JPS61224989A - アポエクオリンを発現しうる組換えｄｎａベクタ− - Google Patents
アポエクオリンを発現しうる組換えｄｎａベクタ−Info
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- JPS61224989A JPS61224989A JP60299601A JP29960185A JPS61224989A JP S61224989 A JPS61224989 A JP S61224989A JP 60299601 A JP60299601 A JP 60299601A JP 29960185 A JP29960185 A JP 29960185A JP S61224989 A JPS61224989 A JP S61224989A
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- apoaequorin
- protein
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子工学分野に係シ、よシ特定的には＼；ア
ポエクオリンタンパク質遺伝子を組換えベクターＤＮＡ
内に挿入すること、及び微生物である受容菌株に於いて
アポエクオリンを産生ずるこア、ヴイクトリア（Ａｅｑ
ｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ） から単離されへる
１本のポリペプチド鎖から成るタンパク質である。この
タンパク質が腔腸動物口のルシフェリン−分子を非共有
結合で結合し含有すると、それはエクオリンとして知ら
れているものになる。
ポエクオリンタンパク質遺伝子を組換えベクターＤＮＡ
内に挿入すること、及び微生物である受容菌株に於いて
アポエクオリンを産生ずるこア、ヴイクトリア（Ａｅｑ
ｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ） から単離されへる
１本のポリペプチド鎖から成るタンパク質である。この
タンパク質が腔腸動物口のルシフェリン−分子を非共有
結合で結合し含有すると、それはエクオリンとして知ら
れているものになる。
エクオリンはカルシウムイオンの存在下で酸化され、可
視光を発する。一度光か発せられると、使用されたタン
パク質（アポエクオリン）を酸化ルる。この再結合され
たエクオリンにカルシウムイオンを加えてやることで、
再び光を発するようになる。従って、アポエクオリンは
様々な化学及び生物アッセイに於けるマーカーとして使
用することができるものである。
視光を発する。一度光か発せられると、使用されたタン
パク質（アポエクオリン）を酸化ルる。この再結合され
たエクオリンにカルシウムイオンを加えてやることで、
再び光を発するようになる。従って、アポエクオリンは
様々な化学及び生物アッセイに於けるマーカーとして使
用することができるものである。
天然のアポエクオリンは単一化合物ではなくて、数種の
分子の混合物を表わしている。数千にも及ぶｆ固々のエ
クオレア（但Ｂをμ倶）のエクオリンを表わしていると
ころの純粋な天然エクオリンを電気泳動にかけると（０
，１ｍＭ ＥＤＴＡ班全ての緩衝液に含有させて、伸変
性条件下のアルカリ性緩１９７１年参照）、少なくとも
６つの明瞭な育色ルミネッセンスのバンドが、用いたデ
ル（０，５ｃｍｘｉｏａａ）を０．ＩＭ ＣａＣｊＬ１
中に浸すと見える観察したジエイ・アール・ゾリンクス
（Ｊ−Ｒ・Ｂ１１ｎｋａ）及びジー、シー、バーレス（
（）−Ｃ−Ｈａｒｒｅａ）、（フェト・ゾロス（Ｆｅａ
、ｐｒｏｃ）、３４巻、４７４頁、１９７５年）の結果
と一致している。等邂点電気泳励は電気泳動よシも分離
能が高いのでプリンクス及びバーレスはよシ多くの橿ａ
（バンド）を観察したのである。、しかしながら、これ
らのパンＰのどれも純粋なペプチドとして単離されなか
った。
分子の混合物を表わしている。数千にも及ぶｆ固々のエ
クオレア（但Ｂをμ倶）のエクオリンを表わしていると
ころの純粋な天然エクオリンを電気泳動にかけると（０
，１ｍＭ ＥＤＴＡ班全ての緩衝液に含有させて、伸変
性条件下のアルカリ性緩１９７１年参照）、少なくとも
６つの明瞭な育色ルミネッセンスのバンドが、用いたデ
ル（０，５ｃｍｘｉｏａａ）を０．ＩＭ ＣａＣｊＬ１
中に浸すと見える観察したジエイ・アール・ゾリンクス
（Ｊ−Ｒ・Ｂ１１ｎｋａ）及びジー、シー、バーレス（
（）−Ｃ−Ｈａｒｒｅａ）、（フェト・ゾロス（Ｆｅａ
、ｐｒｏｃ）、３４巻、４７４頁、１９７５年）の結果
と一致している。等邂点電気泳励は電気泳動よシも分離
能が高いのでプリンクス及びバーレスはよシ多くの橿ａ
（バンド）を観察したのである。、しかしながら、これ
らのパンＰのどれも純粋なペプチドとして単離されなか
った。
更に、生物ルミネッセンスアッセイに使用する為に必要
とされる量を供給し得るだけ充分量のエクオリン又はア
ポエクオリンをクラｒ又は他の天然資源から生産するこ
とは困難である。従って、産業上利用し得るだけの充分
な量のアポエクオリンを生産する＝＊を改・良方法寥改
尊を器；婁が強く望まれている。
とされる量を供給し得るだけ充分量のエクオリン又はア
ポエクオリンをクラｒ又は他の天然資源から生産するこ
とは困難である。従って、産業上利用し得るだけの充分
な量のアポエクオリンを生産する＝＊を改・良方法寥改
尊を器；婁が強く望まれている。
近年の発達した技術によって、大量に早く増殖する微生
物を使用して、産業上有用なタンパク質及びペプチドを
その天然に於ける由来源にかかわらず合成することが可
能になった。これらの技術は、成る適当な微生物に、通
常は別の生物で作られているタンパク質又はペプチドを
合成する能力を遺伝子的に付与することを可能にする。
物を使用して、産業上有用なタンパク質及びペプチドを
その天然に於ける由来源にかかわらず合成することが可
能になった。これらの技術は、成る適当な微生物に、通
常は別の生物で作られているタンパク質又はペプチドを
合成する能力を遺伝子的に付与することを可能にする。
上記の技術は、全ての生物に於いて、遺伝物質（普通は
ＤＮＡ）とその生物によって合成されるタンパク質との
間に存在する基本的な関係を利用するものである。この
関係とは、タンパク質のアミノ酸配列がＤＮＡのヌクレ
オチド配列中に反映されているというようなことである
。タンパク質中で最も共通して見られる２０４のアミノ
酸の各々に特異的に対応している３ヌクレオチド配列の
グループが１つ以上ある。各々の成る３マクレオチド配
列とそれに対応するアミノ酸との間の特異的な関係は遺
伝暗号を構成する。この遺伝暗号は全ての生物にとって
同−又は類似しているものと考えられている。その結果
、全てのタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列は、良
く理解されている関係に従って、対応するヌクレオチド
配列に反映されている。更に、原則的には、このヌクレ
オチド配列はどの生物によっても翻訳され得るものであ
る。
ＤＮＡ）とその生物によって合成されるタンパク質との
間に存在する基本的な関係を利用するものである。この
関係とは、タンパク質のアミノ酸配列がＤＮＡのヌクレ
オチド配列中に反映されているというようなことである
。タンパク質中で最も共通して見られる２０４のアミノ
酸の各々に特異的に対応している３ヌクレオチド配列の
グループが１つ以上ある。各々の成る３マクレオチド配
列とそれに対応するアミノ酸との間の特異的な関係は遺
伝暗号を構成する。この遺伝暗号は全ての生物にとって
同−又は類似しているものと考えられている。その結果
、全てのタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列は、良
く理解されている関係に従って、対応するヌクレオチド
配列に反映されている。更に、原則的には、このヌクレ
オチド配列はどの生物によっても翻訳され得るものであ
る。
第 １ 表
７；＝νＶ１ラニン（Ｐｈｅ）Ｔ’Ｉ’Ｋ ヒス
チジン’（ｇｉｇ） ＣＡＫロイシン（Ｌ
ｅｕ） ＸＴＹ ダ句岐ン（Ｇｉｎ）
ＣＡＪイソロイシン（Ｉｌｅ） ＡＴＭ
７２？’ｌ’Ｊａｎ） ＡＡＫメ千オ９（Ｍ
ｅｔ ） ＡＴＧ リジン（Ｌｙｅ）
んυバリン（Ｖａｌ） ＧＴＬ ’ｒ””
Ｍ”／酸（Ａａｐ） （）ＡＫセリン（８ｅｒ）
Ｑ１０ グルタミン酸（Ｇｌｕ） （）Ａ
Ｊノ１リン（Ｐｒｏ） ＣＣＬ システィン
（Ｃ’ｐｓ） ＴＧＫトレオニン（Ｔｈｒ）
ＡｃＬ ）リゾドアアノ（Ｔｒｙ）
ＴＧＧアラニン （Ａｌａ） ＧＣＬ
アルギニン（Ａｒｇ） ＷＧＺセシン （Ｔ
ｙｒ） ＴＡＪＣグリシン （（）１７）
（）Ｇｌ。
チジン’（ｇｉｇ） ＣＡＫロイシン（Ｌ
ｅｕ） ＸＴＹ ダ句岐ン（Ｇｉｎ）
ＣＡＪイソロイシン（Ｉｌｅ） ＡＴＭ
７２？’ｌ’Ｊａｎ） ＡＡＫメ千オ９（Ｍ
ｅｔ ） ＡＴＧ リジン（Ｌｙｅ）
んυバリン（Ｖａｌ） ＧＴＬ ’ｒ””
Ｍ”／酸（Ａａｐ） （）ＡＫセリン（８ｅｒ）
Ｑ１０ グルタミン酸（Ｇｌｕ） （）Ａ
Ｊノ１リン（Ｐｒｏ） ＣＣＬ システィン
（Ｃ’ｐｓ） ＴＧＫトレオニン（Ｔｈｒ）
ＡｃＬ ）リゾドアアノ（Ｔｒｙ）
ＴＧＧアラニン （Ａｌａ） ＧＣＬ
アルギニン（Ａｒｇ） ＷＧＺセシン （Ｔ
ｙｒ） ＴＡＪＣグリシン （（）１７）
（）Ｇｌ。
終結フグナル ＴＡＪ
１ ’Ｉ’ＧＡ
暗号：各々の３文字連鎖（３−１ｅｔｔｅｒｔｒｉｐｌ
ｅｔ）は左側に５′末端及び右側に３′末端を持つＤＮ
Ａの３ヌクレオチドを表わしている。この文字はヌクレ
オチド配列を形成するプリン又はビリミジン塩基を表わ
している。
ｅｔ）は左側に５′末端及び右側に３′末端を持つＤＮ
Ａの３ヌクレオチドを表わしている。この文字はヌクレ
オチド配列を形成するプリン又はビリミジン塩基を表わ
している。
Ａ−アデニン
Ｇ−グアニン
Ｃ−シトシン
Ｊ−Ａ又はＧ
Ｋ−Ｔ又はＣ
Ｌ−Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ
Ｍ−Ａ 、Ｃ又はＴ
Ｔ−チミン
Ｘ−ＹがＡ又はｑの場合、Ｔ又はＣ
Ｘ−ＹがＣ又はＴの場合、Ｃ
Ｙ−ＸがＣ（７）場合、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴＹ−ＸがＴの
場合、Ａ又はＧ Ｗ−ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ又はＡ Ｗ−ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ Ｚ−ＷがＧの場合、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ Ｚ−ＷがＡの場合、Ａ又はＧ ＱＲ−８がＡ、Ｇ、 ＠又はＴの場合、ＴＣＱＲ−８、
ｆｉ’ｌ’又はＣの場合、ＡＣｒ／８−ＱＲがＴＣの場
合、Ａ、（）、Ｃ又はＴＳ−ＱＲがＡＧの場合、Ｔ又は
Ｃ 表１の３ヌクレオチドはコドンと呼称され、生物の遺伝
物質中に存在する吟、ＤＮＡ３ヌクレオチドとして表わ
される。これらコドンのタンパク合成に於ける発現には
伝◆ＲＮＡ（ｍ ＲＮＡ）の中間形成が必要とされ、こ
れに関しては以下により詳細に述べる。ｍＲＮＡコドン
はチミンの代）にクラシルがあることを１１ＪＩｔ、に
るヒ表１のＤＮＡコドンと同じ配列を持ったものである
。歯分野に於いては、反対の鎖極性（ｏｐｐｏｓｉｔｅ
ｓｔｒａｎｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を持った相補的な３
ヌクレオチドＤＮＡ配列は機能的には表１のコドンと同
等のものと理解されよう。遺伝暗号に関して重要で良く
知られている特徴に、その遺伝暗号の持つ冗長性（ｒｅ
ｄｕｎｄａｎｃｙ）があ〕、それによって、タンパク質
を構成するアミノ酸の殆んどについて、１つ以上のヌク
レオチド３連鎖コードが使用されている。
場合、Ａ又はＧ Ｗ−ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ又はＡ Ｗ−ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ Ｚ−ＷがＧの場合、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ Ｚ−ＷがＡの場合、Ａ又はＧ ＱＲ−８がＡ、Ｇ、 ＠又はＴの場合、ＴＣＱＲ−８、
ｆｉ’ｌ’又はＣの場合、ＡＣｒ／８−ＱＲがＴＣの場
合、Ａ、（）、Ｃ又はＴＳ−ＱＲがＡＧの場合、Ｔ又は
Ｃ 表１の３ヌクレオチドはコドンと呼称され、生物の遺伝
物質中に存在する吟、ＤＮＡ３ヌクレオチドとして表わ
される。これらコドンのタンパク合成に於ける発現には
伝◆ＲＮＡ（ｍ ＲＮＡ）の中間形成が必要とされ、こ
れに関しては以下により詳細に述べる。ｍＲＮＡコドン
はチミンの代）にクラシルがあることを１１ＪＩｔ、に
るヒ表１のＤＮＡコドンと同じ配列を持ったものである
。歯分野に於いては、反対の鎖極性（ｏｐｐｏｓｉｔｅ
ｓｔｒａｎｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を持った相補的な３
ヌクレオチドＤＮＡ配列は機能的には表１のコドンと同
等のものと理解されよう。遺伝暗号に関して重要で良く
知られている特徴に、その遺伝暗号の持つ冗長性（ｒｅ
ｄｕｎｄａｎｃｙ）があ〕、それによって、タンパク質
を構成するアミノ酸の殆んどについて、１つ以上のヌク
レオチド３連鎖コードが使用されている。
従って、成るアミノ酸配列をコードしている幾つかの異
なるヌクレオチド配列があシ得る。このようなヌクレオ
チド配列は、成る菌株がその中のある配列を他の配列よ
シ効率良く翻訳することはあっても、それらが全ての生
物に於いて同じアミノ酸配列を産生じ得るので機能的に
同等のものと考えられている。時には、成る一定のヌク
レオチド配列中にプリン又はピリミジンのメチル化され
た変異体（ｖａｒｌａｎｔ）が見つかることがある。こ
のようなメチル化によってもコードの関係は全く影響を
受けることはない。
なるヌクレオチド配列があシ得る。このようなヌクレオ
チド配列は、成る菌株がその中のある配列を他の配列よ
シ効率良く翻訳することはあっても、それらが全ての生
物に於いて同じアミノ酸配列を産生じ得るので機能的に
同等のものと考えられている。時には、成る一定のヌク
レオチド配列中にプリン又はピリミジンのメチル化され
た変異体（ｖａｒｌａｎｔ）が見つかることがある。こ
のようなメチル化によってもコードの関係は全く影響を
受けることはない。
基本的な概略に於いて、微生物に新規なタンパク質を合
成する能力を付与する方法は次の３ステツプを含むもの
である。（１） 所望タンパク質のアミノ酸配列に関
する遺伝的にコードされた情報を含む特史遺伝子１ｔ；
「コγヌクレオチド配列電単離及び精製（又は化学合成
）Ｌ、 （２） この単離したヌクレオチド配列を
適当なベクター、典屋的にはバクテリオファージ又はゾ
２スミドのＤＮＡと組換え、そして （３） このベ
クターを適当な微生物に秤し参会、該所望の遺伝情報を
含む受容倣生物の株を選択する。
成する能力を付与する方法は次の３ステツプを含むもの
である。（１） 所望タンパク質のアミノ酸配列に関
する遺伝的にコードされた情報を含む特史遺伝子１ｔ；
「コγヌクレオチド配列電単離及び精製（又は化学合成
）Ｌ、 （２） この単離したヌクレオチド配列を
適当なベクター、典屋的にはバクテリオファージ又はゾ
２スミドのＤＮＡと組換え、そして （３） このベ
クターを適当な微生物に秤し参会、該所望の遺伝情報を
含む受容倣生物の株を選択する。
上記のゾ党セスを産業上利用しようとする際に遭遇する
基本的に困癲な点は第一段階・、っまシ所望の特定的遺
伝情報を単離し精製することである。
基本的に困癲な点は第一段階・、っまシ所望の特定的遺
伝情報を単離し精製することである。
全ての生物細胞に於いて、ＤＮＡは非常に高分子量のヌ
クレオチド鎖の形態で存在している。細胞中には、各々
の遺伝子が数百のヌクレオチド長を持ち、１０，０００
以上の特史タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
１０，０００以上もの構造アニン（（ト）、シトシン（
Ｃ）及びチミン（Ｔ）である。その結果、特定タンパク
質の構造遺伝子を含有する長い配列は、全体として化学
的組成及び物理特性Ｅこ於いて非常に良く似ている。こ
のような配列の１つを単離したＤＮＡ中に存在する他の
非常に多くの配列から分離することは、従来の物理的、
化学的調製方法では通常達成され得ないものである。
クレオチド鎖の形態で存在している。細胞中には、各々
の遺伝子が数百のヌクレオチド長を持ち、１０，０００
以上の特史タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
１０，０００以上もの構造アニン（（ト）、シトシン（
Ｃ）及びチミン（Ｔ）である。その結果、特定タンパク
質の構造遺伝子を含有する長い配列は、全体として化学
的組成及び物理特性Ｅこ於いて非常に良く似ている。こ
のような配列の１つを単離したＤＮＡ中に存在する他の
非常に多くの配列から分離することは、従来の物理的、
化学的調製方法では通常達成され得ないものである。
先行技術に於いて、上記の一般的な操作方法の第一段階
を達成する為に二つの一般的な方法が用いられてきた。
を達成する為に二つの一般的な方法が用いられてきた。
第一の方法はしばしばショットガン法と呼ばれるもので
ある。この方法では、成る生物のＤＮＡは所望のヌクレ
オチド配列よシも通常長い断片に分析される。上記（１
）の段階は本質的に迂回されている。該ＤＮＡ断片は、
特定配列をあらかじめ精製することなく、直ちに所望の
ベクターと組換えられる。粗分画段階は適宜ヂその間に
行ない得る。全ての可能性を持った菌株の中から、所望
の遺伝情報を含む微生物の株を選択するのに微生物遺伝
学の選択技術を用いて行なうことができる。このショッ
トガン法には二つの重要な欠点がある。
ある。この方法では、成る生物のＤＮＡは所望のヌクレ
オチド配列よシも通常長い断片に分析される。上記（１
）の段階は本質的に迂回されている。該ＤＮＡ断片は、
特定配列をあらかじめ精製することなく、直ちに所望の
ベクターと組換えられる。粗分画段階は適宜ヂその間に
行ない得る。全ての可能性を持った菌株の中から、所望
の遺伝情報を含む微生物の株を選択するのに微生物遺伝
学の選択技術を用いて行なうことができる。このショッ
トガン法には二つの重要な欠点がある。
このうち特に重要な点は、この操作によって数百もの未
知の遺伝子が受容微生物中に取込まれることになシ、実
験中に未知の遺伝素性を持った新規な株が創９出される
ことである。従って、この操作を用いると実験従事者と
環境に対して災害を非常に効率が悪く、第一段階に於け
る分画の欠如明細書の後段で明らかにされるように、前
記欠点ある特定の時に発現されるということは、たとえ
あるとしても極めてまれであるという事実を利用してい
る。特に、高等生物の分化した組織はある一時期に産生
し得るタンパク質のうちのほんの少しの部分しか合成し
ていないことがある。極端な場合には、このような細胞
は主に一種類のタンパク質を合成していることがある。
知の遺伝子が受容微生物中に取込まれることになシ、実
験中に未知の遺伝素性を持った新規な株が創９出される
ことである。従って、この操作を用いると実験従事者と
環境に対して災害を非常に効率が悪く、第一段階に於け
る分画の欠如明細書の後段で明らかにされるように、前
記欠点ある特定の時に発現されるということは、たとえ
あるとしても極めてまれであるという事実を利用してい
る。特に、高等生物の分化した組織はある一時期に産生
し得るタンパク質のうちのほんの少しの部分しか合成し
ていないことがある。極端な場合には、このような細胞
は主に一種類のタンパク質を合成していることがある。
このような極端な場合には、適当な細胞から対応する伝
＋ＲＮＡを単離することによって、問題の該タンパク質
をコードしているヌクレオチド配列を単離することが可
能であった。
＋ＲＮＡを単離することによって、問題の該タンパク質
をコードしているヌクレオチド配列を単離することが可
能であった。
伝◆ＲＮＡはＤＮＡのヌクレオチド配列情報をタンパク
質のアミノ酸配列構造に変換する過程番こ於いで機能す
る。この過程の第一段階（転写）に於いては、産生ずべ
きタンパク質を特定しているヌクレオチド配列を持った
ＤＮＡの局部断片力″＋ 寸 ＲＮＡに写し取 。ＲＮＡは、デオキシリポースの代シ
にリボースが用いられていること及びチミンの代シにつ
２シルが使用されていること以外はＤＮＡに類似してい
るポリヌクレオチＰである。
質のアミノ酸配列構造に変換する過程番こ於いで機能す
る。この過程の第一段階（転写）に於いては、産生ずべ
きタンパク質を特定しているヌクレオチド配列を持った
ＤＮＡの局部断片力″＋ 寸 ＲＮＡに写し取 。ＲＮＡは、デオキシリポースの代シ
にリボースが用いられていること及びチミンの代シにつ
２シルが使用されていること以外はＤＮＡに類似してい
るポリヌクレオチＰである。
ＲＮＡ中のヌクレオチド塩基はＤＮＡの相補的鎖間に存
在するものとして良く知られている塩基対ｔｆｂ関係と
同種の関係を形成することができる。Ａ及びＵ （Ｔｌ
は相補的であり、ｏ及びＣが相補的である。ＤＮＡヌク
レオチド配列のＲＮＡ六の転写体は写し取られに配列に
対して相補的になる。このようなＲＮＡは、細胞の遺伝
装置（ｇｅｎｅｔｉｃａｐｐａｒａｔｕｓ ）とタンパ
ク質合成装置との間の媒介手段としての役割から伝◆Ｒ
ＮＡ（ｍＲＮＡ） と呼称される。一般的には、〆細
胞中で婦ニある特定の時に存在しているｍＲＮＡのみか
その時に活発に合成されているタンパク質に対応してい
るものである。従って、主にある一種のタンパク質を合
成することにその機能が従事しているような分化細胞は
そのタンパク質に対応しているＲＮＡ１１ｇを主に含ん
でいるものである。これがうまくいきそうな場合には、
分化細胞に於けるこうしたタンパク質の特別な合成を利
用して成る所定のタンパク質をコードしている適当なヌ
クレオチド配列を精製″単離することかできる。
在するものとして良く知られている塩基対ｔｆｂ関係と
同種の関係を形成することができる。Ａ及びＵ （Ｔｌ
は相補的であり、ｏ及びＣが相補的である。ＤＮＡヌク
レオチド配列のＲＮＡ六の転写体は写し取られに配列に
対して相補的になる。このようなＲＮＡは、細胞の遺伝
装置（ｇｅｎｅｔｉｃａｐｐａｒａｔｕｓ ）とタンパ
ク質合成装置との間の媒介手段としての役割から伝◆Ｒ
ＮＡ（ｍＲＮＡ） と呼称される。一般的には、〆細
胞中で婦ニある特定の時に存在しているｍＲＮＡのみか
その時に活発に合成されているタンパク質に対応してい
るものである。従って、主にある一種のタンパク質を合
成することにその機能が従事しているような分化細胞は
そのタンパク質に対応しているＲＮＡ１１ｇを主に含ん
でいるものである。これがうまくいきそうな場合には、
分化細胞に於けるこうしたタンパク質の特別な合成を利
用して成る所定のタンパク質をコードしている適当なヌ
クレオチド配列を精製″単離することかできる。
上記操作の主要な欠点ば、細胞が主に単一のりンパク質
を合成しているものと確認できるような比較的まれな場
合にのみしかこの操作を適用し得ないということである
。産業上関心が持たれているタンパク質の多くはこのよ
うな特別な方法では合成されていないものである。所望
のタンパク質は、成る一定の時期に成る組織又は器官の
細胞によって産生される百いくつもの様々なタンパク質
のうちの一つかも知れない。それにもかかわらず、細胞
中に存在するＲＮＡ［の組は通常ＤＮＡ中にしているこ
とになるのである。
を合成しているものと確認できるような比較的まれな場
合にのみしかこの操作を適用し得ないということである
。産業上関心が持たれているタンパク質の多くはこのよ
うな特別な方法では合成されていないものである。所望
のタンパク質は、成る一定の時期に成る組織又は器官の
細胞によって産生される百いくつもの様々なタンパク質
のうちの一つかも知れない。それにもかかわらず、細胞
中に存在するＲＮＡ［の組は通常ＤＮＡ中にしているこ
とになるのである。
極（最近の発展によると、ある配列がｍＲＮＡ１ｉ！。
操作が米国特許、＄４．３６３，８７７号に開示されて
いる。更に、最初に単離された全ＲＮＡ集団中もつと低
い頻度で存在する配列を単離・精製すゐ為に、この操作
をｍＲＮＡを分画する公知の方法とも適用し得、それ故
に産業上及び研究上興味のあるタンパク質を最終的番こ
役に立つだけの量生産する為の強力な基本的な手段を提
供するものである。
いる。更に、最初に単離された全ＲＮＡ集団中もつと低
い頻度で存在する配列を単離・精製すゐ為に、この操作
をｍＲＮＡを分画する公知の方法とも適用し得、それ故
に産業上及び研究上興味のあるタンパク質を最終的番こ
役に立つだけの量生産する為の強力な基本的な手段を提
供するものである。
上記の方法はｍＲＮＡ及びＤＮＡの成る構造上の特徴を
利用し、成る種の酵素によって触媒される反応を使用す
るものである。先行技術に於いて理解されているところ
の上記反応の性質及び構造上の詳細な点については本明
細書中に記載し、上に藷■銅こ於いて更に詳細に述べら
れるものである。
利用し、成る種の酵素によって触媒される反応を使用す
るものである。先行技術に於いて理解されているところ
の上記反応の性質及び構造上の詳細な点については本明
細書中に記載し、上に藷■銅こ於いて更に詳細に述べら
れるものである。
本明細書中で用いられる符号及び略号を次表に示す。
天然の形態では、ＤＮＡは直鎖ボリヌクレオチ他方の’
ｌ−レンド゛上にあるそれと相補的な塩基と対峙して在
るように一対の鎖相互間に存在しているもら新しいパー
トナ−である％１５ｂｌＦを合成することが可能である
。一端から始まるモノマーの添加による配列は元の完全
なままのポリヌクレオチド鎖対応するｍＲＮＡの合成に
関してもこれと同様な原理に従うものと理解されＴｈ４
３ｅ従って、転写された領域に於いて、ある特定のｍＲ
ＮＡ分子はの ＤＮＡの一一一に相補的であり、他方のＤＮＡ７ｐボ鎖
ｆｌと同一の配列を持つことになる。生細胞中には、あ
る＊ｆＡ勾タンパク質に対するヌクレオチド配列を含む
特ｋｍ Ｄ Ｎ Ａ断片を選択的に転写させるような酵
素による機構が存在する。従って、ある特別なタンパク
質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を
含むｍＲＮＡを単離することはＤＮＡそれ自体から同じ
配列、すなわち遺伝子を単離することと等価なものであ
る。もし、ｍＲＮＡが再転写されそれに相補的なり Ｎ
Ａ （ＣＤＮＡ）を形成すると、それによって正確な
りＮＡ配列が再構成されたことになり、適当な方法によ
って他の生物の遺伝物質中にこのＤＮＡ配列を挿入する
ことができる。従って、ある一定の配列のこの二つの相
補版は相互に変換し得、機能的に互いに同等なものであ
る。
ｌ−レンド゛上にあるそれと相補的な塩基と対峙して在
るように一対の鎖相互間に存在しているもら新しいパー
トナ−である％１５ｂｌＦを合成することが可能である
。一端から始まるモノマーの添加による配列は元の完全
なままのポリヌクレオチド鎖対応するｍＲＮＡの合成に
関してもこれと同様な原理に従うものと理解されＴｈ４
３ｅ従って、転写された領域に於いて、ある特定のｍＲ
ＮＡ分子はの ＤＮＡの一一一に相補的であり、他方のＤＮＡ７ｐボ鎖
ｆｌと同一の配列を持つことになる。生細胞中には、あ
る＊ｆＡ勾タンパク質に対するヌクレオチド配列を含む
特ｋｍ Ｄ Ｎ Ａ断片を選択的に転写させるような酵
素による機構が存在する。従って、ある特別なタンパク
質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を
含むｍＲＮＡを単離することはＤＮＡそれ自体から同じ
配列、すなわち遺伝子を単離することと等価なものであ
る。もし、ｍＲＮＡが再転写されそれに相補的なり Ｎ
Ａ （ＣＤＮＡ）を形成すると、それによって正確な
りＮＡ配列が再構成されたことになり、適当な方法によ
って他の生物の遺伝物質中にこのＤＮＡ配列を挿入する
ことができる。従って、ある一定の配列のこの二つの相
補版は相互に変換し得、機能的に互いに同等なものであ
る。
ＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオチドサブユニットは一つの
ヌクレオチド糖のｓ’偉７７とそれと隣接しているもの
の？部分との間をリン酸ジエステル結の繰り返しにより
、一方の末端が他方の末端と区別され得るような意味で
極性を持った直鎖状ポリヌクレオチｒが生じる。３′末
端は遊離３′−ヒる。５′末端についても同様である。
ヌクレオチド糖のｓ’偉７７とそれと隣接しているもの
の？部分との間をリン酸ジエステル結の繰り返しにより
、一方の末端が他方の末端と区別され得るような意味で
極性を持った直鎖状ポリヌクレオチｒが生じる。３′末
端は遊離３′−ヒる。５′末端についても同様である。
Ｓ核生物、すなわち明確な核と有糸分裂装置をもってい
る生物に於いては、機能ｍＲＮＡの合成は通常そのｍＲ
ＮＡの３′末端にポリアデニル酸を付加することを含む
ものである。従って、伝令ＲＮＡは、ポリチミジル酸を
付着させたセルロースのカラムクロマトグラフィによっ
て、填該生物から単離した他のクラスのＲＮＡから分離
することができる。
る生物に於いては、機能ｍＲＮＡの合成は通常そのｍＲ
ＮＡの３′末端にポリアデニル酸を付加することを含む
ものである。従って、伝令ＲＮＡは、ポリチミジル酸を
付着させたセルロースのカラムクロマトグラフィによっ
て、填該生物から単離した他のクラスのＲＮＡから分離
することができる。
アビゾ・エイチ（Ａｖｉｖ、Ｈ８赤）及びレーダー・ビ
ー（Ｌｅａｅｒ、ｐ−）＊ゾロス・ナト・アカド・サイ
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、、）。
ー（Ｌｅａｅｒ、ｐ−）＊ゾロス・ナト・アカド・サイ
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、、）。
６９巻、１４０８頁（１９７２年）を参照のこと。
オリゴ（ＩＴ、ポリＵ、又はポリＴ及びポリＵの組和性
（ｂａｓｓ−ｐａｉｒｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を
利用した他のクロマトグラフィ手段も同様に用いること
ができる。
（ｂａｓｓ−ｐａｉｒｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を
利用した他のクロマトグラフィ手段も同様に用いること
ができる。
逆転写酵素（ｒｅｖｓｒｓｓ ｔｒａｎａｃｒｉｐｔ
ａｓｅ）オキシヌクレオシド３リン酸、つまりｄ Ａ
Ｔ Ｐ。
ａｓｅ）オキシヌクレオシド３リン酸、つまりｄ Ａ
Ｔ Ｐ。
ｄＧＴＰ、ｄｃ’Ｅ’Ｐ及びｄ’ｌ’ＴＰ苓蒋；；＝本
＝° 、
。
＝° 、
。
客の７１″昏ばマ涜る）。この反応はｍＲＮＡの３′末
端近傍にオリビデオキシヌクレオチドプライマーが非共
有結合的に会合することにより開始され、続いてｆｆ１
ＲＮＡヌクレオチド配列との塩基対心関係で決められて
いる如くに、成長している鎖の３′なわれる。生成分子
はヘアピン構造として記述でき、元のＲＮＡは、一部分
が一端に於いてそれ自身に対しｌ’７１すれているＤＮ
Ａの相補的；本領と水素結合によって対になっている。
端近傍にオリビデオキシヌクレオチドプライマーが非共
有結合的に会合することにより開始され、続いてｆｆ１
ＲＮＡヌクレオチド配列との塩基対心関係で決められて
いる如くに、成長している鎖の３′なわれる。生成分子
はヘアピン構造として記述でき、元のＲＮＡは、一部分
が一端に於いてそれ自身に対しｌ’７１すれているＤＮ
Ａの相補的；本領と水素結合によって対になっている。
ＤＮＡとＲＮＡとの鎖は互いに共有結合によって結合し
ているものではない。逆転写酵素は一本領ＤＮＡ鋳盤を
用いた類似の反応を触媒すること杏でき、そのような場
合、得られる生成物は一端が一本鎖ＤＮＡ１４０８頁（
１９７２年）及び、エフストラテイアデイス・ニー（Ｂ
ｆａｔｒａｔｉａｄｉａ、Ａ、）；カファトス・エフ・
シー（Ｋａｆａｔｏｓ、Ｆ、Ｃ，）、マキ２２７９頁（
１９７６年）。゛ 制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ中のリン酸ジエステル
結合を加水分解することのできる酵素であり、ＤＮＡ鎖
の遅がり（ｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ）に切湘目を生起せし
める。もしもＤＮＡが閉じたループの形状である場合に
は、そのループは＃！状構造に変換させられる。制限酵
素の主な特徴は、その加水分解作用がある特定のヌクレ
オチド配列の箇所対する制限部位と呼ばれる。様々な生
物源から制限エンＰヌクレアーゼが単離され、それらの
制限部位のヌクレオチド配列によって特徴づけられてき
た。二本鎖ＤＮＡに作用する時に、制限エンドヌクレア
ーゼの幾種類かは同じ箇所で画調のリン酸ジエステル結
合を加水分解し、平滑末端を生じる。他のものは数ヌク
レオチド分だけ離れて結合を加水分解し、切断分子の各
末端に於ける遊離状態の一本鎖領域を生じる。このよう
な一本鎖末端は自己相補的で接着性（ｃｏｈ＊ａ’１ｖ
ｅ）であるかされるＤＮＡはどれでも同じｉ！ｍＩＰ位
を含んでいるにちがいないから、同じ接着末端が生じる
ことｌζなり、制限エンドヌクレアーゼ処理したＤＮＡ
の異種配列を同様に処理した他の配列に結合させること
が可能である。ロパート・アール・ジエイ（Ｒｏｂ＊ｒ
ｓ！、Ｒｏｙ、）、クリトーｖゾ・バイオケム（Ｃｒ１
ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ ）、４巻、１２３頁（１
９７６年）を参照のこと。
ているものではない。逆転写酵素は一本領ＤＮＡ鋳盤を
用いた類似の反応を触媒すること杏でき、そのような場
合、得られる生成物は一端が一本鎖ＤＮＡ１４０８頁（
１９７２年）及び、エフストラテイアデイス・ニー（Ｂ
ｆａｔｒａｔｉａｄｉａ、Ａ、）；カファトス・エフ・
シー（Ｋａｆａｔｏｓ、Ｆ、Ｃ，）、マキ２２７９頁（
１９７６年）。゛ 制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ中のリン酸ジエステル
結合を加水分解することのできる酵素であり、ＤＮＡ鎖
の遅がり（ｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ）に切湘目を生起せし
める。もしもＤＮＡが閉じたループの形状である場合に
は、そのループは＃！状構造に変換させられる。制限酵
素の主な特徴は、その加水分解作用がある特定のヌクレ
オチド配列の箇所対する制限部位と呼ばれる。様々な生
物源から制限エンＰヌクレアーゼが単離され、それらの
制限部位のヌクレオチド配列によって特徴づけられてき
た。二本鎖ＤＮＡに作用する時に、制限エンドヌクレア
ーゼの幾種類かは同じ箇所で画調のリン酸ジエステル結
合を加水分解し、平滑末端を生じる。他のものは数ヌク
レオチド分だけ離れて結合を加水分解し、切断分子の各
末端に於ける遊離状態の一本鎖領域を生じる。このよう
な一本鎖末端は自己相補的で接着性（ｃｏｈ＊ａ’１ｖ
ｅ）であるかされるＤＮＡはどれでも同じｉ！ｍＩＰ位
を含んでいるにちがいないから、同じ接着末端が生じる
ことｌζなり、制限エンドヌクレアーゼ処理したＤＮＡ
の異種配列を同様に処理した他の配列に結合させること
が可能である。ロパート・アール・ジエイ（Ｒｏｂ＊ｒ
ｓ！、Ｒｏｙ、）、クリトーｖゾ・バイオケム（Ｃｒ１
ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ ）、４巻、１２３頁（１
９７６年）を参照のこと。
成る酵素に対する制限部位は比較的まれであり、不均一
に分布している。成る特定の制限部位が一定の断片内に
存在する力１どうかということは実験的に決定すべきこ
とである。しかしながら、様々な生物源から多様な部位
特異性を持った制限エンドヌクレアーゼが数多単離また
単離されつつあるので、子側のヌクレオチドのある一定
の断片が１えるのは道理にかなったことである。
に分布している。成る特定の制限部位が一定の断片内に
存在する力１どうかということは実験的に決定すべきこ
とである。しかしながら、様々な生物源から多様な部位
特異性を持った制限エンドヌクレアーゼが数多単離また
単離されつつあるので、子側のヌクレオチドのある一定
の断片が１えるのは道理にかなったことである。
一般的な技術的背景に関しては、ワトソン・ジエイ・デ
ィー（Ｗａｔａｏｎ 、Ｊ、Ｄ、）、遺伝分子生物学（
ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅＧｏｎｅ ）、３版、ベンジャミン（Ｅ
ｓｎｊａｍｉｎ）。
ィー（Ｗａｔａｏｎ 、Ｊ、Ｄ、）、遺伝分子生物学（
ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅＧｏｎｅ ）、３版、ベンジャミン（Ｅ
ｓｎｊａｍｉｎ）。
メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ４Ｐａｒｋ ）ｌカリフ（ｃ
ａｚｔｒ）。
ａｚｔｒ）。
１９７６年；ダピツーソン・ジエイ・エヌ（Ｄａｖｉｄ
ａｏｎ。
ａｏｎ。
Ｊ、Ｎ、）、ｍの生化学（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈａｍｉ
ａｔ）’７ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｌ ８版、アダＡスーアール０エル・ピー（Ａｄａｍ
ａ、ＲｌＬ、Ｐ、）。
ａｔ）’７ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｌ ８版、アダＡスーアール０エル・ピー（Ａｄａｍ
ａ、ＲｌＬ、Ｐ、）。
バートン・アール・エイチ（Ｂｕｒｄｏｎ、 Ｒ６Ｈ０
） 。
） 。
キャンペル・ニーエム（ＣａｍＰｂ５ｌｌ、Ａ、Ｍ、’
）、及びスメリエφアール榔エム・ニス（８ｍ＠１ｌｉ
ｅ。
）、及びスメリエφアール榔エム・ニス（８ｍ＠１ｌｉ
ｅ。
Ｒ，Ｍ、８．）改訂版、アカデミツク・プレス、ニュー
ヨーク、１９７６年；及びヘイズ・ダヴリュー・（Ｈ１
ｙ＠ａ、Ｗ、）、バクテリア及びそのウィルスの遺伝学
、基礎遺伝学及び分子生物学の研究（ＴｈｅＧｏｎｅｔ
ｉｃｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ
ｔｈｓｉｒＶｉｒｕｓ＠ｓ、５ｔｕｄｉｅｓ ｉｎ
Ｂａ５ｉｃ Ｇｏｎｅｔｉｃｓを参照のこと。
ヨーク、１９７６年；及びヘイズ・ダヴリュー・（Ｈ１
ｙ＠ａ、Ｗ、）、バクテリア及びそのウィルスの遺伝学
、基礎遺伝学及び分子生物学の研究（ＴｈｅＧｏｎｅｔ
ｉｃｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ
ｔｈｓｉｒＶｉｒｕｓ＠ｓ、５ｔｕｄｉｅｓ ｉｎ
Ｂａ５ｉｃ Ｇｏｎｅｔｉｃｓを参照のこと。
従って、本発明の目的は有用量のアポエクオリンを供給
し得るだけの微生物を提供することに在る。
し得るだけの微生物を提供することに在る。
更に、本発明は微生物の中に挿入されてアポエクオリン
を発現し得るような組換えＤＮＡベクターを提供するこ
とを目的とするものである。
を発現し得るような組換えＤＮＡベクターを提供するこ
とを目的とするものである。
また更に、所望の組換えＤＮＡベクター６生産する際に
使用され得る、合成で製造されるか又は天然源から単離
し得るか本＝；特定構造を持ったＤＮＡ断片を提供する
ことも本発明のもう一つの目的である。
使用され得る、合成で製造されるか又は天然源から単離
し得るか本＝；特定構造を持ったＤＮＡ断片を提供する
ことも本発明のもう一つの目的である。
そうして更に、天然アポエクオリンの活性によく似たペ
プチドを実験室での合成により又は微生物により製造で
きるようにすることも本発明のも選択される均一なペプ
チドを提供することことよって達成し得たものである。
プチドを実験室での合成により又は微生物により製造で
きるようにすることも本発明のも選択される均一なペプ
チドを提供することことよって達成し得たものである。
ｔａｌ第１式
％式％
上式中、人はアラニン、Ｃはシスティン、Ｄはアスパラ
ギン＃を塩、Ｅはグルタミン酸埴、Ｆはフェニルアラニ
ン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはインロイシン
、Ｘはリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはア
スパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアル
ギニン、８はセリン、Ｔはトレオニン、■はバリン、Ｗ
はトリプトファン、及びＹはチロシンである。
ギン＃を塩、Ｅはグルタミン酸埴、Ｆはフェニルアラニ
ン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはインロイシン
、Ｘはリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはア
スパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアル
ギニン、８はセリン、Ｔはトレオニン、■はバリン、Ｗ
はトリプトファン、及びＹはチロシンである。
（ｂｌ 第２式として、第１式のＰ５の代りにＳ。
Ｎ８の代りに０％に１１の代りにＲ４Ｄ７９の代りにＥ
、λＢ１の代りにｌ、 Ｋ６ｇの代りにＲＩＤ９２の代
りにＣ又はＢ、に９ｄの代りにＲ，人９８の代りに８、
Ｑｔｌｌの代りにＢ、１１０２の代りにＰ１１１０７の
代りに”％”１１４の代りにＶ、 ８１２７の代りにり
、８１５５の代りにＡ％Ｔ１４１の代りに８、Ｅ１４４
の代りにＤになったもの（Ｓ＜１’、下付き番号は第１
式のアミノ末端から数えたアミノ酸位置を表わしている
）。
、λＢ１の代りにｌ、 Ｋ６ｇの代りにＲＩＤ９２の代
りにＣ又はＢ、に９ｄの代りにＲ，人９８の代りに８、
Ｑｔｌｌの代りにＢ、１１０２の代りにＰ１１１０７の
代りに”％”１１４の代りにＶ、 ８１２７の代りにり
、８１５５の代りにＡ％Ｔ１４１の代りに８、Ｅ１４４
の代りにＤになったもの（Ｓ＜１’、下付き番号は第１
式のアミノ末端から数えたアミノ酸位置を表わしている
）。
（ｃ）３３３式として、前記第１式又は第２式に於いて
、アミノ末端若しくはカルボキレ末端のいずれか、又は
その両末端の１から１５個のアミノ酸が欠如したもの。
、アミノ末端若しくはカルボキレ末端のいずれか、又は
その両末端の１から１５個のアミノ酸が欠如したもの。
（ｄ） 第４式として、前記第１式又は第２式に於い
て、アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又
はその両末端に１から１０個の付加アミ布下で光を放出
することかできる。＃皺吐ｆチポカＧＴＬＩ ＡＡＪ２
ＸＴＹ５ ＡＣＬ４ （ＣＣＬ又はＱ１０ ）５ Ｇ
ＡＫ ６ＴＴＫ７ （ＡＡＫ又はＧＡＫ）８ ＡＡＫ９
ｃｃｔ、１（１（ＡＡ、ｒ又はＷＧＺ）１１ ＴＧＧ
１２ ＡＴＭ１５ ＧＧＬ１４ ＷＧＺ１５ ＣＡＫ１
４ ＡＡＪ１７ ＣＡＫ１６ＡＴＧ１ｐ ＴＴＫ２０
ＡＡＫ２１ ＴＴＫ２２ ＸＴＹ２５ ＧＡＫ２４
（）ＴＬ２５ ＡＡＫ２６ＣＡＫ２７ ＡＡＫ２６ Ｇ
ＧＬ２９ＡＡＪ３（Ｉ ＡＴＭ５１ ＱＲ８５２ＸＴＹ
５３ ＧＡＫ５４ＧＡＪ５５ ＡＴＧ５６ ＧＴＬ５７
ＴＡＫ５８ ＡＡＪ３９ＧＣＩ４［Ｉ ＱＲ８４１Ｇ
ＡＫ４２ＡＴＭ４３ ＧＴＬ４４ＡＴＭ４５ ＡＡ絢６
ＡＡＫ４７ ＸＴＹ４６ ＧＧＬ４９ ＧＣＬ５０Ａ
ＣＬ５１ ＣＣＬ５２ ＧＡａ５ ＣＡＪ５４
ＧＣＬ５５ ＡＡＪ５６ ＷＧＺ５７ ＣＡＫ５１１
ＡＡＪ５９ ＧＡＫ６Ｑ ＧＣＬ４１ ｅ’ｒム
２ ＧＡＪ４３ ＧＣｌ、４４ Ｔ’Ｌ”胸５ Ｔ
’ｆ’に６６ＧＧＩ、６７ ＧＧＬ６８ ＧＣＬ６９
ＧＧＬ力＾ＴＧ７１ ＡＡＪ ７２ ’Ｉ’Ａに７５
ＧＧＬｙａａＴＴＪ５ａＡＪ７６ （ＧＡＫ又はＧＡ
Ｊ）７Ｑ Ｔ（）０７？ ＣＣＬ８０ （ＧＣＬ又はＧ
ＡＪ）８１ ＴＡＫ８２ ＡＴＭ８５ ＧＡＪ８４ Ｇ
Ｇ１４５ ＴＧＧＩＭ ＡＡＪ８７ＣＡＡＪ又はｗｏｚ
）ｅｅ ＸＴＹ８９０ＯＬ？ＯＡＯＬ？、 〔ｏＡｘ、
ＧＡＪ 。
て、アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又
はその両末端に１から１０個の付加アミ布下で光を放出
することかできる。＃皺吐ｆチポカＧＴＬＩ ＡＡＪ２
ＸＴＹ５ ＡＣＬ４ （ＣＣＬ又はＱ１０ ）５ Ｇ
ＡＫ ６ＴＴＫ７ （ＡＡＫ又はＧＡＫ）８ ＡＡＫ９
ｃｃｔ、１（１（ＡＡ、ｒ又はＷＧＺ）１１ ＴＧＧ
１２ ＡＴＭ１５ ＧＧＬ１４ ＷＧＺ１５ ＣＡＫ１
４ ＡＡＪ１７ ＣＡＫ１６ＡＴＧ１ｐ ＴＴＫ２０
ＡＡＫ２１ ＴＴＫ２２ ＸＴＹ２５ ＧＡＫ２４
（）ＴＬ２５ ＡＡＫ２６ＣＡＫ２７ ＡＡＫ２６ Ｇ
ＧＬ２９ＡＡＪ３（Ｉ ＡＴＭ５１ ＱＲ８５２ＸＴＹ
５３ ＧＡＫ５４ＧＡＪ５５ ＡＴＧ５６ ＧＴＬ５７
ＴＡＫ５８ ＡＡＪ３９ＧＣＩ４［Ｉ ＱＲ８４１Ｇ
ＡＫ４２ＡＴＭ４３ ＧＴＬ４４ＡＴＭ４５ ＡＡ絢６
ＡＡＫ４７ ＸＴＹ４６ ＧＧＬ４９ ＧＣＬ５０Ａ
ＣＬ５１ ＣＣＬ５２ ＧＡａ５ ＣＡＪ５４
ＧＣＬ５５ ＡＡＪ５６ ＷＧＺ５７ ＣＡＫ５１１
ＡＡＪ５９ ＧＡＫ６Ｑ ＧＣＬ４１ ｅ’ｒム
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’ｆ’に６６ＧＧＩ、６７ ＧＧＬ６８ ＧＣＬ６９
ＧＧＬ力＾ＴＧ７１ ＡＡＪ ７２ ’Ｉ’Ａに７５
ＧＧＬｙａａＴＴＪ５ａＡＪ７６ （ＧＡＫ又はＧＡ
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Ｇ１４５ ＴＧＧＩＭ ＡＡＪ８７ＣＡＡＪ又はｗｏｚ
）ｅｅ ＸＴＹ８９０ＯＬ？ＯＡＯＬ？、 〔ｏＡｘ、
ＧＡＪ 。
又はＴＧＫ） ９２ ＧＡＪ９５ ＸＴＹ９４ ＜）Ａ
Ｊ９５ （ＡＡＪ又はｙｅｚ）７６１人に９７ＣＧＣＬ
又はＱ１０）＋＋８ ＡＡＪ９９ ＡＡＫ１０］ （Ｃ
ＡＪ又はＧＡＪ］１０１ （ＡＴＭ又はＣＣＬ）１０２
ＡＣＬ１０３ ＸＴＹ１０４ ＡＴＭ１ｏｓ゛ＷＧＺ
１ｏ６（ＡＴＭ又はｘＴｙ）１ｏ７ＴＧＧＩＱ８ ＧＧ
Ｌ１０９ ＧＡＩＣｌｌｏＧＯＬｌｌｌ ＸＴＹ１１
２ ＴＴＫ１１５ ＧＡＫ１１４ ＡＴＭ１１５ （Ａ
ＴＭ ５／ｉまＧＴＬ］１１６ ＧＡＫ１１７ ＡＡ
Ｊ１１８ ＧＡＫＩＩ？ ＣＡＪ１２０ ＡＡＫ１
２１ＧＧＬ１２２ ＧＣＬ１２３ ＡＴＭ１２４ ＡＣ
Ｌ１２５ ｘｒｙ１２６（ｑＲ８又はＧＡＫ）１２７
ＧＡＪ１２８ ＴＧＧ１２？ ＊Ａ、ｒ１ｇｏ
ＧＣＬ１３１ ＴＡＫ１５２ＡＣＬ肯５ ＡＡＪ１馴
（ＱＲ１３又はＧｃｔ、）ｃｓｓ ＧＣＬ１３６ ＧＧ
Ｌ１５７ＡＴＭ１３８Ａ’Ｉ’Ｍ１３９ ＣＡＪ１４０
（ＡＣＬ又はＱ１０）＋４１ ＱＲ８１４２ＧＡＪ１
４３ （ＧＡＪ又はＧＡＫ）１４４ ＴＧＫ１４５
ＧＡＪ１４６ ＧＡＪ１４７ＡＣＬ１４８ ＴＴＫ
１４９ ＷＧＺ１５０ ＧＴＬｌｓｔ ＴＧＫ４５
２ ＧＡＫｌｓｇ ＡＴＭ１５４ＧＡに１５５ Ｇ
ＡＪ１５ｄ ＱＲ８１５７ＧＧＬ１５１１ ＣＡＪ１
５９ ＸＴＹ１６Ｑ ＧＡＫ１４１ＧＴＴ−ｑ６２Ｇ
ＡＫ１６３ ＧＡＪ１６４ ＡＴＧ、６ｓ ＡＣＬ１
６６ ＷＧＺ１６ｙ ＣＡＪ１６８ＣＡＫ１４９ Ｘ
ＴＹ１７０ ＧＧＬ１７１ ＴＴ１ｃ１７２’Ｉ’Ｇ
Ｇ１７３ ＴＡＫ１７４ ＡＣＬ１７５ＡＴ馬ｙ６
ＧＡＫ１７７ ＣＣＬ１７８ ＧＣＬ１ｙ９ＴＧＫ
１８０ ＧＡＪ１８１ ＡＡＪ１８２ＸＴＹ１６５
ＴＡＫＩＢ４ ＧＧＬ１６５ ＧＧＬ１６４ ＧＣ
Ｌ１Ｂ７ ＧＴＬ１６＠ ＣＣＬ１６９〔式中、Ａはデ
オキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデオキシ
シトシル、Ｔはデオキシチミジル、ＪはＡ又はＧ；には
Ｔ又はＣ；ＬはＡ、Ｔ、Ｃ，又はＧＥＭはＡ、Ｃ又は！
；ｘはそれに続くＹがＡ又はＧのときはＴ又はＣ。
Ｊ９５ （ＡＡＪ又はｙｅｚ）７６１人に９７ＣＧＣＬ
又はＱ１０）＋＋８ ＡＡＪ９９ ＡＡＫ１０］ （Ｃ
ＡＪ又はＧＡＪ］１０１ （ＡＴＭ又はＣＣＬ）１０２
ＡＣＬ１０３ ＸＴＹ１０４ ＡＴＭ１ｏｓ゛ＷＧＺ
１ｏ６（ＡＴＭ又はｘＴｙ）１ｏ７ＴＧＧＩＱ８ ＧＧ
Ｌ１０９ ＧＡＩＣｌｌｏＧＯＬｌｌｌ ＸＴＹ１１
２ ＴＴＫ１１５ ＧＡＫ１１４ ＡＴＭ１１５ （Ａ
ＴＭ ５／ｉまＧＴＬ］１１６ ＧＡＫ１１７ ＡＡ
Ｊ１１８ ＧＡＫＩＩ？ ＣＡＪ１２０ ＡＡＫ１
２１ＧＧＬ１２２ ＧＣＬ１２３ ＡＴＭ１２４ ＡＣ
Ｌ１２５ ｘｒｙ１２６（ｑＲ８又はＧＡＫ）１２７
ＧＡＪ１２８ ＴＧＧ１２？ ＊Ａ、ｒ１ｇｏ
ＧＣＬ１３１ ＴＡＫ１５２ＡＣＬ肯５ ＡＡＪ１馴
（ＱＲ１３又はＧｃｔ、）ｃｓｓ ＧＣＬ１３６ ＧＧ
Ｌ１５７ＡＴＭ１３８Ａ’Ｉ’Ｍ１３９ ＣＡＪ１４０
（ＡＣＬ又はＱ１０）＋４１ ＱＲ８１４２ＧＡＪ１
４３ （ＧＡＪ又はＧＡＫ）１４４ ＴＧＫ１４５
ＧＡＪ１４６ ＧＡＪ１４７ＡＣＬ１４８ ＴＴＫ
１４９ ＷＧＺ１５０ ＧＴＬｌｓｔ ＴＧＫ４５
２ ＧＡＫｌｓｇ ＡＴＭ１５４ＧＡに１５５ Ｇ
ＡＪ１５ｄ ＱＲ８１５７ＧＧＬ１５１１ ＣＡＪ１
５９ ＸＴＹ１６Ｑ ＧＡＫ１４１ＧＴＴ−ｑ６２Ｇ
ＡＫ１６３ ＧＡＪ１６４ ＡＴＧ、６ｓ ＡＣＬ１
６６ ＷＧＺ１６ｙ ＣＡＪ１６８ＣＡＫ１４９ Ｘ
ＴＹ１７０ ＧＧＬ１７１ ＴＴ１ｃ１７２’Ｉ’Ｇ
Ｇ１７３ ＴＡＫ１７４ ＡＣＬ１７５ＡＴ馬ｙ６
ＧＡＫ１７７ ＣＣＬ１７８ ＧＣＬ１ｙ９ＴＧＫ
１８０ ＧＡＪ１８１ ＡＡＪ１８２ＸＴＹ１６５
ＴＡＫＩＢ４ ＧＧＬ１６５ ＧＧＬ１６４ ＧＣ
Ｌ１Ｂ７ ＧＴＬ１６＠ ＣＣＬ１６９〔式中、Ａはデ
オキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデオキシ
シトシル、Ｔはデオキシチミジル、ＪはＡ又はＧ；には
Ｔ又はＣ；ＬはＡ、Ｔ、Ｃ，又はＧＥＭはＡ、Ｃ又は！
；ｘはそれに続くＹがＡ又はＧのときはＴ又はＣ。
それに続くＹがＣ又はＴのときはＣ；Ｙはそれに先立つ
ＸがＣのときはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ、それに先立つＸがＴ
のときはＡ又はＧ；Ｗはそれに続くｚがＧ又は人のとき
はＣ又はＡ、それに続くｚがＣ又はＴのときはＣ；ｚは
それに先立つＷがＣのときはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ、それに
先立つＷがＡのときは人又はＧ；ＱＲはそれに続く８が
Ａ ＋、 Ｇ 、 Ｃ又はＴのときはＴＣ，それζζ続
くＳがＴ又はＣのときはＡＧ；８はそれに先立つＱＲが
ＴＣのときはＡ、Ｇ、Ｃ又は！、そド配列が対応するア
ポエクオリンのアミノ酸位置を示し、アミノ酸位置はア
ミノ末端から数え伝子工学技術による上述のようなベゾ
チドの製造に関係する本発明の好適な一面奇夷ｍｗｒｈ
ｔｑｔ僕略もれる。もヱエで１；る； Ｃ以下余白ン
ＸがＣのときはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ、それに先立つＸがＴ
のときはＡ又はＧ；Ｗはそれに続くｚがＧ又は人のとき
はＣ又はＡ、それに続くｚがＣ又はＴのときはＣ；ｚは
それに先立つＷがＣのときはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ、それに
先立つＷがＡのときは人又はＧ；ＱＲはそれに続く８が
Ａ ＋、 Ｇ 、 Ｃ又はＴのときはＴＣ，それζζ続
くＳがＴ又はＣのときはＡＧ；８はそれに先立つＱＲが
ＴＣのときはＡ、Ｇ、Ｃ又は！、そド配列が対応するア
ポエクオリンのアミノ酸位置を示し、アミノ酸位置はア
ミノ末端から数え伝子工学技術による上述のようなベゾ
チドの製造に関係する本発明の好適な一面奇夷ｍｗｒｈ
ｔｑｔ僕略もれる。もヱエで１；る； Ｃ以下余白ン
添附図面によ）特定の実施例で得られた結果を示す。前
記実施例は本発明を示すものであって、本発明を限定す
るものではない。 オグラフイー分析した結果を示す写真である。翻訳は、
オワンク−）ｒ ポリ（Ａ”）ＲＮＡの非存在下（レー
ン１）、存在下（レーン３）で行なった。２種の反応か
らの抗エクオリン免疫沈降夕／バクを夫々、レーン２お
よび４に的イた。図の右側に、タンパク分子量標準のホ
スホリラーゼｂ１Ｂ Ｓ Ａ、卵アルブミン、炭酸脱水
酵素、５ＢＴ１およびリソチームの位置を示す。天然エ
クオリン列＝冨≠本＝≠を含むオヮンクラｒ（位は凹二
遅ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ） から単
離した遺伝子の制限地図であ〕、第２（ｂ）図は、 ｌ
ａｃプロモーター中 参与下流でシラスミドに挿入された第２（ａ）図のセグ
メントの制限地図である。 第３図は１．ＡＩｅＱｉ 抽出物中のＣａ ２ ＋−
依存性発光タンバク活性の時間および酸素依存性を示す
グラフである。使用した条件は次の通シである。 （ａ） 曲’ｍ１および２では、活性画分０．５ｄを
β−メルカプトエタノール中＄ｉｍＭおよび腔腸動物の
ルシフェリン牛零０．１ ｍＭに調製し、４℃でインキ
エベートした。適当な時間間隔で５μＬを抜き取シ、発
光タンパク活性を調べた。 た。 （ｃ） 曲線３では、ｐＡＩｉｉＱｉ抽出物の代シに
培養混合物中に天然アポエクオリンを用いた。 第４図は、−１Ｑ１抽出物から生ずるｃａ２＋−依存性
発光タンパク活性のｒル濾過プロフィール載したよう７
；Ｃａ２＋−依存性発光タンパク活性を発生させた。次
いで、この発光タンパク両分（５０ｄ ）を、１０
ｍＭＥＤＴＡ、 １５ ｍＭ Ｔｒｉ８ｐＨ７，５お
よび１００ ｍＭＫｃＩ−を用いて平衡化させたＧ−７
５−４０スーパーフアイン（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）力２
ム（ペラＰ容量３０．７ｄ）に充填した。各種分子量標
識物質の溶離位置を示す。 好ましい具体例の記載 これによシ、均質なアポエクオリンの入手が可能となる
。この情報を用いて、適量の均質アポエクオリンを入手
することができる各種組換えＤＮＡベクターが得られる
。一般的な組換えＤＮＡ技法技術の例として産生された
。 アポエクオリンのアミノ酸配列を表３に示す。 表 ３ （８）−：： （ＤＣ＞＋ （ａ）ＶＫＬＴＰＤＦ
ＮＮＰＫＷＩＧＲＨＫＨＭＦＮＦＬＤｖＮＨＮＧＫｌ
１０ ２０
３０ＩＳＬＤＥＭＶＹＫＡＳＤＩＶＩＮＮＬＧＡＴＰ
ＥＱＡＫＲＨＫＤ（匂 （ＩｉＪ …） ＡＶＥＡＦＦＧＧＡＧＭＫＹＧＶ’ＫＴＤＷＰＡＹＩＢ
’ＧＷＫＫＬＡ（Ｃ） ＠ 艶）（１３）＠（ＬＪ （Ｖ）Ｔ
ＤＥＬＩＩｉＫＹＡＫＮＱＩＴＬ４ＲＩＷＧＤＡＬＦＤ
ＩＩＤＫＤＱ’ｆ’１００ （Ｐ） １１
０ １２０（功 囚 （
８） （ＤＪＶＣＤＸＤＢ！８ＧＱＬＤＶｔ）ＥＭＴ
ＲＱＨＬＧＦＷＹＴＭＤＰＡＣ１６０１フＯ１８０ ＥＫＬＹＧＧＡＶＰ−Ｃｏｏｌ 括弧内の文字で示す。表示したアミノ酸置換全てで生物
学的機能性を有するエクオリンを表わす。 上記配列中の文字に対応するアミノ酸は次の通シである
。 Ａ：アラ二ノ、 Ｃニジスティン、 ゛Ｄ：アスパラギ
ン酸、 Ｅ：グルタミン酸、 Ｆ：フェニルアラニン、
Ｇニゲリシン、 Ｈ：ヒスチジン。 Ｉ：イソ、ロイシン、 Ｋ：リシン、 Ｌ：ロイシン、
Ｍ：メチオエン、 Ｎ：アスパラヤン。 Ｐ：ゾロリン、 ｑ：グルタミン、 Ｒ：アルギニン、
８：セリン、 Ｔ：トレオニン、 ｖ：バリン、 Ｗ
ニトリシトファン、 Ｙ：チロシン、ペプチドのアミノ
酸とペプチドをコードするＤＮＡ配列との間に明確な対
応関係があることは知られているので、アポエクオリン
（或いは後記易に銹導され得る。アポエクオリンＤＮＡ
の一本の鎖のヌクレオチド配列を表４に示す。表中、数
字ではりが′ｒｉと代わっている点を除いてＤＮＡ配列
はｍＲＮＡ配列に対応している。 （以下余白ｐ −６＆４の −＠ ｂＪ ｓｒ ｓｌ−Φ−・−
Φ−＠（ｇｏ ｈ＜ −ｏ ａｈ〉＜ のｏ
＜＜ ｈ＜ ＋Ｊ＜ ＜ｅ ＞ｈ−ω シｈ
＠−−φ −一１ｌｏ−〇關Φ閃 ｓ＜ ｈ６
Φ匡 −Ｅ、 １．＋６ にＩＥ、ＩＣ
０ＣＦ ６６ Ｃ）Ｅｍ のａ ＞６＜ＦＩ
Ｇ’＋ｈ″−りｈｓＰＩ−りｈ −關−−トー Ω３ ＝ご ５七 ｇご 二１ ＝ミ ；８・ト ―ヘ
−リ ）＜ ６６ ６０ 遺伝子のＤＮＡ配列は十分に同定されているので、ＤＮ
Ａ遺伝子を全くの化学的合成によって産生ずることがで
きる。その後、遺伝子を公知の組換えＤＮＡ技法を用い
て多くの入手可能なりＮＡベクターに挿入することがで
きる。従って、本発明は、本願出願当時一般に自由に入
手できる試薬、シラスミドおよび微生物を用いて実施さ
れつる。 例えば、塩基長さが１００以上のヌクレオチド容易に合
成されつる。 な右同装置については、例えばジエネテイツクエンジニ
アリングニュース（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｑｅ−
ｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ）、ＮｏＶ ／ Ｄｅｃ、 １９８
４ ｐ、３に広告されている如く周知のものである。前
記オリｊ”ヌクレオチドを後記する技術を用いてスプラ
イスすると本明細書に記載されているヌクレオチド配列
が得られる。 更に１本明細書に記載されているペプチド類を容易に直
接合成し５る自動化装置も入手可能である。上記ジエ木
ティック エンジニアリング ニュースの同じ号には、
９９％を超える結合効率を有する市販の自動ペプチド合
成装置の広告が掲載されている（ｐ、３４）、前記装置
を用いると、直ドを簡単に得ることができる。 表３に示した特定のペプチド配列の他に、これらの配列
をペースとし僅かな変更を加えた他のペプチドもアポエ
クオリンの生物学的活性を有する。 例えば、配列末端の一方もしくは両方から最高１５個の
アミノ酸が欠けていても、ルシフェリンおよびカルシウ
ム結合能は失なわれない。同様に。 末端の一方もしくは両方に最高１０個のアミノ酸が更に
付加されていてもよい。こうした変更（修正）は、ルシ
フェリンおよびカルシウム結合部位央 −Ｈ が上記配列の真裏中のアミノ酸にあるから可能なのであ
る。例えば、アさノ酸４０−１００にルシフェリン結合
部位があるようである。末端は生物学的活性に比較的重
要な影響を及ぼさないので。 付加アミノ酸の本質は重要でなく、かつ上記アミノ酸の
いずれでもよい。 アミン末端の付加アミノ酸が生物発光に大した影響を有
しないことを立証する実験データもある。 しかしながら、上記した特定式により極めて近似し、４
Ｉｈれかの末端の１０個あるいはそれ以下好ましくは５
個あるいはそれ以下のアミノ酸を欠（か、もしくはいず
れかの末端に７個あるいはそれ以下、好ましくは４個あ
るいはそれ以下のアミノ酸が付加されている化合物が好
ましい。 分子の中央部分のアミノ酸を置換することは、生物学的
活性を維持するためにより限定される・しかしながら１
表３またはＩＲ４に示した微不均−性の全ゆる部分が生
物学的機能を有する置換な示し、指示した置換ｔ）１ｆ
ｌｘｉが組合墳αも機能性分子の位置でより広く用いら
れているアミノ酸またはヌクレオチドを示しより好まし
いものである。 更に前記ペプチドおよびＤＮＡ分子を僅かに変更させた
ものも、当業者には明らかなように＊ね・ 秒勾壕！
ｒ詳細ｊ＄蓮びゐダボ冷ギ゛遺・ボバ゛ＤＮＡ分子と同
等のものとしてみなされる。例えば、特に置換が結合部
位のアミノ酸に関連していないならば。 ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン
酸をクルタ之ン酸で、トレオニンをセリンで単ＩＩＩ（
ｌ５ｏｌａｔｅｄ ）置換しても、或いはアミノ酸を構
造的に関連するアミノ酸で同様に置換しても得られた分
子の生物学的活性に重大な影響はないことは予想される
。機能性ペプチドに変化が生じるかどうかは得られたペ
プチドをルシフェリンとインキエベートシ１次いでカル
シウムイオンと分子構造（即ちアミノ酸もしくはヌクレ
オチド配列）が同一であることを意味する。前記した＠
実質的に”という用語は少なくとも９５重量％、より好
ましくは少な（とも９９重量％、最も好ましくは少な（
とも９９．８重量％を意味する。均質ペプチドあるいは
ＤＮＡ配列の全分子に由来する断片が存在する場合、そ
のような断片が５重量％以下、好ましくは１重量％、よ
り好ましくは０．２重量％以下存在しているならば均質
性（ｈｏｍｏ＆ｅｌｔｙ）を調べるときに考慮しなくと
もよい、何故ならば、（天然アポエクオリン中に存在す
る混合物のようＫ）主喫苓牢升ｔ「びヰ分子構造が異な
る分子量の類似した幾つかの分子が存在する混合物とは
対照的に、単一の一定した構造を有する全分子（および
その断片）の存在を１均質”という用語が指しているか
らである０本明細書で使用した１単離されたＣ ｌ５ｏ
ｌａｔｅａ ）’という用語は、夫々他のペプチド類、
ＤＮＡ類またはＲＮＡ類から分離されかつこの生化学的
溶液中に通常存在する溶媒、緩衝液、イオン或いは他の
成分のみの存在下でみとめられる純粋なペプチド、ＤＮ
Ａ或いはＲＮＡを指す、′単離された”の中に、天然の
（ｎａｔｉｖ・）状態の天然物質、或いは（例えばアク
リルアミドゲル中で）成分に分離さん玉純粋な物質また
は溶液として免優呂水はｔｎｌない天然物質は含まれな
い０本明細書中１純粋”という用語は上記した１実質的
に”と同じ数値制限を有するのが好ましい１本明細書中
１・・により置換されゑ”或いは１置換”というフレー
ズは、指示した１置換”アミノ酸が別の式中に存在する
ことが指示されているアミノ酸と同じ位置に存在する場
合（例えばセリ指すとは限らない・ 本明細書に記載のペプチドの塩類とは、該ペプチドが各
種ＰＨの水溶液中に存在する（或いは前記水溶液から単
離された）ときに天然に存在するカルボン酸残基のアル
カリ、アルカリ土類および他の金属塩、アミノ残基の酸
付加塩（例えばＭＣＩ＞および同一分子内のカルボン酸
残基とアミノ残基との反応により形成される両性イオン
が例示される・ これら全ての変種も特に開示されたものとみなされる。 られ、ＤＮＡ遺伝子の構成に使用される。続いて前記Ｄ
ＮＡ遺伝子を用いて本発明ペプチドが産生される。 オワンクラゲの光発光器官からの細胞抽出物を使用する
ことが好ましい、ただし、全体細胞抽出物を使用するこ
とも可能である。典屋的には、クラゲまたはその一部を
小片に切断しく切り刻み）、小片をすり砕して初期の粗
細胞懸濁液を形成する。 細胞懸濁液に音波処理あるいはその他の処理を加えて細
胞膜を破壊し、粗な細胞抽出物を得る。所望により、公
知の生化学的手法（例えばタンパクの選択的沈殿）を用
いて初期精製することもできる。粗の細胞抽出物あるい
はそれからの部分精製ＲＮＡ部分を処理して更にＲＮＡ
を分離する。例えば粗な細胞抽出物を、１インチ×３・
５インチの二トロセルロースチェーブ中のｓ、 ？ Ｍ
ＣｓＣ１。 １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ 、 ｐＨ７，５、１ｍ
ＭＥＤＴＡエア）を用いて１５℃、２７０００ｒｐ”で
１６時間遠ントし、チューブから水を流去させ、澄明な
ＲＮＡペレットを含む底５４ａａをレーザー刃で切断す
る。 ペレットをフラスコに移し、 １０ ｍＭＴｒｉａ−Ｈ
ＣＩ。 ｐＨ７Ｊ 、１ｍＭＥＤＴＡ、５％サルコシ＃（ｓａｒ
ｃｏｓｙｌおよび５％フェノール２０ｗ１中に溶解させ
る０次いで溶液なＮａＣ１１卒で０．１Ｍに調整し、フ
ェノール−クロロホルム混合物（１：１）４Ｇ−を加え
て振盪させろ。ＲＮＡが、０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
ｓ、ｓの存在下でエタノールを用いて処理すると水性相
から沈殿し、これを遠心分離により回収配列および分子
サイズの点で不均買なポリアデニル化された、粗なある
いは部分的に精製されたｍＲＮＡのような各種形態のＲ
ＮＡも使用されうる。ＲＮＡ単離方法の選択性は、単離
されたｍＲＮＡの不均一分散相中に所望のｍＲＮＡを多
く（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ）を招かなければ、本発明の遺伝子の作成にどんな
精製方法も使く 配での調製用沈降法およびゲル電気泳動法が特に適当で
ある。 クレオチド配列を加水分解する能力を有している法とし
ては、細胞破壊段階で４Ｍグアニジニウムチオシアフー
トおよび１Ｍメルカプトエタノールを使用することが適
当である。加えて、単離されたＲＮＡのＲＮａａｅ分解
を抑えるには低温度および５．０に近いｐＨが有用であ
る。 −投に、ｍＲＮＡは汚染メンバク、ＤＮＡ、ポリサッカ
ライドおよび脂質な本質的に含まずに作成される。この
ように精製するだめの標準的な方法は当業界で公知であ
る。こうして単離されたＲＮＡは非メツセンジャーおよ
びメツセンジャーＲＮＡを含む。真核生物のｍＲＮＡを
分離するには、真核生物ｍＲＮ Ａの３′末端にポリア
デニル酸が存在するためにもたらされる水素結合特異性
を利用して、オリゴ−ｄＴセルロースあるいは他のオリ
ゴヌクレオチド置換カラム材料例えばポリＵ−セファロ
ースのカラムを用いるクロマトグラフ配列に相補的なり
ＮＡを形成することにある。この反応のために原則的に
はｍＲＮ Ａ １ｍ型の相補的ＤＮＡコピーを正確に形
成しうる酵素であれば使用し５るが、逆転写要素が選択
される。反応は先行技術に記載された条件下で、鋳型と
してｍＲＮＡおよびＤＮＡ鎖の前駆物質として４ｓのデ
オキシヌクレオシド トリフオスフェート、即ちｄＡＴ
Ｐ 。 ｄＧＴＰ 、ｄｃＴＰおよびｄＴＴＰの混合物を用いて
実施される。反広過程ｆｈ：％エターし、りａ２トゲる
目的で、デオキシヌクレオシド トリフオスフェートの
１糎のアルファ位を放射性同位元素例えば１Ｐで標識す
ることが好都合である。上記したエフ ストラテイアデ
ィス、ニー（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ ＊Ａ、）らの
文献を参照されたい。 逆転写酵素反応により生成されるｃＤＮＡ転写物は、ｍ
ＲＮＡｎｆｆ１に対する各転写物の開始点および終結点
が異っているために５′末端並びに３′末端の配列が幾
分異質である。５′末端の変異性は、合成を開始するた
めに使用されるオリゴ−ｄ”ＦプライマーはｍＲＮＡの
ポリアデニル化領域に沿った各種地点で結合し得るため
と考えられる。 ｃＤＮＡ転写物はボＩＪ −Ａ領域の中間点で合成が″
開始むｔ各穏長さのポリーＡ領域がオリゴ−ｄＴプライ
マーの初期結合サイトに応じて転写される。 この不確実性は、オリゴ−ｄＴ）ラクト（ｔｒａｃｔ
）に加えてＲＮＡ配列それ自体のヌクレオチド１４毘あ
るいは２個を含むプライマーを使用すれば避けられ、転
写反応を開始するのに好ましくかつ一定の結合サイトを
有するプライマーが生成される。 ｃＤＮＡ転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ）の３′末端
の不確実性は、逆転写酵素反応に影響を及ぼす各種因子
およびＲＮＡＭ屋の部分的分解の恐れによるも好都合で
ありＤＮＡ短鎖の合成を抑制するように選択すれば極め
て容易に単離される。ト、す骨髄芽球症ウィルス逆転写
Ｗ＃素のための好ましい反応条件は、米国特許第４，３
６３，８７７号明細書の実施例に記載されており、前記
明細書は本明細書中に援用される。長鎖ＤＮＡ転写物を
高い禮笑度で最大よび反応時間である。 温度および塩濃度条件はニオリゴーｄＴプライマーとＲ
ＮＡ鋳童のポリアデニル化部分との間の特殊な塩基対合
（ｂａ８・−ｐａｉｒｌｎｇ）を最適にするように選択
される。適切に選択された条件下で、プライマーはＲＮ
Ａ＃ｆｆｉのポリアデニル化領域で結合し、短かいＡ−
リッチ配列のような鋳箆上の別の位置でのプライツー結
合による非特異的開始反応は実質的に避けられる。温度
および塩濃度の影響は相互依存性である。温度を高くし
塩濃度を低（すると、特異的な塩基対合相互イ苓用の安
定性が低下する。反応時間は、非特異的開始反応を回避
しかつ分解の機会を最小限にするために出来る限り短（
保たれる。反応時間は温度と相関関係にあり、温度が低
ければ反応時間は長時間を要する。 ４２℃では１〜１０分の反応時間が適当である。 プライマーはＲＮＡ鋳聾に対して５０〜５００倍そル過
剰に存在させなければならず、酵素もＲＮＡ鋳箆に対し
て同様にモル過剰で存在させなければならない。過剰の
！！ｊ累およびプライマーを使用すると開始反応および
ｃＤＮＡ鎖の成長が促進され、長鎖のｃＤＮＡ転写物が
限られた短いインキエペーション時間内に効率よく産生
される。 多（の場合、ｍＲＮＡから転写された一本鎖ｅＤＮＡを
使用して該ｃＤＮＡをさらに精製することが可能であろ
う。しかし下記に論するように、所望の制限酵素が２本
鎖ＤＮＡに対してしか作用しない場合がある。この場合
、前記のようにして調製されたｃＤＮＡは、例えばリバ
ーストランスクリプターゼのようなりＮＡポリメラーゼ
及び１本鎖ＤＮＡを加水分解できるヌクレアーゼを使用
して、２本鎖ＤＮＡ合成用の鋳型として使用できる。こ
の方法による２本鎖ＤＮＡの調製方法は先行文献に記載
されている。例えば、ウルリツチ（Ｕｌｌｒｉａｈ ）
、 Ａ、、シャイン（５ｈｉｎｅ ） 、 Ｊ−、チ
ャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｌｎ ） 、 Ｊ、 、ピ
クテット（Ｐｌｃｔｅｔ） ｅＲ，＊ティシエー（Ｔｉ
５ｃｈｅｒ ）、Ｅ、。 １３１３（１９７？）を参照されたい。必須ではないが
所望により米国特許第４．３ ａ ３，８７７号の方法
によりｃＤＮＡを更に精製することも可能である。 この方法においては、不均−ｍＲＮＡ配列のＩｌｌによ
り調製された不均−ｃＤＮＡを、１種あるい単離ｅｔｇ
Ｊｓ ｃ Ｄ Ｎ Ａ配列中に存在する酵素認識部位の
予備測定に依る。ｊ方法は２つのそのような部位の存在
に−ｍｆ１−６で紅ゐ。該部位が同一である場合、一つ
の５１素で十分である。所望配列は両部位で開裂され、
所望ｃＤＮＡ配列に関する限りす＃−４：る。制限部位
が異なる場合は、所望の長さの均一なフラグメントを生
成するために２つの酵素が必要である。 限＃累の選択は経験的に成されなければならない。 所望のタンパク質のアミノ酸配列が既知である場較する
ことができる。しかしながら、部分的な配列に基いて必
要楊度に正確な同定ができる。嘘キ亭ので、所望タンパ
ク質の完全なアミノ酸配列は必によって生成された統−
長のポリヌクレオチドは、適当ｒ！ｉｎヱＬは互のタン
パク質合成系において所望タンパク質の合成を検知し得
るプローブとして使用し得る。１ｒ２１：Ｊｔ’３、ｍ
ＲＮＡはアフィニティークロマトグラフィーにより精製
し得る。当業者により考えられ得るその他の技術も本目
的に適当な４巳 使用するか２本鎖ＤＮＡを使用するかに依る。好ましい
Ｗｌ、素は一本鎖ＤＮＡに対して作用できるものであり
、−重鎖ＤＮＡはｍＲＮＡ逆転写の直接の反応生成物で
ある。現在知られている一本鎖ＤＮＡに作用し得る制限
酵素の数は限られている。 ！！ｌ ｇＨａｓ ｍ 、 Ｈｈａ Ｉ及びＨｌｎ（ｆ
） Ｉが現在知られている適したものである。さらに、
ｍＲｈｍｙｏＴｌも一本鎖ＤＮＡに作用し得る。さらに
研究されて他の制限酵素が一本鎖ＤＮＡに作用し得るこ
とが判明し′ｒｃ叫場合は、そのような酵素も好ましい
酵素の一端に加えられるであろう。２本％ＮＡに特異的
なものも適した酵素に加えられる。このようなｌ５ｉｌ
！は、２本鎖ｃＤＮＡを生成するために付加的な反応を
必要とし、長い配列のロス及び不完全な回収によるその
他のロスの機会を増加させるので好ましくない。二本鎖
ｃＤＮＡを使用すると更に、事後の配列分析がより複雑
で労力を要するとい５技術的不利を招（。これ等の理由
から一本鎖ＤＮＡが好ましいが、２本鎖ＤＮＡの使用も
可能である。実際、本発明は当初２本鎖ｃＤＮＡを用い
て実施されたものである。 制限エンドヌクレアーゼ処理のために調製されるｃＤＮ
Ａは、放射活性標識をして後の分離段階で検知し得るよ
うにしてもよい。好ましい方法は３２Ｐのような放射活
性標識を４つのデオキシヌクレオシドトリフオスフェー
ト前駆体のうちの１つのα位置に結合するものである。 最高の活性は、放射活性前駆体の濃度が非放射活性形状
のものの度も、逆転写酵素反応において得られるｃＤＮ
Ａの長さを最大にするために３０８Ｍよりも太き（なげ
ればならない。エフストラテイアデイス（Ｅｆｓｔｒａ
ｔｉａｄｉ ｇ ）、Ａ −＊ マニアティヌ（？ｖＩ
ａｎｌａｔｉｇ）、Ｔｏ、カファトス（Ｋａｆａｔｏｓ
）、Ｆ、Ｃ，、ジエフリ−（Ｊｅｆｆｒｅ）’ ）、Ａ
、及びボーナキｘ （Ｖｏｕｙｎａｋｉｇ ）、Ｊ、Ｎ
、、セル（Ｃｅｌｌ ） ４ 。 ３６７（１９７＄）を参照されたいｅ ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列をに葡する目的で、ポリヌクレオチドキナ
ーゼｖ１．禦により触媒される反応におい曵ｓ２Ｐで５
′末端ｌｊｔ標識するのが便利である。マキザムＣムｘ
ｔｍ ） 、Ａ、Ｍ、及びギルバー） （ＧＨｂｅｒｔ
）、Ｗ、、ブロク・ナトル・アカド・スジ（Ｐｒｏｅ
、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ ７４，５６０（１９７
７）を参照されたい。 一つの制限酵素あるいは２つの制限ａＳの組合せの作用
により生成されヒフラクメントは、異なる長さに基いて
ポリヌクレオチドを分離できる何沈降法が含まれる。ゲ
ル電気泳動け、ポリヌクレ易である６便利な電気泳動法
がディングマン及びマニアナイス（Ｍａｎｌａｔｌｇ）
、Ｔｏ、ジエフリ−（Ｊｅｆｆｒｅｙ ）、Ａ、及びバ
ンドサンド（ｖａｎｄｅどは、制限エンドヌクレアーゼ
処理に先立ち、長さにおいて不均一分散であることが判
明するであろう。適当に選択された制限エンドヌクレア
ーゼあるいはエンドヌクレアーゼ対の作用により、所望
の配列を含むポリヌクレオチド鎖が各制限部位るバンド
を形成することが観察される。他の配列における制限部
位の有無により、他の分離したバンドが同様に形成され
得るが、それは所望配列のものとは異なる長さのもので
あろう。従って制限エンドヌクレアーゼ作用の結果によ
り、ゲル電気泳動パターンは１つ以上の分離したバンド
を見せるが、残りのｅＤＮＡは不均一分散のままになる
であろう。所望のｃＤＮＡ配列が、存在する主要なポリ
ヌクレオチドの種から成る場合は、電気泳動し）−一 パターンはｃＤＮＡの殆んどが分離バンド中に存在する
ということを示すであろう。 ２つの異なる配列が制限酵素により開裂されて殆んど同
じ長さのフラグメントな生成するということはありそう
にもないが、規定長のフラグメントの純度検定法は望ま
しいものである。電気泳動バンドの配列分析は、バンド
中の物質の１０％以上の不純物の砿舐には使用できる。 最初の華離方法に適用したのと同じ一般的原理に基いて
、低レベルの不純物を検知する方法が研究されて来た。 該方法においては、所望ヌクレオチド配列フラグメント
が最初の単離においては使用されｒｇｔ）＼な５制限エ
ンドヌクレアーゼに対するｌｌＥｗ＆部位を含んでいる
ことが必要である。ゲル電気泳動バンドから溶出された
ポリヌクレオチド材料を所望配列に内的に作用し得る制
限エンドヌクレアーゼで処理１、ｘｉ、所望配列が殆ん
どは非等長の２つのサブフラグメントに開裂さ■る。こ
れ等のサブフラグメントは電気泳動においてそれぞれの
長さに対応する位置に別々のバンドを形成し、それ等の
合計は開裂前のポリヌクレオチドの長さに等しいはずで
ある。制限酵素に対して敏感でない最初のバンド中の不
純物は最初の位置に移動するであろうと考えられる。前
記酵素に対する１つ以上のｓ！！！職部位上部位不純物
は２つ以上のサブフラグメントを生成すると考えられる
。ｉＩ識部位の分布は本質的にう生成する可能性は極め
て低い。放射活性標識ポリヌクレオチドバンドに存在す
る材料の量は、各バンドに存在する放射活性の量の定量
測定、あるいはその他の適当な方法により測定できる。 所望配列のフラグメントの純度の定量的測定は、所望配
列のサブフラグメントを示すバンド中に存在する材料の
量を材料総量と比較して得ることができる。 前記の分離、あるいは所望の遺伝子を単離するその他の
方法の後、該配列を再結合し得る。ＤＮＡフラグメント
の末端と末端との結合を触媒する酵ンデサンデ（Ｖａｎ
ｄｅ ５ａｎｄｅ ）、Ｊ、）ｆ、及びコラナ（Ｋｈ
ｏｒａｎａ ） 、Ｈ−Ｇ、 ｅプクク・ナトル・アヵ
ド。 スジ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ ）、Ｕ
ＳＡ ６エ、１４６８（１９）０）を参照されたい。 結合する配列が３’？４末端でない場合は、Ｅ−ｃｏｌ
ｌより得られたりガーゼが使用し得る（モトリッチ（Ｍ
ｏｄｒｔｃｈ）、Ｐ、及びレーマン（Ｌ＠ｈｍａｎ ）
、１．Ｒ，、ジエイ・バイオに一ケム（Ｊ、Ｂｔｏｌ、
Ｃｈｅｍ−）、２４５．３６２６（１９７０））。 制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたサブフッ
クメントからのオリジナル配列再結合の効率は、不適当
な配列の再結合を防ぐ方法を使用することてお（ことに
よって防止できる。酵素アルカリフォスファターゼか好
ましい。゛５′末端リン酸基は。 後の開裂サブフラグメントの再結合に使用されるＤＮＡ
リガーゼの結合作用において構造的必要条件である。従
って、５′−末端リン酸を欠（末端は共有結合され得な
い。ＤＮＡサブフラグメントは、単１ｍＤＮＡフラグメ
ントについて成される制限エンドヌクレアーゼによる開
裂によって生成される５ｔ−リン酸を含む末端において
のみ結合される。 体 上述の条件下では″”：’ＤＮＡ転１δ灸部分は、ｍＲ
ＮＡ領域！の５１−末端を含むｍＲＮＡ領域から同じ綺
麗にｉ’ｆｔｔ＞て制限エンドヌクレアーゼ開裂により
得られたフラグメントを特異的なプライマーとすること
によつ℃得られ；雰０で集る。この方′Ｍｔ＄Ｓ：ては
、前記の方法は、所望タンパク賞に関連する特異的ヌク
レオチド配列のフラグメントだげでな（、当該タンパク
＊Ｖコードした全ヌクレオチド配列を得るのにも使用し
得る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドリンカー
費あって、制限エンドヌクレアーゼのｌ！繊配列を有す
る２本錯離ｃＤＮＡの末端に付けて、後のベクターＤＮ
Ａからの遺伝子部分のｌ！ｌＩ票的除去を容易化１照さ
れたい。ベクターＤＮＡは適当な制限エンドヌクレアー
ゼによる処理により、連続ループから直鎖形状に変換さ
れる。それによって形成された末端はアルカリフォスフ
ァターゼで処理して５′−リン酸末端基を除去し、ベク
ターＤＮＡがＤＮＡリガーゼ反応において第１にアポエ
クオリンＤＮＡセグメントなりｉＪ太むことなしに連続
ループを形成しないようにする。リンカ−オリゴヌクレ
オチドを伴なうｃＤＮＡと処理済ベクターＤＮＡをＤＮ
Ａリガーゼ酵累酵素合し、ｃＤＮＡなベクターＤＮＡに
結合してｃＤＮＡを駁堪駄んで゛その中に有する組換ベ
クターＤＮＡの連続ループを形成する。プラスミドベク
ターを使用する場合、通常該閉鎖ループがバクテリアの
形質転換を行える唯一の形となる。形質転換とは、当該
分野で理解され本明細書でも使用されているように、微
生物のそれ自身の遺伝子展馳に細胞外ＤＮＡｔ’ｌｌＪ
ト込む工程を指すものである。閉鎖ループ形状のプラス
ミドＤＮＡは適当な環境条件下でそのように叙」声、迷
子細胞にも伝森移れる。その結果、プラスミドを含有し
その遺伝子デターミナントを持った新規なセルラインが
、１１ｉｔ立される。プラスミドの複製によりプラスミ
ド遺伝子がセルライン中に維持されΔ染台Ｇこの方法に
おけるプラスミドによる形質転換は、形質転換プラスミ
ドＤＮＡが閉鎖ループ形状であると蓋、ｌ’ＸＱに゛起
り、直鎖状のグラスミドＤＮＡを使用すると全く起らな
いか、あるいはまれにしか起らない。−組紐換えベクタ
ーが形成されると、適当な微生物の形質転換は単純な工
程であり、当業者に理解されるような適当な選択技術を
使用してアポエクオリン遺伝子を含む新規な微生物株を
容易に単離できる。 要約すると下記のようにして％Ａ！！１！Ｌ９μｍクラ
ゲから遺伝子情報を得、ｅＤＮＡに変換し、ベクターに
挿入し、宿主微生物の形質転換に使用し、アポエクオリ
ンを発現できる。 １、Ａ１５（ｌｕａｒｅａクラゲからポリ（Ａ＋）ＲＮ
Ａを単離する。 ２、 ｔｎ ’ｖｔｔｒｏで１水銀ｃＤＮＡを合成し、
その後逆転写酵素を使用して２重鎖ｃＤＮＡを合成する
。 λＳ１ヌクレアーゼにより１本鎖部分を消化する。 表ゲルロ過で２重鎖ｃＤＮＡをサイズにより分画化する
。 よダシ ５、床傭→ランスフェラーゼ及びｄＣＴＰを使用してｃ
ＤＮＡをティリンクする。 ６、Ｐｓｔ Ｉ Ｋ！’ｌ ｐＢＲ３２２ｔ−消化シテ
、夕ＡＳｉｊレトランスフエラーゼ及びｄＧＴＰにより
直鎖状ＤＮＡ１にティリングする。 ７、ｄＣ−ティリンクｃＤＮＡフラクメントとｄＧ−テ
ィリングｐＢＲ３２２をアニーりングする。 ＆Ｅ、ｃｏｌｉ ５Ｋ１５９２を形ｆｆ転換ｆる。テト
ラサイクリン１ｌｉＴｔ狂コロニーを選択する。 ９、アンピシリン感受性に形質転換されたものをスクリ
ーニングする。ｔｅｔＲａｍｐＳ＝ｙ ｏ ＝−は組換
えプラスミドを含有する。それ等を一８０℃を保存する
。 １αオリゴヌクレオチド混合プローブ（既知アミノ酸配
列より演鐸した配列を使用）１に放射活性で標識する。 ＩＬニトロセルロースフイルメー上でｊＦＮＩＩＡｅｑ
ｕｏｒｅａし、ＤＮＡ１にフィルターに固定する。 １λ”ｐｍｍオリゴヌクレオチド混合物をニトロセルロ
ースフィルターにハイブリダイゼーションさせる。）■
Ｐ−プローブは、エクオリンｅＤＮＡ配列を含むＥ、ａ
ｏｌ１組換欅組換ビスミドＤＮＡブリダイゼーションす
る。 １１過剰の３リープローブなフィルターから洗浄する。 からプラスミドＤＮＡを調製する０ １ａ ｌ ＊ ｐ −標識オリゴヌクレオチドをプラス
きドＤＮＡ（サザンプロット）にハイブリダイゼーショ
ンさせ、ハイブリダイゼーションを確認する。 １７、ｐＨ７，２のＥＤＴＡ含有バ含有バッフアール等
の組換体の抽出物を調製し、組換体忙エクオリンＤＮＡ
配列が含まれていることを示す。 腔腸動物ルシフェリン及びβ−メルカプトエタノールを
加え、−夜４℃にインキエベートして発現アポタンパク
質をチャージする。エクオリンアポタンパク質を発現す
る試料はＣａ の添加により青色光を発する。 上記に一連の工程を記載したが、遺伝子工学分野の技術
者の知識と前述したガイドラインを合わせれば所望の遺
伝子の単離及び組換ＤＮＡベクターでのその使用は容易
に可能であろうし、同じ結果が得られる他の方法も判り
、本発明の組換ＤＮＡベクターの調製に使用できるであ
ろう。 宿主中で再生成することが判明しているベクター１−選
択することによって形質転換宿主中にアポエクオリン遺
伝子のコピーを多数存在させ、外因的な挿入ＤＮＡ（例
えばｐＵ（：８、ｐｔａｃ １２あるいはｐＩＮ−ｍ−
ｏｍｐＡｌ 、２又は３）から多量のタンパク質を生成
する方法、あるいは公知のその他のペプチド発現増加手
段を用いてアポエクオリンの発現を増加させることがで
きる。 全ての場合においてアポエクオリンは、ＤＮＡ配列がベ
クターに機能的に挿入された時に発現される。「機能的
に挿入された」とは、当業者にはよく理解されるように
、辿疋な１８読棹置と配向にあるということを意鰍する
。典型的にはアポエクオリン遺伝子はプロモーターから
下流に挿入され。 その後に停止コドンが位置する。所望により後に開裂を
伴うハイブリッドタンパク質として生成し℃もそうであ
る。 る一般的方法に加えて、その他の公知の方法及びその変
形も本発明を実施するのに使用できる。特に、遺伝子工
学に関する技術は近年、研究開発が進んでいる。多（の
最近の米国特許に、本発明の実施に使用できるプラスミ
ド、遺伝子操作を受けた微生物及び遺伝子操作の方法が
開示されている。 例えば米国特許第４，２７３，８７５号はプラスミドと
その単離方法を開示している。米国特許第４．３０４．
８６３号は遺伝子工学によるバクテリアの生産方法を開
示しており、それによるとハイブリッドプラスミドを構
築し、バクテリア宿主の形質転換に使用している。米国
特許第４，４１９．４５Ｑ号は組換ＤＮｈＲＩＬにおい
てクローン化担体としてによって生成された
）１イブリツドヌクレオチドを開示して
いる。米国特許第４，４０３，０３６号は、多数のＤＮ
Ａセグメントフビーを含むプラスミドを生成するだめの
遺伝子特許第４，３５６，２７０号は組換ＤＮＡククー
ン化担体を開示しており、また遺伝子工学で使用される
多くの用語及びそこで使用される基本的方法を定義して
いるので、遺伝子工学分野において限られた経験しか持
たない者にとって特に有用な文献である。米国特許第４
，３３ ｇ、３３８号は融合遺伝子及びその製法を開示
している。米国特許第４．３４９，６２９号はプラスミ
ドベクター及びその製造と使用を開示している。米国特
許第４，３３２，９０１号は組換ＤＮＡに有用なりロー
ン化ベクターを開示していそこに記載された方法は、遺
伝子工学の技術者であれば本明細書に記載された本発明
を実施するのに容易に改変し得るものである。 これ等の特許及び本明細書で引用したその他の全ての特
許及び刊行物は、本発明の属する分野の技術者の技術レ
ベルを示すものであり、全て本明細書中にリファランス
として含ｙＪ、！Ａ−０本発明の内容は、エクオリンを
螢光免疫測定の研究あるいはその他のエクオリンを標識
として使工鼾 用するアッセイにおいて、エクオリンを制限を受けるこ
となく使用できるようになるという点において有意義な
ものである。生物発光アッセイにお？ｒ −Ｙノ けるエクオリンの使用方法は、同一出願人が１９８３年
１０月１３日に出願した出願番号５４１．４０１５号に
開示されており、本明細書にリフるいは他の宿主中の蚤
哄アポエクオリンの発現を１０（ｆる構築物４＼゛生成
する。さらに、アポエクオリンｅＤＮＡあるいはそのフ
ラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使
用することによって、他の生物発光腔腸動物及び例えば
イカ（軟体動物門）、魚（魚上絶）及び甲殻綱のその他
の生物に見られる構造的に関連する遺伝子を容易にクロ
ーン化できる。これ等の遺伝子の中には、ラミシイタケ
（Ｒｅｎｉｌｌａ）、スチラチューラ（Ｓｔ３’ｌａｔ
ｕ１ｍ ） 、ブチロサルカス（Ｐｔｉ １ ｏｓａｒ
ｅｕｓ ）。 つｉサボテｙ （Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ）及びア
カントプチラム（Ａａａｕｔｈｏｐｔｌｌｕｍ ）のル
シフェラーゼをコードするもの、更にヒドロ虫類のオペ
リア（Ｏｂｅｌｌａ）及び有橋動物のムネミオプシス（
飲億１見１０）及びウリクラゲ（Ｂ＊ｒｏｅ ）に見ら
れる発光タンパク質をコードするものが含まれる・ 本明細書に記載した原理に基いたオリゴヌクレオチドプ
ローブ及び変形ヌクレオチド配列を使用待される。その
ようなプローブは完全な配列よりもかなり短くてもよい
が、全長において少くとも１０のヌクレオチＶが必要で
あり、少（とも１４のヌクレオチドを有することが好ま
しい、それより゛長く、遺伝子の全長までのオリゴヌク
レオチドりまた有用なものである。ＲＮＡプローブ及び
ＤＮＡプローブとも使用できる。 使用においては、該プローブを検知可能なように１Ｉａ
Ｌ （例えば”Ｐ％ ”Ｈ％ビオチンあるいはトする
。１本鎖及び２本鎖のくハイブリダイゼーションした’
）ＤＮＡ（あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ）Ｙ分ｍｌ （Ａｆ
ｆｉ的にはニトロセルロースペーパーなるのに適したハ
イブリダイゼーション技術は公知のものである。 プローブは通常、容易に同定できるようにする検知可能
な標識とともに用いられるが、非標識のオリゴヌクレオ
チドも有用なものであり、竜方客へ１識プローブの前駆
体としても、２本鎖ＤＮＡ（あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ）
の直接検知を行なうゴヌクレオチドプロープ」という用
語は、ｓＲ及゛び非標識両方の形状のものを指すもので
ある。本明細書に記載したペプチド配列の４０から１１
０のアさノｍｌをコードする領域から得られたオリゴら
である。 におゆるプローブとして有用 ｌであると考えられるものである。 （以下余白） 表 ５ ｔｌｌ胞動物門（腔腸動物門） Ａ花火類（Ａｎｔｋｏｚｏ′Ｌ） つさシイタケ（Ｒｅｎｔ １１ａ） （ｓ １１ ）’
スチラチェーラ（坦ム五匡口） ブチロサルカス（Ｐｔｌｌｏａａｒａｕｓ）クミサボテ
ンｂ（Ｃａｖ＠ｒｎｕｌａｒｌａ）アカントプチラム（
Ａｃａｎｔｈｏ ｔｉ ｌｕｍ）Ｂヒドロ虫類ＣＨｙＪ
ｐｏｚｏｔ ） オワンクラ＄３（Ｍ１臼μ遍） オペリア（Ｏｂｅｌｌａ） ２有櫛動物門（Ｃｔｅ、１ｏｒｈｏｒａ）ムネミオプシ
スのｈ荘１蛙ｌ匡） ウリクラゲ（カ厖μ） １軟体動物門（Ｍｏｌｌ＝ｔｓｃｅＬ＞ホタルイカ’
（Ｗａｔａａｅｎｉｍ）本魚類（Ｐｒｓｃｅｓ） ネオスプベラス ミクロシール庫 （Ｎｅｏｓｃｏｐｅｌｕｓ ｍ１ｃｙｏｃｈｉｒ）ハダ
カイワシ（Ｄｔａｐｈｕｉ） アカンテフイラ エキシミア （Ａｅａｎｔｈｅ ｂ７ｒａ ＊ｘ１ｍ１ｍ）アカンテ
フイリア バーブレア （Ａｃａｎｔｈｅ ｈｙｒｉａ ｐｕｒ ｕｒｅ
ａ）オプロフオラス スビノサス＆ （ＯＰｌｏｐｈｏｒｕｓ ａｐｉｎｏｓｕｓ）ヘテロ
カルプス グリマルテイ （Ｈａｔｅｒｏｅａｒｐｕｓ ｇｒｉｍａｌｄｌｌ）へ
テロカルブス レビガタスａ （Ｈ＠ｔ＠ｒｏｃａｒｐｕｓ １ｅａｖｉｇａｔｕｓ＋
）システラスビス クリスタタ （Ｓｙｉｔａｌｌａｓ ｉｓ ｃｒｉｓｔａｔｍ）
システラスビス デビリス グナトボジア インゲンス （Ｘ）【 データに基いて構蓬フ■イー。その他の全てのものはル
シフェリン−ルシフェラーゼ交差反応並びに速動力学及
び生物発光の発光スペクトルの比較に基く。 ｂ ルシフェリンがＣＩ）と同一のものであるという付
加的な証拠は、（■）と同一のものであることが示され
た分離発光体に閏げる化学的及び物理的データから得ら
れた。 （以下余日） 腔腸動物量 ルシフエリν（１） 腔腸動物戯 オ午シルシフニリン（ｎ） これまで総括的に記述してきた本発明は、以下の実施例
を参照しながらより容易に理解されるであろう。これら
の実施例は単に詳細な説明を意図するのみであって、特
に記載のない限シ本発明を限定するものではない。 実施例１：天然エクオリンの精製 第２のグル濾過段階にセファデックスＧ−７５（スーパ
ーファイン）を用いること以外はプリンシス（Ｂ１１ｎ
ｋｓ ）等の方法〔プリンシス・ジエイ・アール（Ｂ１
１ｎｋｓ、 Ｊ、 Ｒ，） 、 ビーエイチ・マツチ
イングリ−（Ｐ、 Ｈ，Ｍａｔｔｌｎｇｌｙ ） 、ビ
ーｅアール・ジエウエル（Ｂ、λＪｅｗｅｌｌ） ｅ
エム・ファン・ルーヴエン（Ｍ、 ｖａｎ Ｌｅｅｕｗ
ｅｎ ） 、ジ−１シー０バー′ア（Ｇ、 ０． Ｈａ
ｒｒｅｒ）及びデー・ジー・アレン（Ｄ、 Ｇ。 に１ｅａ）＋メツド・エンザイモロジー（Ｍ６ｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏ１． ） 、 ５７巻、２９２−３２
８頁（１９７８年）〕に従ってエクオリンを精製した。 エクオリンの精製は以下の手順で行った。 Ｌ ７ライデイ湾（Ｆｒ１ｄａｙ Ｈａｒｂｏｒ ）
、 ワシントンでエクオレア（Ｍ皿と↓）を収集し日
周組織（光細胞： ｐｈｏｔｏｃｙｔｅｓ ） を採取
する。 ｌ ＥＤＴＡ中の低張溶解に１って光細胞から、タン
パク質を抽出する。 ＆ 光細胞抽出物を硫酸アンモニウム分色（Ｏ−’７５
％）する。 ４ （ＮＨ４）１８０４による沈殿物を遠心分離して
一７０℃に保存したまま、フライディ湾、ワシントンよ
シ船で運ぶ。 ＆ セファデックスＧ−５０（７フイン）を使ってゲル
濾過を行なう。 ＩＬ ＱＡＩセファデックスを使って一一ステップ及
び塩勾配溶出によるイオン交換を行なう。 ７、七７アデツクスＧ−７５（スーパーファイン）を使
ってゲル濾過を行なう。 ＆ ＤＥＡＩ−セファデックスを使って、−一ステッ
プ及び塩勾配溶出に１夛イオン交換を行なうＯ 上記洗１−４段階はフライディ溝上にて行なった。収集
と日周組織の株攻以外の全ての段階は０゜−４Ｉ℃で行
なわれた。〆段嬉写為らの最終生成物は遠心ボトル（２
５０ｍ）に入れてドライアイス中で保存し念。該物質は
この１りな形で船で運ばれた〇 ヨーシアのアテンス（Ａｔｈｅｎｓ ）で行なった。全
段階は０−４℃で実施された。エクオリン含有画分は各
段階の間−８０℃で保存された。タンパク質濃度にかか
わらず、エクオリンは凍結融解に対して安定であるよう
である。 第５段階 セファデックスＧ−５０（ファイン）による
ゲル濾過。 このカラムに１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＆５ （ＨＤ’Ｉ
’Ａ溶液を調製するのに２ナトリウム塩を用いた）溶液
ｆ ７５ ｔｄ／時の流速で流した。ＧＦＰ及びエクオ
後段の精製のために保存された。この段階でのエクオリ
ンの収率は５Ｇ−８０％の範囲に亘シ、通常６５−７５
％の収率が得られた。このカラムの能力は約ｉ ｏ ｏ
０ＩＲ９（プラトフォード： Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ
）７７５ｍであシ、可能である限シ一般にそれニジも少
ない量ｔカラムにかけた。 第６段階 ＱＡＥセファデックスによるイオン交この段
階に用い念。カラムのベッド体積はイオン強度及び緩衝
液組成によってクロマトグラフィの間で変化した。 に工って全収量が増え、効率的であった。この段階はプ
リンタス等の方法（１９７８年）と全く同様に実施され
た。カラムにη為けた後、ＧＦＰｔ；ｉ…−ステップ（
５ｍＭ ＮａＡｃ、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ４７５
）によって選択的に溶出された。エクオリンは次に、過
（アミコンＹＭ−１０膜）で濃縮して次段階に用いる調
製物とした。エクオリン収率は８０チでカラムに１０ｍ
ＭＥＤＴ人、−＆５の溶液を１０一／時で流した。エク
オリン収率は６０−８０％であつ几。 ８８段＃ ＤＥＡＥ−セファデックスによるイオかけ、
ＱＡＢセファデックスカラムと全く同様に溶出を行なっ
た。エクオリン収率は一般に７５−８０％であった。こ
の段階は殆んどのエクオリン調製の際には必要のないも
のである。第７段階からのエクオリンは通常純粋なもの
である（１２％アクリルアミド８Ｄ８−ＰＡＧＢＫよる
）０第９段階 ＥＤＴＡ存在下でエクオリンを９５４Ｌ
力大きい回収率で凍結乾燥し次。］１ｉＤＴＡが存在し
ないと回収率はＯから９５％ｔで様々であった（プリン
タス等、１９７８年参照）。 実施例２：エクオリンの配列決定に用いられる配列決定
方法 アミノ酸配列分析は自動エドマン分解（エドマン（Ｂｄ
ｍａｎ ）及びベツグ（Ｂｅｇｇ）、 １９６７年）を
用いて実施された。比較的多量のタンパク質又はペプチ
ド（１０ｎｍａ１以上）の配列分析はモデル８９０Ｂベ
ツクマンシークエンサー（テューク大Ｍクアド菅−ル（
Ｑｕａｄｒｏｊ ）プログ２ム（タール（Ｔａｒｒ ）
等、１９７８年）を採用して実施し次。 Ｍ３及びＭ５という２つのペプチドは小さいか又はジア
ドロール法ではカップから洗浄されてしまうので、クラ
パー（Ｋ１１ｐｐｅ、 ）等（１９７８年）に工を行っ
た。アミノ酸のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ−）
ｎ導体は、バンカピラー（ＨｕａｋａｐｉＪＩａｒ ）
及びフッド（Ｈｏｏｄ ）によって記載された方法（１
９７８年）に主に従って、デュポン・ゾルベイ（ＤｕＰ
ｏｎｔ Ｚｏｒｂａｙ） ＯＤ ８カラムを用いて逆相
ＨＰＬＯり四マドグラフィにニジ同定された。２−１２
−１Ｏｎ程度の量で２利用できろｌペプチドは、０、
’Ｉ Ｍクアドロール（プラウア−（Ｂｒａｕｅｒ ）
等、１９７５年）及びポリグレン用のプログラムを使っ
てモデル８９００ベツクマンシークエンサ−（ワシント
ン大学）に１って配列決定された。 ＰＴＨ−アミノ酸はエリクソン（Ｅｒ１ｃｓａｏｎ ）
等に工って記載された（１９７７年）逆相ＨＰＬＯシス
テムを用いて同定され次。ｌ、 ５ ｎｍｏｔ（、？）
少ない量のペプチドを使う場合には、応用バイオシステ
ムモデル４７０人気相シークエンサー（ワシントン大学
、バンカピラー等、１９８３年）を用いて配列分析を行
った。気相装置からのｐＴｎ７ｔノ酸はバンカピラー及
びフッドの記載（、Ｌ ９８３年）に従ってＩＢＭシア
ノカラムを用いて同定された。 参考文献 エドマン・ピー及ヒペッグ・ジー ヨーロピアン−ジエ
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ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ
） 、 ＝ ｓ−−イングランドバイオラボ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ ）及びインターナ
シ目ナル・バイオテクノ算ジー会社（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｂｌｏｔｅｃｌｕｓｏｌｏｇｉａｍ、 Ｉ
ｎｃ、 ）から購入し合成し、必要な時まで凍結乾燥粉
末で保存した：ポリ・ケ−（Ｈｏｒム、Ｌ）、アンプル
セン・ジエイ・エム（Ａｎｄ＠ｒｓａｎ、 Ｊ、 Ｍ、
） ＃ ワード・ダグリュー・ダグリュー（Ｗａｒ
ｄ、 Ｗ、 Ｗ、 ）及びコルミアー・エム・ジエイ（
Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 Ｊ、 ） 、バイオケミスト
リー、１４巻、 ２３７．１−２３７６頁（１９７５年
）；ポリ・チー（Ｈｏｒｌ、 Ｋ−） ＊ カルボネア
ウ・エイチ（０ｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、 Ｈ，） ｌ”
−ト・アール・シー（Ｈａｒｔ、 Ｒ，Ｏ，）及びコル
ミア一番エム嗜ジエイ。 プロス・ナトル・アカド・サイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’
ｌ。 人ｃａｄ、 ８ｃ１． ） ＊米国、７４巻、 ４
２８５−４２８７頁（１９７７年）；イノウニ・ニス（
Ｉｎｏｕ７ｅ、 ８．） ＃スギ中う・エイチ（Ｓｕｇ
＆ＬＡ＋ｒａ＊ Ｈ，）、カコイ・エイチ（Ｋａｋｏｌ
、 Ｈ，） 、 ハシヅマ・チー（Ｈａａｉｚｕｍａ、
Ｋ、 ）＊ゴトウ・チー（Ｇｏｔｏ、 Ｔ、 ）及び
イイオ・エイチ（ｌｌ０Ｉ Ｈｌ）＋ケ＜−レター（Ｏ
ｈｅｍ、 Ｌｅｔｔ、 ） 、 １４１−１４４頁（
１９７５年）。 ＲＮＡ単離及びイン・ヴイトロに於ける翻訳エクオレア
・グイクトリア（人ｅｑｕｏｒａａ ｖｌｃｔｏｒｉｍ
）クラゲがワシントン大学海洋生物研究所にて、ワシ
ントンの７ライデイ湾に於いて収集された。クラゲの周
囲から日周リング（ｃｉｒｃｕｍｏｒａｌ ｒｉｎｇ
）を切シ取〕、直ちにドライアイス／メタノール浴中で
凍結させた。この組織ｔ−−７０℃にて所望の時まで保
存した。 キム（ＫｉＩｎ）等の方法〔キム・ワイ拳ジエイ・シュ
ーマンンジエイ（８ｈｓｕｎａｎ、 Ｊ、ｌセツテ・チ
ー（８ｅｔｔｅ、 Ｋ、）及びプルライピラ・ニー（Ｐ
ｒｚｙｂｙｌａ。 人、）、細胞生物誌（Ｊ、 Ｏｅｌ’１． Ｂｌｏｌ、
） 、 ９６巻。 ３９３−４００頁（１９８３年）〕に従ってＲＮＡを単
離し、ポリ（４）＋ＲＮＡ’ｉ前記方法〔アビプ・エイ
チ（Ａｖｌｖ、 Ｈ，）及びレーダー・ピー（Ｌｅｄｅ
ｙ。 Ｐ、）、 ＰＮＡ８６９． １４０８−１４１２頁（１
９７２年）〕を用いて調製しな。 ポリ（人士）ＲＮＡ（１Ｉｇ）及びポリ（Ａ−）ＲＮＡ
（２０μｇ）はラビット網状赤血球イン・ヴイト日翻訳
システムを用いて翻訳された〔ペルハム・エイチ・アー
ルｅビー（Ｐｅ１ｈ鳩Ｈ，λＢ）及びジャクソン・アー
ル曇ジエイ（Ｊａｃｋｍｏｎ、λＪ、）、曹−ａビアン
・ジャーナル舎バイオケ電ストリ−（Ｂｕｔ、 Ｊ、
Ｂｌｏｃｈｅｍ、 ） 、 ２４８巻（１９７６年）
；メリック・ダブリニー・シー（Ｍａｒｒｌｃｋ、 Ｗ
、 Ｏ，） ｅメソド・イン・エンザイム（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｆｆａｘ、 ） 、 １０１ｔｏ）＝
６０６−６１５頁（１９８３年）参照〕。溶解物からミ
クソコツカスヌクレアーゼを用いて内因性ｍＲＮＡを除
去した０各翻訳試料（総量６２ＡＡ）をａＭＢ−メチオ
ニ：’ （３８Ｊ１１０１ ）存在下に９０分及びスタ
フアウレウス（虹柑把匣ｔａｇ）細胞を５０μＬの各翻
訳混合物中に加えてアポエクオリンを免疫沈降させた。 数回洗浄後に抗体−アポエクオリン複合体を８Ｄ８存在
下で加熱して解離させた。 この翻訳生成物を８ＤＢポリアクリルアミド（１３Ｓ）
ゲルで分析した。電気泳動に次いで、ゲルをクマシー（
Ｏｏｏｍａｓａｌｅ ） Ｒ−２５０で染色しタンパク
フイを行なった。 ＤＮ人組換え操作 二本鎖ｃＤＮＡを全エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ）
ポリ（人士）ＲＮ人からライケンス（Ｗｉｃｋｅｎｓ
）等の記載〔ライケンス・エム・ピー（ＷＩｃｋｅｎａ
、 Ｍ、 Ｐ、 ）、プエル・ジー・エフ（Ｂｕｅ口、
αＮ、）及びシムケ・アール・ティー（５ｃｈｈｎｋｅ
、 Ｌ Ｔ、 ）、生物化学誌（Ｊ。 Ｂｌｏｌ、 Ｏｈ＠ｍ、 ） 、 ２５３ 、２４８３
−２４１５頁（１９７８年）〕のように合成答ハた。ホ
モポリマーのｄＱデテール付加し喪後、二本鎖ｃＤＮＡ
をｄＧ−チー／Ｉ／を付加されたヱａｔ １切断ｐＢＲ
３２２（ヴイツ・コｆｆＥ１）・エル（Ｖｉｌｌａ −
Ｋｏｍａｒｏｆｆ、 Ｌ、）、エフスト２デイアゾイス
・ニー（Ｒｆｓｔｒａｄｌａｄｌｍ、ん）、プルーム・
ニス（Ｂｒｏｏｍｓ、 ８． ） ＠ ０メジ−・ピー
（Ｌｏｍｅｄｌｃｏ、 Ｐ、）、チザード・アール（Ｔ
ｌｘａｒｄ、 ＆）。 チーペル・ニス・ビ、−（Ｎａｂｅｒ、 ｊ３． Ｐ、
）＊チック拳ダグリエー・エル（０ｈｉｃｋ、 Ｗ、
Ｌ、）及びギルバート（α１ｂｅｒｔ ） 、 ＰＮＡ
８ ７８巻、 ８７２７−３７３１頁（１９７８年）〕
と〕ア二−リングレ、大腸菌臘）８に１５９２株を形質
転換するのに用いた。テトラナイフリン耐性・アンピシ
リン感受性コ四ニーを移し取シマイク胃タイターディッ
シェ内で一７０℃にて凍結させた。 エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ） ｃＤＮ人ライブラリ
ーを合成オリゴヌクレオチド混合物を使ってスクリーニ
ングにかけエクオリンｃＤＮＡを捜した。このオリゴヌ
クレオチド混合物はコレンビア大学のチャールズ・カン
） −（０ｈａｒｌａｓ ０ａｎｔｏｒ）及び力／Ｉ／
ａ ｘ・アルガラナ（０訂ｌｏｇ Ａｒｇａｒａｎａ
）から提供された。 ポリアクリルアミド電気泳動〔マエアテイス・ティー（
Ｍａｎｌａｔｌｓ、 Ｔ、）及び工７ストラテイデイス
・ニー（Ｅｆａｔｒａｔｌｄｌｍ、 Ａ、Ｌメソ・イン
・工ンザイム（Ｍ＠ｔｈ、 ｆｎ Ｅｎｘ、 ） 、
６５巻、２９９−３０５頁（１９８０年）〕に１って
それらを精製した後、１７コＬシ成る前記オリゴヌクレ
オチド（１？マー）ヲポリヌクレオチドキナーゼ及びｒ
−ｊ ＊ｐ ＋＋人ＴＰを用いて放射活性標識した〔
マキシマム・ニー・エム（Ｍａｘｉｍ、人、ｋ）及びギ
ルバート・ダブリニー（Ｇ１１ｂａｒｔ、 Ｗ、 ）
、メソ曇イン・エンザイム、６５巻、４９９−５５９頁
（１９８０年）〕。 取シ込まれなかったｉｍｐはＤｉｉＡＦｌセルロースイ
オン交換りｐマドグラフィによって除去された。 エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ） ｃＤＮＡバンクは
火工のようにスクリーニングされた： 大腸菌（Ｂ、 ｃｏｌｉ ）組換え体を凍結培養物から
シリア寒天プレート上のエト四セルロースフィルター（
７Ｘ１１ＣＩＥ）に移行し次。これらのコロニーた〔タ
ウン・エフ（Ｔａｕｂ、 Ｆ、 ）及びトンプソン・イ
ー・ピー（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 Ｂ、 Ｂ、 ） ＋
７ナル＊ ハイ；ｆケミ（Ａｎａｌ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ
、 ） 、 １２６巻、２２２−２３０頁（１９μ２
年）〕参照〕。このフィルターを空気乾燥後に真空下２
時間ベーキングし次。 このフィルターをまず初めにｌＸ８ｆ９０中で湿らせ穴
径、フィルター１枚当シ３−のグレハイプリダイゼーシ
ョン溶液（ｌ０ＸＮＢＴ、 α１チ８Ｄ８゜３×デン
ハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ ）中で５５℃、１２−２０
時間保持した。この溶液をハイブリダイゼーションバッ
グから注ぎ出し、フィルター１枚シ１−のハイブリダイ
ゼーションｆｆｉ液（ｌｏｘＮｇＴ。 ０．１％８Ｄ８，３ＸデンハＡ／ト、ｌＸｌ０・ｃｐｍ
のａ”Ｐ標識１７マー／フィルター）１代シに注入した
。３７℃にて２４時間ハイブリダイゼーションを行ない
、その後４℃の１０Ｘ８８０中で１０分間かけて４回洗
浄した。フィルターを空気乾燥し穴径プラスチックラッ
プに包んだ。デュポン・クロネツクス増感板を使い＝ダ
ックＸＡＲ−５フィルムを一７０℃にてこのフィルター
に露出し念。 大腸 （ｃ■）の び 操 ｐＡＩＱ１− ｐＡＩｌｉＱ６ を含む大腸菌８に１５
９２ｔ−ルリア流体培養基２５−中で３７℃にて一晩増
殖させた。この細胞を遠心分離した後、１０チショ糖、
ｓｏｍＭ）すｘｐｉ（８ｊ＠液５−に再懸濁した。こＯ
？Ｉ液Ｋ、α１Ｍフェニルメチルスルホニル７０２イド
ｔ−７，２μｔ、α２Ｍ ＨＤ’ｒＡを３１２μｔ、１
０ダのリゾチーム及び１０ｍｙ／−のＲＮａ婁ｅＡを１
０μを加えて細胞を溶解した・氷中で４５分間保持した
後、この混合物を４＆５０Ｇ）ｌで１時間遠心分離にか
け、この上清を貯えた。 エクオリンの精製及びアッセイ プリンタス等の方法〔プリンタスｅジェイ−７−ル（Ｂ
１１ｎｋｓ、 Ｊ、λ）ｌ ウ４７＠／ヴリ！−＊ ジ
ー（Ｗｉ＠ｒｓ Ｖｉ’−Ｇ−） ｅ ”ス・ピー（Ｍ
ｅｓｓ、 Ｐ、 ）及びグレダーガスト・エフ・ジー（
Ｐｒｅｄｅｒｇａｓｔ、 Ｆ、α）。 プログ・パイロフイズ・モレキユラー・バイオ四＜Ｐｒ
ｏｇｍＢｌｏｐｈｙｓａＭｏｌｅｃａＢｌｏｌ ）、
４０巻、ｌ−１１４頁（１９８２年）〕に従って、エ
クオリンを抽出・精製した。エクオリンすなわち光タン
パク質（ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ）活性は、Ｓμｔ
の試料をへＩＭＯｎ賄、 α１Ｍ）リス、ｐＨａＯｆ
ａ液α５−に液入５ると同時に番、ｑ光強度（ｐｅａｋ
ｌｉｇｈｔ Ｉｎｔｅｎｔ口ｙ）及び全光子数を測定
することで求めた。この測定用の測光計の設計及び光子
収量の絶対量に対する装置の標準化については、以前に
記載され念ものを参照されたい〔アンデルソン・ジエイ
・エム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｊ、Ｍ、 ） 、 ７ア
イニ・ジー・ジエイ（Ｆａｌｎｉ、 Ｇ、 Ｊ、 ）及
びワアングラー・ジエイ・イー（Ｗａｍｐｌｅｒ、 Ｊ
、 Ｂ、 ） 、メソトーイン・エンサイモ四ジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｎｚ、 ） 、 ５７巻、５
２９−５５９頁（１９７８年）；カルボネアウ虐エイチ
（０ｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、 Ｈ，）及びニルζエル・
エム・ジエイ（Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 Ｊ、） 、ジ
エイ・バイオ党・ケム（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ｃｈｅｍ、
） 、 ２５４頁、７６９−７８０頁（１９７９年
）〕。 ！！ＡＢ １抽出 からのアポエクオリン活性の部分精
製 発現されたアポエクオリンは、ｐＡｅＱ１抽出物２３ｄ
ｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｌ５ｔｎＭ）すＪ、ｐｔ１７．
５溶液で平衡化されたワットマンＤ）ｉｉ−２２カラム
・（４２ｍペット体積）に通すことに１って部分精製さ
れた。８００−〇Ｎｍ０Ｌ勾配（０−ＩＭ）ｆ：漣１υ
、アポエクオリン活性はａ ３ Ｍ Ｎａ０Ａのところ
に溶出してきた。ピークの分画を回収し、α５実験に供
し次。 結果及び考察 インゲイトはに於けるエクオレアポリ（Ａ＋）ＲＮＡの
翻訳 凍結したクラゲの組織１９７０−ら約ｔｓＡｇのポリ（
人士’）ＲＮＡを単離した。イン・グイトロに於は４五
り主と１ポリ（λ＋’）ＲＮＡの翻訳に関する結果は第
１図に示す。抗エクオリンと反応した翻訳生成物はレー
ン４で示されている。免疫沈降した１１Ｓのカウントは
翻訳され穴ものの全酸沈殿物のカウントのα３％であり
、これはアポエクオリンｍＲＮＡが全ポリ（人士） ｍ
ＲＮ人集団の約α３チであることを示している。このよ
うに７ポ工クオリンｍＲＮＡが比較的多いということは
、エクオリンのロ周リング粗抽出物中のエクオリンに相
答する全タンパク質の割合（α５％）と良く一致するも
のである。邑久主ｕＲＮ人（レーン２）の非存在下、又
はエクオリンポリ（ム一）ＲＮ人の存在下（データは記
載していない）でイン・ヴイトロの翻訳を行うと、免疫
沈降するタンパク質はできなかつ念。 抗エクオリンｉ′免疫沈降する翻訳−次産物（ｐｒｂｎ
ａｒｙ ｔｒａｎｓｌａｔＩｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）は
ｆ９Ｄｓ−ＰＡＧＥゲルに於いて明らかに２３，４００
ダルトンの分子量を示すように動き（レーン４）、これ
はエクオリンから単離した天然エクオリンの分子量（２
２，８００ダルトン、第１図参照）エフも僅かに大きい
ものである。このデータ及び第４図に示したデータは、
初期翻訳生成物には約７つのアミノ酸のｆ’１７ｆ’ｌ
シ配列（ｐｒｅｐｒｅａｅｎｃｅ ）の存在があること
と一致するものである。 ポリ（Ａ＋）ＲＮ人翻訳からの免疫沈降タンパク質は、
元のオート２ジオグラムを見てみると、二重線或いはさ
らに三重線（レーン４．第１図）で動いていたことが判
る。この結果は二通勺に解釈し得るものである。第１番
目に、！ヱ、ヱイクトリアには多数のアポエクオリン遺
伝子が存在し得、それぞれのプレタンパク質の分子量が
、それらのｄ！配列の長さが多様であるが故に異ってい
るということである。エクオリンアイソザイム〔プリン
クス・ジェイ・アール（Ｂ１１ｎｋｓ、 Ｊ−λ）及び
ハレアージー・シー（Ｈａｒｒａｒ、 Ｇ、 Ｏ，）
、 ７：Ｌド・プ四ス（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、 ） 、
３４巻、４７４頁（１９７５年）〕の存在はζうした
多重遺伝子族（ｍｕｌｔｉ −ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ
） ｆ示しているかも知れない。 第二番目に、７ツイデイ湾のエクオリン・グイク）＋７
７集団がエクオリンの複数種から成シ立っているかも知
れないということである。 エクオリンｃＤＮＡｓの同定 使用されたエクオレアｃＤＮ人ライブラリーは４５０ｂ
ｐニジ大きい挿入部分を持つ６００００組換え体を含ん
でい次。スクリーニングに付された２５の任意の該組換
え体のうちのどれも５００ｂｐ以下の挿入部分ｑ持りて
おイ；そのうちの２つは３ＫｋＰかニジも大きかった・ エクオレアｃＤＮ人バンクは次の混合合成オリゴヌクレ
オチドプローブを用いてスクリーニングにかゆられた。 上記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はアポエクオリン
の全アミノ酸配列の研究に１って求められた。このオリ
ゴヌクレチドはエクオリンポリベグチドのカルボキシ末
端領域に於いてＴｒｐ ｌ’ ａ・Ｔｙｒ ｅ Ｔｈｒ
＠ Ｍｅｔ ａλｓｐ ｍ Ｐｒｏ”’のペプチドを
コードしているｍＲＮ人と相補的なものである。上記の
１７マー（１７−ｇｎａｔ龜）は、方法の欄で記述した
様にｌａｐで標識されエクオリンｃＤＮＡライブラリー
からのプラスミドＤＮＡとハイブリッドを形成した。 ６つの形質転換体が上記合成オリゴヌクレオチドとハイ
ブリッドを形成する挿入部分を持つ次プラスミドを含有
しているものと同定され念。最大のＰｓｔ Ｉ挿入部を
含むプラスミド、ｐＡＢＱｌの制限地図を第２図に示す
。ｐＡＥｆＱｉをＢａｍ ＨＩで消化すると該合成オリ
ゴヌクレオチドとのハイブリッドは形成されないであろ
う。前記の１７マ−ＤＮ人配列の研究によると、仁のハ
イブリダイゼーションプローブはＢａｍ ＨＩ認識配列
（ＧＧＡＴＯＯ）を含んでいるものである。従って、ｐ
ＡＩｉｉＱｉ中のＢｊｌｎｌＩＨＩ部位はアポエクオリ
ンをコードしている配列の３′領域を同定するのに用い
ることが出来りう。以下に示すＬ５に、組換えプラスミ
ドｐＡｉｌＱ１は、大腸菌（４９凪）に於けるその発現
から示されるように、アポエクオリンｃＤＮＡ１に実際
に含んでいるものである。 大 に るアポエクオリンの 前記の６つの形質転換体のうちのどれが生物学的に活性
なアポエクオリンを発現しているかどうかを見つけ出す
為に、それらの抽出物、及び同様に親株（ｈｏｓｔ ５
ｔｒａｌｎ ）の抽出物を方法のところで記述した様に
調製し九。それぞれの抽出物０．５−にβ−メルカプト
エタノール＜２ｍＭ＞及び腔腸動物門のルシフェリン（
αＨ＋ｓＭ）を添加し、この混合物ｔ−４℃にて２０時
間保持した。その後、諌混合物のＯａ 依存光タンパ
ク質活性について方法に記載したようにして測定し喪。 組換え体ｐＡ］１ｔＱ１から１４表した抽出物について
はＯａす依存ルミネッセンスが観察されたが、親株又は
他のいずれの形質転換体からの抽出物についてはこのよ
うなルミネッセンスは観察されなかった。ｐＡＦｔＱｌ
−６の挿入部分がクロスハイブリッドを形成するとい
う仁とは、それらが相同なりＮＡ配列を含んでいるとい
うことを示唆するものである。しかしながら、もしも９
ＡＢＱ２〜６のｃＤＮ人挿入部分の長さが充分でなかっ
たり、プラスミド中で適切に配向していなかつ念シする
と、それら抽出物中のアポエクオリン活性は期待出来な
いものであろう０ｐＡＢＱ１抽出物の光タンパク質活性
発現の速度論は天然の混合アポエクオリンのそれと類似
している（第３図参照）。この抽出物に於いて光タンパ
ク質活性が発現する為に必要とされる条件も真正の（ａ
ｕｔｈｅｎｔｉｃ ）アポエクオリンを用いた場合に観
察されるものと同一である。第３図に示すように、溶存
へが必要とされる。更に、ｌ−メルカプトエタノール又
は腔腸動物門のルシフェリンのいずれかが反応混合物中
に存在しなくなると、０ａｆｆｉ＋依存光タンパク質活
性が全く発現されなくなる。 Ｏｓ ｆ：含まない緩衝液中に活性成分を注入しても
ルミネッセンスは発さられなかったｏＯａｔ−後で添加
するとルミネッセンスの閃光（ｆｌａｓｈ）が見られた
。 ｐＡ、Ｈｔ含有形質転換体の抽出物中の活性成分を更に
詳しく調べる為に、この組換えプラスミドを含有する形
質転換体抽出物を、方法のところで記載した工うにＤＥ
−２２ｆ：用いたクロマトグラフィにかけ念。アポエク
オリン活性は約α３Ｍ塩のところで溶出され、これは真
正のアポエクオリンの場合に類似している。この活性画
分を腔腸動物門のルシフェリン、／−メルカプトエタノ
ール及び酸素の存在下でインキユベートし、光タンパク
質活性を発生させた（第３図参照）。次いで、この混合
物をゲル濾過にかけた。第４図に示すように、ｐＡＩＱ
１抽出物中の部分精製成分から生じた光タンパク質活性
はＭｒ＝ ２０．６００のところに溶出し、一方天然エ
クオリンは１亀６０Ｇのところであった。同様の結果は
イン・ヴイト冒の翻訳実験中にも観察された（第１図）
。第４図のデータから、使用した条件ｍ下に於いて、ル
シフェリンはｐＡＥＱ１抽出物中の活性成分と強固に会
合するという結論が得られるであろう。 を 第４図からの回 タンパク質画分はＣ１の添加によっ
てルミネッセンスの閃光を発する。この閃光の速度論は
Ｏａ 依存エクオリン反応のそれと区別ができないもの
でありな。他の組換えプラスミドは形質転換体抽出物分
て゛゛光放出タンパク質（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉ田ｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ） ｔ−発現しなかった（第６表参照
）。 上記のデータは、ｐＡＥＱｉ中に挿入され７’１−ｅＤ
ＮＡ部分はアポエクオリンをコードしている全長ｃＤＮ
Ｉｔを表わしていることを示している。更にこのデータ
は、該ｃＤＮＡがｐＡＥＱｌ中で発現されておシ、その
タンパク質生産物の生物学的活性は天然の混合アポエク
オリンのそれと区別され得ないことを示している。発現
レベルは全可溶性タンパク質の約０．０１％であると推
定され念。 表６７ボエクオリンｃＤＮＡクローン抽出物中のアポエ
クオリンの再充電 ｐＡＩｅＱｌ ５Ｘ１０’ ０ｐ
ＡＢＱ１ ０ ０ｐＡＩＱ３
０ ０ｐＡＩＱ４−
０ ０ｐＡＢＱ５ ０
０ｐＡ］１ｌＱ６ Ｇ
Ｏ８Ｋ １１５９２ （親株＞
０ ０各抽出物α５−にメルカプトエタノ
ール（２ｍＭ）及び腔腸動物門のルシフェリン（０，０
１ｓｍＭ）ｔ−加えた。この混合物ｔ−４℃で２０時間
インキエベートし７ｔ、試料５１１ｔを取ル出しα１
ｍ Ｍ Ｃｙ−１０、ｌ５ｓｄに注入して、泰４光強度
を測定した。 ε携ス ｐＡ］ｉ！Ｑｌ ｉ含む大腸菌に於げるアポエクオリン
の発現は比較的低レベルである。この発現レベルて増加
するように、ｐＡＥＱｌ ＠ｂらのアポエクオリン遺伝
子をもう１つのプラスミド（ｐＵＯ９”）ｉでサブクロ
ーン化させ良。 ｐＡＩ！ＱｌからのＰａｔ Ｉ断片（αｙｓｋｂ ）を
単離し、ｐＵＯ９の単−Ｐｓｔ Ｉ部位にクローン化さ
せた。 ２つの異なるプラスミド、ｐＡｇｑ７及びｐＡ］！ＩＱ
ａ管得た。プラスミドｐＡＩＱ８は第２図（ｂ）で示す
ように、所望の配向で挿入されたＰｓｔＩ断片金含んで
いた。プラスンドｐＡｌｌＱ７には反対方向の配向で該
断片が挿入されていた。 ｐＡＩＱ７及びｐＡ）！ｆＱ８ ｔ−含有している大腸
菌株（親；ホス） ：ＪＭＩＯ５）を各々３７℃にてア
ンピシリン（５０μｇ／−）含有のルリア流体培養基２
０−中で増殖させた。ＯＤ、１゜が０．６に達し九時に
、培養物を１００惰Ｍ保存溶液中で１ｍＭにし念。 ５ｍの試料を取シ出し、一方残シの培養物は振とうされ
続は友。１時間及び２時間後にも同様に試料の一部を取
シ出した。それぞれ試料の一部を採取した直後に、細胞
を遠心分離し一２０℃で必要になる時まで保存した。 ６つの採取試料抽出物のアポエクオリン活性をシフニリ
ン及びメルカプトエタノール（２６０ＡＡ抽出物、５％
メルカグトエタノール水溶液３μを及び腔腸動物門ルシ
フェリン３μＬ）の存在下で一晩インキエベートした。 このインキエベーショ全光子数を測定して、混合物中の
エクオリン活性を求めた。タンパク質はブラッド７オー
ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ）アラ七イ（Ｂｉｏ Ｒａｄ
）？用いて測定した。 第７表には、ｐｋＥＱ７及びｐＡＥＱ８含有株の６つの
抽出物、：２ントｐ−ル大腸菌株（８に１５９２）及び
ｐＡＩｉｔＱ１含有株の抽出物から得られた結果が記さ
れている。 第７表 ｐＡＥＱｌ 、 ｐＡＢＱ７及びｐＡＥＱ８
を含む大腸菌中のアポエクオリン発現レベル インキエベー 比活性（光 充電効率１％ 充電効率２
０チプラスミド シ１ンｍ寺間 ７数４１１） と仮
定 と仮定ｐＡＥＱ７ Ｇ ＜α
０２ − ０１ （０，０４−０ ２≦α０２ − ０ ｐＡＥＱ８ ０ ０．６６８ α０４２
（１１）” α００２ （１０）１ １７．２
１Ｏ７（２６８） ０．０５ （２６１１）
２ ３＆４ ２．４０ （６００） ａ１
２ （６０Ｇ）ｐＡＲＱｌ α０
６１ α００４ α０００２株 ８に１５９２ ０ − ０
（＊ カッコ内の数字はｐＡｇＱｌ ｔ−含む抽出物に
於いて観察される活性の何倍になるかを示したもの。）
これら抽出物中のエクオリン活性レベルはルシフている
。粗抽出物に於ける充電効率を定量化することは不可能
である。エクオレ７から単離したアポエクオリンを用い
た場合に観察される充電効率は２０％以下であシ、大腸
菌抽出物中ではこの効率は多分幾らかそれエフ低いもの
であろう。従って、充電効率１ｑｂ及び２０−を基に計
算した値を求め７ｔ。 エクオリン遺伝子１ｐＡＫＱ８と反対方向の配向で含ん
でいるｐＡ１１Ｑ７からはエクオリン遺伝子の誘導が観
察されなかつ九。 このデータは、ｃＤＮＡヌクレオチド配列が誘導プ四モ
ーターの３′に適切に位置していればＪアポエクオリン
の発現レベルは顕著に増大し得るということを示してい
るものである。 （以下余白） 実ｍ例５：％定のアポエクオリン遺伝子の構造決定 第２図に示した、プラスミドｐＡ］！ｔＱ１． ｐＡＩ
ｔＱ７お工びｐＡＦＸＱ８の中に存在するＰｓｔ ｌ
−Ｐａｔ Ｉ断片の構造を標準的遺伝子配列解析法に１
って決定Ｌ７’ｈ。３′末端から６９個のヌクレオチド
は翻訳されない。翻訳領域が発現されると、実施例１に
記載した方法で単離したタンパク質（アポエクオリン）
のＮ末端に７個のアミノ酸残基が付いたタンパク質が発
現される。この実施例１で得られたタンパク質のＮ末端
はＶＡＬで始まる。この余分の７個のアミノ酸残基は実
施例１の単離工程の間にプロテアーゼに工って切シとら
れるのであろう。 ＰＲＯ’ｉコードしている〇−末端コトンの次には停止
コドンがあシ、その後１２個のヌクレオチドが続いてい
る。これは明らかに単離されｆｔ−ｃＤＮＡが完全長（
ｆｕｌｌ −ｌｅｎｇｔｈ ）であることを示している
。 全二本鎖ＤＮＡとアミノ酸配列は次のとおシである。 耐″ｒｏＣム■轟ム偽龜ａ！賜ムπ爾関Ｔ−↑ム讃繊掴
πｃｃμ（９）臨＠ＡＡ ＡｃｏＴＯＯＴＴＴ 判Ｔ
ケ＠ＴＡ ＯＴＴ ？ＡＧ ＭＸＩ ？ＩＪ ＡＣ？
Ａ胃ＴＯＡ ＴＴＴ ＡＧＯ１０００Ｔ？ ＧＣＣＯＴ
Ｔ冨ｒ ｔｍ ｓｍ ｏｕｔ ｉｔｓ ｔｎ ｓ−マ醋
、ムｎ Ｘａ ｍ ＦＩＯＡＭＰ ＰＩＥＩ ＡＳＰ
Ａ１１ｌ ＦＩＬＯｃａｏ ＧＣｃ ＡＡＩ！ ｉｔｓ
ＡＣ（ｊ ＭＩＣＯＡＡ （ＪＡ １Ｍ２ ？ｅＡ
ＱＴＯＡＡＱ Ｃｎ ＡＣＡ ＣＯＡ ＧＡ（！ Ｔ”
Ｎ： ＯＡＣＡＡＣＣＣＡａｔｅ ｃａｏ ＴＴａｔｍ
ｔｏｏ ｔｅａ ｃｗｔ ａｒｔムＴｏ ＡＯ？ Ｃ
ＡＯ’ｎｅ ＯＡＡ ’ＮＷ ｆＮＴ Ｃ！’１’ＯＡ
ＡＯＣ’ＮＩ ？ＴＯＧｏｔＬＴＩｆｆｒＩＬ諺ａｔ、
ｙＡＩＩＱｉｔｓｔｙｓｉｔｓＷＰＩＥ■ムａｔＰｉｌ
ｌｕσＡＩＩＰＶムＬＡｌｌｉｌｌＡＩＲＯＩＪＡＲＯ
ＡＡＡ ’ＨＡ ＡＴ？ ＯＯＡ ＯＧＡ ＣＡＣＡＩ
ＭＩ ＣＡＣＡｆｆ’ｌｌ ＴＴＴ ＡＡ？ ＴＴＴ
ＣＴ’ｒ ＧＡＹ ＯＭ ＡＡＣＣＡＣＡＡ？ ０ＩＩ
ＩＡ ＡＧＯｆｆｒＡＣＣ？ＡＡｅ！！’ｒＱＣテ０Ｔ
ＯＴ’Ｎ２ＧＴＯ？ＡｃＡＡＡｆｆＡムＡＡＯＡＡｅｒ
ムＣ＾ＱｔｗｏａｔｅｔｒムｃｃｔｔｃｃＩＬＩ ａｎ
Ｌｌｌｌ ＡＳＰ ０ＬＩＩＩ ｋｗｒｑｔｍ ｒｒ
ｍ ｈｙ＊ ムムムａｍ ＡＩＰ ｎａ ＹＡＬ
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！ Ｔ（！Ｔ Ｃｎ Ｏｌｏ ０ｍ ＡＴＯＯＴＣ？Ａ
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Ｃ’ｆ＠ Ｑ）ｅ ｅｒｒ ＴＯＡ ＯＡＣｏｖａ この同定され九配列が示していることは、この配列の中
では微不均−性のいろいろな位置に主要アミノ酸（ｐｒ
ｌｎｃｉｐａｌ ａｍｉｎｏ ｗｅｌｄ ）と少数アミ
ノ酸（ｍｌｎｏｒａｍｉｎｅ ａｃ４ｄ ）の双方が含
まれているので、表３に示した変異形からどのアミノ酸
配列を選択しても活性なアポエクオリンが得られるとい
うことである。 したがって、同じようにして様々なペプチドをコ本明細
書中に開示した一般的な配列で表わされ、多少の変異を
示す（したがってアポエクオリンの生物活性を有する）
他のペプチド、ＤＮＡ分子、ベクター等に関して前述し
た議論は、本実施例に開示し九特定の配列にも等しく適
用できる。本実施例では特に１つのペプチド、これをコ
ードしているＤＮＡ配列、および２個の制限部位の間の
完全長ＤＮＡ配列を開示し次。コードＤＮＡ配列（任意
に末端停止コドンを含んでいても工い）は、完全長のＤ
ＮＡ配列とは別の実体として明らかにされ、その変異形
も含めて全長ＤＮＡ配列とは切り離して考えられる。二
本鎖ＤＮＡとして開示されたいずれのＤＮＡも、この二
本鎖ＤＮＡｆｃ形成する個個の１本鎖ＤＮＡお工び転写
によって得られるこれに相当するＲＮＡ１開示している
ものと考えられる。 上記実施例のベクターと宿主は本発明の好ましい態様の
いくつかで用いられるが本発明はこれらの実施例に開示
された特定のベクターや宿主細菌に限定されるわけでは
ない。使用した細菌とプラスミドは全て、バイオテクノ
ロジー分野の当業者が様々な起源から容易に入手できる
。たとえば、大腸菌（旦、蝦））ＪＭ１０５とプラスミ
ドｐＵＯ９お工びｐＢｎ３２２は米国０８８５４ニユー
シヤーシー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ） 、 ピスカ
タウエイ（Ｐｌａｃａｔｍｗａｙ）。 センテニアル アベニュー（０ｅａｔｅｘｎ１ａｌ Ａ
ｖｅｎｕｅ ）８０Ｑのビー、エル、バイオケミカルズ
社（Ｐ、 Ｌ。 ＢＩｏｃｈｅｍｌｃａｌｍ、 Ｘｎｃ、 ） （これは
ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｙｓ、 Ｉｎｃ、 ）
の一部門である〕から市販されてお９、そのカタログで
はそれぞれ第２７−１５５０−０１，２７町４９１８−
ＯＸおよび２７−１７５０−Ｏｆとされている。さらに
、本発明の実施に使用することができる上記やその他の
微生物とプラスミドは、米国２０８Ｂ２メリーランド（
Ｍａｒｙｌａｎｄ ） 、ロックビル（ｌ１ａｃｋｖ…
ａ）ｅパーク四−ン ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗａ Ｄ
ｒｉｖａ ） １！３０１のアメリカン タイプ カル
チャー コレクシ冒ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
０ｕｌｔｕｒａ ０ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）からも入手
できる。代表的なものとその寄託番号吋大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）８に１５９２（ＡＴＯＯ４８５１０６）、大腸
菌（旦、臼■）ＪＭ１０５（人Ｔｏ０ ４１１３０９）
、ｐＵＯ９（ＡＴＯＯ／１６３７２５２＞、ｐＢＲＬ２
２（人Ｔｏｏ ／１６３１３４４）である。 以上本発明の詳細な説明したが、本発明の思想と範囲を
逸脱することなく多くの変更や修正ができることは当業
者には明らかであろう。 ４、図面の簡単な説明 第１図はオワングラゲから単離し次ポリ（ム）ＲＮＡｔ
用いてインビト四で翻訳したオートラジオグラフィー分
析結果を示す写真でアシ、第２図（ａ）はエクオレア
ビクトリア（ト型五↓ｖｌｃｔｏｒ１暑 ）グラフから
単離し九アポエクオリンをコードしているＤＮ人配列を
含有する遺伝子の制限地図であル、 あり、 第３図はｐＡＩＱ１抽出物中のＯａ −依存性発光タ
ンパク質活性の時間と酸素に対する依存性を示すグラフ
であり、 第４図はｐＡＩｉＱ１抽出物で現われるＯａ −依存
性発光タンパク質活性のゲルー過の結果のグラフである
。 ・代理人 ｆＰ哩士川用 口 ｆ１１ｓ１１Ｑ浄ＩＦ
（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １
記実施例は本発明を示すものであって、本発明を限定す
るものではない。 オグラフイー分析した結果を示す写真である。翻訳は、
オワンク−）ｒ ポリ（Ａ”）ＲＮＡの非存在下（レー
ン１）、存在下（レーン３）で行なった。２種の反応か
らの抗エクオリン免疫沈降夕／バクを夫々、レーン２お
よび４に的イた。図の右側に、タンパク分子量標準のホ
スホリラーゼｂ１Ｂ Ｓ Ａ、卵アルブミン、炭酸脱水
酵素、５ＢＴ１およびリソチームの位置を示す。天然エ
クオリン列＝冨≠本＝≠を含むオヮンクラｒ（位は凹二
遅ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ） から単
離した遺伝子の制限地図であ〕、第２（ｂ）図は、 ｌ
ａｃプロモーター中 参与下流でシラスミドに挿入された第２（ａ）図のセグ
メントの制限地図である。 第３図は１．ＡＩｅＱｉ 抽出物中のＣａ ２ ＋−
依存性発光タンバク活性の時間および酸素依存性を示す
グラフである。使用した条件は次の通シである。 （ａ） 曲’ｍ１および２では、活性画分０．５ｄを
β−メルカプトエタノール中＄ｉｍＭおよび腔腸動物の
ルシフェリン牛零０．１ ｍＭに調製し、４℃でインキ
エベートした。適当な時間間隔で５μＬを抜き取シ、発
光タンパク活性を調べた。 た。 （ｃ） 曲線３では、ｐＡＩｉｉＱｉ抽出物の代シに
培養混合物中に天然アポエクオリンを用いた。 第４図は、−１Ｑ１抽出物から生ずるｃａ２＋−依存性
発光タンパク活性のｒル濾過プロフィール載したよう７
；Ｃａ２＋−依存性発光タンパク活性を発生させた。次
いで、この発光タンパク両分（５０ｄ ）を、１０
ｍＭＥＤＴＡ、 １５ ｍＭ Ｔｒｉ８ｐＨ７，５お
よび１００ ｍＭＫｃＩ−を用いて平衡化させたＧ−７
５−４０スーパーフアイン（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）力２
ム（ペラＰ容量３０．７ｄ）に充填した。各種分子量標
識物質の溶離位置を示す。 好ましい具体例の記載 これによシ、均質なアポエクオリンの入手が可能となる
。この情報を用いて、適量の均質アポエクオリンを入手
することができる各種組換えＤＮＡベクターが得られる
。一般的な組換えＤＮＡ技法技術の例として産生された
。 アポエクオリンのアミノ酸配列を表３に示す。 表 ３ （８）−：： （ＤＣ＞＋ （ａ）ＶＫＬＴＰＤＦ
ＮＮＰＫＷＩＧＲＨＫＨＭＦＮＦＬＤｖＮＨＮＧＫｌ
１０ ２０
３０ＩＳＬＤＥＭＶＹＫＡＳＤＩＶＩＮＮＬＧＡＴＰ
ＥＱＡＫＲＨＫＤ（匂 （ＩｉＪ …） ＡＶＥＡＦＦＧＧＡＧＭＫＹＧＶ’ＫＴＤＷＰＡＹＩＢ
’ＧＷＫＫＬＡ（Ｃ） ＠ 艶）（１３）＠（ＬＪ （Ｖ）Ｔ
ＤＥＬＩＩｉＫＹＡＫＮＱＩＴＬ４ＲＩＷＧＤＡＬＦＤ
ＩＩＤＫＤＱ’ｆ’１００ （Ｐ） １１
０ １２０（功 囚 （
８） （ＤＪＶＣＤＸＤＢ！８ＧＱＬＤＶｔ）ＥＭＴ
ＲＱＨＬＧＦＷＹＴＭＤＰＡＣ１６０１フＯ１８０ ＥＫＬＹＧＧＡＶＰ−Ｃｏｏｌ 括弧内の文字で示す。表示したアミノ酸置換全てで生物
学的機能性を有するエクオリンを表わす。 上記配列中の文字に対応するアミノ酸は次の通シである
。 Ａ：アラ二ノ、 Ｃニジスティン、 ゛Ｄ：アスパラギ
ン酸、 Ｅ：グルタミン酸、 Ｆ：フェニルアラニン、
Ｇニゲリシン、 Ｈ：ヒスチジン。 Ｉ：イソ、ロイシン、 Ｋ：リシン、 Ｌ：ロイシン、
Ｍ：メチオエン、 Ｎ：アスパラヤン。 Ｐ：ゾロリン、 ｑ：グルタミン、 Ｒ：アルギニン、
８：セリン、 Ｔ：トレオニン、 ｖ：バリン、 Ｗ
ニトリシトファン、 Ｙ：チロシン、ペプチドのアミノ
酸とペプチドをコードするＤＮＡ配列との間に明確な対
応関係があることは知られているので、アポエクオリン
（或いは後記易に銹導され得る。アポエクオリンＤＮＡ
の一本の鎖のヌクレオチド配列を表４に示す。表中、数
字ではりが′ｒｉと代わっている点を除いてＤＮＡ配列
はｍＲＮＡ配列に対応している。 （以下余白ｐ −６＆４の −＠ ｂＪ ｓｒ ｓｌ−Φ−・−
Φ−＠（ｇｏ ｈ＜ −ｏ ａｈ〉＜ のｏ
＜＜ ｈ＜ ＋Ｊ＜ ＜ｅ ＞ｈ−ω シｈ
＠−−φ −一１ｌｏ−〇關Φ閃 ｓ＜ ｈ６
Φ匡 −Ｅ、 １．＋６ にＩＥ、ＩＣ
０ＣＦ ６６ Ｃ）Ｅｍ のａ ＞６＜ＦＩ
Ｇ’＋ｈ″−りｈｓＰＩ−りｈ −關−−トー Ω３ ＝ご ５七 ｇご 二１ ＝ミ ；８・ト ―ヘ
−リ ）＜ ６６ ６０ 遺伝子のＤＮＡ配列は十分に同定されているので、ＤＮ
Ａ遺伝子を全くの化学的合成によって産生ずることがで
きる。その後、遺伝子を公知の組換えＤＮＡ技法を用い
て多くの入手可能なりＮＡベクターに挿入することがで
きる。従って、本発明は、本願出願当時一般に自由に入
手できる試薬、シラスミドおよび微生物を用いて実施さ
れつる。 例えば、塩基長さが１００以上のヌクレオチド容易に合
成されつる。 な右同装置については、例えばジエネテイツクエンジニ
アリングニュース（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｑｅ−
ｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ）、ＮｏＶ ／ Ｄｅｃ、 １９８
４ ｐ、３に広告されている如く周知のものである。前
記オリｊ”ヌクレオチドを後記する技術を用いてスプラ
イスすると本明細書に記載されているヌクレオチド配列
が得られる。 更に１本明細書に記載されているペプチド類を容易に直
接合成し５る自動化装置も入手可能である。上記ジエ木
ティック エンジニアリング ニュースの同じ号には、
９９％を超える結合効率を有する市販の自動ペプチド合
成装置の広告が掲載されている（ｐ、３４）、前記装置
を用いると、直ドを簡単に得ることができる。 表３に示した特定のペプチド配列の他に、これらの配列
をペースとし僅かな変更を加えた他のペプチドもアポエ
クオリンの生物学的活性を有する。 例えば、配列末端の一方もしくは両方から最高１５個の
アミノ酸が欠けていても、ルシフェリンおよびカルシウ
ム結合能は失なわれない。同様に。 末端の一方もしくは両方に最高１０個のアミノ酸が更に
付加されていてもよい。こうした変更（修正）は、ルシ
フェリンおよびカルシウム結合部位央 −Ｈ が上記配列の真裏中のアミノ酸にあるから可能なのであ
る。例えば、アさノ酸４０−１００にルシフェリン結合
部位があるようである。末端は生物学的活性に比較的重
要な影響を及ぼさないので。 付加アミノ酸の本質は重要でなく、かつ上記アミノ酸の
いずれでもよい。 アミン末端の付加アミノ酸が生物発光に大した影響を有
しないことを立証する実験データもある。 しかしながら、上記した特定式により極めて近似し、４
Ｉｈれかの末端の１０個あるいはそれ以下好ましくは５
個あるいはそれ以下のアミノ酸を欠（か、もしくはいず
れかの末端に７個あるいはそれ以下、好ましくは４個あ
るいはそれ以下のアミノ酸が付加されている化合物が好
ましい。 分子の中央部分のアミノ酸を置換することは、生物学的
活性を維持するためにより限定される・しかしながら１
表３またはＩＲ４に示した微不均−性の全ゆる部分が生
物学的機能を有する置換な示し、指示した置換ｔ）１ｆ
ｌｘｉが組合墳αも機能性分子の位置でより広く用いら
れているアミノ酸またはヌクレオチドを示しより好まし
いものである。 更に前記ペプチドおよびＤＮＡ分子を僅かに変更させた
ものも、当業者には明らかなように＊ね・ 秒勾壕！
ｒ詳細ｊ＄蓮びゐダボ冷ギ゛遺・ボバ゛ＤＮＡ分子と同
等のものとしてみなされる。例えば、特に置換が結合部
位のアミノ酸に関連していないならば。 ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン
酸をクルタ之ン酸で、トレオニンをセリンで単ＩＩＩ（
ｌ５ｏｌａｔｅｄ ）置換しても、或いはアミノ酸を構
造的に関連するアミノ酸で同様に置換しても得られた分
子の生物学的活性に重大な影響はないことは予想される
。機能性ペプチドに変化が生じるかどうかは得られたペ
プチドをルシフェリンとインキエベートシ１次いでカル
シウムイオンと分子構造（即ちアミノ酸もしくはヌクレ
オチド配列）が同一であることを意味する。前記した＠
実質的に”という用語は少なくとも９５重量％、より好
ましくは少な（とも９９重量％、最も好ましくは少な（
とも９９．８重量％を意味する。均質ペプチドあるいは
ＤＮＡ配列の全分子に由来する断片が存在する場合、そ
のような断片が５重量％以下、好ましくは１重量％、よ
り好ましくは０．２重量％以下存在しているならば均質
性（ｈｏｍｏ＆ｅｌｔｙ）を調べるときに考慮しなくと
もよい、何故ならば、（天然アポエクオリン中に存在す
る混合物のようＫ）主喫苓牢升ｔ「びヰ分子構造が異な
る分子量の類似した幾つかの分子が存在する混合物とは
対照的に、単一の一定した構造を有する全分子（および
その断片）の存在を１均質”という用語が指しているか
らである０本明細書で使用した１単離されたＣ ｌ５ｏ
ｌａｔｅａ ）’という用語は、夫々他のペプチド類、
ＤＮＡ類またはＲＮＡ類から分離されかつこの生化学的
溶液中に通常存在する溶媒、緩衝液、イオン或いは他の
成分のみの存在下でみとめられる純粋なペプチド、ＤＮ
Ａ或いはＲＮＡを指す、′単離された”の中に、天然の
（ｎａｔｉｖ・）状態の天然物質、或いは（例えばアク
リルアミドゲル中で）成分に分離さん玉純粋な物質また
は溶液として免優呂水はｔｎｌない天然物質は含まれな
い０本明細書中１純粋”という用語は上記した１実質的
に”と同じ数値制限を有するのが好ましい１本明細書中
１・・により置換されゑ”或いは１置換”というフレー
ズは、指示した１置換”アミノ酸が別の式中に存在する
ことが指示されているアミノ酸と同じ位置に存在する場
合（例えばセリ指すとは限らない・ 本明細書に記載のペプチドの塩類とは、該ペプチドが各
種ＰＨの水溶液中に存在する（或いは前記水溶液から単
離された）ときに天然に存在するカルボン酸残基のアル
カリ、アルカリ土類および他の金属塩、アミノ残基の酸
付加塩（例えばＭＣＩ＞および同一分子内のカルボン酸
残基とアミノ残基との反応により形成される両性イオン
が例示される・ これら全ての変種も特に開示されたものとみなされる。 られ、ＤＮＡ遺伝子の構成に使用される。続いて前記Ｄ
ＮＡ遺伝子を用いて本発明ペプチドが産生される。 オワンクラゲの光発光器官からの細胞抽出物を使用する
ことが好ましい、ただし、全体細胞抽出物を使用するこ
とも可能である。典屋的には、クラゲまたはその一部を
小片に切断しく切り刻み）、小片をすり砕して初期の粗
細胞懸濁液を形成する。 細胞懸濁液に音波処理あるいはその他の処理を加えて細
胞膜を破壊し、粗な細胞抽出物を得る。所望により、公
知の生化学的手法（例えばタンパクの選択的沈殿）を用
いて初期精製することもできる。粗の細胞抽出物あるい
はそれからの部分精製ＲＮＡ部分を処理して更にＲＮＡ
を分離する。例えば粗な細胞抽出物を、１インチ×３・
５インチの二トロセルロースチェーブ中のｓ、 ？ Ｍ
ＣｓＣ１。 １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ 、 ｐＨ７，５、１ｍ
ＭＥＤＴＡエア）を用いて１５℃、２７０００ｒｐ”で
１６時間遠ントし、チューブから水を流去させ、澄明な
ＲＮＡペレットを含む底５４ａａをレーザー刃で切断す
る。 ペレットをフラスコに移し、 １０ ｍＭＴｒｉａ−Ｈ
ＣＩ。 ｐＨ７Ｊ 、１ｍＭＥＤＴＡ、５％サルコシ＃（ｓａｒ
ｃｏｓｙｌおよび５％フェノール２０ｗ１中に溶解させ
る０次いで溶液なＮａＣ１１卒で０．１Ｍに調整し、フ
ェノール−クロロホルム混合物（１：１）４Ｇ−を加え
て振盪させろ。ＲＮＡが、０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
ｓ、ｓの存在下でエタノールを用いて処理すると水性相
から沈殿し、これを遠心分離により回収配列および分子
サイズの点で不均買なポリアデニル化された、粗なある
いは部分的に精製されたｍＲＮＡのような各種形態のＲ
ＮＡも使用されうる。ＲＮＡ単離方法の選択性は、単離
されたｍＲＮＡの不均一分散相中に所望のｍＲＮＡを多
く（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ）を招かなければ、本発明の遺伝子の作成にどんな
精製方法も使く 配での調製用沈降法およびゲル電気泳動法が特に適当で
ある。 クレオチド配列を加水分解する能力を有している法とし
ては、細胞破壊段階で４Ｍグアニジニウムチオシアフー
トおよび１Ｍメルカプトエタノールを使用することが適
当である。加えて、単離されたＲＮＡのＲＮａａｅ分解
を抑えるには低温度および５．０に近いｐＨが有用であ
る。 −投に、ｍＲＮＡは汚染メンバク、ＤＮＡ、ポリサッカ
ライドおよび脂質な本質的に含まずに作成される。この
ように精製するだめの標準的な方法は当業界で公知であ
る。こうして単離されたＲＮＡは非メツセンジャーおよ
びメツセンジャーＲＮＡを含む。真核生物のｍＲＮＡを
分離するには、真核生物ｍＲＮ Ａの３′末端にポリア
デニル酸が存在するためにもたらされる水素結合特異性
を利用して、オリゴ−ｄＴセルロースあるいは他のオリ
ゴヌクレオチド置換カラム材料例えばポリＵ−セファロ
ースのカラムを用いるクロマトグラフ配列に相補的なり
ＮＡを形成することにある。この反応のために原則的に
はｍＲＮ Ａ １ｍ型の相補的ＤＮＡコピーを正確に形
成しうる酵素であれば使用し５るが、逆転写要素が選択
される。反応は先行技術に記載された条件下で、鋳型と
してｍＲＮＡおよびＤＮＡ鎖の前駆物質として４ｓのデ
オキシヌクレオシド トリフオスフェート、即ちｄＡＴ
Ｐ 。 ｄＧＴＰ 、ｄｃＴＰおよびｄＴＴＰの混合物を用いて
実施される。反広過程ｆｈ：％エターし、りａ２トゲる
目的で、デオキシヌクレオシド トリフオスフェートの
１糎のアルファ位を放射性同位元素例えば１Ｐで標識す
ることが好都合である。上記したエフ ストラテイアデ
ィス、ニー（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ ＊Ａ、）らの
文献を参照されたい。 逆転写酵素反応により生成されるｃＤＮＡ転写物は、ｍ
ＲＮＡｎｆｆ１に対する各転写物の開始点および終結点
が異っているために５′末端並びに３′末端の配列が幾
分異質である。５′末端の変異性は、合成を開始するた
めに使用されるオリゴ−ｄ”ＦプライマーはｍＲＮＡの
ポリアデニル化領域に沿った各種地点で結合し得るため
と考えられる。 ｃＤＮＡ転写物はボＩＪ −Ａ領域の中間点で合成が″
開始むｔ各穏長さのポリーＡ領域がオリゴ−ｄＴプライ
マーの初期結合サイトに応じて転写される。 この不確実性は、オリゴ−ｄＴ）ラクト（ｔｒａｃｔ
）に加えてＲＮＡ配列それ自体のヌクレオチド１４毘あ
るいは２個を含むプライマーを使用すれば避けられ、転
写反応を開始するのに好ましくかつ一定の結合サイトを
有するプライマーが生成される。 ｃＤＮＡ転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ）の３′末端
の不確実性は、逆転写酵素反応に影響を及ぼす各種因子
およびＲＮＡＭ屋の部分的分解の恐れによるも好都合で
ありＤＮＡ短鎖の合成を抑制するように選択すれば極め
て容易に単離される。ト、す骨髄芽球症ウィルス逆転写
Ｗ＃素のための好ましい反応条件は、米国特許第４，３
６３，８７７号明細書の実施例に記載されており、前記
明細書は本明細書中に援用される。長鎖ＤＮＡ転写物を
高い禮笑度で最大よび反応時間である。 温度および塩濃度条件はニオリゴーｄＴプライマーとＲ
ＮＡ鋳童のポリアデニル化部分との間の特殊な塩基対合
（ｂａ８・−ｐａｉｒｌｎｇ）を最適にするように選択
される。適切に選択された条件下で、プライマーはＲＮ
Ａ＃ｆｆｉのポリアデニル化領域で結合し、短かいＡ−
リッチ配列のような鋳箆上の別の位置でのプライツー結
合による非特異的開始反応は実質的に避けられる。温度
および塩濃度の影響は相互依存性である。温度を高くし
塩濃度を低（すると、特異的な塩基対合相互イ苓用の安
定性が低下する。反応時間は、非特異的開始反応を回避
しかつ分解の機会を最小限にするために出来る限り短（
保たれる。反応時間は温度と相関関係にあり、温度が低
ければ反応時間は長時間を要する。 ４２℃では１〜１０分の反応時間が適当である。 プライマーはＲＮＡ鋳聾に対して５０〜５００倍そル過
剰に存在させなければならず、酵素もＲＮＡ鋳箆に対し
て同様にモル過剰で存在させなければならない。過剰の
！！ｊ累およびプライマーを使用すると開始反応および
ｃＤＮＡ鎖の成長が促進され、長鎖のｃＤＮＡ転写物が
限られた短いインキエペーション時間内に効率よく産生
される。 多（の場合、ｍＲＮＡから転写された一本鎖ｅＤＮＡを
使用して該ｃＤＮＡをさらに精製することが可能であろ
う。しかし下記に論するように、所望の制限酵素が２本
鎖ＤＮＡに対してしか作用しない場合がある。この場合
、前記のようにして調製されたｃＤＮＡは、例えばリバ
ーストランスクリプターゼのようなりＮＡポリメラーゼ
及び１本鎖ＤＮＡを加水分解できるヌクレアーゼを使用
して、２本鎖ＤＮＡ合成用の鋳型として使用できる。こ
の方法による２本鎖ＤＮＡの調製方法は先行文献に記載
されている。例えば、ウルリツチ（Ｕｌｌｒｉａｈ ）
、 Ａ、、シャイン（５ｈｉｎｅ ） 、 Ｊ−、チ
ャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｌｎ ） 、 Ｊ、 、ピ
クテット（Ｐｌｃｔｅｔ） ｅＲ，＊ティシエー（Ｔｉ
５ｃｈｅｒ ）、Ｅ、。 １３１３（１９７？）を参照されたい。必須ではないが
所望により米国特許第４．３ ａ ３，８７７号の方法
によりｃＤＮＡを更に精製することも可能である。 この方法においては、不均−ｍＲＮＡ配列のＩｌｌによ
り調製された不均−ｃＤＮＡを、１種あるい単離ｅｔｇ
Ｊｓ ｃ Ｄ Ｎ Ａ配列中に存在する酵素認識部位の
予備測定に依る。ｊ方法は２つのそのような部位の存在
に−ｍｆ１−６で紅ゐ。該部位が同一である場合、一つ
の５１素で十分である。所望配列は両部位で開裂され、
所望ｃＤＮＡ配列に関する限りす＃−４：る。制限部位
が異なる場合は、所望の長さの均一なフラグメントを生
成するために２つの酵素が必要である。 限＃累の選択は経験的に成されなければならない。 所望のタンパク質のアミノ酸配列が既知である場較する
ことができる。しかしながら、部分的な配列に基いて必
要楊度に正確な同定ができる。嘘キ亭ので、所望タンパ
ク質の完全なアミノ酸配列は必によって生成された統−
長のポリヌクレオチドは、適当ｒ！ｉｎヱＬは互のタン
パク質合成系において所望タンパク質の合成を検知し得
るプローブとして使用し得る。１ｒ２１：Ｊｔ’３、ｍ
ＲＮＡはアフィニティークロマトグラフィーにより精製
し得る。当業者により考えられ得るその他の技術も本目
的に適当な４巳 使用するか２本鎖ＤＮＡを使用するかに依る。好ましい
Ｗｌ、素は一本鎖ＤＮＡに対して作用できるものであり
、−重鎖ＤＮＡはｍＲＮＡ逆転写の直接の反応生成物で
ある。現在知られている一本鎖ＤＮＡに作用し得る制限
酵素の数は限られている。 ！！ｌ ｇＨａｓ ｍ 、 Ｈｈａ Ｉ及びＨｌｎ（ｆ
） Ｉが現在知られている適したものである。さらに、
ｍＲｈｍｙｏＴｌも一本鎖ＤＮＡに作用し得る。さらに
研究されて他の制限酵素が一本鎖ＤＮＡに作用し得るこ
とが判明し′ｒｃ叫場合は、そのような酵素も好ましい
酵素の一端に加えられるであろう。２本％ＮＡに特異的
なものも適した酵素に加えられる。このようなｌ５ｉｌ
！は、２本鎖ｃＤＮＡを生成するために付加的な反応を
必要とし、長い配列のロス及び不完全な回収によるその
他のロスの機会を増加させるので好ましくない。二本鎖
ｃＤＮＡを使用すると更に、事後の配列分析がより複雑
で労力を要するとい５技術的不利を招（。これ等の理由
から一本鎖ＤＮＡが好ましいが、２本鎖ＤＮＡの使用も
可能である。実際、本発明は当初２本鎖ｃＤＮＡを用い
て実施されたものである。 制限エンドヌクレアーゼ処理のために調製されるｃＤＮ
Ａは、放射活性標識をして後の分離段階で検知し得るよ
うにしてもよい。好ましい方法は３２Ｐのような放射活
性標識を４つのデオキシヌクレオシドトリフオスフェー
ト前駆体のうちの１つのα位置に結合するものである。 最高の活性は、放射活性前駆体の濃度が非放射活性形状
のものの度も、逆転写酵素反応において得られるｃＤＮ
Ａの長さを最大にするために３０８Ｍよりも太き（なげ
ればならない。エフストラテイアデイス（Ｅｆｓｔｒａ
ｔｉａｄｉ ｇ ）、Ａ −＊ マニアティヌ（？ｖＩ
ａｎｌａｔｉｇ）、Ｔｏ、カファトス（Ｋａｆａｔｏｓ
）、Ｆ、Ｃ，、ジエフリ−（Ｊｅｆｆｒｅ）’ ）、Ａ
、及びボーナキｘ （Ｖｏｕｙｎａｋｉｇ ）、Ｊ、Ｎ
、、セル（Ｃｅｌｌ ） ４ 。 ３６７（１９７＄）を参照されたいｅ ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列をに葡する目的で、ポリヌクレオチドキナ
ーゼｖ１．禦により触媒される反応におい曵ｓ２Ｐで５
′末端ｌｊｔ標識するのが便利である。マキザムＣムｘ
ｔｍ ） 、Ａ、Ｍ、及びギルバー） （ＧＨｂｅｒｔ
）、Ｗ、、ブロク・ナトル・アカド・スジ（Ｐｒｏｅ
、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ ７４，５６０（１９７
７）を参照されたい。 一つの制限酵素あるいは２つの制限ａＳの組合せの作用
により生成されヒフラクメントは、異なる長さに基いて
ポリヌクレオチドを分離できる何沈降法が含まれる。ゲ
ル電気泳動け、ポリヌクレ易である６便利な電気泳動法
がディングマン及びマニアナイス（Ｍａｎｌａｔｌｇ）
、Ｔｏ、ジエフリ−（Ｊｅｆｆｒｅｙ ）、Ａ、及びバ
ンドサンド（ｖａｎｄｅどは、制限エンドヌクレアーゼ
処理に先立ち、長さにおいて不均一分散であることが判
明するであろう。適当に選択された制限エンドヌクレア
ーゼあるいはエンドヌクレアーゼ対の作用により、所望
の配列を含むポリヌクレオチド鎖が各制限部位るバンド
を形成することが観察される。他の配列における制限部
位の有無により、他の分離したバンドが同様に形成され
得るが、それは所望配列のものとは異なる長さのもので
あろう。従って制限エンドヌクレアーゼ作用の結果によ
り、ゲル電気泳動パターンは１つ以上の分離したバンド
を見せるが、残りのｅＤＮＡは不均一分散のままになる
であろう。所望のｃＤＮＡ配列が、存在する主要なポリ
ヌクレオチドの種から成る場合は、電気泳動し）−一 パターンはｃＤＮＡの殆んどが分離バンド中に存在する
ということを示すであろう。 ２つの異なる配列が制限酵素により開裂されて殆んど同
じ長さのフラグメントな生成するということはありそう
にもないが、規定長のフラグメントの純度検定法は望ま
しいものである。電気泳動バンドの配列分析は、バンド
中の物質の１０％以上の不純物の砿舐には使用できる。 最初の華離方法に適用したのと同じ一般的原理に基いて
、低レベルの不純物を検知する方法が研究されて来た。 該方法においては、所望ヌクレオチド配列フラグメント
が最初の単離においては使用されｒｇｔ）＼な５制限エ
ンドヌクレアーゼに対するｌｌＥｗ＆部位を含んでいる
ことが必要である。ゲル電気泳動バンドから溶出された
ポリヌクレオチド材料を所望配列に内的に作用し得る制
限エンドヌクレアーゼで処理１、ｘｉ、所望配列が殆ん
どは非等長の２つのサブフラグメントに開裂さ■る。こ
れ等のサブフラグメントは電気泳動においてそれぞれの
長さに対応する位置に別々のバンドを形成し、それ等の
合計は開裂前のポリヌクレオチドの長さに等しいはずで
ある。制限酵素に対して敏感でない最初のバンド中の不
純物は最初の位置に移動するであろうと考えられる。前
記酵素に対する１つ以上のｓ！！！職部位上部位不純物
は２つ以上のサブフラグメントを生成すると考えられる
。ｉＩ識部位の分布は本質的にう生成する可能性は極め
て低い。放射活性標識ポリヌクレオチドバンドに存在す
る材料の量は、各バンドに存在する放射活性の量の定量
測定、あるいはその他の適当な方法により測定できる。 所望配列のフラグメントの純度の定量的測定は、所望配
列のサブフラグメントを示すバンド中に存在する材料の
量を材料総量と比較して得ることができる。 前記の分離、あるいは所望の遺伝子を単離するその他の
方法の後、該配列を再結合し得る。ＤＮＡフラグメント
の末端と末端との結合を触媒する酵ンデサンデ（Ｖａｎ
ｄｅ ５ａｎｄｅ ）、Ｊ、）ｆ、及びコラナ（Ｋｈ
ｏｒａｎａ ） 、Ｈ−Ｇ、 ｅプクク・ナトル・アヵ
ド。 スジ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ ）、Ｕ
ＳＡ ６エ、１４６８（１９）０）を参照されたい。 結合する配列が３’？４末端でない場合は、Ｅ−ｃｏｌ
ｌより得られたりガーゼが使用し得る（モトリッチ（Ｍ
ｏｄｒｔｃｈ）、Ｐ、及びレーマン（Ｌ＠ｈｍａｎ ）
、１．Ｒ，、ジエイ・バイオに一ケム（Ｊ、Ｂｔｏｌ、
Ｃｈｅｍ−）、２４５．３６２６（１９７０））。 制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたサブフッ
クメントからのオリジナル配列再結合の効率は、不適当
な配列の再結合を防ぐ方法を使用することてお（ことに
よって防止できる。酵素アルカリフォスファターゼか好
ましい。゛５′末端リン酸基は。 後の開裂サブフラグメントの再結合に使用されるＤＮＡ
リガーゼの結合作用において構造的必要条件である。従
って、５′−末端リン酸を欠（末端は共有結合され得な
い。ＤＮＡサブフラグメントは、単１ｍＤＮＡフラグメ
ントについて成される制限エンドヌクレアーゼによる開
裂によって生成される５ｔ−リン酸を含む末端において
のみ結合される。 体 上述の条件下では″”：’ＤＮＡ転１δ灸部分は、ｍＲ
ＮＡ領域！の５１−末端を含むｍＲＮＡ領域から同じ綺
麗にｉ’ｆｔｔ＞て制限エンドヌクレアーゼ開裂により
得られたフラグメントを特異的なプライマーとすること
によつ℃得られ；雰０で集る。この方′Ｍｔ＄Ｓ：ては
、前記の方法は、所望タンパク賞に関連する特異的ヌク
レオチド配列のフラグメントだげでな（、当該タンパク
＊Ｖコードした全ヌクレオチド配列を得るのにも使用し
得る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドリンカー
費あって、制限エンドヌクレアーゼのｌ！繊配列を有す
る２本錯離ｃＤＮＡの末端に付けて、後のベクターＤＮ
Ａからの遺伝子部分のｌ！ｌＩ票的除去を容易化１照さ
れたい。ベクターＤＮＡは適当な制限エンドヌクレアー
ゼによる処理により、連続ループから直鎖形状に変換さ
れる。それによって形成された末端はアルカリフォスフ
ァターゼで処理して５′−リン酸末端基を除去し、ベク
ターＤＮＡがＤＮＡリガーゼ反応において第１にアポエ
クオリンＤＮＡセグメントなりｉＪ太むことなしに連続
ループを形成しないようにする。リンカ−オリゴヌクレ
オチドを伴なうｃＤＮＡと処理済ベクターＤＮＡをＤＮ
Ａリガーゼ酵累酵素合し、ｃＤＮＡなベクターＤＮＡに
結合してｃＤＮＡを駁堪駄んで゛その中に有する組換ベ
クターＤＮＡの連続ループを形成する。プラスミドベク
ターを使用する場合、通常該閉鎖ループがバクテリアの
形質転換を行える唯一の形となる。形質転換とは、当該
分野で理解され本明細書でも使用されているように、微
生物のそれ自身の遺伝子展馳に細胞外ＤＮＡｔ’ｌｌＪ
ト込む工程を指すものである。閉鎖ループ形状のプラス
ミドＤＮＡは適当な環境条件下でそのように叙」声、迷
子細胞にも伝森移れる。その結果、プラスミドを含有し
その遺伝子デターミナントを持った新規なセルラインが
、１１ｉｔ立される。プラスミドの複製によりプラスミ
ド遺伝子がセルライン中に維持されΔ染台Ｇこの方法に
おけるプラスミドによる形質転換は、形質転換プラスミ
ドＤＮＡが閉鎖ループ形状であると蓋、ｌ’ＸＱに゛起
り、直鎖状のグラスミドＤＮＡを使用すると全く起らな
いか、あるいはまれにしか起らない。−組紐換えベクタ
ーが形成されると、適当な微生物の形質転換は単純な工
程であり、当業者に理解されるような適当な選択技術を
使用してアポエクオリン遺伝子を含む新規な微生物株を
容易に単離できる。 要約すると下記のようにして％Ａ！！１！Ｌ９μｍクラ
ゲから遺伝子情報を得、ｅＤＮＡに変換し、ベクターに
挿入し、宿主微生物の形質転換に使用し、アポエクオリ
ンを発現できる。 １、Ａ１５（ｌｕａｒｅａクラゲからポリ（Ａ＋）ＲＮ
Ａを単離する。 ２、 ｔｎ ’ｖｔｔｒｏで１水銀ｃＤＮＡを合成し、
その後逆転写酵素を使用して２重鎖ｃＤＮＡを合成する
。 λＳ１ヌクレアーゼにより１本鎖部分を消化する。 表ゲルロ過で２重鎖ｃＤＮＡをサイズにより分画化する
。 よダシ ５、床傭→ランスフェラーゼ及びｄＣＴＰを使用してｃ
ＤＮＡをティリンクする。 ６、Ｐｓｔ Ｉ Ｋ！’ｌ ｐＢＲ３２２ｔ−消化シテ
、夕ＡＳｉｊレトランスフエラーゼ及びｄＧＴＰにより
直鎖状ＤＮＡ１にティリングする。 ７、ｄＣ−ティリンクｃＤＮＡフラクメントとｄＧ−テ
ィリングｐＢＲ３２２をアニーりングする。 ＆Ｅ、ｃｏｌｉ ５Ｋ１５９２を形ｆｆ転換ｆる。テト
ラサイクリン１ｌｉＴｔ狂コロニーを選択する。 ９、アンピシリン感受性に形質転換されたものをスクリ
ーニングする。ｔｅｔＲａｍｐＳ＝ｙ ｏ ＝−は組換
えプラスミドを含有する。それ等を一８０℃を保存する
。 １αオリゴヌクレオチド混合プローブ（既知アミノ酸配
列より演鐸した配列を使用）１に放射活性で標識する。 ＩＬニトロセルロースフイルメー上でｊＦＮＩＩＡｅｑ
ｕｏｒｅａし、ＤＮＡ１にフィルターに固定する。 １λ”ｐｍｍオリゴヌクレオチド混合物をニトロセルロ
ースフィルターにハイブリダイゼーションさせる。）■
Ｐ−プローブは、エクオリンｅＤＮＡ配列を含むＥ、ａ
ｏｌ１組換欅組換ビスミドＤＮＡブリダイゼーションす
る。 １１過剰の３リープローブなフィルターから洗浄する。 からプラスミドＤＮＡを調製する０ １ａ ｌ ＊ ｐ −標識オリゴヌクレオチドをプラス
きドＤＮＡ（サザンプロット）にハイブリダイゼーショ
ンさせ、ハイブリダイゼーションを確認する。 １７、ｐＨ７，２のＥＤＴＡ含有バ含有バッフアール等
の組換体の抽出物を調製し、組換体忙エクオリンＤＮＡ
配列が含まれていることを示す。 腔腸動物ルシフェリン及びβ−メルカプトエタノールを
加え、−夜４℃にインキエベートして発現アポタンパク
質をチャージする。エクオリンアポタンパク質を発現す
る試料はＣａ の添加により青色光を発する。 上記に一連の工程を記載したが、遺伝子工学分野の技術
者の知識と前述したガイドラインを合わせれば所望の遺
伝子の単離及び組換ＤＮＡベクターでのその使用は容易
に可能であろうし、同じ結果が得られる他の方法も判り
、本発明の組換ＤＮＡベクターの調製に使用できるであ
ろう。 宿主中で再生成することが判明しているベクター１−選
択することによって形質転換宿主中にアポエクオリン遺
伝子のコピーを多数存在させ、外因的な挿入ＤＮＡ（例
えばｐＵ（：８、ｐｔａｃ １２あるいはｐＩＮ−ｍ−
ｏｍｐＡｌ 、２又は３）から多量のタンパク質を生成
する方法、あるいは公知のその他のペプチド発現増加手
段を用いてアポエクオリンの発現を増加させることがで
きる。 全ての場合においてアポエクオリンは、ＤＮＡ配列がベ
クターに機能的に挿入された時に発現される。「機能的
に挿入された」とは、当業者にはよく理解されるように
、辿疋な１８読棹置と配向にあるということを意鰍する
。典型的にはアポエクオリン遺伝子はプロモーターから
下流に挿入され。 その後に停止コドンが位置する。所望により後に開裂を
伴うハイブリッドタンパク質として生成し℃もそうであ
る。 る一般的方法に加えて、その他の公知の方法及びその変
形も本発明を実施するのに使用できる。特に、遺伝子工
学に関する技術は近年、研究開発が進んでいる。多（の
最近の米国特許に、本発明の実施に使用できるプラスミ
ド、遺伝子操作を受けた微生物及び遺伝子操作の方法が
開示されている。 例えば米国特許第４，２７３，８７５号はプラスミドと
その単離方法を開示している。米国特許第４．３０４．
８６３号は遺伝子工学によるバクテリアの生産方法を開
示しており、それによるとハイブリッドプラスミドを構
築し、バクテリア宿主の形質転換に使用している。米国
特許第４，４１９．４５Ｑ号は組換ＤＮｈＲＩＬにおい
てクローン化担体としてによって生成された
）１イブリツドヌクレオチドを開示して
いる。米国特許第４，４０３，０３６号は、多数のＤＮ
Ａセグメントフビーを含むプラスミドを生成するだめの
遺伝子特許第４，３５６，２７０号は組換ＤＮＡククー
ン化担体を開示しており、また遺伝子工学で使用される
多くの用語及びそこで使用される基本的方法を定義して
いるので、遺伝子工学分野において限られた経験しか持
たない者にとって特に有用な文献である。米国特許第４
，３３ ｇ、３３８号は融合遺伝子及びその製法を開示
している。米国特許第４．３４９，６２９号はプラスミ
ドベクター及びその製造と使用を開示している。米国特
許第４，３３２，９０１号は組換ＤＮＡに有用なりロー
ン化ベクターを開示していそこに記載された方法は、遺
伝子工学の技術者であれば本明細書に記載された本発明
を実施するのに容易に改変し得るものである。 これ等の特許及び本明細書で引用したその他の全ての特
許及び刊行物は、本発明の属する分野の技術者の技術レ
ベルを示すものであり、全て本明細書中にリファランス
として含ｙＪ、！Ａ−０本発明の内容は、エクオリンを
螢光免疫測定の研究あるいはその他のエクオリンを標識
として使工鼾 用するアッセイにおいて、エクオリンを制限を受けるこ
となく使用できるようになるという点において有意義な
ものである。生物発光アッセイにお？ｒ −Ｙノ けるエクオリンの使用方法は、同一出願人が１９８３年
１０月１３日に出願した出願番号５４１．４０１５号に
開示されており、本明細書にリフるいは他の宿主中の蚤
哄アポエクオリンの発現を１０（ｆる構築物４＼゛生成
する。さらに、アポエクオリンｅＤＮＡあるいはそのフ
ラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使
用することによって、他の生物発光腔腸動物及び例えば
イカ（軟体動物門）、魚（魚上絶）及び甲殻綱のその他
の生物に見られる構造的に関連する遺伝子を容易にクロ
ーン化できる。これ等の遺伝子の中には、ラミシイタケ
（Ｒｅｎｉｌｌａ）、スチラチューラ（Ｓｔ３’ｌａｔ
ｕ１ｍ ） 、ブチロサルカス（Ｐｔｉ １ ｏｓａｒ
ｅｕｓ ）。 つｉサボテｙ （Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ）及びア
カントプチラム（Ａａａｕｔｈｏｐｔｌｌｕｍ ）のル
シフェラーゼをコードするもの、更にヒドロ虫類のオペ
リア（Ｏｂｅｌｌａ）及び有橋動物のムネミオプシス（
飲億１見１０）及びウリクラゲ（Ｂ＊ｒｏｅ ）に見ら
れる発光タンパク質をコードするものが含まれる・ 本明細書に記載した原理に基いたオリゴヌクレオチドプ
ローブ及び変形ヌクレオチド配列を使用待される。その
ようなプローブは完全な配列よりもかなり短くてもよい
が、全長において少くとも１０のヌクレオチＶが必要で
あり、少（とも１４のヌクレオチドを有することが好ま
しい、それより゛長く、遺伝子の全長までのオリゴヌク
レオチドりまた有用なものである。ＲＮＡプローブ及び
ＤＮＡプローブとも使用できる。 使用においては、該プローブを検知可能なように１Ｉａ
Ｌ （例えば”Ｐ％ ”Ｈ％ビオチンあるいはトする
。１本鎖及び２本鎖のくハイブリダイゼーションした’
）ＤＮＡ（あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ）Ｙ分ｍｌ （Ａｆ
ｆｉ的にはニトロセルロースペーパーなるのに適したハ
イブリダイゼーション技術は公知のものである。 プローブは通常、容易に同定できるようにする検知可能
な標識とともに用いられるが、非標識のオリゴヌクレオ
チドも有用なものであり、竜方客へ１識プローブの前駆
体としても、２本鎖ＤＮＡ（あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ）
の直接検知を行なうゴヌクレオチドプロープ」という用
語は、ｓＲ及゛び非標識両方の形状のものを指すもので
ある。本明細書に記載したペプチド配列の４０から１１
０のアさノｍｌをコードする領域から得られたオリゴら
である。 におゆるプローブとして有用 ｌであると考えられるものである。 （以下余白） 表 ５ ｔｌｌ胞動物門（腔腸動物門） Ａ花火類（Ａｎｔｋｏｚｏ′Ｌ） つさシイタケ（Ｒｅｎｔ １１ａ） （ｓ １１ ）’
スチラチェーラ（坦ム五匡口） ブチロサルカス（Ｐｔｌｌｏａａｒａｕｓ）クミサボテ
ンｂ（Ｃａｖ＠ｒｎｕｌａｒｌａ）アカントプチラム（
Ａｃａｎｔｈｏ ｔｉ ｌｕｍ）Ｂヒドロ虫類ＣＨｙＪ
ｐｏｚｏｔ ） オワンクラ＄３（Ｍ１臼μ遍） オペリア（Ｏｂｅｌｌａ） ２有櫛動物門（Ｃｔｅ、１ｏｒｈｏｒａ）ムネミオプシ
スのｈ荘１蛙ｌ匡） ウリクラゲ（カ厖μ） １軟体動物門（Ｍｏｌｌ＝ｔｓｃｅＬ＞ホタルイカ’
（Ｗａｔａａｅｎｉｍ）本魚類（Ｐｒｓｃｅｓ） ネオスプベラス ミクロシール庫 （Ｎｅｏｓｃｏｐｅｌｕｓ ｍ１ｃｙｏｃｈｉｒ）ハダ
カイワシ（Ｄｔａｐｈｕｉ） アカンテフイラ エキシミア （Ａｅａｎｔｈｅ ｂ７ｒａ ＊ｘ１ｍ１ｍ）アカンテ
フイリア バーブレア （Ａｃａｎｔｈｅ ｈｙｒｉａ ｐｕｒ ｕｒｅ
ａ）オプロフオラス スビノサス＆ （ＯＰｌｏｐｈｏｒｕｓ ａｐｉｎｏｓｕｓ）ヘテロ
カルプス グリマルテイ （Ｈａｔｅｒｏｅａｒｐｕｓ ｇｒｉｍａｌｄｌｌ）へ
テロカルブス レビガタスａ （Ｈ＠ｔ＠ｒｏｃａｒｐｕｓ １ｅａｖｉｇａｔｕｓ＋
）システラスビス クリスタタ （Ｓｙｉｔａｌｌａｓ ｉｓ ｃｒｉｓｔａｔｍ）
システラスビス デビリス グナトボジア インゲンス （Ｘ）【 データに基いて構蓬フ■イー。その他の全てのものはル
シフェリン−ルシフェラーゼ交差反応並びに速動力学及
び生物発光の発光スペクトルの比較に基く。 ｂ ルシフェリンがＣＩ）と同一のものであるという付
加的な証拠は、（■）と同一のものであることが示され
た分離発光体に閏げる化学的及び物理的データから得ら
れた。 （以下余日） 腔腸動物量 ルシフエリν（１） 腔腸動物戯 オ午シルシフニリン（ｎ） これまで総括的に記述してきた本発明は、以下の実施例
を参照しながらより容易に理解されるであろう。これら
の実施例は単に詳細な説明を意図するのみであって、特
に記載のない限シ本発明を限定するものではない。 実施例１：天然エクオリンの精製 第２のグル濾過段階にセファデックスＧ−７５（スーパ
ーファイン）を用いること以外はプリンシス（Ｂ１１ｎ
ｋｓ ）等の方法〔プリンシス・ジエイ・アール（Ｂ１
１ｎｋｓ、 Ｊ、 Ｒ，） 、 ビーエイチ・マツチ
イングリ−（Ｐ、 Ｈ，Ｍａｔｔｌｎｇｌｙ ） 、ビ
ーｅアール・ジエウエル（Ｂ、λＪｅｗｅｌｌ） ｅ
エム・ファン・ルーヴエン（Ｍ、 ｖａｎ Ｌｅｅｕｗ
ｅｎ ） 、ジ−１シー０バー′ア（Ｇ、 ０． Ｈａ
ｒｒｅｒ）及びデー・ジー・アレン（Ｄ、 Ｇ。 に１ｅａ）＋メツド・エンザイモロジー（Ｍ６ｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏ１． ） 、 ５７巻、２９２−３２
８頁（１９７８年）〕に従ってエクオリンを精製した。 エクオリンの精製は以下の手順で行った。 Ｌ ７ライデイ湾（Ｆｒ１ｄａｙ Ｈａｒｂｏｒ ）
、 ワシントンでエクオレア（Ｍ皿と↓）を収集し日
周組織（光細胞： ｐｈｏｔｏｃｙｔｅｓ ） を採取
する。 ｌ ＥＤＴＡ中の低張溶解に１って光細胞から、タン
パク質を抽出する。 ＆ 光細胞抽出物を硫酸アンモニウム分色（Ｏ−’７５
％）する。 ４ （ＮＨ４）１８０４による沈殿物を遠心分離して
一７０℃に保存したまま、フライディ湾、ワシントンよ
シ船で運ぶ。 ＆ セファデックスＧ−５０（７フイン）を使ってゲル
濾過を行なう。 ＩＬ ＱＡＩセファデックスを使って一一ステップ及
び塩勾配溶出によるイオン交換を行なう。 ７、七７アデツクスＧ−７５（スーパーファイン）を使
ってゲル濾過を行なう。 ＆ ＤＥＡＩ−セファデックスを使って、−一ステッ
プ及び塩勾配溶出に１夛イオン交換を行なうＯ 上記洗１−４段階はフライディ溝上にて行なった。収集
と日周組織の株攻以外の全ての段階は０゜−４Ｉ℃で行
なわれた。〆段嬉写為らの最終生成物は遠心ボトル（２
５０ｍ）に入れてドライアイス中で保存し念。該物質は
この１りな形で船で運ばれた〇 ヨーシアのアテンス（Ａｔｈｅｎｓ ）で行なった。全
段階は０−４℃で実施された。エクオリン含有画分は各
段階の間−８０℃で保存された。タンパク質濃度にかか
わらず、エクオリンは凍結融解に対して安定であるよう
である。 第５段階 セファデックスＧ−５０（ファイン）による
ゲル濾過。 このカラムに１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＆５ （ＨＤ’Ｉ
’Ａ溶液を調製するのに２ナトリウム塩を用いた）溶液
ｆ ７５ ｔｄ／時の流速で流した。ＧＦＰ及びエクオ
後段の精製のために保存された。この段階でのエクオリ
ンの収率は５Ｇ−８０％の範囲に亘シ、通常６５−７５
％の収率が得られた。このカラムの能力は約ｉ ｏ ｏ
０ＩＲ９（プラトフォード： Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ
）７７５ｍであシ、可能である限シ一般にそれニジも少
ない量ｔカラムにかけた。 第６段階 ＱＡＥセファデックスによるイオン交この段
階に用い念。カラムのベッド体積はイオン強度及び緩衝
液組成によってクロマトグラフィの間で変化した。 に工って全収量が増え、効率的であった。この段階はプ
リンタス等の方法（１９７８年）と全く同様に実施され
た。カラムにη為けた後、ＧＦＰｔ；ｉ…−ステップ（
５ｍＭ ＮａＡｃ、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ４７５
）によって選択的に溶出された。エクオリンは次に、過
（アミコンＹＭ−１０膜）で濃縮して次段階に用いる調
製物とした。エクオリン収率は８０チでカラムに１０ｍ
ＭＥＤＴ人、−＆５の溶液を１０一／時で流した。エク
オリン収率は６０−８０％であつ几。 ８８段＃ ＤＥＡＥ−セファデックスによるイオかけ、
ＱＡＢセファデックスカラムと全く同様に溶出を行なっ
た。エクオリン収率は一般に７５−８０％であった。こ
の段階は殆んどのエクオリン調製の際には必要のないも
のである。第７段階からのエクオリンは通常純粋なもの
である（１２％アクリルアミド８Ｄ８−ＰＡＧＢＫよる
）０第９段階 ＥＤＴＡ存在下でエクオリンを９５４Ｌ
力大きい回収率で凍結乾燥し次。］１ｉＤＴＡが存在し
ないと回収率はＯから９５％ｔで様々であった（プリン
タス等、１９７８年参照）。 実施例２：エクオリンの配列決定に用いられる配列決定
方法 アミノ酸配列分析は自動エドマン分解（エドマン（Ｂｄ
ｍａｎ ）及びベツグ（Ｂｅｇｇ）、 １９６７年）を
用いて実施された。比較的多量のタンパク質又はペプチ
ド（１０ｎｍａ１以上）の配列分析はモデル８９０Ｂベ
ツクマンシークエンサー（テューク大Ｍクアド菅−ル（
Ｑｕａｄｒｏｊ ）プログ２ム（タール（Ｔａｒｒ ）
等、１９７８年）を採用して実施し次。 Ｍ３及びＭ５という２つのペプチドは小さいか又はジア
ドロール法ではカップから洗浄されてしまうので、クラ
パー（Ｋ１１ｐｐｅ、 ）等（１９７８年）に工を行っ
た。アミノ酸のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ−）
ｎ導体は、バンカピラー（ＨｕａｋａｐｉＪＩａｒ ）
及びフッド（Ｈｏｏｄ ）によって記載された方法（１
９７８年）に主に従って、デュポン・ゾルベイ（ＤｕＰ
ｏｎｔ Ｚｏｒｂａｙ） ＯＤ ８カラムを用いて逆相
ＨＰＬＯり四マドグラフィにニジ同定された。２−１２
−１Ｏｎ程度の量で２利用できろｌペプチドは、０、
’Ｉ Ｍクアドロール（プラウア−（Ｂｒａｕｅｒ ）
等、１９７５年）及びポリグレン用のプログラムを使っ
てモデル８９００ベツクマンシークエンサ−（ワシント
ン大学）に１って配列決定された。 ＰＴＨ−アミノ酸はエリクソン（Ｅｒ１ｃｓａｏｎ ）
等に工って記載された（１９７７年）逆相ＨＰＬＯシス
テムを用いて同定され次。ｌ、 ５ ｎｍｏｔ（、？）
少ない量のペプチドを使う場合には、応用バイオシステ
ムモデル４７０人気相シークエンサー（ワシントン大学
、バンカピラー等、１９８３年）を用いて配列分析を行
った。気相装置からのｐＴｎ７ｔノ酸はバンカピラー及
びフッドの記載（、Ｌ ９８３年）に従ってＩＢＭシア
ノカラムを用いて同定された。 参考文献 エドマン・ピー及ヒペッグ・ジー ヨーロピアン−ジエ
イ・バイオケミ（］１ｆｕｒＪ、Ｂヰ加−）１巻。 ８Ｇ−９１頁（１９６７年）。 ボーン・ニー・シー、コルネリウス・ティー・ニー （
０ｏｒｎｅｌｌｕｓ、 Ｔ、 Ｕ、 ） ＋モール・ジ
エイ・イー（Ｍｏ１ｅ、 Ｊ、 Ｅ、 ） 、 リン
・ジエイ・デー（Ｌｙｎｎ、 Ｊ。 Ｄ、）、ティドウェル、ダヴリュー・ニー（Ｔｌｄｗｅ
ｌｌ。 Ｕ Ｗ０人０、）及ヒヘネット・ジエイ番シー（１３ｅｎｅ
口。 Ｊ、 Ｏ，） 、アナル・バイオケミ（Ｍ吐」掻セｌ）
。 １０２巻、３５−３８頁（１９８０年）。 タール−シーＯイー（Ｔａｒｒ、 Ｇ、 Ｅ、 ） ＊
ペーチナー・ジエイ・エフ（Ｂｅｅｃｈｎｅｒ、 Ｊ
、 Ｆ、） ＋ペル・エム１２６−１３１頁（１９７８
年）。 バンカピラ一番エムーダグリ−’ −（Ｈｕａｋａｐｉ
ＪＩａｒ。 Ｍ、Ｗ、）、フッド・エル・イー（Ｈｏｏｄｅ Ｌ−Ｅ
−）バイオケミストリー（見匹聾暉駄ユ）＊ ’ ７
巻、 ２１２４−２１３３頁（１９７８年）。 プラウアー・ニー・ダグリュ−（Ｂｒａｕｅｒ、 Ａ、
Ｗ、 ） ：マルゴリエス・エム・エヌ（Ｍａｒｇｏ
ｌｌｅａ、 Ｍ、 Ｎ、 ）及びハーペー・イー（Ｈａ
ｂｅｒ、 Ｉ！ｉ、） 、バイオケミストリー、１３巻
、 ３０２９−３０３５頁（１９７５年）。 エリクツ７＠エル＠エイチ（Ｂｒｌｃｍｍｏｎ、 Ｌ、
Ｈ，） ａウエード・アール・ディー（Ｗａｄｅ、λ
Ｄ、）、ギャグソン・ジエイ（Ｇａｇｎｏｎ、 Ｊ、
） ＃ マクドナルドΦアール・アール（ＭｃＤｏｓｕ
ｌｄ、 Ｒ，Ｒ，）及びワアルシュ・チー・ニー（Ｗａ
ｌｓｈ、 Ｌ Ａ、 ） 、タンパク質配列分析に於ゆ
る固相法、プレビエロ・ニー（Ｐｒｅｖｉｅｒｏ、 Ａ
、 ）及びコレハイ−プレビニｐ・エム・ニー（０ｏ
１ｅＨ１−Ｐｒｅｖｊｅｒｏ、 Ｍ、 Ａ、 ）版、１
３７−１４２頁、エルセピア−（Ｅｌｓｅｖ神ｒ）／北
オランダアムステルダム（１９７７年）。 バンカピラー・エム・ダグリュー、へヴイツク・アール
・エム（Ｈｅｗｉｃｋ、１Ｍ、）、ドレイヤー・ダ３９
９−４１３頁（１９８３年）。 バンカピラｍ−エム・ダグリュー及び７ツド・エル・イ
ー、メソド・エンザイモロジー、９１巻。 ４８６−４９３頁（１９８３年）。 材料及び方法 制限酵素はベセスダーリサーチ・研究所（Ｂｅｔｈｅａ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ
） 、 ＝ ｓ−−イングランドバイオラボ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ ）及びインターナ
シ目ナル・バイオテクノ算ジー会社（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｂｌｏｔｅｃｌｕｓｏｌｏｇｉａｍ、 Ｉ
ｎｃ、 ）から購入し合成し、必要な時まで凍結乾燥粉
末で保存した：ポリ・ケ−（Ｈｏｒム、Ｌ）、アンプル
セン・ジエイ・エム（Ａｎｄ＠ｒｓａｎ、 Ｊ、 Ｍ、
） ＃ ワード・ダグリュー・ダグリュー（Ｗａｒ
ｄ、 Ｗ、 Ｗ、 ）及びコルミアー・エム・ジエイ（
Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 Ｊ、 ） 、バイオケミスト
リー、１４巻、 ２３７．１−２３７６頁（１９７５年
）；ポリ・チー（Ｈｏｒｌ、 Ｋ−） ＊ カルボネア
ウ・エイチ（０ｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、 Ｈ，） ｌ”
−ト・アール・シー（Ｈａｒｔ、 Ｒ，Ｏ，）及びコル
ミア一番エム嗜ジエイ。 プロス・ナトル・アカド・サイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’
ｌ。 人ｃａｄ、 ８ｃ１． ） ＊米国、７４巻、 ４
２８５−４２８７頁（１９７７年）；イノウニ・ニス（
Ｉｎｏｕ７ｅ、 ８．） ＃スギ中う・エイチ（Ｓｕｇ
＆ＬＡ＋ｒａ＊ Ｈ，）、カコイ・エイチ（Ｋａｋｏｌ
、 Ｈ，） 、 ハシヅマ・チー（Ｈａａｉｚｕｍａ、
Ｋ、 ）＊ゴトウ・チー（Ｇｏｔｏ、 Ｔ、 ）及び
イイオ・エイチ（ｌｌ０Ｉ Ｈｌ）＋ケ＜−レター（Ｏ
ｈｅｍ、 Ｌｅｔｔ、 ） 、 １４１−１４４頁（
１９７５年）。 ＲＮＡ単離及びイン・ヴイトロに於ける翻訳エクオレア
・グイクトリア（人ｅｑｕｏｒａａ ｖｌｃｔｏｒｉｍ
）クラゲがワシントン大学海洋生物研究所にて、ワシ
ントンの７ライデイ湾に於いて収集された。クラゲの周
囲から日周リング（ｃｉｒｃｕｍｏｒａｌ ｒｉｎｇ
）を切シ取〕、直ちにドライアイス／メタノール浴中で
凍結させた。この組織ｔ−−７０℃にて所望の時まで保
存した。 キム（ＫｉＩｎ）等の方法〔キム・ワイ拳ジエイ・シュ
ーマンンジエイ（８ｈｓｕｎａｎ、 Ｊ、ｌセツテ・チ
ー（８ｅｔｔｅ、 Ｋ、）及びプルライピラ・ニー（Ｐ
ｒｚｙｂｙｌａ。 人、）、細胞生物誌（Ｊ、 Ｏｅｌ’１． Ｂｌｏｌ、
） 、 ９６巻。 ３９３−４００頁（１９８３年）〕に従ってＲＮＡを単
離し、ポリ（４）＋ＲＮＡ’ｉ前記方法〔アビプ・エイ
チ（Ａｖｌｖ、 Ｈ，）及びレーダー・ピー（Ｌｅｄｅ
ｙ。 Ｐ、）、 ＰＮＡ８６９． １４０８−１４１２頁（１
９７２年）〕を用いて調製しな。 ポリ（人士）ＲＮＡ（１Ｉｇ）及びポリ（Ａ−）ＲＮＡ
（２０μｇ）はラビット網状赤血球イン・ヴイト日翻訳
システムを用いて翻訳された〔ペルハム・エイチ・アー
ルｅビー（Ｐｅ１ｈ鳩Ｈ，λＢ）及びジャクソン・アー
ル曇ジエイ（Ｊａｃｋｍｏｎ、λＪ、）、曹−ａビアン
・ジャーナル舎バイオケ電ストリ−（Ｂｕｔ、 Ｊ、
Ｂｌｏｃｈｅｍ、 ） 、 ２４８巻（１９７６年）
；メリック・ダブリニー・シー（Ｍａｒｒｌｃｋ、 Ｗ
、 Ｏ，） ｅメソド・イン・エンザイム（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｆｆａｘ、 ） 、 １０１ｔｏ）＝
６０６−６１５頁（１９８３年）参照〕。溶解物からミ
クソコツカスヌクレアーゼを用いて内因性ｍＲＮＡを除
去した０各翻訳試料（総量６２ＡＡ）をａＭＢ−メチオ
ニ：’ （３８Ｊ１１０１ ）存在下に９０分及びスタ
フアウレウス（虹柑把匣ｔａｇ）細胞を５０μＬの各翻
訳混合物中に加えてアポエクオリンを免疫沈降させた。 数回洗浄後に抗体−アポエクオリン複合体を８Ｄ８存在
下で加熱して解離させた。 この翻訳生成物を８ＤＢポリアクリルアミド（１３Ｓ）
ゲルで分析した。電気泳動に次いで、ゲルをクマシー（
Ｏｏｏｍａｓａｌｅ ） Ｒ−２５０で染色しタンパク
フイを行なった。 ＤＮ人組換え操作 二本鎖ｃＤＮＡを全エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ）
ポリ（人士）ＲＮ人からライケンス（Ｗｉｃｋｅｎｓ
）等の記載〔ライケンス・エム・ピー（ＷＩｃｋｅｎａ
、 Ｍ、 Ｐ、 ）、プエル・ジー・エフ（Ｂｕｅ口、
αＮ、）及びシムケ・アール・ティー（５ｃｈｈｎｋｅ
、 Ｌ Ｔ、 ）、生物化学誌（Ｊ。 Ｂｌｏｌ、 Ｏｈ＠ｍ、 ） 、 ２５３ 、２４８３
−２４１５頁（１９７８年）〕のように合成答ハた。ホ
モポリマーのｄＱデテール付加し喪後、二本鎖ｃＤＮＡ
をｄＧ−チー／Ｉ／を付加されたヱａｔ １切断ｐＢＲ
３２２（ヴイツ・コｆｆＥ１）・エル（Ｖｉｌｌａ −
Ｋｏｍａｒｏｆｆ、 Ｌ、）、エフスト２デイアゾイス
・ニー（Ｒｆｓｔｒａｄｌａｄｌｍ、ん）、プルーム・
ニス（Ｂｒｏｏｍｓ、 ８． ） ＠ ０メジ−・ピー
（Ｌｏｍｅｄｌｃｏ、 Ｐ、）、チザード・アール（Ｔ
ｌｘａｒｄ、 ＆）。 チーペル・ニス・ビ、−（Ｎａｂｅｒ、 ｊ３． Ｐ、
）＊チック拳ダグリエー・エル（０ｈｉｃｋ、 Ｗ、
Ｌ、）及びギルバート（α１ｂｅｒｔ ） 、 ＰＮＡ
８ ７８巻、 ８７２７−３７３１頁（１９７８年）〕
と〕ア二−リングレ、大腸菌臘）８に１５９２株を形質
転換するのに用いた。テトラナイフリン耐性・アンピシ
リン感受性コ四ニーを移し取シマイク胃タイターディッ
シェ内で一７０℃にて凍結させた。 エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ） ｃＤＮ人ライブラリ
ーを合成オリゴヌクレオチド混合物を使ってスクリーニ
ングにかけエクオリンｃＤＮＡを捜した。このオリゴヌ
クレオチド混合物はコレンビア大学のチャールズ・カン
） −（０ｈａｒｌａｓ ０ａｎｔｏｒ）及び力／Ｉ／
ａ ｘ・アルガラナ（０訂ｌｏｇ Ａｒｇａｒａｎａ
）から提供された。 ポリアクリルアミド電気泳動〔マエアテイス・ティー（
Ｍａｎｌａｔｌｓ、 Ｔ、）及び工７ストラテイデイス
・ニー（Ｅｆａｔｒａｔｌｄｌｍ、 Ａ、Ｌメソ・イン
・工ンザイム（Ｍ＠ｔｈ、 ｆｎ Ｅｎｘ、 ） 、
６５巻、２９９−３０５頁（１９８０年）〕に１って
それらを精製した後、１７コＬシ成る前記オリゴヌクレ
オチド（１？マー）ヲポリヌクレオチドキナーゼ及びｒ
−ｊ ＊ｐ ＋＋人ＴＰを用いて放射活性標識した〔
マキシマム・ニー・エム（Ｍａｘｉｍ、人、ｋ）及びギ
ルバート・ダブリニー（Ｇ１１ｂａｒｔ、 Ｗ、 ）
、メソ曇イン・エンザイム、６５巻、４９９−５５９頁
（１９８０年）〕。 取シ込まれなかったｉｍｐはＤｉｉＡＦｌセルロースイ
オン交換りｐマドグラフィによって除去された。 エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ） ｃＤＮＡバンクは
火工のようにスクリーニングされた： 大腸菌（Ｂ、 ｃｏｌｉ ）組換え体を凍結培養物から
シリア寒天プレート上のエト四セルロースフィルター（
７Ｘ１１ＣＩＥ）に移行し次。これらのコロニーた〔タ
ウン・エフ（Ｔａｕｂ、 Ｆ、 ）及びトンプソン・イ
ー・ピー（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 Ｂ、 Ｂ、 ） ＋
７ナル＊ ハイ；ｆケミ（Ａｎａｌ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ
、 ） 、 １２６巻、２２２−２３０頁（１９μ２
年）〕参照〕。このフィルターを空気乾燥後に真空下２
時間ベーキングし次。 このフィルターをまず初めにｌＸ８ｆ９０中で湿らせ穴
径、フィルター１枚当シ３−のグレハイプリダイゼーシ
ョン溶液（ｌ０ＸＮＢＴ、 α１チ８Ｄ８゜３×デン
ハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ ）中で５５℃、１２−２０
時間保持した。この溶液をハイブリダイゼーションバッ
グから注ぎ出し、フィルター１枚シ１−のハイブリダイ
ゼーションｆｆｉ液（ｌｏｘＮｇＴ。 ０．１％８Ｄ８，３ＸデンハＡ／ト、ｌＸｌ０・ｃｐｍ
のａ”Ｐ標識１７マー／フィルター）１代シに注入した
。３７℃にて２４時間ハイブリダイゼーションを行ない
、その後４℃の１０Ｘ８８０中で１０分間かけて４回洗
浄した。フィルターを空気乾燥し穴径プラスチックラッ
プに包んだ。デュポン・クロネツクス増感板を使い＝ダ
ックＸＡＲ−５フィルムを一７０℃にてこのフィルター
に露出し念。 大腸 （ｃ■）の び 操 ｐＡＩＱ１− ｐＡＩｌｉＱ６ を含む大腸菌８に１５
９２ｔ−ルリア流体培養基２５−中で３７℃にて一晩増
殖させた。この細胞を遠心分離した後、１０チショ糖、
ｓｏｍＭ）すｘｐｉ（８ｊ＠液５−に再懸濁した。こＯ
？Ｉ液Ｋ、α１Ｍフェニルメチルスルホニル７０２イド
ｔ−７，２μｔ、α２Ｍ ＨＤ’ｒＡを３１２μｔ、１
０ダのリゾチーム及び１０ｍｙ／−のＲＮａ婁ｅＡを１
０μを加えて細胞を溶解した・氷中で４５分間保持した
後、この混合物を４＆５０Ｇ）ｌで１時間遠心分離にか
け、この上清を貯えた。 エクオリンの精製及びアッセイ プリンタス等の方法〔プリンタスｅジェイ−７−ル（Ｂ
１１ｎｋｓ、 Ｊ、λ）ｌ ウ４７＠／ヴリ！−＊ ジ
ー（Ｗｉ＠ｒｓ Ｖｉ’−Ｇ−） ｅ ”ス・ピー（Ｍ
ｅｓｓ、 Ｐ、 ）及びグレダーガスト・エフ・ジー（
Ｐｒｅｄｅｒｇａｓｔ、 Ｆ、α）。 プログ・パイロフイズ・モレキユラー・バイオ四＜Ｐｒ
ｏｇｍＢｌｏｐｈｙｓａＭｏｌｅｃａＢｌｏｌ ）、
４０巻、ｌ−１１４頁（１９８２年）〕に従って、エ
クオリンを抽出・精製した。エクオリンすなわち光タン
パク質（ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ）活性は、Ｓμｔ
の試料をへＩＭＯｎ賄、 α１Ｍ）リス、ｐＨａＯｆ
ａ液α５−に液入５ると同時に番、ｑ光強度（ｐｅａｋ
ｌｉｇｈｔ Ｉｎｔｅｎｔ口ｙ）及び全光子数を測定
することで求めた。この測定用の測光計の設計及び光子
収量の絶対量に対する装置の標準化については、以前に
記載され念ものを参照されたい〔アンデルソン・ジエイ
・エム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｊ、Ｍ、 ） 、 ７ア
イニ・ジー・ジエイ（Ｆａｌｎｉ、 Ｇ、 Ｊ、 ）及
びワアングラー・ジエイ・イー（Ｗａｍｐｌｅｒ、 Ｊ
、 Ｂ、 ） 、メソトーイン・エンサイモ四ジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｎｚ、 ） 、 ５７巻、５
２９−５５９頁（１９７８年）；カルボネアウ虐エイチ
（０ｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、 Ｈ，）及びニルζエル・
エム・ジエイ（Ｏｏｒｍｉｅｒ、 Ｍ、 Ｊ、） 、ジ
エイ・バイオ党・ケム（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ｃｈｅｍ、
） 、 ２５４頁、７６９−７８０頁（１９７９年
）〕。 ！！ＡＢ １抽出 からのアポエクオリン活性の部分精
製 発現されたアポエクオリンは、ｐＡｅＱ１抽出物２３ｄ
ｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｌ５ｔｎＭ）すＪ、ｐｔ１７．
５溶液で平衡化されたワットマンＤ）ｉｉ−２２カラム
・（４２ｍペット体積）に通すことに１って部分精製さ
れた。８００−〇Ｎｍ０Ｌ勾配（０−ＩＭ）ｆ：漣１υ
、アポエクオリン活性はａ ３ Ｍ Ｎａ０Ａのところ
に溶出してきた。ピークの分画を回収し、α５実験に供
し次。 結果及び考察 インゲイトはに於けるエクオレアポリ（Ａ＋）ＲＮＡの
翻訳 凍結したクラゲの組織１９７０−ら約ｔｓＡｇのポリ（
人士’）ＲＮＡを単離した。イン・グイトロに於は４五
り主と１ポリ（λ＋’）ＲＮＡの翻訳に関する結果は第
１図に示す。抗エクオリンと反応した翻訳生成物はレー
ン４で示されている。免疫沈降した１１Ｓのカウントは
翻訳され穴ものの全酸沈殿物のカウントのα３％であり
、これはアポエクオリンｍＲＮＡが全ポリ（人士） ｍ
ＲＮ人集団の約α３チであることを示している。このよ
うに７ポ工クオリンｍＲＮＡが比較的多いということは
、エクオリンのロ周リング粗抽出物中のエクオリンに相
答する全タンパク質の割合（α５％）と良く一致するも
のである。邑久主ｕＲＮ人（レーン２）の非存在下、又
はエクオリンポリ（ム一）ＲＮ人の存在下（データは記
載していない）でイン・ヴイトロの翻訳を行うと、免疫
沈降するタンパク質はできなかつ念。 抗エクオリンｉ′免疫沈降する翻訳−次産物（ｐｒｂｎ
ａｒｙ ｔｒａｎｓｌａｔＩｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）は
ｆ９Ｄｓ−ＰＡＧＥゲルに於いて明らかに２３，４００
ダルトンの分子量を示すように動き（レーン４）、これ
はエクオリンから単離した天然エクオリンの分子量（２
２，８００ダルトン、第１図参照）エフも僅かに大きい
ものである。このデータ及び第４図に示したデータは、
初期翻訳生成物には約７つのアミノ酸のｆ’１７ｆ’ｌ
シ配列（ｐｒｅｐｒｅａｅｎｃｅ ）の存在があること
と一致するものである。 ポリ（Ａ＋）ＲＮ人翻訳からの免疫沈降タンパク質は、
元のオート２ジオグラムを見てみると、二重線或いはさ
らに三重線（レーン４．第１図）で動いていたことが判
る。この結果は二通勺に解釈し得るものである。第１番
目に、！ヱ、ヱイクトリアには多数のアポエクオリン遺
伝子が存在し得、それぞれのプレタンパク質の分子量が
、それらのｄ！配列の長さが多様であるが故に異ってい
るということである。エクオリンアイソザイム〔プリン
クス・ジェイ・アール（Ｂ１１ｎｋｓ、 Ｊ−λ）及び
ハレアージー・シー（Ｈａｒｒａｒ、 Ｇ、 Ｏ，）
、 ７：Ｌド・プ四ス（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、 ） 、
３４巻、４７４頁（１９７５年）〕の存在はζうした
多重遺伝子族（ｍｕｌｔｉ −ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ
） ｆ示しているかも知れない。 第二番目に、７ツイデイ湾のエクオリン・グイク）＋７
７集団がエクオリンの複数種から成シ立っているかも知
れないということである。 エクオリンｃＤＮＡｓの同定 使用されたエクオレアｃＤＮ人ライブラリーは４５０ｂ
ｐニジ大きい挿入部分を持つ６００００組換え体を含ん
でい次。スクリーニングに付された２５の任意の該組換
え体のうちのどれも５００ｂｐ以下の挿入部分ｑ持りて
おイ；そのうちの２つは３ＫｋＰかニジも大きかった・ エクオレアｃＤＮ人バンクは次の混合合成オリゴヌクレ
オチドプローブを用いてスクリーニングにかゆられた。 上記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はアポエクオリン
の全アミノ酸配列の研究に１って求められた。このオリ
ゴヌクレチドはエクオリンポリベグチドのカルボキシ末
端領域に於いてＴｒｐ ｌ’ ａ・Ｔｙｒ ｅ Ｔｈｒ
＠ Ｍｅｔ ａλｓｐ ｍ Ｐｒｏ”’のペプチドを
コードしているｍＲＮ人と相補的なものである。上記の
１７マー（１７−ｇｎａｔ龜）は、方法の欄で記述した
様にｌａｐで標識されエクオリンｃＤＮＡライブラリー
からのプラスミドＤＮＡとハイブリッドを形成した。 ６つの形質転換体が上記合成オリゴヌクレオチドとハイ
ブリッドを形成する挿入部分を持つ次プラスミドを含有
しているものと同定され念。最大のＰｓｔ Ｉ挿入部を
含むプラスミド、ｐＡＢＱｌの制限地図を第２図に示す
。ｐＡＥｆＱｉをＢａｍ ＨＩで消化すると該合成オリ
ゴヌクレオチドとのハイブリッドは形成されないであろ
う。前記の１７マ−ＤＮ人配列の研究によると、仁のハ
イブリダイゼーションプローブはＢａｍ ＨＩ認識配列
（ＧＧＡＴＯＯ）を含んでいるものである。従って、ｐ
ＡＩｉｉＱｉ中のＢｊｌｎｌＩＨＩ部位はアポエクオリ
ンをコードしている配列の３′領域を同定するのに用い
ることが出来りう。以下に示すＬ５に、組換えプラスミ
ドｐＡｉｌＱ１は、大腸菌（４９凪）に於けるその発現
から示されるように、アポエクオリンｃＤＮＡ１に実際
に含んでいるものである。 大 に るアポエクオリンの 前記の６つの形質転換体のうちのどれが生物学的に活性
なアポエクオリンを発現しているかどうかを見つけ出す
為に、それらの抽出物、及び同様に親株（ｈｏｓｔ ５
ｔｒａｌｎ ）の抽出物を方法のところで記述した様に
調製し九。それぞれの抽出物０．５−にβ−メルカプト
エタノール＜２ｍＭ＞及び腔腸動物門のルシフェリン（
αＨ＋ｓＭ）を添加し、この混合物ｔ−４℃にて２０時
間保持した。その後、諌混合物のＯａ 依存光タンパ
ク質活性について方法に記載したようにして測定し喪。 組換え体ｐＡ］１ｔＱ１から１４表した抽出物について
はＯａす依存ルミネッセンスが観察されたが、親株又は
他のいずれの形質転換体からの抽出物についてはこのよ
うなルミネッセンスは観察されなかった。ｐＡＦｔＱｌ
−６の挿入部分がクロスハイブリッドを形成するとい
う仁とは、それらが相同なりＮＡ配列を含んでいるとい
うことを示唆するものである。しかしながら、もしも９
ＡＢＱ２〜６のｃＤＮ人挿入部分の長さが充分でなかっ
たり、プラスミド中で適切に配向していなかつ念シする
と、それら抽出物中のアポエクオリン活性は期待出来な
いものであろう０ｐＡＢＱ１抽出物の光タンパク質活性
発現の速度論は天然の混合アポエクオリンのそれと類似
している（第３図参照）。この抽出物に於いて光タンパ
ク質活性が発現する為に必要とされる条件も真正の（ａ
ｕｔｈｅｎｔｉｃ ）アポエクオリンを用いた場合に観
察されるものと同一である。第３図に示すように、溶存
へが必要とされる。更に、ｌ−メルカプトエタノール又
は腔腸動物門のルシフェリンのいずれかが反応混合物中
に存在しなくなると、０ａｆｆｉ＋依存光タンパク質活
性が全く発現されなくなる。 Ｏｓ ｆ：含まない緩衝液中に活性成分を注入しても
ルミネッセンスは発さられなかったｏＯａｔ−後で添加
するとルミネッセンスの閃光（ｆｌａｓｈ）が見られた
。 ｐＡ、Ｈｔ含有形質転換体の抽出物中の活性成分を更に
詳しく調べる為に、この組換えプラスミドを含有する形
質転換体抽出物を、方法のところで記載した工うにＤＥ
−２２ｆ：用いたクロマトグラフィにかけ念。アポエク
オリン活性は約α３Ｍ塩のところで溶出され、これは真
正のアポエクオリンの場合に類似している。この活性画
分を腔腸動物門のルシフェリン、／−メルカプトエタノ
ール及び酸素の存在下でインキユベートし、光タンパク
質活性を発生させた（第３図参照）。次いで、この混合
物をゲル濾過にかけた。第４図に示すように、ｐＡＩＱ
１抽出物中の部分精製成分から生じた光タンパク質活性
はＭｒ＝ ２０．６００のところに溶出し、一方天然エ
クオリンは１亀６０Ｇのところであった。同様の結果は
イン・ヴイト冒の翻訳実験中にも観察された（第１図）
。第４図のデータから、使用した条件ｍ下に於いて、ル
シフェリンはｐＡＥＱ１抽出物中の活性成分と強固に会
合するという結論が得られるであろう。 を 第４図からの回 タンパク質画分はＣ１の添加によっ
てルミネッセンスの閃光を発する。この閃光の速度論は
Ｏａ 依存エクオリン反応のそれと区別ができないもの
でありな。他の組換えプラスミドは形質転換体抽出物分
て゛゛光放出タンパク質（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉ田ｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ） ｔ−発現しなかった（第６表参照
）。 上記のデータは、ｐＡＥＱｉ中に挿入され７’１−ｅＤ
ＮＡ部分はアポエクオリンをコードしている全長ｃＤＮ
Ｉｔを表わしていることを示している。更にこのデータ
は、該ｃＤＮＡがｐＡＥＱｌ中で発現されておシ、その
タンパク質生産物の生物学的活性は天然の混合アポエク
オリンのそれと区別され得ないことを示している。発現
レベルは全可溶性タンパク質の約０．０１％であると推
定され念。 表６７ボエクオリンｃＤＮＡクローン抽出物中のアポエ
クオリンの再充電 ｐＡＩｅＱｌ ５Ｘ１０’ ０ｐ
ＡＢＱ１ ０ ０ｐＡＩＱ３
０ ０ｐＡＩＱ４−
０ ０ｐＡＢＱ５ ０
０ｐＡ］１ｌＱ６ Ｇ
Ｏ８Ｋ １１５９２ （親株＞
０ ０各抽出物α５−にメルカプトエタノ
ール（２ｍＭ）及び腔腸動物門のルシフェリン（０，０
１ｓｍＭ）ｔ−加えた。この混合物ｔ−４℃で２０時間
インキエベートし７ｔ、試料５１１ｔを取ル出しα１
ｍ Ｍ Ｃｙ−１０、ｌ５ｓｄに注入して、泰４光強度
を測定した。 ε携ス ｐＡ］ｉ！Ｑｌ ｉ含む大腸菌に於げるアポエクオリン
の発現は比較的低レベルである。この発現レベルて増加
するように、ｐＡＥＱｌ ＠ｂらのアポエクオリン遺伝
子をもう１つのプラスミド（ｐＵＯ９”）ｉでサブクロ
ーン化させ良。 ｐＡＩ！ＱｌからのＰａｔ Ｉ断片（αｙｓｋｂ ）を
単離し、ｐＵＯ９の単−Ｐｓｔ Ｉ部位にクローン化さ
せた。 ２つの異なるプラスミド、ｐＡｇｑ７及びｐＡ］！ＩＱ
ａ管得た。プラスミドｐＡＩＱ８は第２図（ｂ）で示す
ように、所望の配向で挿入されたＰｓｔＩ断片金含んで
いた。プラスンドｐＡｌｌＱ７には反対方向の配向で該
断片が挿入されていた。 ｐＡＩＱ７及びｐＡ）！ｆＱ８ ｔ−含有している大腸
菌株（親；ホス） ：ＪＭＩＯ５）を各々３７℃にてア
ンピシリン（５０μｇ／−）含有のルリア流体培養基２
０−中で増殖させた。ＯＤ、１゜が０．６に達し九時に
、培養物を１００惰Ｍ保存溶液中で１ｍＭにし念。 ５ｍの試料を取シ出し、一方残シの培養物は振とうされ
続は友。１時間及び２時間後にも同様に試料の一部を取
シ出した。それぞれ試料の一部を採取した直後に、細胞
を遠心分離し一２０℃で必要になる時まで保存した。 ６つの採取試料抽出物のアポエクオリン活性をシフニリ
ン及びメルカプトエタノール（２６０ＡＡ抽出物、５％
メルカグトエタノール水溶液３μを及び腔腸動物門ルシ
フェリン３μＬ）の存在下で一晩インキエベートした。 このインキエベーショ全光子数を測定して、混合物中の
エクオリン活性を求めた。タンパク質はブラッド７オー
ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ）アラ七イ（Ｂｉｏ Ｒａｄ
）？用いて測定した。 第７表には、ｐｋＥＱ７及びｐＡＥＱ８含有株の６つの
抽出物、：２ントｐ−ル大腸菌株（８に１５９２）及び
ｐＡＩｉｔＱ１含有株の抽出物から得られた結果が記さ
れている。 第７表 ｐＡＥＱｌ 、 ｐＡＢＱ７及びｐＡＥＱ８
を含む大腸菌中のアポエクオリン発現レベル インキエベー 比活性（光 充電効率１％ 充電効率２
０チプラスミド シ１ンｍ寺間 ７数４１１） と仮
定 と仮定ｐＡＥＱ７ Ｇ ＜α
０２ − ０１ （０，０４−０ ２≦α０２ − ０ ｐＡＥＱ８ ０ ０．６６８ α０４２
（１１）” α００２ （１０）１ １７．２
１Ｏ７（２６８） ０．０５ （２６１１）
２ ３＆４ ２．４０ （６００） ａ１
２ （６０Ｇ）ｐＡＲＱｌ α０
６１ α００４ α０００２株 ８に１５９２ ０ − ０
（＊ カッコ内の数字はｐＡｇＱｌ ｔ−含む抽出物に
於いて観察される活性の何倍になるかを示したもの。）
これら抽出物中のエクオリン活性レベルはルシフている
。粗抽出物に於ける充電効率を定量化することは不可能
である。エクオレ７から単離したアポエクオリンを用い
た場合に観察される充電効率は２０％以下であシ、大腸
菌抽出物中ではこの効率は多分幾らかそれエフ低いもの
であろう。従って、充電効率１ｑｂ及び２０−を基に計
算した値を求め７ｔ。 エクオリン遺伝子１ｐＡＫＱ８と反対方向の配向で含ん
でいるｐＡ１１Ｑ７からはエクオリン遺伝子の誘導が観
察されなかつ九。 このデータは、ｃＤＮＡヌクレオチド配列が誘導プ四モ
ーターの３′に適切に位置していればＪアポエクオリン
の発現レベルは顕著に増大し得るということを示してい
るものである。 （以下余白） 実ｍ例５：％定のアポエクオリン遺伝子の構造決定 第２図に示した、プラスミドｐＡ］！ｔＱ１． ｐＡＩ
ｔＱ７お工びｐＡＦＸＱ８の中に存在するＰｓｔ ｌ
−Ｐａｔ Ｉ断片の構造を標準的遺伝子配列解析法に１
って決定Ｌ７’ｈ。３′末端から６９個のヌクレオチド
は翻訳されない。翻訳領域が発現されると、実施例１に
記載した方法で単離したタンパク質（アポエクオリン）
のＮ末端に７個のアミノ酸残基が付いたタンパク質が発
現される。この実施例１で得られたタンパク質のＮ末端
はＶＡＬで始まる。この余分の７個のアミノ酸残基は実
施例１の単離工程の間にプロテアーゼに工って切シとら
れるのであろう。 ＰＲＯ’ｉコードしている〇−末端コトンの次には停止
コドンがあシ、その後１２個のヌクレオチドが続いてい
る。これは明らかに単離されｆｔ−ｃＤＮＡが完全長（
ｆｕｌｌ −ｌｅｎｇｔｈ ）であることを示している
。 全二本鎖ＤＮＡとアミノ酸配列は次のとおシである。 耐″ｒｏＣム■轟ム偽龜ａ！賜ムπ爾関Ｔ−↑ム讃繊掴
πｃｃμ（９）臨＠ＡＡ ＡｃｏＴＯＯＴＴＴ 判Ｔ
ケ＠ＴＡ ＯＴＴ ？ＡＧ ＭＸＩ ？ＩＪ ＡＣ？
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Ｏｌ、Ｔ （ＩＩＪ Ａｔａ ＶＡＬ ＰｊＬＯ（ｋ
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ＴＩＸＩ ｔＡｔｊ ＯＴＡ （ｍ ＱＩＡ ＡＣＷ
（’ｆｆ ｆｆＣ’ ＯＭａ Ａｆｆｌ Ｃ（ｊ ＣＣ
Ｔ ＱＩＩＡ ＣＡＩ） ＧｏＯＡ？？ＱＡＡムＣ？
Ｃ’ｆ＠ Ｑ）ｅ ｅｒｒ ＴＯＡ ＯＡＣｏｖａ この同定され九配列が示していることは、この配列の中
では微不均−性のいろいろな位置に主要アミノ酸（ｐｒ
ｌｎｃｉｐａｌ ａｍｉｎｏ ｗｅｌｄ ）と少数アミ
ノ酸（ｍｌｎｏｒａｍｉｎｅ ａｃ４ｄ ）の双方が含
まれているので、表３に示した変異形からどのアミノ酸
配列を選択しても活性なアポエクオリンが得られるとい
うことである。 したがって、同じようにして様々なペプチドをコ本明細
書中に開示した一般的な配列で表わされ、多少の変異を
示す（したがってアポエクオリンの生物活性を有する）
他のペプチド、ＤＮＡ分子、ベクター等に関して前述し
た議論は、本実施例に開示し九特定の配列にも等しく適
用できる。本実施例では特に１つのペプチド、これをコ
ードしているＤＮＡ配列、および２個の制限部位の間の
完全長ＤＮＡ配列を開示し次。コードＤＮＡ配列（任意
に末端停止コドンを含んでいても工い）は、完全長のＤ
ＮＡ配列とは別の実体として明らかにされ、その変異形
も含めて全長ＤＮＡ配列とは切り離して考えられる。二
本鎖ＤＮＡとして開示されたいずれのＤＮＡも、この二
本鎖ＤＮＡｆｃ形成する個個の１本鎖ＤＮＡお工び転写
によって得られるこれに相当するＲＮＡ１開示している
ものと考えられる。 上記実施例のベクターと宿主は本発明の好ましい態様の
いくつかで用いられるが本発明はこれらの実施例に開示
された特定のベクターや宿主細菌に限定されるわけでは
ない。使用した細菌とプラスミドは全て、バイオテクノ
ロジー分野の当業者が様々な起源から容易に入手できる
。たとえば、大腸菌（旦、蝦））ＪＭ１０５とプラスミ
ドｐＵＯ９お工びｐＢｎ３２２は米国０８８５４ニユー
シヤーシー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ） 、 ピスカ
タウエイ（Ｐｌａｃａｔｍｗａｙ）。 センテニアル アベニュー（０ｅａｔｅｘｎ１ａｌ Ａ
ｖｅｎｕｅ ）８０Ｑのビー、エル、バイオケミカルズ
社（Ｐ、 Ｌ。 ＢＩｏｃｈｅｍｌｃａｌｍ、 Ｘｎｃ、 ） （これは
ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｙｓ、 Ｉｎｃ、 ）
の一部門である〕から市販されてお９、そのカタログで
はそれぞれ第２７−１５５０−０１，２７町４９１８−
ＯＸおよび２７−１７５０−Ｏｆとされている。さらに
、本発明の実施に使用することができる上記やその他の
微生物とプラスミドは、米国２０８Ｂ２メリーランド（
Ｍａｒｙｌａｎｄ ） 、ロックビル（ｌ１ａｃｋｖ…
ａ）ｅパーク四−ン ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗａ Ｄ
ｒｉｖａ ） １！３０１のアメリカン タイプ カル
チャー コレクシ冒ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
０ｕｌｔｕｒａ ０ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）からも入手
できる。代表的なものとその寄託番号吋大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）８に１５９２（ＡＴＯＯ４８５１０６）、大腸
菌（旦、臼■）ＪＭ１０５（人Ｔｏ０ ４１１３０９）
、ｐＵＯ９（ＡＴＯＯ／１６３７２５２＞、ｐＢＲＬ２
２（人Ｔｏｏ ／１６３１３４４）である。 以上本発明の詳細な説明したが、本発明の思想と範囲を
逸脱することなく多くの変更や修正ができることは当業
者には明らかであろう。 ４、図面の簡単な説明 第１図はオワングラゲから単離し次ポリ（ム）ＲＮＡｔ
用いてインビト四で翻訳したオートラジオグラフィー分
析結果を示す写真でアシ、第２図（ａ）はエクオレア
ビクトリア（ト型五↓ｖｌｃｔｏｒ１暑 ）グラフから
単離し九アポエクオリンをコードしているＤＮ人配列を
含有する遺伝子の制限地図であル、 あり、 第３図はｐＡＩＱ１抽出物中のＯａ −依存性発光タ
ンパク質活性の時間と酸素に対する依存性を示すグラフ
であり、 第４図はｐＡＩｉＱ１抽出物で現われるＯａ −依存
性発光タンパク質活性のゲルー過の結果のグラフである
。 ・代理人 ｆＰ哩士川用 口 ｆ１１ｓ１１Ｑ浄ＩＦ
（内容に変更なし） ＦＩＧ、 １
Claims (11)
- （１）式： 【アミノ酸配列があります】 の均質ペプチド。
- （２）特許請求の範囲第１項に記載のペプチドをコード
しているヌクレオチド配列からなる単離ＤＮＡ分子。 - （３）前記配列が 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
分子。 - （４）前記分子がさらに前記配列の３′に非発現セグメ
ントを、かつ前記配列の５′に非発現セグメントを含ん
でおり、前記分子が 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の
分子。 - （５）前記分子が１本鎖ＤＮＡであることを特徴とする
特許請求の範囲第３項に記載の分子。 - （６）前記分子が２本鎖ＤＮＡであることを特徴とする
特許請求の範囲第３項に記載の分子。 - （７）微生物内で複製でき、かつ特許請求の範囲第１項
に記載のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を
含んでいる組換えＤＮＡベクター。 - （８）前記配列が 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の
ベクター。 - （９）前記配列の前にｌａｃプロモーターが存在するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載のベクター
。 - （１０）特許請求の範囲第７項に記載のベクターを含む
遺伝子工学処理された微生物。 - （１１）前記ベクターが式 ： 【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする特許請求の
範囲第１０項に記載の微生物。
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|---|---|---|---|
| US68790384A | 1984-12-31 | 1984-12-31 | |
| US687903 | 1984-12-31 | ||
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| US702308 | 1985-02-15 |
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|---|---|---|---|
| JP4347199A Division JP2655981B2 (ja) | 1984-12-31 | 1992-12-25 | アポエクオリンをコードするヌクレオチド配列、該配列を含む組換えベクター及び該ベクターを含む組換え微生物 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4347199A Expired - Lifetime JP2655981B2 (ja) | 1984-12-31 | 1992-12-25 | アポエクオリンをコードするヌクレオチド配列、該配列を含む組換えベクター及び該ベクターを含む組換え微生物 |
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