーを溶解し、ＤＮＡをフィルターに固定する。

【０１１０】12．³²Ｐ標識オリゴヌクレオチド混合物を
ニトロセルロースフィルターにハイブリダイゼーション
させる。この³²Ｐ−プローブは、エクオリンｃＤＮＡ配
列を含むＥ．ｃｏｌｉ組換え体由来のプラスミドＤＮＡ
とハイブリンダイゼーションする。

【０１１１】13．過剰の³²Ｐ−プローブをフィルターか
ら洗浄する。

【０１１２】14．Ｘ線フィルムをフィルターに露出す
る。

【０１１３】15．Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃＤＮＡバンク中
で同定された組換体からプラスミドＤＮＡを調製する。

【０１１４】16．³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドをプラ
スミドＤＮＡ（サザンプロット）にハイブリダイゼーシ
ョンさせ、ハイブリダイゼーションを確認する。

【０１１５】17．ｐＨ7.2 のＥＤＴＡ含有バッファー中
でこれ等の組換体の抽出物を調製し、組換体にエクオリ
ンＤＮＡ配列が含まれていることを示す。腔腸動物ルシ
フェリン及びβ−メルカプトエタノールを加え、一液４
℃にインキュベートして発現アポタンパク質をチャージ
する。エクオリンアポタンパク質を発現する試料はＣａ
⁺²の添加により青色光を発する。

【０１１６】上記に一連の工程を記載したが、遺伝子工
学分野の技術者の知識と前述したガイドラインを合わせ
れば所望の遺伝子の単離及び組換ＤＮＡベクターでのそ
の使用は容易に可能であろうし、同じ結果が得られる他
の方法も判り、本発明の組換ＤＮＡベクターの調製に使
用できるであろう。

【０１１７】宿主中で再生成することが判明しているベ
クターを選択することによって形質転換宿主中にアポエ
クオリン遺伝子のコピーを多数存在させ、外因的な挿入
ＤＮＡ（例えばｐＵＣ８、ｐｔａｃ12あるいはｐＩＮ−
III −ｏｍｐＡ１，２又は３）から多量のタンパク質を
生成する方法、あるいは公知のその他のペプチド発現増
加手段を用いてアポエクオリンの発現を増加させること
ができる。

【０１１８】全ての場合においてアポエクオリンは、Ｄ
ＮＡ配列がベクターに機能的に挿入された時に発現され
る。「機能的に挿入された」とは、当業者にはよく理解
されるように、適正な解読枠と配向にあるということを
意味する。典型的にはアポエクオリン遺伝子はプロモー
ターから下流に挿入され、その後に停止コドンが位置す
る。所望により後に開裂を伴うハイブリッドタンパク質
として生成してもそうである。

【０１１９】上記したような、本発明の実施による組換
ＤＮＡ分子及び形質転換単細胞生物の調製に使用できる
一般的方法に加えて、その他の公知の方法及びその変形
も本発明を実施するのに使用できる。特に、遺伝子工学
に関する技術は近年、研究開発が進んでいる。多くの最
近の米国特許に、本発明の実施に使用できるプラスミ
ド、遺伝子操作を受けた微生物及び遺伝子操作の方法が
開示されている。例えば米国特許第4,273,875 号はプラ
スミドとその単離方法を開示している。米国特許第4,30
4,863 号は遺伝子工学によるバクテリアの生産方法を開
示しており、それによるとハイブリッドプラスミドを構
築し、バクテリア宿主の形質転換に使用している。米国
特許第4,419,450 号は組換ＤＮＡ研究においてクローン
化担体として有用なプラスミドを開示している。米国特
許第4,362,867 号は、クローン化工程に有用な組換ｃＤ
ＮＡ構築方法及びそれによって生成されたハイブリッド
ヌクレオチドを開示している。米国特許第4,403,036 号
は、多数のＤＮＡセグメントコピーを含むプラスミドを
生成するための遺伝子物質を開示している。米国特許第
4,363,877 号は組換ＤＮＡトランスファーベクターを開
示している。米国特許第4,356,270 号は組換ＤＮＡクロ
ーン化担体を開示しており、また遺伝子工学で使用され
る多くの用語及びそこで使用される基本的方法を定義し
ているので、遺伝子工学分野において限られた経験しか
持たない者にとって特に有用な文献である。米国特許第
4,336,336 号は融合遺伝子及びその製法を開示してい
る。米国特許第4,349,629 号はプラスミドベクター及び
その製造と使用を開示している。米国特許第4,332,901
号は組換ＤＮＡに有用なクローン化ベクターを開示して
いる。これ等の特許のうちいくつかのものは本発明の範
囲外の特定の遺伝子産物についてのものであるが、そこ
に記載された方法は、遺伝子工学の技術者であれば本明
細書に記載された本発明を実施するのに容易に改変し得
るものである。

【０１２０】これ等の特許及び本明細書で引用したその
他の全ての特許及び刊行物は、本発明の属する分野の技
術者の技術レベルを示すものであり、全て本明細書中に
リファランスとして含める。

【０１２１】本発明の内容は、エクオリンを螢光免疫測
定の研究あるいはその他のエクオリンを標識として使用
するアッセイにおいて、アポエクオリンを制限を受ける
ことなく使用できるようになるという点において有意義
なものである。生物発光アッセイにおけるアポエクオリ
ンの使用方法は、同一出願人が1983年10月13日に出願し
た出願番号541,405 号に開示されており、本明細書にリ
ファレンスとして含める。単離されたアポエクオリンｃ
ＤＮＡを他の発現ベクターに移入することにより、Ｅ．
ｃｏｌｉ中のアポエクオリンポリペプチドの発現を改善
し、あるいは他の宿主中のアポエクオリンの発現を可能
にする構築物が生成する。さらに、アポエクオリンｃＤ
ＮＡあるいはそのフラグメントをハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用することによって、他の生物発光
腔腸動物及び例えばイカ（軟体動物門）、魚（魚上綱）
及び甲殻綱のその他の生物に見られる構造的に関連する
遺伝子を容易にクローン化できる。これ等の遺伝子の中
には、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、スチラチュー
ラ（Ｓｔｙｌａｔｕｌａ）、プチロサルカス（Ｐｔｉｌ
ｏｓａｒｃｕｓ）、ウミサボテン（Ｃａｖｅｒｎｕｌａ
ｒｉａ）及びアカントプチラム（Ａｃａｎｔｈｏｐｔｉ
ｌｕｍ）のルシフェラーゼをコードするもの、更にヒド
ロ虫類のオベリア（Ｏｂｅｌｉａ）及び有櫛動物のムネ
ミオプシス（Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ）及びウリクラゲ
（Ｂｅｒｏｅ）に見られる発光タンパク質をコードする
ものが含まれる。

【０１２２】本明細書に記載した原理に基いたオリゴヌ
クレオチドプローブ及び変形ヌクレオチド配列を使用し
て、発光タンパク質を発現する上記の生物及び関連する
生物から遺伝子を単離することが特に期待される。その
ようなプローブは完全な配列よりもかなり短くてもよい
が、全長において少くとも10のヌクレオチドが必要であ
り、少くとも14のヌクレオチドを有することが好まし
い。それより長く、遺伝子の全長までのオリゴヌクレオ
チドもまた有用なものである。ＲＮＡプローブ及びＤＮ
Ａプローブとも使用できる。

【０１２３】使用においては、該プローブを検知可能な
ように標識し（例えば³²Ｐ、 ³Ｈ、ビオチンあるいはア
ビジンによる）、所望遺伝子を有する生物から得た一本
鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとインキュベートする。１本鎖
及び２本鎖の（ハイブリダイゼーションした）ＤＮＡ
（あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ）を分離（典型的にはニトロ
セルロースペーパーを使用して）した後、標識によりハ
イブリダイゼーションを検知する。オリゴヌクレオチド
と共に使用するのに適したハイブリダイゼーション技術
は公知のものである。

【０１２４】プローブは通常、容易に同定できるように
する検知可能な標識とともに用いられるが、非標識のオ
リゴヌクレオチドも有用なものであり、標識プローブの
前駆体としても、２本の鎖ＤＮＡ（あるいはＤＮＡ／Ｒ
ＮＡ）の直接検知を行なう方法における使用にも有用で
ある。従って、「オリゴヌクレオチドプローブ」という
用語は、標識及び非標識両方の形状のものを指すもので
ある。本明細書に記載したペプチド配列の40から110 の
アミノ酸をコードする領域から得られたオリゴヌクレオ
チドが特に好ましく、それはそれ等がルシフェリンとの
結合に関与するアミノ酸であるからである。

【０１２５】腔腸動物ルシフェリンは、表５に挙げた全
ての生物中に見られ、これらから得た発光タンパク質に
結合する。本明細書中に記載したオリゴヌクレオチドは
これ等の種から得た発光タンパク質遺伝子の単離におけ
るプローブとして有用であると考えられるものである。

【０１２６】

【表１０】表 ５ 腔腸動物型ルシフェリンの分布 １．刺胞動物門（腔腸動物門） Ａ花虫類（Anthozoa） ウミシイタケ（Renilla ）（３種）^aスチラチューラ (Stylatula ） プチロサルカス（Ptilosarcus ） ウミサボテン^b （Cavernularia） アカントプチラム（Acanthoptilum ） Ｂヒドロ虫類（Hydrozoa） オワンクラゲ^b （Aequorea） オベリア（Obelia） ２．有櫛動物門（Ctenophora） ムネミオプシス（Mnemiopsis） ウリクラゲ（Beroe ） ３．軟体動物門（Mollusca） ホタルイカ^a （Watasenia ） ４．魚類（Pisces） ネオスコペラス ミクロシール^a （Neoscopelus microc
hir ） ハダカイワシ（Diaphus ） ５．甲殻類（Crustacea ） Ａ十脚類（Decapods）（エビ） アカンテフィラ エキシミア（Acanthephyra eximia ） アカンテフィリア パープレア（Acanthephyria purpur
ea） オプロフォラス スピノサス^a （Oplophorus spinosus
） ヘテロカルプス グリマルディ（Heterocarpus grimald
ii） ヘテロカルプス レビガタス^a （Heterocarpus leaviga
tus ） システラスピス クリスタタ（Systellaspis cristata
） システラスピス デビリス（Systellaspis debilis） Ｂアミ類（Mysidacea ）（オポッサムシュリンプ，Opos
sum shrimp） グナトポジア インゲンス（Gnathophausia ingens） ａ 抽出ルシフェリンに関する化学的及び物理的データ
に基いて構造が(I) と同一。その他の全てのものはルシ
フェリン−ルシフェラーゼ交差反応並びに動力学及び生
物発光の発光スペクトルの比較に基く。

【０１２７】ｂ ルシフェリンが(I) と同一のものであ
るという付加的な証拠は、(II)と同一のものであること
が示された分離発光体に関する化学的及び物理的データ
から得られた。

【０１２８】

【化２０】

【０１２９】これまで総括的に記述してきた本発明は、
以下の実施例を参照しながらより容易に理解されるであ
ろう。これらの実施例は単に詳細な説明を意図するのみ
であって、特に記載のない限り本発明を限定するもので
はない。

【０１３０】実施例１：天然エクオリンの精製 第２のゲル濾過段階にセファテックスＧ−75（スーパー
ファイン）を用いること以外はブリンクス（Ｂｌｉｎｋ
ｓ）等の方法［ブリンクス・ジェイ・アール（Ｂｌｉｎ
ｋｓ，Ｊ．Ｒ．），ピー・エイチ・マッティングリー
（Ｐ．Ｈ．Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ），ビー・アール・ジェ
ウェル（Ｂ．Ｒ．Ｊｅｗｅｌｌ），エム・ファン・ルー
ヴェン（Ｍ．ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ），ジー・シー・
ハーレア（Ｇ．Ｃ．Ｈａｒｒｅｒ）及びデー・ジー・ア
レン（Ｄ．Ｇ．Ａｌｌｅｎ），メッド・エンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），57巻、 292
〜328 頁（1978年）］に従ってエクオリンを精製した。
エクオリンの精製は以下の手順で行った。

【０１３１】１．フライディ湾（Ｆｒｉｄａｙ Ｈａｒ
ｂｏｒ），ワシントンでエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅ
ａ）を収集し口周組織（光細胞：ｐｈｏｔｏｃｙｔｅ
ｓ）を採取する。

【０１３２】２．ＥＤＴＡ中の低張溶解によって光細胞
からタンパク質を抽出する。

【０１３３】３．光細胞抽出物を硫酸アンモニウム分画
（０〜75％）する。

【０１３４】４．（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ による沈殿物を遠
心分離して−70℃に保存したまま、フライディ湾、ワシ
ントンより船で運ぶ。

【０１３５】５．セファデックスＧ−50（ファイン）を
使ってゲル濾過を行なう。

【０１３６】６．ＱＡＥセファデックスを使ってｐＨ−
ステップ及び塩勾配溶出によるイオン交換を行なう。

【０１３７】７．セファデックスＧ−75（スーパーファ
イン）を使ってゲル濾過を行なう。

【０１３８】８．ＤＥＡＥ−セファデックスを使って、
ｐＨ−ステップ及び塩勾配溶出によりイオン交換を行な
う。

【０１３９】９．純粋なエクオリンを凍結乾燥（ＥＤＴ
Ａ中）し−80℃で保存する。

【０１４０】上記１−４段階はフライディ湾上にて行な
った。収集と口周組織の採取以外の全ての段階は０℃〜
４℃で行なわれた。段階４からの最終生成物は遠心ボト
ル（250ml）に入れてドライアイス中で保存した。該物
質はこのような形で船で運ばれた。

【０１４１】エクオリン及び緑蛍光タンパク質（ｇｒｅ
ｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦ
Ｐ）の精製（第５−９段階）はジョージアのアテンス
（Ａｔｈｅｎｓ）で行なった。全段階は０〜４℃で実施
された。エクオリン含有画分は各段階の間−80℃で保存
された。タンパク質濃度にかかわらず、エクオリンは凍
結融解に対して安定であるようである。

【０１４２】第５段階 セファデックスＧ−50（ファイ
ン）によるゲル濾過。

【０１４３】カラム寸法： 5.8cm×97cm；2563ml。

【０１４４】このカラムに10ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ5.5
（ＥＤＴＡ溶液を調製するのに２ナトリウム塩を用い
た）溶液を75ml／時の流速で流した。ＧＦＰ及びエクオ
リンはこのカラムで一緒に溶出された。次段階用にエク
オリン活性の65〜75％がプールされた。この画分の前後
の画分（ｓｉｄｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）もプールし後
段の精製のために保存された。この段階でのエクオリン
の収率は50〜80％の範囲に亘り、通常65〜75％の収率が
得られた。このカラムの能力は約1000mg（ブラドフォー
ド：Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ）／75mlであり、可能である限
り一般にそれよりも少ない量をカラムにかけた。

【０１４５】第６段階 ＱＡＥセファデックスによるイオン交換。

【０１４６】カラム寸法：直径５cm。15ｇの乾燥セファ
デックスをこの段階に用いた。カラムのベッド体積はイ
オン強度及び緩衝液組成によってクロマトグラフィの間
で変化した。

【０１４７】一般に、Ｇ−50の最初の６−10ステップか
らプールしたものをこのカラムに流した。この操作によ
って全収量が増え、効率的であった。この段階はブリン
クス等の方法（1978年）と全く同様に実施された。カラ
ムにかけた後、ＧＦＰはｐＨ−ステップ（５ｍＭ Ｎａ
Ａｃ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ4.75）によって選択的に
溶出された。エクオリンは次に、10ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ5.5 でＮａＣｌの直線勾配によって溶出された（全量
500ml）。ＧＦＰはＴｒｉｓ中10ｍＭにしｐＨを8.0 ま
で上げて−80℃にて次の精製まで保存された。エクオリ
ンプールは限外濾過（アミコンＹＭ−10膜）で濃縮して
次段階に用いる調製物とした。エクオリン収率は80％で
あった。

【０１４８】第７段階 セファデックスＧ−75（ｓｕｐ
ｅｒｆｉｎｅ）によるゲル濾過。

【０１４９】カラム寸法：2.8 cm×150 cm； 924ml。

【０１５０】カラムに10ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ5.5 の溶
液を10ml／時で流した。エクオリン収率は60−80％であ
った。

【０１５１】第８段階 ＤＥＡＥ−セファデックスによ
るイオン交換。

【０１５２】第７段階でのプールエクオリンをこのカラ
ムに直接かけ、ＱＡＥセファデックスカラムと全く同様
に溶出を行なった。エクオリン収率は一般に75〜80％で
あった。この段階は殆どのエクオリン調製の際には必要
のないものである。第７段階からのエクオリンは通常純
粋なものである（12％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による）。

【０１５３】第９段階 ＥＤＴＡ存在下でエクオリンを
95％より大きい回収率で凍結乾燥した。ＥＤＴＡが存在
しないと回収率は０から95％まで様々であった（ブリン
クス等、1978年参照）。

【０１５４】実施例２：エクオリンの配列決定に用いら
れる配列決定方法 アミノ酸配列分析は自動エドマン分解（エドマン（Ｅｄ
ｍａｎ）及びベッグ（Ｂｅｇｇ），1967年）を用いて実
施された。比較的多量のタンパク質又はペプチド（10nm
ol以上）の配列分析はモデル 890Ｂベックマンシークエ
ンサー（デューク大学、ボーン（Ｂｈｏｗｎ）等の記載
（1980年）のように最新のもの）及びポリブレン（ｐｏ
ｌｙｂｒｅｎｅ）を用いた0.55Ｍクアドロール（Ｑｕａ
ｄｒｏｌ）プログラム（タール（Ｔａｒｒ等、1978年）
を採用して実施した。Ｍ３及びＭ５という２つのペプチ
ドは小さいか又はクアドロール法ではカップから洗浄さ
れてしまうので、クラパー（Ｋｌａｐｐｅｒ）等（1978
年）によって提案されたジメチルアリルアミン緩衝液及
びポリブレン用に適合させたプログラムを使って配列決
定を行った。アミノ酸のフェニルチオヒダントイン（Ｐ
ＴＨ−）誘導体は、ハンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅｒ）及びフッド（Ｈｏｏｄ）によって記載された方法
（1978年）に主に従って、デュポン・ゾルベイ（ＤｕＰ
ｏｕｔ Ｚｏｒｂａｙ）ＯＤＳカラムを用いて逆相ＨＰ
ＬＣクロマトグラフィにより同定された。２−10nmol程
度の量で利用できるペプチドは、 0.1Ｍクアドロール
（ブラウアー（Ｂｒａｕｅｒ）等、1975年）及びポリブ
レン用のプログラムを使ってモデル 890Ｃベックマンシ
ークエンサー（ワシントン大学）によって配列決定され
た。ＰＴＨ−アミノ酸はエリクソン（Ｅｒｉｃｓｓｏ
ｎ）等によって記載された（1977年）逆相ＨＰＬＣシス
テムを用いて同定された。 1.5nmolより少ない量のペプ
チドを使う場合には、応用バイオシステムモデル 470Ａ
気相シークエンサー（ワシントン大学，ハンカビラー
等，1983年）を用いて配列分析を行った。気相装置から
のＰＴＨアミノ酸はハンカビラー及びフッドの記載（19
83年）に従ってＩＢＭシアノカラムを用いて同定され
た。

【０１５５】参考文献 エドマン・ピー及びベッグ・ジー ヨーロピアン・ジェ
イ・バイオケミ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１
巻、80〜91頁（1967年）。

【０１５６】ボーン・エー・ジー，コルネリウス・ティ
ー．ユー（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，Ｔ．Ｕ．），モール・
ジェイ・イー（Ｍｏｌｅ，Ｊ．Ｅ．），リン・ジェイ・
デー（Ｌｙｎｎ，Ｊ．Ｄ．），ティドウェル，ダヴリュ
ー・エー（Ｔｉｄｗｅｌｌ，Ｗ．Ａ．）及びベネット・
ジェイ・シー（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．），アナル・
バイオケミ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）， 102巻，
35〜38頁（1980年）。

【０１５７】タール・ジー・イー（Ｔａｒｒ，Ｇ．
Ｅ．），ベーチナー・ジェイ・エフ（Ｂｅｅｃｈｎｅ
ｒ，Ｊ．Ｆ．），ベル・エム（Ｂｅｌｌ，Ｍ．）及びマ
ックイーン・ディー・ジェイ（ＭｃＫｅａｎ，Ｄ．
Ｊ．），アナル・バイオケミ，84，622−627 （197
8）。Ｋｌａｐｐｅｒ，Ｄ．Ｇ．，Ｗｉｌｄｅ，Ｃ．
Ｅ．，III 及びＣａｐｒａ，Ｊ．Ｄ．Ａｎａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．85巻，126 〜131 頁（1978年）。

【０１５８】ハンカピラー・エム・ダヴリュー（Ｈｕｎ
ｋａｐｉｌｌａｒ，Ｍ．Ｗ．），フッド・エル・イー
（Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ），17巻，2124〜2133頁（1978年）。

【０１５９】ブラウアー・エー・ダヴリュー（Ｂｒａｕ
ｅｒ，Ａ．Ｗ．）；マルゴリエス・エム・エヌ（Ｍａｒ
ｇｏｌｉｅｓ，Ｍ．Ｎ．）及びハーベー・イー（Ｈａｂ
ｅｒ，Ｅ．），バイオケミストリー，13巻，3029〜3035
頁（1975年）。エリクソン・エル・エイチ（Ｅｒｉｃｓ
ｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．），ウェード・アール・ディー（Ｗａ
ｄｅ，Ｒ．Ｄ．），ギャグノン・ジェイ（Ｇａｇｎｏ
ｎ，Ｊ．），マクドナルド・アール・アール（ＭｃＤｏ
ｎａｌｄ．Ｒ．Ｒ．）及びワアルシュ・ケー・エー（Ｗ
ａｌｓｈ，Ｋ．Ａ．），タンパク質配列分析に於ける固
相法，プレビエロ・エー（Ｐｒｅｖｉｅｒｏ，Ａ．）及
びコレハイ−プレビエロ・エム・エー（ＣｏｌｅＨｉ−
Ｐｒｅｖｊｅｒｏ，Ｍ．Ａ．）版， 137〜142 頁，エル
セビアー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）／北オランダアムステル
ダム（1977年）。

【０１６０】ハンカピラー・エム・ダヴリュー，ヘヴィ
ック・アール・エム（Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．），ドレ
イヤー・ダヴリュー・ジェイ（Ｄｒｅｙｅｒ，Ｗ．
Ｊ．）及びフッド・エル・イー，メソド・エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ），91巻， 399
〜413 頁（1983年）。

【０１６１】ハンカピラー・エム・ダヴリュー及びフッ
ド・エル・イー，メソド・エンザイモロジー，91巻， 4
86〜493 頁（1983年）。

【０１６２】実施例３：均一アポエクオリンをコードし
ているｃＤＮＡのクローニング及びその発現。

【０１６３】材料及び方法 制限酵素はベセスダ・リサーチ・研究所（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ），ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）及びインターナショナル
・バイオテクノロジー会社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から
購入し、それぞれに記載された条件に従って使用した。
ＲＮアーゼ（ＲＮａｓｉｎ）及び逆転写酵素はそれぞれ
バイオテク（Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びライフ・サイエンス
（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。末端転移酵
素（ターミナルトランスフェラーゼ）はＰＬバイオケミ
カルから購入した。腔腸動物門のルシフェリンは従来技
術の記載に従って合成し、必要な時まで凍結乾燥粉末で
保存した：ホリ・ケー（Ｈｏｒｉ，Ｋ．），アンデルセ
ン・ジェイ・エム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．），ワ
ード・ダヴリュー・ダヴリュー（Ｗａｒｄ，Ｗ．Ｗ．）
及びコルミアー・エム・ジェイ（Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｍ．
Ｊ．），バイオケミストリー，14巻，2371〜2376頁（19
75年）；ホリ・ケー（Ｈｏｒｉ，Ｋ．），カルボネアゥ
・エイチ（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．），ハート・
アール・シー（Ｈａｒｔ，Ｒ．Ｃ．）及びコルミアー・
エム・ジェイ，プロス・ナトル・アカド・サイ（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），米国，74巻，
4285〜4287頁（1977年）；イノウエ・エス（Ｉｎｏｕｙ
ｅ，Ｓ），スギムラ・エイチ（Ｓｕｇｉｕｒａ，
Ｈ．），カコイ・エイチ（Ｋａｋｏｉ，Ｈ．），ハシヅ
マ・ケー（Ｈａｓｉｚｕｍａ，Ｋ．），ゴトウ・テー
（Ｇｏｔｏ，Ｔ．）及びイイオ・エイチ（Ｉｉｏ，
Ｈ．），ケミ・レター（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）， 141
〜144 頁（1975年）。

【０１６４】ＲＮＡ単離及びイン・ヴィトロに於ける翻訳 エクオレア・ヴィクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃ
ｔｏｒｉａ）クラゲがワシントン大学海洋生物研究所に
て、ワシントンのフライディ湾に於いて収集された。ク
ラゲの周囲から口周リング（ｃｉｒｃｕｍｏｒａｌ ｒ
ｉｎｇ）を切り取り、直ちにドライアイス／メタノール
浴中で凍結させた。この組織を−70℃にて所望の時まで
保存した。

【０１６５】キム（Ｋｉｍ）等の方法［キム・ワイ・ジ
ェイ・シューマン・ジェイ（Ｓｈｕｍａｎ，Ｊ．），セ
ッテ・ケー（Ｓｅｔｔｅ，Ｋ．）及びプルツィビラ・エ
ー（Ｐｒｚｙｂｙｌａ，Ａ．），細胞生物誌（Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．），96巻，393〜400 頁（1983年）］
に従ってＲＮＡを単離し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを前記方
法［アビブ・エイチ（Ａｖｉｖ，Ｈ．）及びレーダー・
ピー（Ｌｅｄｅｒ，Ｐ．），ＰＮＡＳ69，1408〜1412頁
（1972年）］を用いて調製した。

【０１６６】ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（１μｇ）及びポリ
（Ａ−）ＲＮＡ（20μｇ）はラビット網状赤血球イン・
ヴィトロ翻訳システムを用いて翻訳された［ペルハム・
エイチ・アール・ビー（Ｐｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．Ｂ）及
びジャクソン・アール・ジェイ（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．
Ｊ．），ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリ
ー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）， 247巻（1976
年）；メリック・ダヴリュー・シー（Ｍｅｒｒｉｃｋ，
Ｗ．Ｃ．），メソド・イン・エンザイム（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚ．）， 101（Ｃ）， 606〜615 頁（19
83年）参照］。溶解物からミクロコッカスヌクレアーゼ
を用いて内因性ｍＲＮＡを除去した。各翻訳試料（総量
62μｌ）を³⁵Ｓ−メチオニン（38μＣｉ）存在下に90分
間25℃に保持した。電気泳動分析用に各翻訳試料から２
μｌを取った。抗エクオリン（２μｌ）及びスタファウ
レウス（Ｓｔａｐｈａｕｒｅｕｓ）細胞を50μｌの各翻
訳混合物中に加えてアポエクオリンを免疫沈降させた。
数回洗浄後に抗体−アポエクオリン複合体をＳＤＳ存在
下で加熱して解離させた。この翻訳生成物をＳＤＳポリ
アクリルアミド（13％）ゲルで分析した。電気泳動に次
いで、ゲルをクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）Ｒ−250
で染色しタンパク質の標準物を同定し、その後該ゲルに
ＤＭＳＯ中のＰＰＯを含浸させた。−70℃でフルオログ
ラフィを行なった。

【０１６７】ＤＮＡ組換え操作 二本鎖ｃＤＮＡを全エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ポ
リ（Ａ＋）ＲＮＡからウィケンス（Ｗｉｃｋｅｎｓ）等
の記載［ウィケンス・エム・ピー（Ｗｉｃｋｅｎｓ，
Ｍ．Ｐ．），ブエル・ジー・エヌ（Ｂｕｅｌｌ，Ｇ．
Ｎ．）及びシムケ・アール・ティー（Ｓｃｈｉｍｋｅ，
Ｒ．Ｔ．），生物化学誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）， 253，2483〜2495頁（1978年）］のように合成
した。ホモポリマーのｄＣテールを付加した後、二本鎖
ｃＤＮＡをｄＧ−テールを付加されたＰｓｔＩ切断ｐＢ
Ｒ322 ［ヴィラ・コマロフ・エル（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍ
ａｒｏｆｆ，Ｌ．），エフストラディアディス・エー
（Ｅｆｓｔｒａｄｉａｄｉｓ，Ａ．），ブルーム・エス
（Ｂｒｏｏｍｅ，Ｓ．），ロメジコ・ピー（Ｌｏｍｅｄ
ｉｃｏ，Ｐ．），チザード・アール（Ｔｉｚａｒｄ，
Ｒ．），ナーベル・エス・ピー（Ｎａｂｅｒ，Ｓ．
Ｐ．），チック・ダヴリュー・エル（Ｃｈｉｃｋ，Ｗ．
Ｌ．）及びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ），ＰＮＡＳ，
75巻，3727〜3731頁（1978年）］とアニーリングし、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＫ1592株を形質転換するのに用
いた。テトラサイクリン耐性・アンビシリン感受性コロ
ニーを移し取りマイクロタイターディッシュ内で−70℃
にて凍結させた。

【０１６８】エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ｃＤＮＡ
ライブラリーを合成オリゴヌクレオチド混合物を使って
スクリーニングにかけエクオリンｃＤＮＡを捜した。こ
のオリゴヌクレオチド混合物はコロンビア大学のチャー
ルズ・カントー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃａｎｔｏｒ）及び
カルロス・アルガラナ（Ｃａｒｌｏｓ Ａｒｇａｒｎａ
ｎａ）から提供された。ポリアクリルアミド電気泳動
［マニアティス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）及
びエフストラティディス・エー（Ｅｆｓｔｒａｔｉｄｉ
ｓ，Ａ．），メソ・イン・エンザイム（Ｍｅｔｈ．ｉｎ
Ｅｎｚ．），65巻， 299〜305 頁（1980年）］によっ
てそれらを精製した後、17コより成る前記オリゴヌクレ
オチド（17マー）をポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−
³²Ｐ−ＡＴＰを用いて放射活性標識した［マキシマム・
エー・エム（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．）及びギルバート・
ダヴリュー（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．），メソ・イン・エ
ンザイム，65巻， 499〜559 頁（1980年）］。取り込ま
れなかった³²ＰはＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマ
トグラフィによって除去された。

【０１６９】エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ｃＤＮＡ
バンクは次下のようにスクリーニングされた：大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体を凍結培養物からルリア寒天
プレート上のニトロセルロースフィルター（７×11cm）
に移行した。これらのコロニーを37℃にて12時間培養し
た後溶解し、そしてワットマン541 紙用の記載に従って
そのＤＮＡを固定した［タウブ・エフ（Ｔａｕｂ，
Ｆ．）及びトンプソン・イー・ビー（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，Ｅ．Ｂ．），アナル・バイオケミ（Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．），126 巻， 222〜230 頁（1982年）］参
照。このフィルターを空気乾燥後に真空下２時間ベーキ
ングした。

【０１７０】このフィルターをまず初めに１×ＳＳＣ中
で湿らせた後、フィルター１枚当り３mlのプレハイブリ
ダイゼーション溶液（10×ＮＥＴ， 0.1％ＳＤＳ，３×
デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）中で55℃，12−20時間
保持した。この溶液をハイブリダイゼーションバッグか
ら注ぎ出し、フィルター１枚当り１mlのハイブリダイゼ
ーション溶液（10×ＮＥＴ， 0.1％ＳＤＳ，３×デンハ
ルト，１×10⁶ cpm の³²Ｐ標識１７マー／フィルター）
を代りに注入した。37℃にて24時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行ない、その後４℃の10×ＳＳＣ中で10分間かけ
て４回洗浄した。フィルターを空気乾燥した後プラスチ
ックラップに包んだ。デュポン・クロネックス増感板を
使いコダックＸＡＲ−５フィルムを−70℃にてこのフィ
ルターに露出した。

【０１７１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖及び抽出操作 ｐＡＥＱ１−ｐＡＥＱ６を含む大腸菌ＳＫ1592をルリア
流体培養基25ml中で37℃にて一晩増殖させた。この細胞
を遠心分離した後、10％ショ糖，50ｍＭトリスｐＨ８溶
液５mlに再懸濁した。この溶液に、 0.1Ｍフェニルメチ
ルスルホニルフロライドを 7.2μｌ， 0.2Ｍ ＥＤＴＡ
を 312μｌ，10mgのリゾチーム及び10mg／mlのＲ Ｎａ
ｓｅ Ａを10μｌ加えて細胞を溶解した。氷中で45分間
保持した後、この混合物を43,500×ｇで１時間遠心分離
にかけ、この上清を貯えた。

【０１７２】エクオリンの精製及びアッセイ ブリンクス等の方法［ブリンクス・ジェイ・アール（Ｂ
ｌｉｎｋｓ，Ｊ．Ｒ．），ウィア・ダヴリュー・ジー
（Ｗｉｅｒ，Ｗ．Ｇ．），ヘス・ピー（Ｈｅｓｓ，
Ｐ．）及びプレダーガスト・エフ・ジー（Ｐｒｅｄｅｒ
ｇａｓｔ，Ｆ．Ｇ．），プログ・バイロフィズ・モレキ
ュラー・バイオロ（Ｐｒｏｇ・Ｂｉｏｐｈｙｓ・Ｍｏｌ
ｅｃ・Ｂｉｏｌ），40巻，１〜114 頁（1982年）］に従
って、エクオリンを抽出・精製した。エクオリンすなわ
ち光タンパク質（ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）活性は、
５μｌの試料を 0.1Ｍ ＣａＣｌ₂ ， 0.1Ｍトリス，ｐ
Ｈ8.0 溶液 0.5mlに注入すると同時にピーク光強度（ｐ
ｅａｋ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）及び全光子
数を測定することで求めた。この測定用の測光計の設計
及び光子収量の絶対量に対する装置の標準化について
は、以前に記載されたものを参照されたい［アンデルソ
ン・ジェイ・エム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．），フ
ァイニ・ジー・ジェイ（Ｆａｉｎｉ，Ｇ．Ｊ．）及びワ
アンプラー・ジェイ・イー（Ｗａｍｐｌｅｒ，Ｊ．
Ｅ．），メソド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．），57巻， 529〜559 頁（1978
年）；カルボネアゥ・エイチ（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａ
ｕ，Ｈ．）及びコルミエル・エム・ジェイ（Ｃｏｒｍｉ
ｅｒ，Ｍ．Ｊ．），ジェイ・バイオロ・ケム（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．ｃｈｅｍ．），254 頁， 769〜780 頁（1979
年）］。

【０１７３】ｐＡＥＱ１抽出物からのアポエクオリン活性の部分精製 発現されたアポエクオリンは、ｐＡＥＱ１抽出物23mlを
１ｍＭ ＥＤＴＡ， 1.5ｍＭトリス，ｐＨ7.5 溶液で平
衡化されたワットマンＤＥ−22カラム（42mlペット体
積）に通すことによって部分精製された。 800mlのＮａ
Ｃｌ勾配（０〜１Ｍ）を通すと、アポエクオリン活性は
0.3Ｍ ＮａＣｌのところに溶出してきた。ピークの分
画を回収し、 0.5Ｍ ＫＣｌ，10ｍＭ ＥＤＴＡ及び15
ｍＭトリス，ｐＨ7.5 溶液に対して透析した。これを第
３図に記載の実験に供した。

【０１７４】結果及び考察 インヴィトロに於けるエクオレアポリ（Ａ＋）ＲＮＡの
翻訳 凍結したクラゲの組織１ｇから約1.6 μｇのポリ（Ａ
＋）ＲＮＡを単離した。イン・ヴィトロに於けるエクオ
レアポリ（Ａ＋）ＲＮＡの翻訳に関する結果は第１図に
示す。抗エクオリンと反応した翻訳生成物はレーン４で
示されている。免疫沈降した³⁵Ｓのカウントは翻訳され
たものの全酸沈殿物のカウントの 0.3％であり、これは
アポエクオリンｍＲＮＡが全ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡ集団
の約 0.3％であることを示している。このようにアポエ
クオリンｍＲＮＡが比較的多いということは、エクオレ
アの口周リング粗抽出物中のエクオリンに相答する全タ
ンパク質の割合（ 0.5％）と良く一致するものである。
エクオレアＲＮＡ（レーン２）の非存在下、又はエクオ
レアポリ（Ａ−）ＲＮＡの存在下（データは記載してい
ない）でイン・ヴィトロの翻訳を行うと、免疫沈降する
タンパク質はできなかった。

【０１７５】抗エクオリンで免疫沈降する翻訳一次産物
（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｄ
ｕｃｔ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに於いて明らかに23,4
00ダルトンの分子量を示すように動き（レーン４）、こ
れはエクオレアから単離した天然エクオリンの分子量
（22,800ダルトン，第１図参照）よりも僅かに大きいも
のである。このデータ及び第４図に示したデータは、初
期翻訳生成物には約７つのアミノ酸のプレ配列（ｐｒｅ
ｐｒｅｓｅｎｃｅ）の存在があることと一致するもので
ある。

【０１７６】ポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡ翻訳からの免疫沈降タ
ンパク質は、元のオートラジオグラムを見てみると、二
重線或いはさらに三重線（レーン４，第１図）で動いて
いたことが判る。この結果は二通りに解釈し得るもので
ある。第１番目に、エクオレア、ヴィクトリアには多数
のアポエクオリン遺伝子が存在し得、それぞれのプレタ
ンパク質の分子量が、それらのプレ配列の長さが多様で
あるが故に異なっているということである。エクオリン
アイソザイム［ブリンクス・ジェイ・アール（Ｂｌｉｎ
ｋｓ，Ｊ．Ｒ．）及びハレア・ジー・シー・（Ｈａｒｒ
ｅｒ，Ｇ．Ｃ．），フェド・プロス（Ｆｅｄ．Ｐｒｏ
ｃ．），34巻， 474頁（1975年）］の存在はこうした多
重遺伝子族（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）を
示しているかも知れない。第二番目に、フライディ湾の
エクオレア・ヴィクトリア集団がエクオレアの複数種か
ら成り立っているかも知れないということである。

【０１７７】エクオリンｃＤＮＡｓの同定 使用されたエクオレアｃＤＮＡライブラリーは 450bpよ
り大きい挿入部分を持つ6000の組換え体を含んでいた。
スクリーニングに付された25の任意の該組換え体のうち
のどれも 500bp以下の挿入部分は持っておらず、そのう
ちの２つは３Kbp よりも大きかった。

【０１７８】エクオレアｃＤＮＡバンクは次の混合合成
オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングに
かけられた。

【０１７９】

【化２１】

【０１８０】上記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はア
ポエクオリンの全アミノ酸配列の研究によって求められ
た。このオリゴヌクレチドはエクオリンポリペプチドの
カルボキシ末端領域に於いてＴｒｐ¹⁷³ ・Ｔｙｒ・Ｔｈ
ｒ・Ｍｅｔ・Ａｓｐ・Ｐｒｏ¹⁷⁸ のペプチドをコードし
ているｍＲＮＡと相補的なものである。上記の17マー
（17−ｍｅｒｓ）は、方法の欄で記述した様に³²Ｐで標
識されエクオレアｃＤＮＡライブラリーからのプラスミ
ドＤＮＡとハイブリッドを形成した。

【０１８１】６つの形質転換体が上記合成オリゴヌクレ
オチドとハイブリッドを形成する挿入部分を持ったプラ
スミドを含有しているものと同定された。最大のＰｓｔ
Ｉ挿入部を含むプラスミド、ｐＡＥＱ１の制限地図を
第２図に示す。ｐＡＥＱ１をＢａｍ ＨＩで消化すると
該合成オリゴヌクレオチドとのハイブリッドは形成され
ないであろう。前記の１７マーＤＮＡ配列の研究による
と、このハイブリダイゼーションプローブはＢａｍ Ｈ
Ｉ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を含んでいるものである。
従って、ｐＡＥＱ１中のＢａｍ ＨＩ部位はアポエクオ
リンをコードしている配列の３′領域を同定するのに用
いることが出来よう。以下に示すように、組換えプラス
ミドｐＡＥＱ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に於けるそ
の発現から示されるように、アポエクオリンｃＤＮＡを
実際に含んでいるものである。

【０１８２】大腸菌に於けるアポエクオリンの発現 前記の６つの形質転換体のうちのどれが生物学的に活性
なアポエクオリンを発現しているかどうかを見つけ出す
為に、それらの抽出物、及び同様に親株（ｈｏｓｔ ｓ
ｔｒａｉｎ）の抽出物を方法のところで記述した様に調
製した。それぞれの抽出物 0.5mlにβ−メルカプトエタ
ノール（２ｍＭ）及び腔腸動物門のルシフェリン（ 0.1
ｍＭ）を添加し、この混合物を４℃にて20時間保持し
た。その後、該混合物のＣａ²⁺依存光タンパク質活性に
ついて方法に記載したようにして測定した。組換え体ｐ
ＡＥＱ１から調製した抽出物についてはＣａ²⁺依存ルミ
ネッセンスが観察されたが、親株又は他のいずれの形質
転換体からの抽出物についてはこのようなルミネッセン
スは観察されなかった。ｐＡＥＱ１−６の挿入部分がク
ロスハイブリッドを形成するということは、それらが相
同なＤＮＡ配列を含んでいるということを示唆するもの
である。しかしながら、もしもｐＡＥＱ２−６のｃＤＮ
Ａ挿入部分の長さが充分でなかったり、プラスミド中で
適切に配向していなかったりすると、それら抽出物中の
アポエクオリン活性は期待出来ないものであろう。

【０１８３】ｐＡＥＱ１抽出物の光タンパク質活性発現
の速度論は天然の混合アポエクオリンのそれと類似して
いる（第３図参照）。この抽出物に於いて光タンパク質
活性が発現する為に必要とされる条件も真正の（ａｕｔ
ｈｅｎｔｉｃ）アポエクオリンを用いた場合に観察され
るものと同一である。第３図に示すように、溶存Ｏ₂が
必要とされる。更に、β−メルカプトエタノール又は腔
腸動物門のルシフェリンのいずれかが反応混合物中に存
在しなくなると、Ｃａ²⁺依存光タンパク質活性が全く発
現されなくなる。Ｃａ²⁺を含まない緩衝液中に活性成分
を注入してもルミネッセンスは発さられなかった。Ｃａ
²⁺を後で添加するとルミネッセンスの閃光（ｆｌａｓ
ｈ）が見られた。

【０１８４】ｐＡＥＱ１含有形質転換体の抽出物中の活
性成分を更に詳しく調べる為に、この組換えプラスミド
を含有する形質転換体抽出物を、方法のところで記載し
たようにＤＥ−22を用いたクロマトグラフィにかけた。
アポエクオリン活性は約 0.3Ｍ塩のところで溶出され、
これは真正のアポエクオリンの場合に類似している。こ
の活性画分を腔腸動物門のルシフェリン，β−メルカプ
トエタノール及び酸素の存在下でインキュベートし、光
タンパク質活性を発生させた（第３図参照）。次いで、
この混合物をゲル濾過にかけた。第４図に示すように、
ｐＡＥＱ１抽出物中の部分精製成分から生じた光タンパ
ク質活性はＭｒ＝20,600のところに溶出し、一方天然エ
クオリンは19,600のところであった。同様の結果はイン
・ヴィトロの翻訳実験中にも観察された（第１図）。第
４図のデータから、使用した条件下に於いて、ルシフェ
リンはｐＡＥＱ１抽出物中の活性成分と強固に会合する
とういう結論が得られるであろう。

【０１８５】第４図からの回収（プール）光タンパク質
画分はＣａ²⁺の添加によってルミネッセンスの閃光を発
する。この閃光の速度論はＣａ²⁺依存エクオリン反応の
それと区別ができないものであった。他の組換えプラス
ミドは形質転換体中で光放出タンパク質（ｌｉｇｈｔ−
ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現しなかった
（第６表参照）。

【０１８６】上記のデータは、ｐＡＥＱ１中に挿入され
たｃＤＮＡ部分はアポエクオリンをコードしている全長
ｃＤＮＡを表していることを示している。更にこのデー
タは、該ｃＤＮＡがｐＡＥＱ１中で発現されており、そ
のタンパク質生産物の生物学的活性は天然の混合アポエ
クオリンのそれと区別され得ないことを示している。発
現レベルは全可溶性タンパク質の約0.01％であると推定
された。

【０１８７】

【表１１】

【０１８８】各抽出物 0.5mlにメルカプトエタノール
（２ｍＭ）及び腔腸動物門のルシフェリン（0.015 ｍ
Ｍ）を加えた。この混合物を４℃で20時間インキュベー
トした。試料５μｌを取り出し 0.1ｍＭＣａ²⁺ 0.5mlに
注入して、ピーク光強度を測定した。

【０１８９】実施例４：誘導ｌａｃプロモーターを用い
た大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのアポエクオリン発現の
増大 ｐＡＥＱ１を含む大腸菌に於けるアポエクオリンの発現
は比較的低レベルである。この発現レベルを増大させる
為に、アポエクオリン遺伝子の転写が誘導性（ｉｎｄｕ
ｃｉｂｌｅ）ｌａｃプロモーターに対する相対位置によ
って増加するように、ｐＡＥＱ１からのアポエクオリン
遺伝子をもう１つのプラスミド（ｐＵＣ９）内でサブク
ローン化させた。

【０１９０】ｐＡＥＱ１からのＰｓｔ Ｉ断片（0.75ｋ
ｂ）を単離し、ｐＵＣ９の単一Ｐｓｔ Ｉ部位にクロー
ン化させた。２つの異なるプラスミド、ｐＡＥＱ７及び
ｐＡＥＱ８を得た。プラスミドｐＡＥＱ８は第２図(b)
で示すように、所望の配向で挿入されたＰｓｔ Ｉ断片
を含んでいた。プラスミドｐＡＥＱ７には反対方向の配
向で該断片が挿入されていた。

【０１９１】ｐＡＥＱ７及びｐＡＥＱ８を含有している
大腸菌株（親；ホスト；ＪＭ105 ）を各々37℃にてアン
ピシリン（50μｇ／ml）含有のルリア流体培養基20ml中
で増殖させた。ＯＤ₅₅₀ が 0.6に達した時に、培養物を
100ｍＭ保存溶液中で１ｍＭにした。５mlの試料を取り
出し、一方残りの培養物は振とうされ続けた。１時間及
び２時間後にも同様に試料の一部を取り出した。それぞ
れ試料の一部を採取した直後に、細胞を遠心分離し−20
℃で必要になる時まで保存した。

【０１９２】６つの採取試料抽出物のアポエクオリン活
性を測定した。大腸菌細胞をまず最初に50ｍＭトリス、
ｐＨ、10％ショ糖、25μｇ／mlリゾチーム及び20μｇ／
mlＲ Ｎａｓｅ Ａ溶液１mlに再懸濁して溶解した。氷
中45分間保持後に、この混合物を43,500×ｇで１時間遠
心分離した。上清を採取保存した。上清（抽出物）を次
いで腔腸動物門のルシフェリン及びメルカプトエタノー
ル（250 μｌ抽出物、５％メルカプトエタノール水溶液
３μｌ及び腔腸動物門ルシフェリン３μｌ）の存在下で
一晩インキュベートした。このインキュベーション試料
５μｌを 0.1Ｍ ＣａＣｌ₂ 、 0.1Ｍトリス、ｐＨ8.0
溶液0.5ml に注入し、同時に最高（ピーク）光強度及び
全光子数を測定して、混合物中のエクオリン活性を求め
た。タンパク質はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ）アッセイ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いて測定した。

【０１９３】第７表には、ｐＡＥＱ７及びｐＡＥＱ８含
有株の６つの抽出物、コントロール大腸菌株（ＳＫ159
2）及びｐＡＥＱ１含有株の抽出物から得られた結果が
記されている。

【０１９４】

【表１２】

【０１９５】これら抽出物中のエクオリン活性レベルは
ルシフェリンによる充電効率（ｃｈａｒｇｉｎｇ ｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ）に依存している。粗抽出物に於ける
充電効率を定量化することは不可能である。エクオレア
から単離したアポエクオリンを用いた場合に観察される
充電効率は20％以下であり、大腸菌抽出物中ではこの効
率は多分幾らかそれより低いものであろう。従って、充
電効率１％及び20％を基に計算した値を求めた。

【０１９６】ｐＡＥＱ８からの発現は、ｐＡＥＱ１のそ
れと較べて誘導後２時間に於いて著しく高いものである
（600 倍）。エクオリン遺伝子をｐＡＥＱ８と反対方向
の配向で含んでいるｐＡＥＱ７からはエクオリン遺伝子
の誘導が観察されなかった。

【０１９７】このデータは、ｃＤＮＡヌクレオチド配列
が誘導プロモーターの３′に適切に位置していれば、ア
ポエクオリンの発現レベルは顕著に増大し得るというこ
とを示しているものである。

【０１９８】実施例５：特定のアポエクオリン遺伝子の構造決定 第２図に示した、プラスミドｐＡＥＱ１、ｐＡＥＱ７お
よびｐＡＥＱ８の中に存在するＰｓｔ Ｉ−Ｐｓｔ Ｉ
断片の構造を標準的遺伝子配列解析法によって決定し
た。３′末端から69個のヌクレオチドは翻訳されない。
翻訳領域が発現されると、実施例１に記載した方法で単
離したタンパク質（アポエクオリン）のＮ末端に７個の
アミノ酸残基が付いたタンパク質が発現される。この実
施例１で得られたタンパク質のＮ末端はＶＡＬで始ま
る。この余分の７個のアミノ酸残基は実施例１の単離工
程の間にプロテアーゼによって切りとられるのであろ
う。ＰＲＯをコードしているＣ−末端コドンの次には停
止コドンがあり、その後12個のヌクレオチドが続いてい
る。これは明らかに単離されたｃＤＮＡが完全長（ｆｕ
ｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）であることを示している。全二本
鎖ＤＮＡとアミノ酸配列は次のとおりである。

【０１９９】

【表１３】

【０２００】

【表１４】

【０２０１】

【表１５】

【０２０２】

【表１６】

【０２０３】この同定された配列が示していることは、
この配列の中では微不均一性のいろいろな位置に主要ア
ミノ酸（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）
と少数アミノ酸（ｍｉｎｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）
の双方が含まれているので、表３に示した変異形からど
のアミノ酸配列を選択しても活性なアポエクオリンが得
られるということである。

【０２０４】したがって、同じようにして様々なペプチ
ドをコードしている種々の遺伝子が生物学的に活性な分
子を表わすことが示される。

【０２０５】本明細書中に開示した一般的な配列で表わ
され、多少の変異を示す（したがってアポエクオリンの
生物活性を有する）他のペプチド、ＤＮＡ分子、ベクタ
ー等に関して前述した議論は、本実施例に開示した特定
の配列にも等しく適用できる。本実施例では特に１つの
ペプチド、これをコードしているＤＮＡ配列、および２
個の制限部位の間の完全長ＤＮＡ配列を開示した。コー
ドＤＮＡ配列（任意に末端停止コドンを含んでいてもよ
い）は、完全長のＤＮＡ配列とは別の実体として明らか
にされ、その変異形も含めて全長ＤＮＡ配列とは切り離
して考えられる。二本鎖ＤＮＡとして開示されたいずれ
のＤＮＡも、この二本鎖ＤＮＡを形成する個々の１本鎖
ＤＮＡおよび転写によって得られるこれに相当するＲＮ
Ａを開示しているものと考えられる。

【０２０６】上記実施例のベクターと宿主は本発明の好
ましい態様のいくつかで用いられるが本発明はこれらの
実施例に開示された特定のベクターや宿主細菌に限定さ
れるわけではない。使用した細菌とプラスミドは全て、
バイオテクノロジー分野の当業者が様々な起源から容易
に入手できる。たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ
105 とプラスミドｐＵＣ９およびｐＢＲ322 は米国0885
4 ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ピスカ
タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、センテニアル ア
ベニュー（Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ）800
のピー・エル・バイオケミカルズ社（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）［これはファルマシア社
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）の一部門である］か
ら市販されており、そのカタログではそれぞれ第27−15
50−01，27−4918−01および27−1750−01とされてい
る。さらに、本発明の実施に使用することができる上記
やその他の微生物とプラスミドは、米国20852 メリーラ
ンド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ）、パークローン ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ）12301 のアメリカン タイプ カルチャ
ー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からも入手でき
る。代表的なものとその寄託番号は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＳＫ1592（ＡＴＣＣ No．35106 ）、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＪＭ105 （ＡＴＣＣ No．53029 ）、ｐＵＣ
９（ＡＴＣＣ No．37252 ）、ｐＢＲ322 （ＡＴＣＣ
No．31344）である。

【０２０７】以上本発明を詳細に説明したが、本発明の
思想と範囲を逸脱することなく多くの変更や修正ができ
ることは当業者には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】オワンクラゲから単離したポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡ
を用いてインビトロで翻訳したオートラジオグラフィー
分析結果を示す写真である。

【図２】(a) はエクオレア ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒ
ｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）クラゲから単離したアポエク
オリンをコードしているＤＮＡ配列を含有する遺伝子の
制限地図であり、(b) はプラスミドのｌａｃプロモータ
ーの下流に挿入した第２図(a) のセグメントの制限地図
である。

【図３】ｐＡＥＱ１抽出物中のＣａ²⁺−依存性発光タン
パク質活性の時間と酸素に対する異存性を示すグラフで
ある。

【図４】ｐＡＥＱ１抽出物で現われるＣａ²⁺−依存性発
光タンパク質活性のゲル濾過の結果のグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ダグラス・プラツシヤー アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02536、イースト・フアルマウス、ゴーレ ツタ・ドライブ・72

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 【化２】 のペプチドをコードしているヌクレオチド配列からなる
   単離ＤＡＮ分子。
2. 【請求項２】 前記配列が 【化３】 【化４】 であることを特徴とする請求項１に記載の分子。
3. 【請求項３】 前記分子がさらに前記配列の３′に非発
   現セグメントを、かつ前記配列の５′に非発現セグメン
   トを含んでおり、前記分子が 【化５】 【化６】 であることを特徴とする請求項２に記載の分子。
4. 【請求項４】 前記分子が１本鎖ＤＮＡであることを特
   徴とする請求項２に記載の分子。
5. 【請求項５】 前記分子が２本鎖ＤＮＡであることを特
   徴とする請求項２に記載の分子。
6. 【請求項６】 微生物内で複製でき、かつ請求項１に記
   載のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含ん
   でいる組換えＤＮＡベクター。
7. 【請求項７】 前記配列が 【化７】 【化８】 であることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
8. 【請求項８】 前記配列の前にｌａｃプロモーターが存
   在することを特徴とする請求項６に記載のベクター。
9. 【請求項９】 請求項６に記載のベクターを含む遺伝子
   工学処理された微生物。
10. 【請求項１０】 前記ベクターが式： 【化９】 【化１０】 のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項９に
    記載の微生物。
11. 【請求項１１】 （１）化合物 (a) 第１式： 【化１１】 （式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
    ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
    はグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋは
    リジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラ
    ギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
    ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
    リプトファン、及びＹはチロシンである）、 (b) 第２式：第１式のＰ₅ の代りにＳ、Ｎ₈ の代りに
    Ｄ、Ｋ₁₁の代りにＲ、Ｄ₇₈の代りにＥ、Ａ₈₁の代りに
    Ｅ、Ｋ₈₈の代りにＲ、Ｄ₉₂の代りにＣ又はＥ、Ｅ₉₅の代
    りにＫ、Ｋ₉₆の代りにＲ、Ａ₉₈の代りにＳ、Ｑ₁₀₁ の代
    りにＥ、Ｉ₁₀₂ の代りにＰ、Ｉ₁₀₇ の代りにＬ、Ｉ₁₁₆
    の代りにＶ、Ｓ₁₂₇ の代りにＤ、Ｓ₁₃₅ の代りにＡ、Ｔ
    _{14 1} の代りにＳ、Ｅ₁₄₄ の代りにＤになったもの（ここ
    で、下付き番号は第１式のアミノ末端から数えたアミノ
    酸位置を表している）、 (c) 第３式として、前記第１式又は第２式に於いて、
    アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
    の両末端の１から15個のアミノ酸が欠如したもの、 (d) 第４式として、前記第１式又は第２式に於いて、
    アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
    の両末端に１から10個の付加アミノ酸を連続的に結合し
    たもの；及び （２）前記式を有する化合物の塩類；から選択される均
    質ペプチドであって、該ペプチドは腔腸動物門のルシフ
    ェリンを結合しＣａ²⁺の存在下で光を放つことができる
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実質的
    に純粋なＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
12. 【請求項１２】 前記分子がＤＮＡであり、前記配列が 【化１２】 【化１３】 ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
    ル、Ｃはデオキシシトシル、Ｔはデオキシチミジル、Ｊ
    はＡ又はＧ；ＫはＴ又はＣ；ＬはＡ，Ｔ，Ｃ又はＧ；Ｍ
    はＡ，Ｃ又はＴ；Ｘはそれに続くＹがＡ又はＧのときは
    Ｔ又はＣ、それに続くＹがＣ又はＴのときはＣ；Ｙはそ
    れに先立つＸがＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ、それに先
    立つＸがＴのときはＡ又はＧ；Ｗはそれに続くＺがＧ又
    はＡのときはＣ又はＡ、それに続くＺがＣ又はＴのとき
    はＣ；Ｚはそれに先立つＷがＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又は
    Ｔ、それに先立つＷがＡのときはＡ又はＧ；ＱＲはそれ
    に続くＳがＡ，Ｇ，Ｃ又はＴのときはＴＣ、それに続く
    ＳがＴ又はＣのときはＡＧ；Ｓはそれに先立つＱＲがＴ
    ＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ、それに先立つＱＲがＡＧ
    のときはＴ又はＣ；であり、下付き番号は遺伝暗号によ
    ってこのヌクレオチド配列が対応するアポエクオリンの
    アミノ酸位置を示し、アミノ酸位置はアミノ末端から数
    えたものである］である、請求項１１記載の分子。
13. 【請求項１３】 下記の第１アミノ酸配列： 【化１４】 （式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
    ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
    はグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋは
    リジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラ
    ギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
    ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
    リプトファン、及びＹはチロシンである）、 又は第２のアミノ酸配列として、第１式のＰ₅ の代りに
    Ｓ、Ｎ₈ の代りにＤ、Ｋ₁₁の代りにＲ、Ｄ₇₈の代りに
    Ｅ、Ａ₈₁の代りにＥ、Ｋ₈₈の代りにＲ、Ｄ₉₂の代りにＣ
    又はＥ、Ｅ₉₅の代りにＫ、Ｋ₉₆の代りにＲ、Ａ₉₈の代り
    にＳ、Ｑ₁₀₁ の代りにＥ、Ｉ₁₀₂ の代りにＰ、Ｉ₁₀₇ の
    代りにＬ、Ｉ₁₁₆ の代りにＶ、Ｓ₁₂₇ の代りにＤ、Ｓ
    ₁₃₅ の代りにＡ、Ｔ₁₄₁ の代りにＳ、Ｅ₁₄₄ の代りにＤ
    になったもの（ここで、下付き番号は第１式のアミノ末
    端から数えたアミノ酸位置を表している）をコードする
    ヌクレオチド配列から選ばれる、連続する少なくとも10
    個のヌクレオチドを含有する単離オリゴヌクレオチド。
14. 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、
    請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、
    請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 オリゴヌクレオチドが放射活性標識さ
    れている請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
17. 【請求項１７】 オリゴヌクレオチドが前記ヌクレオチ
    ド配列から連続する少なくとも14個のヌクレオチドを含
    有する請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
18. 【請求項１８】 前記連続するヌクレオチドが前記配列
    の40〜110 位のアミノ酸をコードする、請求項１３記載
    のオリゴヌクレオチド。
19. 【請求項１９】 下記のヌクレオチド配列： 【化１５】 ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
    ル、Ｃはデオキシシトシル、Ｔはデオキシチミジル、Ｊ
    はＡ又はＧ；ＫはＴ又はＣ；ＬはＡ，Ｔ，Ｃ又はＧ；Ｍ
    はＡ，Ｃ又はＴ；Ｘはそれに続くＹがＡ又はＧのときは
    Ｔ又はＣ、それに続くＹがＣ又はＴのときはＣ；Ｙはそ
    れに先立つＸがＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ、それに先
    立つＸがＴのときはＡ又はＧ；Ｗはそれに続くＺがＧ又
    はＡのときはＣ又はＡ、それに続くＺがＣ又はＴのとき
    はＣ；Ｚはそれに先立つＷがＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又は
    Ｔ、それに先立つＷがＡのときはＡ又はＧ；ＱＲはそれ
    に続くＳがＡ，Ｇ，Ｃ又はＴのときはＴＣ、それに続く
    ＳがＴ又はＣのときはＡＧ；Ｓはそれに先立つＱＲがＴ
    ＣのときはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ、それに先立つＱＲがＡＧ
    のときはＴ又はＣ；であり、下付き番号は遺伝暗号によ
    ってこのヌクレオチド配列が対応するアポエクオリンの
    アミノ酸位置を示し、アミノ酸位置はアミノ末端から数
    えたものである］を含む、E. coli 中で複製することが
    可能な、組換えＤＮＡベクター。
20. 【請求項２０】 前記配列が挿入されているｐＢＲ322
    を含む、請求項１９記載のベクター。
21. 【請求項２１】 請求項１９記載のベクターを含む遺伝
    子工学処理された微生物。
22. 【請求項２２】 前記ベクターがｐＢＲ322 を含む請求
    項２１記載の微生物。