CN113717986B - 基于拆分荧光素酶Akaluc的蛋白片段互补系统及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及蛋白质相互作用成像技术领域，本申请提供一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统及其构建方法。该系统包括第一载体和第二载体，其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。该系统是基于拆分荧光素酶Akaluc的互补系统，荧光素酶Akaluc能够与底物Akalumine反应，在生理温度(37℃)条件下，产生荧光。进一步地，由荧光素酶Akaluc和底物Akalumine反应所产生的荧光具有较长的波长，因此，该系统产生的荧光具有比较好的组织通透性，有利于成像观察。

Description

基于拆分荧光素酶Akaluc的蛋白片段互补系统及其构建方法
技术领域
本申请涉及蛋白质相互作用成像技术领域，特别是涉及一种基于拆分荧光素酶Akaluc的蛋白片段互补系统以及基于拆分荧光素酶的蛋白片段互补系统的构建方法。
背景技术
蛋白质之间的相互作用在生物体的生命过程中发挥了重要的作用。比如在基因调控、细胞信号转导以及肿瘤的生长发育过程中均涉及到许多蛋白质之间的相互作用。监测这些蛋白质间的相互作用对于生命过程的解析尤为重要。在过去的几十年里有一些基于荧光成像的方法被发展并用于研究蛋白质间的相互作用，比如：荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)、基于单重态氧三重态能量转移的成像技术以及双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)等。
蛋白片段互补系统是一种以功能蛋白质作为材料的片段互补系统。其基本原理是在功能蛋白质的合适位点将其拆分成两个没有功能的片段。这两个蛋白片段在没有相互作用蛋白的作用下，不能自发的重构成完整的功能蛋白。若有两个相互作用的蛋白分别与两个蛋白片段相互融合，在这两个相互作用蛋白的作用下，两个无功能的蛋白片段就会相互靠近，从而重构成完整的功能蛋白质。蛋白片段互补技术为研究蛋白质与蛋白质相互作用提供了简便、直观、灵敏的方法，并在近些年得到越来越多的关注。
目前发展的基于功能蛋白的片段互补系统包括了基于拆分Gluc、Rluc、Fluc等荧光素酶的系统。而上述互补系统中，蛋白片段互补后产生的荧光强度较弱。并且，在生物组织的荧光成像过程中，600nm-1200nm波长的光具有比较好的组织通透性，能够在动物活体中产生较好的成像效果。而目前的蛋白质片段互补系统产生的荧光波长较短，影响了该系统在动物活体中的成像效果。
2018年Miyawaki等人通过蛋白质定向进化获得了荧光素酶Akaluc，并通过与其相应的底物Akalumine反应，可以获得光谱范围在近红外区间的生物荧光，实现小鼠活体内单个荧光细胞的检测，其在动物活体成像方面具有非常大的优势。但尚未开发出基于该荧光素酶Akaluc的蛋白互补系统，用于研究蛋白质间的相互作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请实施例采用的一个技术方案是提供一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统，包括第一载体和第二载体，其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。
在一些实施例中，序列SEQ ID NO.2用于表达Akaluc416N蛋白片段，序列SEQ IDNO.3用于表达Akaluc417C蛋白片段；当Akaluc416N蛋白片段和Akaluc417C蛋白片段相互靠近时，可重构形成荧光素酶Akaluc。
在一些实施例中，第一载体进一步包括第一基因序列，第一基因序列用于表达第一蛋白，第一载体用于表达第一融合蛋白，第一融合蛋白为第一蛋白与Akaluc416N蛋白片段的融合蛋白。
在一些实施例中，Akaluc416N蛋白片段为由荧光素酶Akaluc的第1号位至第416号位氨基酸构成的蛋白片段。
在一些实施例中，第二载体进一步包括第二基因序列，第二基因序列用于表达第二蛋白，第二载体用于表达第二融合蛋白，第二融合蛋白为第二蛋白与Akaluc417C蛋白片段的融合蛋白。
在一些实施例中，Akaluc417C蛋白片段为由荧光素酶Akaluc的第417号位至第550号位氨基酸构成的蛋白片段。
为解决上述技术问题，本申请还提供了一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统的构建方法，包括：以荧光素酶Akaluc的基因序列为模板进行聚合酶链式反应(PCR)得到序列SEQ ID NO.2和序列SEQ ID NO.3；利用第一质粒的双酶切位点，将序列SEQ IDNO.2插入第一质粒的多克隆位点，以得到第一载体；利用第二质粒的双酶切位点，将序列SEQ ID NO.3插入第二质粒的多克隆位点，以得到第二载体。
在一些实施例中，利用第一质粒的双酶切位点，将所述序列SEQ ID NO.2插入第一质粒的多克隆位点之前，该方法还包括：通过PCR，获得用于表达第一蛋白的第一基因序列以及用于表达第二蛋白的第二基因序列；通过重叠PCR，获得第一基因序列与序列SEQ IDNO.2串联的第一串联基因；通过重叠PCR，获得第二基因序列与序列SEQ ID NO.3串联的第二串联基因。
在一些实施例中，利用第一质粒的双酶切位点，将所述序列SEQ ID NO.2插入第一质粒的多克隆位点，包括：利用第一质粒的双酶切位点，将第一串联基因插入第一质粒的多克隆位点；利用第二质粒的双酶切位点，将序列SEQ ID NO.3插入第二质粒的多克隆位点，包括：利用第二质粒的双酶切位点，将第二串联基因插入第二质粒的多克隆位点。
在一些实施例中，序列SEQ ID NO.2用于表达荧光素酶Akaluc的Akaluc416N蛋白片段，Akaluc416N蛋白片段为由荧光素酶Akaluc第1号位至第416号位氨基酸构成的蛋白片段；第一载体用于表达第一蛋白和Akaluc416N蛋白片段的融合蛋白；序列SEQ ID NO.3用于表达荧光素酶Akaluc的Akaluc417C蛋白片段，Akaluc417C蛋白片段为由荧光素酶Akaluc第417号位至第550号位氨基酸构成的蛋白片段；第二载体用于表达第二蛋白和Akaluc417C蛋白片段的融合蛋白。
为解决上述技术问题，本申请还提供了一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统在蛋白质间相互作用的成像应用，其特征在于，基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统为以上实施例所述的任何一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统
相比于现有的双分子荧光互补系统，本申请提供一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白互补系统，包括第一载体和第二载体。其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。该系统是基于拆分荧光素酶Akaluc的互补系统，荧光素酶Akaluc能够与底物Akalumine反应，在生理温度(37℃)条件下，产生荧光。进一步地，由荧光素酶Akaluc和底物Akalumine反应所产生的荧光具有较长的波长，因此，该系统产生的荧光具有比较好的组织通透性，有利于成像观察。
附图说明
本申请将结合附图对实施方式进行说明。本申请的附图仅用于描述实施例，以展示为目的。在不偏离本发明的原理的条件下，本领域技术人员能够轻松地通过以下描述根据所述步骤做出其他实施例。
图1A为本申请实施例提供的包含有用于表达荧光素酶Akaluc的第一蛋白片段Akaluc416N的序列SEQ ID NO.2的第一载体示意图。
图1B为本申请实施例提供的包含有用于表达荧光素酶Akaluc的第二蛋白片段Akaluc417C的序列SEQ ID NO.3的第二载体示意图。
图2A为本申请实施例提供的包含有用于表达bJun-Akaluc416N融合蛋白的第一载体示意图。
图2B为本申请实施例提供的包含有用于表达bFos-Akaluc417C融合蛋白的第二载体示意图。
图3A-3B为HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和第二载体所产生的荧光亮度与HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和对照载体所产生的荧光亮度的亮度对比图。
图3C为HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和第二载体接种至裸鼠皮下后，裸鼠所产生的荧光亮度，与HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和对照载体接种至裸鼠皮下后，裸鼠所产生的荧光亮度的亮度对比图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本申请，而非对本申请的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本申请相关的部分而非全部结构。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本申请提供一种基于拆分荧光素酶Akaluc的蛋白片段互补系统，包括第一载体和第二载体，其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQID NO.3的载体。
具体地，获得包含有荧光素酶Akaluc的基因的载体。荧光素酶Akaluc是由550个氨基酸形成的蛋白，其基因序列如序列SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如序列SEQ ID NO.4所示。
在本申请实施例中，构建了载体pUC57-Akaluc，其包含有用于表达荧光素酶Akaluc的序列SEQ ID NO.1。例如，可以通过双酶切位点将序列SEQ ID NO.1插入到质粒pUC57的多克隆位点中，即可得到载体pUC57-Akaluc。可以理解的是，序列SEQ ID NO.1也可插入其他的真核表达载体，例如pEGFP-C1，pEGFP-N1，pcDNA3.1等，在不同的真核表达载体中，可选择合适的双酶切位点将序列SEQ ID NO.1插入，本申请对真核表达载体的选择以及酶切位点的选择不做限制。在本申请实施例中，载体pUC57-Akaluc为商业购得(苏州金唯智生物科技有限公司)。
在本申请实施例中，荧光素酶Akaluc将在416号位氨基酸和417号位氨基酸之间(从氮端开始计数)，被拆分成两个蛋白片段，分别为Akaluc416N蛋白片段和Akaluc417C蛋白片段。其中，Akaluc416N蛋白片段可以理解为包含有荧光素酶Akaluc(即如SEQ ID NO.4所示的序列)的第1号位至第416号位氨基酸的蛋白片段；Akaluc417C蛋白片段可以理解为包含有荧光素酶Akaluc的第417号位至第550号位氨基酸的蛋白片段。
获得载体pUC57-Akaluc后，以该载体为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)，可扩增得到序列SEQ ID NO.2。其中，PCR扩增序列SEQ ID NO.2时，可根据实际情况设计合适的上下游引物。例如，本实施例中，扩增序列SEQ ID NO.2时用到的上游引物为：
5’-CTAGCTAGCGCCACCATGGAAGATGCCAAAAACATTA-3’，
下游引物为：
5’-CCGGAATTCTTAGCCGTCCTTGTCGATGAGA-3’。
通过PCR扩增得到的序列SEQ ID NO.2为能够表达Akaluc416N蛋白片段的核苷酸序列。
进一步地，以载体pUC57-Akaluc为模板，通过PCR还可获得序列SEQ ID NO.3。PCR扩增SEQ ID NO.3时，可根据实际情况设计合适的上下游引物。例如，本申请中，扩增序列SEQ ID NO.3时用到的上游引物为：
5’-CTAGCTAGCGCCACCATGTGGCTGCACAGCGGCGACAT-3’，
下游引物为：
5’-CCGGAATTCTTACACGGCGATCTTGCCGT-3’。
此时，通过PCR扩增得到的序列SEQ ID NO.3为能够表达Akaluc417C蛋白片段的核苷酸序列。
进一步地，将用于表达Akaluc416N蛋白片段的序列SEQ ID NO.2和用于表达Akaluc417C蛋白片段的序列SEQ ID NO.3分别插入到两个真核表达载体中，构建得到包含有序列SEQ ID NO.2的第一载体和包含有序列SEQ ID NO.3的第二载体。本申请对真核表达载体不做限制，例如可以为pEGFP-C1、pEGFP-N1、pcDNA3.1等真核表达载体。本实施例将以质粒pcDNA3.1为例进行描述。
具体地，如图1A所示，图1A为包含有SEQ ID NO.2的第一载体的示意图。在本申请实施例中，利用双酶切位点NheI和EcoRI，将用于表达Akaluc416N蛋白片段的序列SEQ IDNO.2插入到pcDNA3.1的多克隆位点，构建成包含有序列SEQ ID NO.2的第一载体。
如图1B所示，图1B为包含有SEQ ID NO.3的第二载体的示意图。在本申请实施例中，利用双酶切位点NheI和EcoRI，将用于表达Akaluc417C蛋白片段的序列SEQ ID NO.3插入到pcDNA3.1的多克隆位点，构建成包含有序列SEQ ID NO.3的第二载体。
进一步地，第一载体还包括第一基因，用于表达第一蛋白，第二载体还包括第二基因，用于表达第二蛋白。这样，第一载体可表达第一蛋白与Akaluc416N蛋白片段形成的第一融合蛋白；第二载体可表达第二蛋白与Akaluc417C蛋白片段形成的第二融合蛋白。其中，第一蛋白与第二蛋白为两个相互作用的蛋白。
具体地，第一基因与序列SEQ ID NO.2可以通过重叠PCR的方式形成第一串联基因，以串联基因作为整体，插入至质粒中得到第一载体，如图2A所示；第二基因与序列SEQID NO.3可以通过重叠PCR的方式形成第二串联基因，以串联基因作为整体，插入至质粒中得到第二载体，如图2B所示。
例如，以包含有第一基因序列的质粒为模板，设计相应的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得第一基因。其中，第一基因用于表达第一蛋白。以包含有序列SEQ ID NO.2的质粒为模板(例如以质粒pUC57-Akaluc为模板)，设计相应的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得序列SEQ ID NO.2。再以PCR得到的第一基因和序列SEQ ID NO.2为模板，进行重叠PCR(overlap PCR)。经重叠PCR后，可得到第一基因-SEQ ID NO.2串联的第一串联基因。再利用双酶切位点，将第一串联基因插入到表达载体中，得到第一载体。
其中，可以通过overlap PCR将第一基因串联至SEQ ID NO.2基因序列的上游，也可以将第一基因串联至SEQ ID NO.2基因序列的下游。实际应用中，可根据两个基因序列的上下游顺序，设计合适的引物。例如，当决定将第一基因串联至SEQ ID NO.2基因序列的上游时，可将扩增第一基因序列时使用的上游引物作为overlap PCR时的上游引物，将扩增SEQ ID NO.2基因序列时使用的下游引物作为overlap PCR时的下游引物，同时使扩增第一基因序列时使用的下游引物和扩增SEQ ID NO.2基因序列时使用的上游引物之间具有一定的互补序列。当决定将第一基因串联至SEQ ID NO.2基因序列的下游时，可将扩增第一基因序列时使用的下游引物作为overlap PCR时的下游引物，将扩增SEQ ID NO.2基因序列时使用的上游引物作为overlap PCR时的上游引物，同时使扩增第一基因序列时使用的上游引物和扩增SEQ ID NO.2基因序列时使用的下游引物之间具有一定的互补序列。
类似地，以包含有第二基因的质粒为模板，设计相应的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得第二基因。其中，第二基因用于表达第二蛋白。以包含有SEQ ID NO.3的质粒为模板(例如以质粒pUC57-Akaluc为模板)，设计相应的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得序列SEQ ID NO.3。再以PCR得到的第二基因和序列SEQ ID NO.3为模板，进行overlapPCR。经overlapPCR后，可得到第二基因-SEQ ID NO.3串联的第二串联基因。再利用双酶切位点，将第二串联基因插入到表达载体中，得到第二载体。
其中，可以通过overlap PCR将第二基因串联至SEQ ID NO.3基因序列的上游，也可以将第二基因串联至SEQ ID NO.3基因序列的下游。实际应用中，可根据两个基因序列的上下游顺序，设计合适的引物。例如，当决定将第二基因串联至SEQ ID NO.3基因序列的上游时，可将扩增第二基因序列时使用的上游引物作为overlap PCR时的上游引物，将扩增SEQ ID NO.3基因序列时使用的下游引物作为overlap PCR时的下游引物，同时使扩增第二基因序列时使用的下游引物和扩增SEQ ID NO.3基因序列时使用的上游引物之间具有一定的互补序列。当决定将第二基因串联至SEQ ID NO.3基因序列的下游时，可将扩增第二基因序列时使用的下游引物作为overlap PCR时的下游引物，将扩增SEQ ID NO.3基因序列时使用的上游引物作为overlap PCR时的上游引物，同时使扩增第二基因序列时使用的上游引物和扩增SEQ ID NO.3基因序列时使用的下游引物之间具有一定的互补序列。
可以理解的是，本申请对可以互相作用的第一蛋白和第二蛋白不做限制，例如第一蛋白可以为FKBP蛋白，第二蛋白可以为FRB蛋白；第一蛋白可以为Bak蛋白，第二蛋白可以为Bcl-XL蛋白；第一蛋白可以为bJun蛋白，第二蛋白可以为bFos蛋白等。实际应用中，可以根据具体的研究对象确定第一蛋白和第二蛋白。又或者，在未知两个蛋白是否具有相互作用时，也可采用本申请提供的系统来进行判断作为研究对象的两个蛋白之间是否具有相互作用。
在本申请实施例中，将以bJun蛋白作为第一蛋白，bFos蛋白作为第二蛋白为例进行描述。
首先，构建第一载体。获取包含有bJun基因序列的质粒，例如质粒pbJun-iRN97，设计相应的上游引物bJun-F为：
5’-CTAGCTAGCGCCACCATGGATTATAAAGATGACGACGATAAAAAGGCGGAGAGGAAGCGC-3’
下游引物bJun-R为：
5’-AATGTTTTTGGCATCTTCCATACTTCCACCGCCACCACTCCCGCCACCTCCAAA-3’。
经过PCR，得到第一基因，即bJun基因序列。
获取包含有可表达Akaluc416N蛋白片段的质粒pUC57-Akaluc，设计相应的上游引物Akaluc416N-F为：
5’-GGTGGCGGTGGAAGTATGGAAGATGCCAAAAACATT-3’；
下游引物Akaluc416N-R为：
5’-CCGGAATTCTTAGCCGTCCTTGTCGATGAGA-3’。
经过PCR，得到序列SEQ ID NO.2，即用于表达Akaluc416N蛋白片段的基因序列。
进一步地，以bJun-F作为上游引物，Akaluc416N-R作为下游引物，对第一基因bJun基因序列和序列SEQ ID NO.2进行overlap PCR，得到第一串联基因bJun-SEQ ID NO.2。再利用双酶切位点NheI和EcoRI，把第一串联基因bJun-SEQ ID NO.2插入到pcDNA3.1载体的多克隆位点上，构建得到第一载体。
此时，第一载体可表达由bJun蛋白和Akaluc416N蛋白片段构成的第一融合蛋白bJun-Akaluc416N。
然后，构建第二载体。获取包含有bJun基因序列的质粒，例如质粒piRC98-bFos，设计相应的上游引物bFos-F为：
5’-CTAGCTAGCGCCACCATGTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTCGTGCGCAGTCCATC-3’
下游引物bFos-R为：
5’-ATGTCGCCGCTGTGCAGCCAACTTCCACCGCCACCACTCCCGCCACCTCCACC-3’。
经过PCR，得到第二基因，即bFos基因序列。
然后，获取包含有可表达Akaluc417C蛋白片段的质粒pUC57-Akaluc，设计相应的上游引物Akaluc417C-F为：
5’-GGTGGCGGTGGAAGTTGGCTGCACAGCGGCGACATCGC-3’；
下游引物Akaluc417C-R为：
5’-CCGGAATTCTTACACGGCGATCTTGCCGT-3’。
经过PCR，得到序列SEQ ID NO.3，即用于表达Akaluc417C蛋白片段的基因序列。
进一步地，以bFos-F作为上游引物，Akaluc417C-R作为下游引物，对第一基因bFos基因序列和序列SEQ ID NO.3进行overlap PCR，得到第二串联基因bFos-SEQ ID NO.3。再利用双酶切位点NheI和EcoRI，把第二串联基因bFos-SEQ ID NO.3插入到pcDNA3.1载体的多克隆位点上，构建得到第二载体。
此时，第二载体可表达由bFos蛋白和Akaluc417C蛋白片段构成的第二融合蛋白bFos-Akaluc417C。
进一步地，构建上述基于拆分荧光素酶Akaluc的蛋白片段互补系统之后，可在细胞系以及动物活体中检测该系统的荧光效果。
具体地，构建包含有第一串联基因(第一基因以及序列SEQ ID NO.2)的第一载体、包含有第二串联基因(第二基因以及序列SEQ ID NO.3)的第二载体、对照载体、以及参考载体。其中，对照载体为包含有第三基因与序列SEQ ID NO.3相串联的载体，第三基因表达的蛋白片段可以为任何无法与第一基因序列表达的蛋白片段产生相互作用的蛋白片段。构建对照载体的方法可参考上述的构建包含有第二基因序列以及序列SEQ ID NO.3的第二载体的方法，将第二基因序列替换为第三基因序列即可，在此不做赘述。参考载体可表达其他荧光蛋白，其他荧光蛋白产生的荧光可作为荧光亮度的内参。
为了方便描述，同样以bJun基因序列作为第一基因和bFos基因序列作为第二基因序列为例，但可以理解是，在实际应用中，可以根据具体的研究对象确定第一基因序列和第二基因序列。在本实施例中，构建的第一载体为bJun-SEQ ID NO.2载体，构建的第二载体为bFos-SEQ ID NO.3载体，构建的对照载体为mbFos-SEQ ID NO.3载体，构建的参考载体为pEGFP载体。其中，对照载体可表达突变的bFos蛋白片段，即mbFos蛋白片段，而mbFos蛋白片段无法与第一载体表达出的bJun蛋白片段进行相互作用。pEGFP载体可表达EGFP，该EGFP能够在488nm激发光的激发下产生荧光，以作为检测本实施例的蛋白片段互补系统的荧光效果的内参。
基于上述的蛋白片段互补系统，设置实验组和对照组。
向实验组的HEK293T细胞中，转染构建好的第一载体(pbJun-SEQ ID NO.2)、第二载体(bFos-SEQ ID NO.3)以及参考载体(pEGFP)，在37℃条件下培养转染后的实验组HEK293T细胞24小时。然后，将实验组的细胞收集，加入底物Akalumine，并将细胞接种在裸鼠的皮下。
向对照组的HEK293T细胞中，转染构建好的第一载体(pbJun-SEQ ID NO.2)、对照载体(mbFos-SEQ ID NO.3)以及参考载体(pEGFP)，在37℃条件下培养转染后的对照组HEK293T细胞24小时。然后，将对照组的细胞收集，加入底物Akalumine，并将细胞接种在裸鼠的皮下。
由于EGFP确定可以产生荧光，因此，将接种了不同细胞(对照组和实验组)的小鼠产生的荧光亮度与EGFP的亮度进行对比，可体现出本申请实施例提供的拆分荧光素酶Akaluc蛋白互补系统所产生的荧光亮度的强弱。
图3A-3B为HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和第二载体所产生的荧光亮度与HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和对照载体所产生的荧光亮度的亮度对比图。
图3C为HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和第二载体接种至裸鼠皮下后，裸鼠所产生的荧光亮度，与HEK293T细胞转染了本申请实施例提供的第一载体和对照载体接种至裸鼠皮下后，裸鼠所产生的荧光亮度的亮度对比图。
如图3B所示，转染了第一载体bJun-Akaluc416N和第二载体bFos-Akaluc417C的细胞产生的荧光亮度约为EGFP亮度的3.5倍。转染了第一载体bJun-Akaluc416N和对照载体mbFos-Akaluc417C的细胞产生的荧光亮度约为EGFP亮度的0.5倍。也就是说，转染了第一载体bJun-Akaluc416N和第二载体bFos-Akaluc417C的细胞产生的荧光亮度显著高于转染了第一载体bJun-Akaluc416N和对照载体mbFos-Akaluc417C的细胞产生的荧光亮度。
这是因为，荧光素酶Akaluc可以与底物Akalumine反应，生成光谱范围在近红外区间的生物荧光。因此，当融合蛋白中的第一蛋白和第二蛋白，例如本申请中的bJun和bFos蛋白，具有相互作用并能够相互靠近，那么二者的靠近便会使融合蛋白中的Akaluc416N蛋白片段和Akaluc417C蛋白片段也相互靠近，从而重构形成完整的具有荧光素酶功能(即，能够与Akalumine反应)的荧光素酶Akaluc。因此，通过小动物活体成像仪即可在近红外光谱区观察到荧光。
相反，当融合蛋白中的第一蛋白和第二蛋白，例如本申请实施例中的bJun和mbFos蛋白，不具有相互作用，那么也就无法相互靠近，融合蛋白中的Akaluc416N蛋白片段和Akaluc417C蛋白片段也就无法相互靠近，从而无法重构形成完整的具有荧光素酶功能(即，能够与Akalumine反应)的荧光素酶Akaluc，也就无法产生荧光。
综上可以看出，本申请提供的基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白互补系统中，在同一细胞内，表达出第一蛋白与Akaluc416N蛋白片段相串联的第一融合蛋白以及第二蛋白与Akaluc417C蛋白片段相串联的第二融合蛋白。通过第一蛋白与第二蛋白的相互作用，可以使Akaluc416N蛋白片段和Akaluc417C蛋白片段相互靠近，从而重构形成完整的、具有功能的荧光素酶Akaluc。这样，重构后的Akaluc能够与底物(Akalumine)进行反应，产生荧光。
相比于现有的双分子荧光互补系统，本申请提供一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白互补系统，包括第一载体和第二载体。其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。该系统是基于拆分荧光素酶Akaluc的互补系统，荧光素酶Akaluc能够与底物Akalumine反应，在生理温度(37℃)条件下，产生荧光。进一步地，由荧光素酶Akaluc和底物Akalumine反应所产生的荧光具有较长的波长，因此，该系统产生的荧光具有比较好的组织通透性，有利于成像观察。
以上仅为本申请的较佳实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统，其特征在于，包括第一载体和第二载体，其中，所述第一载体为包含有编码Akaluc416N蛋白片段的基因序列的载体，所述第二载体为包含有编码Akaluc417C蛋白片段的基因序列的载体，其中所述Akaluc416N蛋白片段为荧光素酶Akaluc的第1号位至第416号位氨基酸构成的蛋白片段，所述Akaluc417C蛋白片段为荧光素酶Akaluc的第417号位至第550号位氨基酸构成的蛋白片段，所述荧光素酶Akaluc是能够与Akalumine反应而产生荧光的酶。
2.根据权利要求1所述的蛋白片段互补系统，其特征在于，
当所述Akaluc416N蛋白片段和所述Akaluc417C蛋白片段相互靠近时，可重构形成所述荧光素酶Akaluc。
3.根据权利要求2所述的蛋白片段互补系统，其特征在于，所述第一载体进一步包括第一基因序列，所述第一基因序列用于表达第一蛋白，所述第一载体用于表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白为所述第一蛋白与所述Akaluc416N蛋白片段的融合蛋白。
4.根据权利要求2所述的蛋白片段互补系统，其特征在于，所述第二载体进一步包括第二基因序列，所述第二基因序列用于表达第二蛋白，所述第二载体用于表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白为所述第二蛋白与所述Akaluc417C蛋白片段的融合蛋白。
5.一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统的构建方法，所述荧光素酶Akaluc是能够与Akalumine反应而产生荧光的酶，其特征在于，包括：
以所述荧光素酶Akaluc的基因序列为模板进行聚合酶链式反应得到编码Akaluc416N蛋白片段的基因序列和编码Akaluc417C蛋白片段的基因序列，其中所述Akaluc416N蛋白片段为荧光素酶Akaluc的第1号位至第416号位氨基酸构成的蛋白片段，所述Akaluc417C蛋白片段为荧光素酶Akaluc的第417号位至第550号位氨基酸构成的蛋白片段；
利用第一质粒的双酶切位点，将所述编码Akaluc416N蛋白片段的基因序列插入所述第一质粒的多克隆位点，以得到第一载体；
利用第二质粒的双酶切位点，将所述编码Akaluc417C蛋白片段的基因序列插入所述第二质粒的多克隆位点，以得到第二载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述利用第一质粒的双酶切位点，将所述编码Akaluc416N蛋白片段的基因序列插入所述第一质粒的多克隆位点之前，所述方法还包括：
通过PCR，获得用于表达第一蛋白的第一基因序列以及用于表达第二蛋白的第二基因序列；
通过重叠PCR，获得第一基因序列与编码Akaluc416N蛋白片段的基因序列串联的第一串联基因；
通过重叠PCR，获得第二基因序列与编码Akaluc417C蛋白片段的基因序列串联的第二串联基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述利用第一质粒的双酶切位点，将所述编码Akaluc416N蛋白片段的基因序列插入所述第一质粒的多克隆位点，包括：利用第一质粒的双酶切位点，将所述第一串联基因插入所述第一质粒的多克隆位点；
所述利用第二质粒的双酶切位点，将所述编码Akaluc417C蛋白片段的基因序列插入所述第二质粒的多克隆位点，包括：利用第二质粒的双酶切位点，将所述第二串联基因插入所述第二质粒的多克隆位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述第一载体用于表达所述第一蛋白和所述Akaluc416N蛋白片段的融合蛋白；
所述第二载体用于表达所述第二蛋白和所述Akaluc417C蛋白片段的融合蛋白。
9.一种基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统在蛋白质间相互作用的成像应用，其特征在于，所述基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统为如权利要求1-4中任意一项所述的基于拆分荧光素酶Akaluc蛋白片段互补系统。
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