KR20080070838A - 활성화된 분절­폴리펩티드 및 이의 생산 방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재구성되자마자 즉각적으로 활성 단백질을 형성하는 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 실시간 단백질 보완과 관련이 있다. 또한 재구성되자마자 즉각적으로 형광 시그널을 생산하는 활성 상태의 분절-형광 단백질을 분절하는 방법과 상기 단백질을 생산하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본원은 또한 본 발명의 신규한 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들을 이용하여 실시간으로 핵산; 비핵산 분석대상물과 핵산 혼성화를 검출하기 위한 방법을 제공한다.

Description

활성화된 분절­폴리펩티드 및 이의 생산 방법 및 이의 용도{ACTIVATED SPILIT­POLYPEPTIDES AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND USE}

관련 특허출원에 대한 크로스 레퍼런스

본원은 35 U.S.C. 119(e)에 근거하여 2005년 10월 27일자로 출원된, 미국 가특허 출원 제60/730,752호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허문헌의 전체 내용은 본원의 참고문헌으로서 본원에 통합된다.

기술분야

본 발명은 급속한 생분자 단백질 보완(complementation)을 위한 신규한 활성화된 분절-폴리펩티드 단백질(split-polypeptide proteins)과 상기 단백질의 생산 방법 및 상기 단백질의 용도를 제공한다.

배경기술

단백질 보완은 상당히 신규한 방법인데, 이 방법에 따라 단백질은 활성 단백질을 형성하기 위해 재조립될 수 있는 2 이상의 비활성 단편들로 분절된다. 비활성 분절-폴리펩티드 단편들의 사용에 따른 한가지 제약은, 재구성시, 상기 단편들이 활성 단백질을 형성하기 위해 리폴딩(refolding)과 재조립(reassembly)될 필요가 있다는 것이다. 이러한 단백질들의 저조한 폴딩 특성은 급속한 동역학(kinetics)을 수반하며 실시간으로 생분자 상호작용을 검출하기 위해 상기 방법의 단백질 보완에서 비활성 분절-폴리펩티드들의 사용을 제약한다.

GFP와 이의 수많은 관련 형광 단백질들은 현재 단백질 태그 물질(protein tagging agents)로서 널리 사용되고 있다(검토를 위하여, 다음 문헌을 참조하라: Verkhusha et al., 2003, Ch. 18, pp. 405-439). 또한, GFP는 말단에 융합된 시험 단백질들에 대한 용해도 리포터로서 사용되어 왔다(Waldo et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:691-695; U.S. Pat. No. 6,448,087). GFP-유사 단백질들은 그 수가 증가하는 추세의 단백질 패밀리인데, 보존된 11개의 베타-가닥 "배럴(barrel)" 구조를 공유하는, 상동성있는, 25-30 kDa 폴리펩티드들이다. GFP-유사 단백질 패밀리는 현재, 여러 종의 화충류(Anthozoa)와 히드로충류(Hydrozoa)에서 클로닝된, 대략 100개의 구성원들을 포함하며, 적색 형광 단백질, 노란색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질 및 다양한 비형광 색소단백질(chromoproteins)을 포함한다(Verkhusha et al., 전게서). DsRED와 다른 적색 형광 단백질을 포함하는, 스펙트럼 범위가 넓은 GFP 스펙트럼 변이체와 GFP-유사 형광 단백질(Clontech, Palo Alto, Calif; Amersham, Piscataway, NJ.)을 포함하는, 매우 다양한 형광 단백질 표지 분석법과 키트를 상업적으로 활용할 수 있다.

GFP와 관련 단백질의 용해도를 개선하기 위한 다양한 전략이 보고되었으며, 그 결과 개선된 폴딩, 용해도 및 섭동허용(perturbation tolerance) 특성을 갖는 다수의 돌연변이체의 생성이 초래되었다. 기존의 단백질 태깅(tagging)과 검출 플랫폼은 강력하나 몇가지 결점을 지니고 있다. 분절 단백질 태그는 단백질 용해도를 교란하거나(Ullmann, Jacob et al. 1967; Nixon and Benkovic 2000; Fox, Kapust et al. 2001; Wigley, Stidham et al. 2001 ; Wehrman, Kleaveland et al. 2002) 살아 있는 세포에서 작동하지 아니할 수 있다(Richards and Vithayathil 1959; Kim and Raines 1993; Kelemen, Klink et al. 1999). 녹색 형광 단백질 융합은 오접(misfolding)을 일으키거나(Waldo, Standish et al. 1999) 변형된 가공(processing)을 나타낸다(Bertens, Heijne et al. 2003). 형광체성 바이아세닉(Fluorogenic biarsenical) FLaSH 또는 ReASH(Adams, Campbell et al. 2002) 기질은 상기 많은 제약을 극복하였으나, 폴리시스테인 태그 모티프, 환원성 환경, 및 세포 트랜스펙션 또는 투과성(permeabilization)을 필요로 한다(Adams, Campbell et al. 2002).

GFP 단편 재구성 시스템은 주로 단백질-단백질 상호작용에 관해 소개되었으나, 어느 시스템도 올바르게 폴딩되며, 가용성이며 형광을 나타내는 재구성된 GFP로 비보조된 자가-조립을 할 수 없다. 또한, 일반적인 분절 GFP 폴딩 시스템은 상기 접근법에서 등장하지 아니하였다. 예를 들어, 고쉬 등(Ghosh et al, 2000)은 2개의 GFP 단편들(GFP 구조의 아미노산 1-157과 158-238에 해당함)은, 개개의 단편들이 역평행 류신 지퍼(antiparallel leucine zipper)를 형성할 수 있는 코일링된 코일(coiled-coil) 서열에 융합될 때, 재구성되어 시험관내 또는 대장균에서의 동시발현(co-expression)으로 형광 산물을 생성시킬 수 있다고 보고하였다(Ghosh et al., 2000, J. Am. Chem. Soc. 122: 5658-5659). 이와 유사하게, 미국 특허 제6,780,599호는 GFP 분자의 분절 단편에 결합할 수 있는 역평행 류신 지퍼를 형성할 수 있는 헬릭스 코일(helical coils)의 용도를 개시하고 있다. 그러나, 상기 방법은 양성 시그널을 획득하는데 2일이 소요되며 그로인해 이를 사용하는 것은 너무나 비실용적이다.

유사하게, 후 등(Hu et al., 2002)은 상호작용하는 단백질들(bZIP와 Re1)이, GFP의 2개의 단편들에 융합될 때, 그들 간의 상호작용에 의해 GFP 재구성을 매개할 수 있다는 것을 보여주었다(Hu et al., 2002, MoI. 세포 9: 789-798). 나가이 등(Nagai et al., 2001)은 칼모둘린과 Ml3에 융합된 노란색 형광 단백질(YFP)의 단편들은 칼슘 존재하에 YFP의 재구성을 매개할 수 있다는 것을 보여주었다(Nagai et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3197-3202). 상기 접근법의 변형에서, 오자와 등(Ozawa at al.)은 칼모둘린과 M13을 자가-스플라이싱 인테인 폴리펩티드 서열을 거쳐 2개의 GFP 단편들에 융합시켰고, 그에 따라 칼슘 존재하에 GFP 단편들의 공유결합성 재구성을 매개하였다(Ozawa et al., 2001, Anal. Chem. 72: 5151-5157; Ozawa et al., 2002 Anal. Chem. 73: 5866-5874).

앞서 언급한 GFP 재구성 시스템들이 2개의 스펙트럼 상 독특한 형광 단배질 태그들의 사용을 능가하는 이점을 제공하기는 하지만, 상기 시스템들은 단편들의 크기와 그에 따른 저조한 폴딩 특성(Ghosh et al., Hu et al., supra), 화학적 라이게이션에 대한 요구, 및 폴딩되어 있고 형광을 나타내는 검출가능 GFP를 생상하기 위해서 동시-발현 또는 동시-리폴딩(Ghosh et al., 2000; Hu et al., 2001, 전게서)에 의해 제약을 받았다.

저조한 폴딩 특성은 이들 단편들과 다른 비활성 분절-폴리펩티드 단편들의 사용을 제한하는데, 상기 단편들은 감소된 형광을 지니거나 실시간 분석에 유용할 수 있는 생체내 형광을 나타내는데 너무나 오래 걸리기 때문이다. 또한, 상기 단 편들은 보완 이전에 각각의 단편들에 대하여 장기간의 안정성과 용해도를 요구하는 시험관내 분석법에서는 유용하지 아니하다.

활성 단백질의 형성을 위한 재구성시 리폴딩될 필요가 없는 분절-형광 폴리펩티드의 생산은 활성 단백질의 생성을 위한 래그 타임(lag time)을 제거할 것이고, 실시간 단백질 보완 분석법에 사용될 수 있을 것이다.

이상적인 분절-폴리펩티드 단편은 유전자적으로 엔코딩될 것이고, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 작동할 것이고, 가역적인 민감한 분석 시그널을 제공할 수 있으며, 활성 단백질과 그에 따라 표적 인식시 시그널을 즉각적으로 생산할 수 있을 것이다. 그러나, 현재까지, 실시간 단백질 보완의 목적을 충분히 달성하는 이미(already) 활성화된, 분절-폴리펩티드 단편들은 개시된 바가 없다.

발명의 요약

본 발명은 DNA, RNA 표적을 포함하는 표적 핵산 분자뿐만 아니라, 핵산 유사체와 비핵산 분석대상물(analytes)의 실시간 검출을 위한 신규한 시스템을 지향한다. 특히, 본 발명은 분자와 상기 분자의 생산과 사용에 관한 방법을 포함한다. 본 발명의 분자는 i) 활성화된 분절-폴리펩티드의 재구성을 통해 실시간으로 그리고 인지와 검출 사이의 래그 타임이 거의 없이 핵산과 비핵산 분석대상물을 검출할 수 있고; ii) 이의 표적 분자, 예컨대, 핵산 또는 분석대상물의 검출을 위한 반응에서 이의 시그널을 가역적으로 증가 및 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 상기 분자는 재구성시 즉각적으로 활성 단백질을 형성하는 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 혼성화-유도 보완(hybridization-driven complementation)에 기반한다. 또 다른 구체예에서, 상기 분자는 표적 분석대상물에 대한 분절-폴리펩티드 단편의 결합에 기반한다. 단백질 보완 방법에 사용되는 단백질은 단편들로 쪼개질 수 있고 활성 단백질을 형성하기 위해 재구성될 수 있는 임의의 단백질일 수 있는데, 특히, 형광 특성의 효소 활성, 예를 들어, 형광체 활성(fluoogenic activity) 또는 색원체 활성(chromogenic activity)을 갖는 활성 단백질을 생성시키는 마커 단백질일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 분절-폴리펩티드는 형광 단백질 또는 폴리펩티드인데, 여기서 상기 분절-형광 단편들 중 하나는 미리형성된 발색단을 포함한다. 이와 같은 구체예에서, 상기 발색단은 미리 형성되어 있고 이의 성숙한 형태로 존재하므로, 통상의 기술자는 형광 시그널을 위한 발색단이 형성될 때까지 기다릴 필요가 없다.

본 발명의 분자는 핵산 진단학, 병원체 모니터링 및 바이오컴퓨팅(biocomputing)과 같은, 다양한 생분자 응용분야의 실시간 모니터링에 유용하다.

본 발명의 활성화된 분절-폴리펩티드는 분절될 수 있고, 재결합되자마자, 즉각적으로 활성 단백질을 형성하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 활성화된 분절-폴리펩티드는, 예를 들어, 색원체 활성을 지닌 효소 또는 형광 단백질과 같은, 효소 활성 또는 형광체 활성을 지닌 단백질을 포함한다.

본 발명의 한 양상은 성숙한 미리형성된 발색단을 포함하는 활성화된 형광 폴리펩티드 단편들의 생산을 포함하는데, 상기 단편들은 이의 상응하는 형광 폴리펩티드 파트너와 결합될 때 즉각적인 형광을 나타낼 수 있으며, 분리되어 있을 때 형광을 나타내지 아니한다. 한 구체예에서, 발색단은 용매에 노출되며 용매에 의 해 켄칭되기 때문에 단편 내에서 형광을 나타내지 아니하며, 다른 단편의 아미노산들과 필요한 접촉이 결여되어 있다. 2개의 단백질 단편들이 핵산 보완 상호작용에 의해 서로에 대해 근접하게 될 때, 제 2 폴리펩티드는 용액으로부터 발색단을 분리시키고, 즉각적인 형광의 발생을 초래하는, 모든 소실된 아미노산 접촉의 회복을 가능케 하는 차폐물(shield)로서 역할한다. 단편들 중 하나에 존재하는 미리형성된 발색단은 이의 상보적인 단백질 단편과의 결합시 사실상 즉각적인 형광 발광을 가능하게 한다. 즉각적인 형광발광은 발색단이 미리 형성되어 있기 때문에, 그에 따라 이의 올바른 폴딩 및 형성을 위하여 요구되는 래그 타임이 비소요되기 때문에 일어난다.

한 구체예에서, 본 발명은, 본원에서 생분자 컨스트럭트(biomolecular construct)로 지칭될 수도 있는, 분절-폴리펩티드 분자를 생산하기 위한 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 한 단편에 발색단이 이미 존재하는 분절된 형광 단백질들과 같은, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 시험관내 분리를 위한 방법을 제공한다. 특히, 상기 분절-폴리펩티드 단편들은 작은 자가-분절 Ssp DNAB 인테인을 지닌 융합 단백질로서 대장균 내에서 발현된다. 이러한 폴리펩티드들은 리폴딩 후 봉입체로부터 분리되는데, 상기 리폴딩은 한 단편 내부의 발색단이 성숙되게 하나, 이의 형광을 성숙시키지는 아니한다. 숙주 세포 폴리펩티드들 및 다른 숙주 세포-유래성 불순물들로부터 매우 효과적인 방식으로 활성화된 분절-폴리펩티드 단백질을 포함하는 봉입체를 정제하는 것은 가능한데, 상기 봉입체에 포함된 대부분의 모든 물질들은 단백질 정제를 가능하게 하나, 상기 단백질들을 변성시키지 아니하는, 변성 조건(denaturing conditions) 하에서 용이하게 용해되기 때문이다. 인테인은 단백질 정제를 촉진하며 분절-폴리펩티드 단백질 단편들의 구졸르 변형시키지는 아니한다. 인테인 이외의 펩티드들이 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 본 발명의 정제 방법에서 사용될 수 있다.

분절-폴리펩티드 단편이 분절-형광 단백질인, 몇몇 구체예들에서, 한 단편은 활성이 있으나 형광을 나타내지 않는 상태의 미리형성된 성숙한 발색단을 포함한다. 성숙한 상태이나, 아직 비활성 상태인 발색단의 분리는 상기 발색단의 상응하는 단편과 보완시에 즉각적으로 활성이 검출될 수 있게 한다.

한 구체예에서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)이다. 대안적인 구체예들에서, 상기 형광 단백질은 노란색 형광 단백질(YFP), 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP), 파란색 형광 단백질(BFP), 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP) 또는 적색 형광 단백질(dsRED) 또는 상기 나열된 단백질의 임의의 다른 천연 형광 단백질 또는 유전자적으로 조작된 형광 단백질이다. 추가의 구체예에서, 재구성된 형광 단백질들은 상기 나열된 형광 단백질들 중 임의의 단백질과 동일한 단백질 또는 이들의 조합물로부터의 단편들의 혼합물을 포함할 수 있다.

형광 단백질이 EGFP인 구체예에서, 상기 EGFP 단백질은 알파 단편(대략 아미노산 1-158)과 베타 단편(대략 아미노산 159-239)으로 분절된다. 상기 알파 단편은 성숙한 발색단을 함유하는데, 상기 발색단은 단독으로는 형광을 나타내지 아니하나, 베타 단편과 쌍을 이룰 때 형광을 나타낼 수 있도록 프라이밍(priming)된다. 발색단이 미리형성되기 때문에, 발색단은 즉각적으로 형광발광할 수 있다. 중요하게, 알파 및 베타 단편들은 촉진된 결합의 부재하에 재결합하거나 형광을 나타내지 못한다. 또한, 재조립된 EGFP는, EGFP의 488/507 nm와 비교할 때, 490/524 nm로의 적색 편이된 여기/방출 최대파장(maxima)을 지닌다. 더욱이, 본원에 기재된 재조립된 EGFP는 Mg²⁺의 존재시 안정화된다.

본 발명의 대안적인 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은, 효소 활성 분석을 이용하여 검출될 수 있는, 활성 효소의 단편들을 포함할 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 효소 활성은 색소 또는 형광 반응에 의해 검출된다. 한 구체예에서, 효소는 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 β-락타메이즈이다.

본 발명의 또 다른 양상은 활성화된 분절-폴리펩티드 분자이다. 한 구체예에서, 상기 분자는 2 이상의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들을 포함하는데, 각각의 단편은 핵산 결합 모이어티(moieties) 또는 핵산 결합 모티프(motifs)에 커플링된다. 핵산 결합 모이어티는, 이에만 국한되는 것은 아니나, 예를 들어, 기재된 핵산 표적에 특이적인, DNA, RNA와 같은 핵산, PNA, LNA와 같은 핵산 유사체 및 다른 유사체와 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 핵산 결합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 상기 핵산 결합 모이어티는 2이상의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 커플링되며, 근접 위치에서의 표적 핵산과의 이들의 결합은 즉각적인 활성 단백질의 형성과 즉각적인 시근널 생성을 촉진한다. 활성화된 분절-폴리펩티드 분자가 활성화된 분절-형광 단편들을 포함할 경우, 활성화된 형광 단편들의 밀접한 결합은 결과적으로 즉각적인 형광발광을 초래한다. 상기 핵산-결합 모이어티는 단일 부위에 결합하기 위해 독립적으로 기능하거나 협동하여 기능함으로써 표적 핵산과 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 표적 핵산은, 예를 들어, DNA, RNA, PNA 또는 핵산의 유사체 또는 변이체일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 핵산 결합 모이어티는 유연한 링커(flexible linkers)를 통해 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 컨주게이션된다. 한 구체예에서, 링커는 비오틴-스트렙트아비딘 화학(chemistry)(예를 들어, 도 1을 참조하라). 이와 같은 구체예에서, 2개의 형광 단편들은, 설프히드릴-반응 시약을 이용한 비오틴표지화(biotinylation)(비오틴-HPDP)로 인해, 각각, C- 및 N-말단에서 여분의 시스테인 잔기들과 함께 발현될 수 있다. 그 후 C- 및 N-말단에 비오틴표지된 폴리펩티드들은 비오틴표지화된 핵산 결합 모이어티(예를 들어, 스트렙트아비딘을 통해 올리고뉴클레오티드)에 커플링될 수 있다. 스트렙트아비딘, 고-친화력 비오틴-결합 단백질은 링커로서 역할한다. 대안적인 구체예들에서, 상기 유연한 링커의 변형은 각각의 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 및/또는 C-말단 아미노산을 시스테인으로 변형시키는 것을 포함하며, 상기 핵산 결합 모이어티(또는 올리고뉴클레오티드)의 3' 또는 5' 말단의 티올기는 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인에 대한 커플링을 가능하게 한다.

대안적인 구체예에서, 본 발명의 형광 단백질 단편들에 커플링된 핵산 결합 모이어티는, 다른 핵산 결합 분자일 수 있는데, 비제한적인 예로서, PNA, 앱타머, RNA 등일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 RNA- 또는 DNA-결합 단백질일 수 있다. 상기 형광 단백질들은 핵산-결합 모티프들에 덧붙여진 2개의 비활성 단편들일 수 있는데, 여기서 상기 핵산 결합 모티프들은 독립적으로 기능하거나 협조하여 단일 부위에 결합할 수 있다. 형광 단백질의 전장-길이(full-size) 단백질로의 재결합은, 예컨대, RNA 상의 RNA-결합 단백질의 동종(cognate) 결합 부위(들)에 대한 RNA-결합 단백질의 상호작용으로서, 표적 결합 부위 존재시에만 일어날 것이다. 상기 상호작용은 형광 단백질의 2개의 절반(halves)을 접합시켜, 시그널 검출을 가능하게 할 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 2개 이상의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들을 포함하는 활성화된 분절-폴리펩티드 분자인데, 각각의 단편들은 비핵산 분석대상물의 결합 모티프에 커플링된다. 이와 같은 비핵산 결합 모티프들은, 이에만 국한되는 것은 아니나, 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 다른 구체예들에서, 비핵산 분석대상물에 대한 결합 모티프는, 예를 들어, 생분자, 유기 분자 또는 무기 분자일 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 상기 표적 분석대상물은, 예를 들어, 생분자, 무기 분자 또는 유기 분자, 또는 이의 변이체일 수 있다.

형광 단백질이 사용될 경우, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), GFP-유사 형광 단백질(GFP-like), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 노란색 형광 단백질(YFP), 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP), 파란색 형광 단백질(BFP), 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP); 청록색 형광 단백질(CFP), 강화된 청록색 형광 단백 질(ECFP), 적색 형광 단백질(dsRED) 및 이의 변이체를 포함하는 군에서 선택딜 수 있다.

한 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 분자는 핵산 분자들에 대한 실시간 검출 방법을 제공한다. 표적 핵산 분자는 DNA, RNA뿐만 아니라, 핵산 유사체일 수 있다. 표적 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 상기 표적 핵산은 분절-형광 분자에 대한 노출 이전에 증폭될 수 있다. 예를 들어, 순환주기증폭(rolling circle amplification, RCA)은 다수의 동일한 혼성화 부위들을 지니는 단일-가닥 DNA 표적을 생산하는데 사용될 수 있는데, 상기 부위에는 보완 복합체의 프로브들이 결합한다.

한 구체예에서, 결합 모이어티는 표적 핵산 상의 2개의 인접 서열들에 결합하는데, 한 핵산 결합 모이어티는 제 1 표적 서열에 결합하고 제 2 핵산 결합 모이어티는 제 2 표적 서열에 결합한다. 이 구체예에서, 상기 인접 서열들은, 두 결합 모이어티들이 표적에 결합될 때, 제 1 및 제 2 폴리펩티드들이 상호작용할 수 있을 정도로 각자 서로에 대해 충분히 가깝게 존재하여 형광 단편들의 보완을 가능케 한다. 이 구체예는 단일-가닥 및 이중-가닥 표적 핵산의 검출을 제공한다. 이중 가닥 표적들의 검출의 경우, 단일-가닥 프로브는 이중-가닥 표적과 상호작용하여 삼중가닥(triplex)을 형성한다.

대안적인 구체예에서, 두 핵산 결합 모이어티들은 핵산 또는 올리고뉴클레오티드이고, 단일-가닥 표적 핵산 상의 동일한 서열에 결합하여, 삼중가닥을 형성한다. 이 구체예에서, 형광 단편의 보완은 두 결합 모이어티들이 핵산 표적 상의 동 일 서열과 상호작용할 때 일어난다.

삼중가닥의 형성을 제공하는 여러 구체예들에서, 프로브는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 삼중가닥-형성 올리고뉴클레오티드는 GC 함량이 풍부(GC-rich)하다. 바람직한 삼중가닥은 피리미딘-퓨린-퓨린으로 이루어진, 퓨린 삼중가닥이다.

한 구체예에서, 본 발명은 샘플 내에 존재하는 표적 핵산의 존재 및/또는 이의 양에 대한 실시간 검출 방법을 제공한다. 표적 핵산을 포함한 샘플은 분절 형광 분자, 분절 형광 단편들의 보완 및 핵산 결합 모이어티들이 표적 핵산에 결합할 때 발생하는 형광의 즉각적인 생성을 수반하는 혼성화 조건하에서 접촉된다. 형광이 존재 및/또는 이의 양은 표적 핵산의 존재 및/또는 이의 양에 대한 지표가 된다.

본 발명은 또한, 심지어 비표적 핵산이 존재하는 경우라 하더라도, 샘플 내의 표적 핵산을 분리하기 위한 방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법들은 실시간 핵산 진단법(diagnostics)을 제공한다. 특히, 샘플 내의 병원체 핵산에 대한 검출. 한 구체예에서, 핵산 진단법은 바이러스 핵산의 실시간 검출에 사용된다. 이와 같은 구체예에서, 본 발명의 분자는 분절 형광 단백질이 특정 바이러스 뉴클레오티드 서열 또는 바이러스 뉴클레오티드 서열의 변이에 기인한 뉴클레오티드 서열에 특이적인 핵산 결합 모이어티 또는 올리고뉴클레오티드에 결합되도록 디자인된다.

대안적인 구체예에서, 본 발명의 분자는 핵산 혼성화에 있어서 변화를 즉각 적으로 검출할 수 있게 한다. 예를 들어, 표적 핵산의 존재시, 활성화된 분절-폴리펩티드의 2개의 절반들은 결합하여 즉각적으로 활성 단백질을 형성하고 그에 따라 실시간적으로 시그널 생성을 가능케 한다. 특히, 분자의 분절-폴리펩티드 단편들이 활성화된 분절-형광 단편들을 포함하는 경우에 있어서, 형광 시그널의 즉각적인 생성. 그러나, 표적 핵산을 활용할 수 없게 되면, 예컨대, 과량의 경쟁적 억제자가 존재할 때, 활성 단백질은 분해(disassociation)되고 시그널은 흩어져 없어지며 더이상 검출되지 못하게 된다. 상기 분리는 시그널 및/또는 형광에서의 감소로 검출될 수 있으며 이와 같은 검출은 즉각적이다. 분리에 따른 검출의 즉시성(immediacy) 종래 기술분야의 분자들에서 현재까지 이용불가능하다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 컨주게이션된 뉴클레오티드 결합 모이어티로서 역할하는 올리고뉴클레오티드들의 혼성화에 대한 즉각적인 실시간 검출 방법을 제공한다. 예를 들어, 국소 가열(localized heating)(이의 전체내용이 참고문헌으로써 본원에 인용되는, 하매드-쉬페리리 등의 논문(Hamad-Schifferli et al., Nature, vol. 415, 10 January 2002)에 소개된 바와 같음)은 결합된 올리고뉴클레오티드들을 변성시켜, 그리하여 형광을 차단(shut-off)시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질 단편들은, 분리시, 활성 단백질의 시그널이 즉각적으로 켄칭되거나 개선된다는 점에서 독특하다. 상기 단편들은 또한 올리고뉴클레오티드들이 재결합될 수 있게 되면, 시그널이 즉각적으로 재형성된다는 점에서 독특하다. 이 구체예에서 본 발명에 따른 분자의 사용은 통상의 기술자가 효율적으로 다수의 온-오프 사이클링이 요구되는 다양한 분석을 수행 및 이 로부터의 결과를 기록할 수 있게 하며 핵산 혼성화 사건들에 대한 실시간 광학 가시화를 가능하게 한다. 더 나아가, 본 발명의 방법들은 혼성화를 방해 또는 촉진하고/하거나 핵산 혼성화 사이클링 사건을 방해하는 물질에 대한 스크리닝을 가능하게 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 개체 또는 피검체 내의 유전자 돌연변이, 다형성(polymorphisms), 또는 변이에 대한 실시간 검출이 가능하게 한다. 생물학적 샘플이 개체로부터 분리되며, DNA 및/또는 RNA가 추출된다. 본 발명의 분자는 상기 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들이 통상의 기술자가 검출하려고 시도하는 특정 돌연변이, 다형성 또는 변이에 특이적인 올리고뉴클레오티드들에 결합되도록 디자인된다. 대안적으로, 한 풀(pool)의 분자들이 사용되어 그에 따라 다수의 돌연변이, 다형성, 또는 변이가 검출되도록 할 수 있다. 이 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 부착된 올리고뉴클레오티드들은 각자 서로에 대해 상보적이며 그에 따라 기준(baseline)은 활성 단백질에서 나온 시그널이 된다. 이후 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA는 분자(들)에 접촉된다. 샘플이 획득된 개체가 특정 돌연변이 또는 다형성을 지니는 경우, 상기 돌연변이 또는 다형성은 분절-폴리펩티드 분자와 경쟁할 것이며 활성 단백질 시그널을 감소시킬 것이다. 개체의 DNA 및/또는 RNA는 활성화된 분절-폴리펩티드 분자와 접촉하기 전에 증폭될 것이다. 이것은 특히 공지된 다형성들 중 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출에 유용하다. 본 발명의 분자는 시그널 및/또는 형광 생성의 즉시성으로 인하여 민감한 검출이 가능하게 한다.

유사한 구체예에서, 본 발명은 개체로부터의 생물학적 샘플 내의 분석대상물, 특히 비핵산 분석대상물의 실시간 검출을 가능하게 한다. 생물학적 샘플은 표적 분석대상물을 포함하는 피검체로부터 분리된다. 몇몇 구체예들에서, 표적 분석대상물은 추출될 수 있다. 본 발명의 분자는 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들이 검출하고자 하는 분석대상물에 특이적인 결합 모티프들에 컨주게이션되도록 디자인된다. 대안적으로, 한 풀의 분자들 또는 분석대상물들을 포함하는 샘플은 하나 이상의 분석대상물들이 검출될 수 있는 경우에 사용될 수 있다. 이 구체예에서, 분석대상물에 대한 결합 모티프는 시험될 분석대상물에 특이적인 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 부착되고 난 다음, 분석대상물을 포함하는 생물학적 샘플에 접촉된다. 샘플이 획득되는 피검체가 특정 분석대상물을 갖는 경우, 분절-폴리펩티드 단편들은 활성화된 분절-폴리펩티드 분자로 하여금 재결합되게 할 것이다. 이것은 샘플 내의 단일 및 다수 분석대상물들에 대한 검출시, 특히, 검출 단백질(detector proteins)이 형광 단백질일 때, 및 단편들이 상이한 형광 스펙트럼을 갖는 상이한 형광 단백질로부터 유래될 때, 특히 유용하다. 본 발명의 분자는 시그널 및/또는 형광 생성의 즉시성으로 인하여 민감한 검출을 가능하게 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 핵산 또는 표적 비핵산 분석대상물의 존재 및/또는 이의 양을 검출하는데 적당한 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 적어도 활성화된 분절-형광 단백질 분자의 성분들, 즉, 미리형성된 발색단을 포함하는 제 1 형광 단편과, 즉각적인 형광을 위해 제 1 단편을 보완하는 제 2 형광 단백질 단편을 포함한다. 대안적인 구체예들에서, 상기 키트는 적어도 활성화된 분절-폴리펩티드 분자의 성분들을 포함하는데, 여기서 상기 활성화된 분절-폴리펩티드는 재구성되어 색원체 활성을 지니는 효소를 형성한다. 몇몇 구체예들에서, 분석대상물의 핵산 결합 모이어티들 또는 결합 모티프는 활성화된 분절-폴리펩티드 단백질 단편들과 이미 결합되어 있다. 대안적인 구체예들에서, 분절-폴리펩티드 단편들은 설프히드릴-반응 시약(비오틴-HPDP)으로 비오틴표지화될 수 있다. 이와 같은 키트에서, 키트는 분절-폴리펩티드 단편들과 사용자들 소유의 관심있는 결합 모이어티의 커플링을 위한 시약을 포함한다. 몇몇 구체예들에서, 키트는 또한 샘플 내의 표적 핵산 또는 표적 비핵산 분석대상물의 존재 또는 양을 포착 및/또는 검출하는데 적당한 시약을 포함한다. 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시약은 효소 활성 시약 또는 조립된 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 상기 항테는 표지될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1: DNA 혼성화에 의해 조절되는 형광 단백질-기반 광학 나노-스위치의 디자인. 형광 단백질(EGFP)은 2개의 비형광 단편들로 분절되는데, 한 단편은 전장-크기 단백질 내부에서 형광을 밝게 나타낼 수 있는 미리-형성된 발색단을 포함한다. 두 단백질 단편들은 비오틴-스트렙트아비딘 상호작용을 통해 상보적인 올리고뉴클레오티드들에 연결된다; 한편, 스트렙트아비딘은 최대 4개의 비오틴 분자에 결합할 수 있는데, 본 발명자들의 프로토롤에서, 본 발명자들은 단백질/스트렙트아비딘/올리고뉴클레오티드 복합체의 비가 1:1:1임을 확신한다. 혼합물에서, 상기 2개의 뉴클레오단백질 컨스트럭트들은, 거대 및 소 EGFP 단편들의 보완을 촉발시켜 결 과적으로 형광의 급속한 발달(스위치-온 상태)을 초래하는, 서열-특이적 이중나선 DNA 형성으로 융합되게 된다. 올리고뉴클레오티드들 중 어느 하나의 과량 첨가는 상응하는 뉴클레오단백질 성분을 대신하게 되고 형광을 꺼뜨린다(스위치-오프 상태).

도 2A-2D: DMD 시뮬레이션으로 분석된 거대 EGFP 단편(1-158 N-말단 아미노산)의 구조. 도 2A. 온도에 관한 함수로 나타낸 거대 EGFP 단편의 위치 에너지(표준 편차는 에러 바로 도시됨). 단백질 폴딩은 전이점(transition point) T_F~0.60에 근접한 좁온 온도 범위 이내에서 일어난다. 도 2B. T_F 근처에서 단백질 구조는 폴딩된 상태(하단 라인)와 비폴딩된 상태(상단 라인) 사이에서 급속하게 변화함을 입증하는 T = 0.59 에서의 시뮬레이션 시간의 함수로 나타낸 위치 에너지의 궤적(potential energy trajectory). 도 2C. DMD 시뮬레이션으로 획득된 거대 EGFP 단편의 10개의 폴딩 및 정렬된 구조의 골격 대표도. 발색단-형성 아미노산(T66, Y67 및 G68)을 포함하는, 아미노산 62로부터 70까지의 세그먼트는 파란색으로 채색되어 있다. 상기 폴리펩티드의 C-말단은 이 분자의 나머지 아미노산과의 소수의 접촉으로 인해 매우 유연한데, 상기 정렬은 상응하는 아미노산들을 생략함으로써 도시되었다. 도 2D. DMD-폴딩된 거대 EGFP 단편들(파란색) 중 어느 하나와 전장 길이 EGFP(노란색)의 골격 정렬. 여기서, 두 폴리펩티드들의 상기 발색단-형성 잔기는 적색으로 도시되어 있다. 도 2E. 폴딩된 거대 EGFP 단편의 각 잔기에 대한 평균제곱근편차(root-mean-square deviation, RMSD). 상기 발색단-형성 잔기는 음 성 지역에 존재하며 이들의 공간적 정렬은 본질적으로, 2이하의 편차와 함께, 고정되어 있다.

도 3A-3C: 클로닝된 EGFP 단편들의 스펙트럼 특성. 도 3A. 대장균 내에서 과발현되었으며 인테인 자가-스플라이싱 기술을 사용하여 분리된 거대(레인 1) 및 소(레인 2) EGFP 단편들을 포함하는 대표적인 단백질 샘플들의 SDS-PAGE 분석(15% PAGE). 레인 M은 단백질 분자량 래더(ladder)에 해당한다. 거대 및 소 EGFP 단편들은 각각, ~15 kD 및 ~10 kD 밴드로 나타난다(적색 별표로 표시됨). 상기 소 EGFP 단편은 실제로 순수한 반면, 상기 거대 EGFP 단편은 인테인(~25 kD) 및 비분절 융합체(~40 kD)에 의해 다소 오염되어 있다. 도 3B. 거대(곡선 1) 및 소(곡선 2) EGFP 단편들을 지닌 단백질 샘플들의 흡수 스펙트럼. 상기 단백질 샘플들은 각각의 파장에서 이들의 흡수 범위를 보여주는 2개의 전형적인 스펙트럼에 의해 대별된다(PBS 완충액(pH 7.4) 중의 40 μM의 EGFP 단편에 해당함). 곡선 3: 40 μM 스트렙트아비딘; 인세트(inset): 2 μM EGFP. 도 3c. 거대 EGFP 단편(PBS 완충액(pH 7.4) 중의 2 μM)의 형광 여기(곡선 1) 및 방출(곡선 2) 스펙트럼.

도 4A-4B: DNA 혼성화-유도 광학적 나노-스위치의 조립 및 성능. 도 4A. 고정량의 스트렙트아비딘과 결합된 증가된 양의 비오틴표지된 EGFP 단편들(2 μg; 60-kD 밴드)의 겔-이동도 분석(SDS-10% PAGE). 적색 화살은 1:1 복합체(70-75-kD 밴드)로 귀결되는 단백질 양을 나타내는데, 이는 > 70%의 비오틴표지화 수율에 해당한다. 도 4B. 거대 또는 소 EGFP 단편, 스트렙트아비딘 및 상응하는 올리고뉴클레오티드를 포함하며 도 1에 도시된 1:1:1의 세부분으로 이루어진(tripartite) 분 자 구조물(constructions)의 형성을 입증하는 겔-이동도 분석(10% PAGE). 레인 1 및 2: 스트렙트아비딘에 커플링된 거대 EGFP 단편의 부재시(1) 또는 존재시(2)의 비오틴표지된 올리고 1; 레인 3 및 4: 스트렙트아비딘에 커플링된 소 EGFP 단편의 부재시(1) 또는 존재시(2)의 비오틴표지된 올리고뉴클레오티드 2; M: 20-bp 사이즈 마커. 적색 화살은, 예상되는 바와 같이, 상방향으로 강하게 이동된, 필요한 올리고뉴클레오티드-단백질 복합체의 위치를 표시한다. 도 4C. PBS 완충액(pH 7.4) 중에 ~200 nM 농도로 취해진, 세부분으로 이루어진 분자 구조물(2)로부터 나온 DNA 혼성화에 의해 재조립된 온전한 EGFP(1) 및 분절 EGFP-기반 단백질 복합체의 형광 스펙트럼(스펙트럼은 혼합 후 20분 경과시 기록됨). 곡선 3: 샘플 2 + 100-배 과량의 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드들 중 어느 하나(비오틴으로 표지되지 않은 올리고 1)와 동일. 곡선 4: 스트렙트아비딘에 커플링된(그러나 올리고뉴클레오티드는 제외됨) EGFP 단편들을 포함하는 대조군. 인세트는 524 nm에 기록된 샘플 2에서의 형광 발달의 시간 경과를 보여준다. 도 4D. 온전한 EGFP(파란색) 및 이중나선 DNA(자주색)를 포함하는 재조립된 분절 EGFP 복합체에 대한 Mg⁺² 양이온의 효과. 컬럼 1: Mg⁺² 없음; 컬럼 2 및 3: 2 mM Mg⁺² 첨가 후 2 분 및 3 시간.

도 5: 전장 길이 EGFP는 이의 거대 단편 보다 더 안정하다. 그래프는 전장 길이 EGFP와 비교하였을 때의 거대 EGFP 단편(aka 알파 도메인)의 폴딩 열역학을 보여주며; 전장 길이 EGFP가 더 높은 전이 온도 T_F를 갖는 다는 것은 명백하다. 분명하게, 안정도의 증가는 거대 및 소 EGFP 단편들 사이의 상호작용의 결과이다. 따라서, 더 작은 EGFP 도메인의 존재는 실질적으로 전장 길이 단백질의 폴드(fold)를 안정화시킨다. 폴딩된 EGFP 구조: X-레이 구조(PDB 코드 Ic4f; S65T GFP 돌연변이체/pH 4.6); 본 발명자들은 이 구조를 천연 EGFP 폴드로서 생각하는데, 그 이유는 이 구조와 일부 다른 EGFP X-레이 구조들 간의 차이가 적기 때문이다. 예를 들어, PDB Ic4f와 PDB lemg(S65T GFP 돌연변이체/pH 8.0) 사이의 rmsd는 단지 0.18 Å이다.

도 6: 전장 길이 EGFP는 2가지 폴딩-언폴딩 중간체 상태를 갖는다. 이러한 2개의 그래프는 베렌드센(Berendsen)의 자동 온도 조절 장치³¹를 사용한 준-평형 가열(quasi-equilibrium heating) DMD 시뮬레이션에 의해 연구된 EGFP의 준-평형 언폴딩을 보여준다. 폴딩된 상태에서 출발하여, 단백질 시스템의 온도는 서서히 T_l = 0.6 < T_F에서 T_h = 0.8 > T_F까지 증가된다. 본 발명자들은 EGFP에 대한 10회 언폴딩 시뮬레이션을 수행하였다. 전형적인 궤적가 도시되어 있다(상단); 2가지 언폴딩된 중간체 상태인, I ₁ ^U 및 I ₂ ^U 가 평준화된(averaged) 폴딩 경로(하단)을 따라 관찰된다. 유사한 결과가 10회 준-평형 EGFP 폴딩 시뮬레이션으로 획득되었다.

도 7: 언폴딩 중간체 I ₁ ^U (좌측 스냅샷)은 N-말단 β-가닥의 펴짐(unfurling)에 해당하며, 제 2의 언폴딩 중간체 ₂ ^U (우측 스냅샷)는 더 작은 EGFP 도메인(어두운 색)과 상호작용하는 C-말단을 지닌 더 거대한 거의 전체 EGFP 도메인의 언폴딩에 해당한다.

발명을 실시하기 위한 양상

본 발명자들은 신규한 시험관내에서 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 생산을 포함하는 급속 실시간 단백질 보완에 관한 신규한 방법을 개발하였다. 본 발명의 방법은 또한 핵산 분자와 핵산 혼성화, 또는 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들(이것들은 생분자 컨스트럭트로 지칭되기도 함)의 단백질 보완을 이용한 비핵산 분석대상물의 실시간 검출과 관련이 있다. 본 발명에서, 본 발명자들은 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들을 준비된 상태로 생산하기 위한 방법을 개발하였는데, 여기서 상기 단편들이 유사하게 활성화된 상보적인 분절-폴리펩티드 단편(들)에 아주 가까워질 때, 활성 단백질이 즉각적으로 형성된다. 또한 형광 단백질을 활성화된 분절-형광 단백질로 분절시키기 위한 신규한 방법이 개시된다. 준비된 상태 및 활성화된 배열의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 생산은 실시간 단백질 보완을 가능하게 하며, 반면 이전의 단백질 보완 방법은 활성 단백질을 형성하기 위해 재배열이 요구되는 비활성 분절-폴리펩티드 단편들을 사용하였다. 활성화된 분절 폴리펩티드 단편들을 사용하는 본 발명의 방법은 급속하고, 민감하며 가역적인 실시간 단백질 보완을 가능하게 한다.

한 구체예에서, 본 발명의 방법은 봉입체를 형성하기 위해 미생물 숙주 세포 내에서 제 1 및 제 2의 폴리펩티드 단편을 엔코딩하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 봉입체는 적당한 단백질 폴딩을 가능하게 하며 그에 따라 전통적인 정제 방법들 보다 생체내 상태를 더 유사하게 반영(mirror)하는 상태로 폴딩된 단백질을 포함한다. 다른 수단이 비히클을 지닌 세포와 같은 공지의 기술에 기초하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 봉입체는 활성화된 준비-상태로 분절-폴리펩티드 단백질들의 생산을 가능하게 한다. 상기 봉입체는 분절-폴리펩티드 단백질 단편들을 획득하기 위해 수확되고, 분해되며 재용해된다.

활성화된 분절-폴리펩티드 단편.

활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 매우 근접될 때 결합하여 단백질을 생산하는 임의의 폴리펩티드들일 수 있는데, 상기 폴리펩티드들은 재조립된 폴리펩티드 단편의 인지는 가능하나 개개의 폴리펩티드 단편들의 인지는 불가능한 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 재구성시 즉각적으로 활성화될 수 있는 분절-폴리펩티드 단편에 관한 디자인을 포함한다.

활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 근접될 때 결합하여 단백질을 생산하는 임의의 폴리펩티드들일 수 있는데, 상기 폴리펩티드들은 재조립된 활성 단백질의 인지는 가능하나 개개의 폴리펩티드 단편들의 인지는 불가능한 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩티드들은 재결합하여 효소 활성을 갖는 단백질을 생산하거나, 색원체 또는 형광체 활성을 갖는 단백질을 생한하거나, 항체에 의해 인지되는 단백질을 생성시킬 수 있다. 더욱이, 상기 폴리펩티드들은 할성화된 상태로 존재하며 시험관내와 생체내에서 단백질 보완과 함께 전통적으로 관찰되는 임의의 래그 타임을 최소화하기 위해 활성 단백질 재구성에 대해 프라이밍되도록 디자인된다.

한 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 형광 단백질 또는 폴리 펩티드이다. 이와 같은 구체예에서, 활성화된 분절 형광 단백질 단편들 중 어느 하나는 성숙한 미리형성된 발색단을 포함하는데, 상기 발색단은 이의 동종 활성화된 분절-형광 단편(들)과의 보완시 즉각적인 형광발광을 위하여 프라이밍되어 있으며 준비된 상태로 존재한다. 예를 들어, 그러한 분절 형광 단편을 포함하는 봉입체를 사용하는 것은 올바르게 폴딩된 성숙한 발색단을 지니는 완전히 폴딩된 형광 단백질의 대략 반쪽을 포함하는데, 상기 발색단은 단독으로는 형광을 나타내지 아니하나, 이의 동족 쌍과 결합시 형광을 나타내도록 프라이밍된다.

그러한 한 구체예에서, 재조립된 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 GFP, 예컨대, EGFP 또는 GFP-유사 형광 단백질, 또는 CFP, YFP와 RFP를 포함하나, 이에만 국한되는 것은 아닌, 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 천연 형광 단백질 또는 유전자적으로 조적된 형광 단백질이다.

몇몇 구체예들에서, 성숙한 발색단-포함 분절-형광 단편과 결합하는 동족 비-형광 폴리펩티드 단편은 하나 이상의 활성 비-형광 단편을 포함할 수 있다. 이러한 활성화된 비-형광 폴리펩티드는 대개 적절한 부위에서 한 형광 단백질의 코딩 뉴클레오티드 서열을 분절시키고 각각의 뉴클레오티드 서열 단편을 독립적으로 발현시킴으로써 생산된다. 활성화된 분절-형광 단백질 단편은 단독으로 발현되거나 하나 이상의 단백질 융합 파트너와 융합되어 발현될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 재구성된 활성 단백질은 활성화된 분절-EGFP 단편들로 구성되는데, 제 1 단편은 아미노산 번호 1로부터 대략 아미노산 번호 158까지의 아미노산들의 연속된 가닥을 포함하는 EGFP의 N-말단 단편이다. C-말단 시스테 인은 발현 후 다양한 핵산 결합 모티프들의 컨주게이션에 도움이 되도록 상기 단편에 부가될 수 있다. 제 2 활성화된 분절-EGFP 단편은 대략 아미노산 번호 159로부터 아미노산 번호 239까지의 아미노산들의 연속된 가닥이다. 또한 N-말단 시스테인이 부가될 수 있다.

아미노산 1은 EGFP의 첫번째 아미노산을 의미하려는 의도이다. 아미노산 239는 GFP의 마지막 아미노산을 의미하려는 의도이다. 모든 잔기들은 야생형 A. 빅토리아 GFP(진뱅크 접근 번호 M62653; 서열번호 7)의 번호매김에 따라 번호가 매겨졌고 상기 번호매김은 상동 서열들의 동등한 위치들에도 적용된다. 따라서, 분절된(truncated) GFP(야생형 GFP와 비교할 때) 또는 추가의 아미노산들을 지는 GFP로 작업할 때, 번호매김은 그에 따라 달라져야 한다.

녹색 형광 단백질(GFP)은 해파리 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea Victoria)(서열번호:8의 mRNA 서열을 참조하라)로부터 유래된 238개 아미노산 길이의 긴 단백질이다. 그러나, 형광 단백질은 또한 코에렌테라타(Coelenterata)의 다른 구성원으로부터 동정되었는데, 예컨대, 디소소마 종(Discosoma sp.)으로부터의 적색 형광 단백질(Matz, M. V. et al. 1999, Nature Biotechnology 17: 969-973), 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)로부터의 GFP, 레닐라 무엘레리(Renilla Muelleri)로부터의 GFP, 또는 다른 동물, 진균 또는 식물로부터의 형광 단백질(미국 특허 제7,109,315호)이 있다. GFP는 여러 변형된 형태로 존재하는데, 이에는 헤임 등(Heim, R. et al, 1994, Proc.Natl.Acad.Sci. 91 :26, pp 12501-12504)에 의해 소개된 GFP의 파란색 형광 변이체(BFP)(야생형 GFP의 Y66H 변이체임); S65G, S72A와 T203Y 돌연변이를 갖는 GFP의 노란색 형광 변이체(YFP)(WO98/06737); Y66W 색 돌연변이와 선택적으로 F64L, S65T, N1461, M153T, V163A 폴딩/용해도 돌연변이를 갖는 GFP의 청록색 형광 변이체(GFP)(Heim, R., Tsien, R. Y. (1996) Curr. Biol. 6, 178-182)가 포함된다. 가장 널리 사용되는 GFP의 변이체는 F64L과 G65T 돌연변이(WO 97/11094 및 WO96/23810) 및 첫번째 Met 다음에 발린 잔기 한개의 삽입을 지니는 EGFP이다. F64L 돌연변이는 발색단으로부터 상류로 1번 위치에 존재하는 아미노산이다. 상기 폴딩 돌연변이를 내포하는 GFP는 GFP가 약 30℃ 이상의 온도에서 세포 내에서 발현될 때, 형광 강도의 증가를 제공한다(WO 97/11094). 상기 언급된 모든 형광 단백질들과 이의 기능적 단편들은 본 발명에 사용되기 위해 포함된다. 또한 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있는 그러한 형광 단백질들, 및 이들의 단편들도 포함된다.

대안적인 구체예들에서, 재구성된 형광 단백질은 다음 형광 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 활성화된 분절-형광 단편들로 구성될 수 있다; 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 녹색-형광-유사 단백질; 노란색 형광 단백질(YFP), 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP), 파란색 형광 단백질(BFP), 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP) 또는 적색 형광 단백질(dsRED)(재구성된 형광 단백질의 단편들 중의 하나는 성숙한 미리형성된 발색단을 포함한다). 결국 형광을 나타내는 형광 단백질이 되는 상기 언급된 모든 형광 단백질들과 이들의 단편들은 본 발명에서 사용되기 위해 포함된다. 또한 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있는 그러한 형광 단백질 들, 및 이의 단편들도 포함된다.

대안적인 구체예들에서, 재조립된 형광 단백질은 상이하며 스펙트럼적으로 독특한 형광 단백질들로부터 나온 활성화된 분절 형광 단편들을 포함할 수 있다. 재구성된 활성 형광 단백질은 보완을 위해 사용된 활성화된 분절-형광 단편들에 따라 뚜렷하고/하거나 독특한 스펙트럼 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 다색 형광 보완은 다색 생분자 형광 보완(multicolor BiFC)을 위한 상이한 형광 단백질들로부터 유래되는 재구성되는 단편들에 의해 달성되어 왔다(다음 문헌을 참조하라: Hu et al, Nature Biotechnology, 2003;21;539-545; Kerppola, 2006, 7;449-456; Hu, et al, Protien-Protien Interactions (Ed. P. Adams and E. Golemis), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2005, 상기 문헌은 이의 전체 내용이 참고문헌으로써 본원에서 인용된다). 다색 실시간 형광을 위한 다수의 형광 단백질들로부터의 활성화된 분절-형광 단편들의 용도가 본 발명에서 사용을 위해 포함되는데, 상기 단편들 중 하나는 미리형성된 성숙한 발색단을 포함한다.

한 구체예에서, 형광 단백질은 유세포 분석기, 형광 플레이트 판독기, 형광강도측정기, 현미경, 형광 공명 에너지 전이(florescence resonance energy transfer, FRET), 육안 또는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법에 의해 검출가능하다. 대안적인 구체예에서, 형광은 형광 활성화 세포 분류기(FACS)를 사용한 유세포 분석기 또는 간헐 촬영 현미경(time lapse microcopy)에 의해 검출된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 재조립된, 활성 효소를 형성하기 위해 가까 이 근접하여 결합되는, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 효소 활성 분석을 이용하여 검출될 수 있다. 바람직하게는, 효소 활성은 색원체 또는 형광체 반응에 의해 검출된다. 바람직한 한 구체예에서, 효소는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 또는 β-락타메이즈이다.

또 다른 구체예에서, 효소는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)이다. 예를 들어, 미크닉 등(Michnick et al.)은 DHFR의 N-말단과 C-말단 단편들로 구성되는 "단백질 보완 분석"을 개발하였는데, 상기 단편들은 단독으로는 임의의 효소 활성이 결여되어 있으나, 아주 근접하게 될 때 기능성 효소를 형성한다. 참고문헌으로써 본원에서 인용된, 예를 들어, 미국 특허 제6,428,951호, 제6,294,330호, 및 제6,270,964호를 참조하라. 색원체성 및 형광체성 방법을 포함하는 DHFR 활성을 검출하기 위한 방법들이 당업계에 공지되어 있다.

대안적인 구체예들에서, 그 밖의 분절 폴리펩티드들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 기질의 검출가능 산물로의 전환을 촉매하는 효소. 분절-폴리펩티드 재조립에 대한 그러한 몇몇 시스템들은 이에만 국한되는 것은 아니나, 다음 단백질의 재조립을 포함한다: β-갈락토시다제(Rossi et al, 1997, PNAS, 94;8405-8410); 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(Pelletier et al, PNAS, 1998; 95;12141-12146); TEM-I β-락타메이즈(LAC)(Galarneau at al, Nat. Biotech. 2002; 20;619- 622) 및 반딧불이 루시퍼라제(Ray et al, PNAS, 2002, 99;3105-3110 and Paulmurugan et al, 2002; PNAS, 99;15608-15613). 예를 들어, 분절된 β-락타메이즈는 이중 가닥 DNA의 검출을 위해 사용되어 왔다(다음 문헌을 참고하라: Ooi et al, Biochemistry, 2006; 45;3620-3525). 실시간 시그널 검출을 위한 활성화된 분절 폴리펩티드 단편들의 용도는 본 발명에서의 사용을 위해 포함되는데, 상기 단편들은 보완되자마자 급속한 시그널 검출을 가능하게 하는 완전히 폴딩된 성숙한 형태로 존재한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 결합은 연속된 에피토프를 포함하는 재조립된 단백질을 형성할 수 있는데, 상기 단백질은 재조립된 단백질 상의 불연속된 에피토프를 특이적으로 인지하지만 어느 한 개개의 폴리펩디드 상에 존재하는 부분적인 에피토프를 인지하지 못하는 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 상기한 불연속된 에피토프에 한 예는 HIV의 gpl20에서 발견된다. 이들 및 다른 유도체들은 널리 공지된 기술들에 기초하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있고, 항체 자체의 단백질 단편이 아니라 재조립된 단백질을 인지하는 항체들로 인해 스크리닝될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드들은 상호작용하여 재조립된 단백질을 형성하는 분자일 수 있다. 예를 들어, 분자들은 단백질 단편들, 또는 이합체 또는 다합체의 소단위체들일 수 있다.

관심있는 분절-폴리펩티드 단편들을 엔코딩하는 핵산 서열과 코돈은, 예를 들어, 코돈을 요망되는 시스템에서 우선적으로 사용되는 코돈으로 변경함으로써 최적화될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 최적화될 수 있다. 비포유동물 세포에서 단백질 발명을 위한 최적의 코돈이 또한 당업계에 공지되어 있으며, 숙주 세포가 비포유동물 세포(예를 들어, 곤충 세포에서)일 때, 사용될 수 있다

본 발명의 활성화된 분절-폴리펩티드들은 요망될 수 있는 임의의 추가 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드들은 핵산 결합 모이어티에 커플링되는 유연한 링커를 포함할 수도 있다.

형광 단편 및 봉입체의 발현

미생물/원핵생물 내에서 봉입체 경로를 통한 재조합 단백질 생산에 대해 소개한 아주 많은 공개문헌들이 있다. 상기 공개헌의 일예는 다음과 같다: Misawa, S., et al., Biopolymers 51 (1999) 297-307; Lilie, H., Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 497-501; Hockney, R. C, Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463.

본 발명에 따른 펩티드들은 미생물 및/또는 원핵생물 내에서 과발현된다. 과발현은 봉입체의 형성을 초래한다. 개시 코돈에 의해 엔코딩된 메티오닌은 주로 숙주 세포에서 발현/번역이 일어나는 동안 제거된다. 미생물/원핵생물에서 단백질의 과발현에 대한 일반적인 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업계의 공개문헌의 일예는 다음과 같다: Skelly, J. V., et al., Methods MoI. Biol. 56 (1996) 23-53; Das, A., Methods Enzymol. 182 (1990) 93-112; and Kopetzki, E., et al., Clin. Chem. 40 (1994) 688-704.

본원에서 사용된 것과 같은, 원핵생물에서의 과발현은 프로모터, 예컨대 tac 또는 lac 프로모터(유럽특허 제0 067 540호)를 지닌 최적화된 발현 카세트(미국 특허 제6,291,245호)를 이용한 발현을 의미한다. 일반적으로, 과발현은 화학적 유도성, 프로모터 또는 온도 변화를 통해 유도되는 프로모터를 포함하는 벡터의 사용에 의해 수행될 수 있다. 대장균에서 유용한 프로모터들 중 하나는 온도-민감 람다- PL 프로모터(유럽 특허 제0 041 767호)이다. 추가의 효율적인 프로모터는 tac 프로모터(미국 특허 제4,551,433호)이다. 대장균과 같은 원핵생물을 위한 강력한 조절 시그널은 일반적으로 박테리아-감염성(bacteria-challenging) 박테리오파지로부터 나온다(다음 문헌을 참조하라: Lanzer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8973-8977; Knaus, R., and Bujard, H., EMBO Journal 7 (1988) 2919- 2923; 람다 T7 프로모터의 경우, Studier, F. W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89); T5 프로모터의 경우, 유럽 특허출원 제0 186 069호; Stuber, D., et al., System for high-level production in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function analysis; In: Immunological Methods IV (1990) 121-152).

이와 같은 과생산 원핵생물 세포 발현 시스템의 사용으로, 본 발명에 따른 펩티드들은 세포의 총 발현 단백질의 10% 이상, 전형적으로 30-40%, 및 경우에 따라 50% 이상을 포함하는 수준으로 생산된다.

본원에서 사용된 것과 같은, "봉입체(IB)"는 미생물/원핵생물 내에서 엔코딩된 핵산의 과발현 후 재조합적으로 생산된 폴리펩티드들의 불용성 형태를 의미한다.

봉입체의 용해화(solubilization)는 약 9 또는 이를 초과하는 pH 값을 갖는 수용액을 사용함으로써 수행하는 것이 바람직하다. 10.0 또는 이를 초과하는 pH 값이 가장 바람직하다. 용해화를 위하여 계면활성제 또는 변성제를 반드시 첨가할 필요는 없다. 최적화된 pH 값은 용이하게 결정될 수 있다. 강한 알칼리 조건이 폴리펩티드를 변성시킬 수 있으므로 최적화된 pH 범위는 명백히 존재한다. 상기 최적화된 범위는 pH 9 내지 pH 12 사이에서 확인된다.

형광 펩티드들 엔코딩하는 핵산(DNA)은 당업계에 공지된 방법에 따라 생산될 수 있다. 숙주 세포 내에서 발현을 최적화하기 위해, 추가의 조절 및 전자 엘리먼트로 핵산 서열을 신장시키는 것이 추가로 바람직할 수 있다. 발현에 적합한 핵산(DNA)는 화학적 합성에 의해 생산되는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 당업계의 통상의 기술자에게 친숙하며, 예를 들어, 다음 문헌에 소개되어 있다: Beattie, K. L., and Fowler, R. F., Nature 352 (1991) 548-549; EP-B 0 424 990; Itakura, K., et al., Science 198 (1977) 1056-1063. 본 발명에 따른 펩티드들의 핵산 서열을 변형시키는 것도 적절할 수 있다.

상기 변형은, 이에만 국한 되는 것은 아니나, 예를 들어, 다음과 같은 변형이 있다; 제한 효소의 다양한 인식 서열을 도입하여 라이게이션, 클로닝 및 돌연변이유발의 단계들을 용이하게 하기 위한 핵산 서열의 변형; 숙주 세포에 대해 바람직한 코돈들을 통합시키기 위한 핵산 서열의 변형; 숙주 세포 내에서의 유전자 발현을 최적화 하기 위해 추가의 조절 및 전사 엘리먼트를 지닌 핵산 서열의 신장.

관심있는 단백질을 합성하기 위해 사용된 코돈들은 바람직한 시스템에서 우선적으로 사용되는 코돈으로 변환시킴으로써 최적화될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 최적화될 수 있다. 비포유동물 세포에서 단백질 발현을 위한 최적의 코돈들이 또한 공지되어 있으며, 숙주 세포가 비포유동물 세포일 때(예를 들어, 곤충 세포에서), 사용될 수 있다.

분절-폴리펩티드 분자.

본원에서 개시한 방법에 의해 생산된, 활성화된 분절-폴리펩티드 분자(생분자 컨주게이트로도 지칭됨)가 또한 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 분자는 색원체성 또는 형광체성 활성을 지닌 효소의 분절-폴리펩티드들을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 효소는 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 β-락타메이즈 또는 루시퍼라제이다. 한 구체예에서, 상기 형광 단백질은 GFP 또는 GFP-유사 형광 단백질이다.

몇몇 구체예들에서, 상기 분자의 활성화된 분절-폴리펩티드는 추가로 핵산 결합 모티프 또는 핵산 결합 모이어티를 포함한다. 표적 핵산의 존재시, 핵산 표적 서열에 대한 핵산 결합 모이어티의 결합은 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 결합을 용이하게 하여 활성 단백질이 형성되게 한다.

대안적인 구체예들에서, 상기 분자의 활성화된 분절-폴리펩티드는 추가로 비핵산 분석대상물에 대한 결합 모티프를 포함한다. 표적 분석대상물, 일반적으로 비핵산 분석대상물의 존재시, 표적 분석대상물에 대한 분석대상물 결합 모티프의 결합은 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 결합을 용이하게 하여 활성 단백질이 형성되게 한다.

또 다른 구체예에서, 상기 활성화된 분절-폴리펩티드 분자는 분절-형광 분자이다. 이와 같은 구체예에서, 상기 분자는 GFP, GFP-유사 형광 단백질, 형광 단백질, 및 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 2 이상의 활성화된 분절 형광 단편들을 포함한다. 상기 분절-형광 단편들 중 하나는 미리형성된 성숙한 발색단을 포함 하는데, 상기 발색단은 분리된 단편에서 비형광 상태인 단편에 의해 활성화된다. 활성화된 형광 단편들은, 서로 서로 결합될 때, 형광을 위해 필요한 베타-가닥들의 완전한 보완을 내포하지만, 단편들 단독으로는 형광을 나타내지 아니한다. 상기 분자의 활성화된 분절-형광 단편들 각각은 추가로 핵산 결합 모티프를 포함한다. 표적 핵산에 대한 핵산 결합 모티프들의 결합은 실시간적으로 2 이상의 활성 분절-형광 단편들의 결합과 활성 형광 단백질 및 형광 표현형의 재구성을 용이하게 한다.

핵산 결합 모이어티

각 분절-폴리펩티드 분자의 핵산 결합 모이어티는 표적 핵산에 결합되는 임의의 분자일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 핵산, 핵산 유사체, 및 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드이다. 주어진 한 쌍의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편 중의 핵산 결합 모이어티는 동종 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)이거나, 상기 모이어티들은 서로 다를 수 있는데, 예를 들어, 활성 단백질을 포함하는 한 쌍 중의 한 분절-폴리펩티드는 올리고뉴클레오티드 핵산 결합 모이어티를 지닐 수 있으며, 상기 쌍의 나머지 구성원은 폴리펩티드 핵산 결합 모이어티를 지닐 수 있다.

핵산 결합 모이어티는 또 다른 분자, 예컨대, 폴리펩티드에 커플링될 수 있는 임의의 분자일 수 있으며, 매우 근접되어 표적 핵산에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 핵산 또는 핵산 유사체(예컨대 올리고뉴클레오티드)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 핵산 결합 모이어티는 핵산 결합 폴 리펩티드 또는 단백질인데, 이들은 고 친화력으로 표적 핵산과 상호작용한다. 핵산 유사체는, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 위-상보적(pseudo-complementary) PNA(pcPNA), 잠금 핵산(locked nucleic acids), 몰포린(morpholin) DNA, 포스포티오에이트(phosphorthioate) DNAs, 2'-O-메톡시메틸-RNA, 2'-O, 4'-C 메틸렌 다리를 포함하는 핵산 유사체인 잠금 핵산(LNA)을 포함하나, 이에만 국한되는 것은 아니다.

핵산 결합 모이어티는 혼성화 부위에서 삼중가닥을 생성시키면서 단일-가닥 표적 상의 동일한 혼성화 부위에 결합할 수 있다. 대안적으로, 핵산 결합 모이어티는 각각의 혼성화 부위에서, 각각, 이중가닥 또는 삼중가닥을 생성시키면서, 단일 가닥 또는 이중 가닥 표적 핵산 상의 가까이 인접한 혼성화 부위에 결합할 수 있다.

핵산 결합 모이어티가 핵산인 구체예에서, 핵산 결합 모이어티의 길이는 핵산 표적에 대한 상보적인 결합을 가능하게 할 정도로 충분히 길어야 하며, 양 프로브 부분이 동일한 표적 핵산에 결합될 때, 분절-폴리펩티드 단편들 중의 하나가 이의 상응하는 분절-폴리펩티드 단편(들)과 상호작용하는 것이 가능하도록 하여야 한다. 예를 들어, 핵산 결합 모이어티 프로브는 5-30 염기 길이일 수 있다. 더 바람직하게는, 5-15 염기 길이이다.

삼중가닥이 형성을 제공하는 구체예에서, 핵산 결합 모이어티는 삼중가닥 형성을 가능하게 하는 임의의 핵산일 수 있다. 바람직한 삼중가닥-형성 올리고뉴클레오티드는 GC 함량이 높다. 바람직한 삼중가닥은 피리미딘-퓨린-퓨린으로 구성되 는, 퓨린 삼중가닥이다.

한 바람직한 삼중가닥-형성 올리고뉴클레오티드는 GC 함량이 높다. 바람직한 삼중가닥은 피리미딘-퓨린-퓨린으로 구성되는, 퓨린 삼중가닥이다.

핵산 결합 모이어티는 다음을 포함하는 군에서 선택될 수 있다: 올리고뉴클레오티드; 단일 가닥 RNA 분자; 및 위상보성 PNA(pcPNA), 잠금 핵산(LNA) 및 그 외의 유사체를 포함하는 펩티드 핵산(PNAs).

한 구체예에서, 상기 핵산 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드를 디자인 및 합성하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 때대로 올리고뉴클레오티드 프라이머로 지칭된다.

본 발명에 유용한 올리고뉴클레오티드는 확립된 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성에 관한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 그러한 방법은 표준 효소 절단에 뒤이은 뉴클레오티드 단편 동정으로부터[예를 들어, 다음 문헌을 참조하라: Sambrook, et al., Molecular 클로닝: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, N. Y., 1997), and Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 1997), 상기 문헌의 개시내용은 참고문헌으로써 본원에서 인용됨], 순수하게 합성적인 방법까지[예를 들어, 밀리겐 또는 벡크만 시스템 아이플러스 DNA 합성기(Beckman System IPlus DNA synthesizer)(예를 들어, 밀리겐-바이오서치(Milligen-Biosearch)(Burlington, Mass.)의 자동화 합성기 모델 8700, 또는 ABI Model 380B)를 사용한 시아노에틸 포스포라미다이트 방법에 의해] 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 유용한 합성 방법은 또한 다음 문헌에 소개되어 있다: Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (phosphotriester and phosphite-triester methods), 및 Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (phosphotriester method).

본원에 소개된 많은 올리고뉴클레오티드들은 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 특정 부분에 상보적이도록 디자인되어, 이들 사이의 안정한 혼성체(hybrids)가 형성될 수 있다. 이러한 혼성체의 안정도는 다음과 같은 문헌에 소개된 공지된 방법을 이용하여 계산될 수 있다: Lesnick and Freier, Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw et al., Biotechniques 8:674-678 (1990), 및 Rychlik et al., 핵산s Res. 18:6409-6412 (1990).

한 구체예에서, 핵산 결합 모이어티는 단일 가닥 RNA 분자이다. 단일 가닥 RNA 분자의 디자인 및 합성에 관한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

몇몇 구체예들에서, 핵산 결합 모이어티는 위상보성 PNA(pcPNA)를 포함하는, 펩티드 핵산(PNA)이다. PNA와 pcPNA의 디자인 및 합성에 관한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 펩티드 핵산(PNA)은 이의 골격이 당이라기 보다 위펩티드인 DNA의 유사체이다. 따라서, 이들의 행동은 DNA의 행동을 모방하며 상보적인 핵산 가닥에 결합한다. 펩티드 핵산에서, 올리고뉴클레오티드의 디옥시리보스 인산 골격은 당 포스포디에스터보다 펩티드와 더 유사한 골격으로 대체된다. 각 소단위체 는 상기 골격에 부착된 천연적으로 생성되거나 천연적으로 생성되지 아니하는 염기를 지닌다. 이와 같은 골격은 아미드 결합을 통해 연결된 N-(2-아미노에틸)글리신의 반복 단위로 구성된다.

PNA는 DNA와 RNA 둘 모두에 결합한다. 그 결과 생성되는 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중나선은 상응하는 DNA/DNA 또는 DNA/KNA 이중나선보다 더 큰 친화력과 증가된 특이성으로 결합된다. 또한, 이들의 폴리아미드 골격(적절한 뉴클레오염기 또는 이에 부착된 다른 측쇄 그룹을 지님)은 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 인지되지 아니하며, 그에 따라 PNA는 DNA와 펩티드와는 달리, 효소에 의한 분해에 내성이 있다. DNA 또는 RNA 가닥에 대한 PNA 가닥의 결합은 정방향 또는 역방향으로 일어날 수 있다. PNA는 단일 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA 둘 모두에 결합한다.

전형적인 PNA의 서열 제약을 다루기 위해, 위상보성 PNA(pcPNAs)가 개발되었다. 구아닌과 시토신 이외에, pcPNA는 각각 아데닌과 티민 대신에 2,6-디아미노퓨린(D)과 2-티오우라실을 지닌다. pcPNA는 독특한 결합 양상인, 이중-나선 침습(double-duplex invasion)을 나타내는데, 이는 위상보성의 개념에 의해 보완된 왓슨-크릭 인지 원칙에 기초한다. pcPNA는 이들의 천연적인 A, T, (U), 또는 G, C 대응부를 인지하고 이와 결합한다. pcPNA는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, PNA의 화학적 조립에 관한 방법이 널리 공지되어 있다(참고문헌으로써 본원에서 인용된, 다음 문헌을 참고하라: 미국 특허 제5,539,082호, 제5,527,675호, 제5,623,049호, 제5,714,331호, 제5,736,336호, 제5,773,571호 또는 제 5,786,571호).

본 발명의 다른 구체예는 핵산 결합 모이어티를 제공하는데, 상기 모이어티는 폴리펩티드 또는 펩티드이다. 폴리펩티드는 표적 핵산에 대하여 고 친화력을 지니는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 이 구체예에서, 표적 핵산은 이중-가닥, 삼중-가닥, 또는 단일-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 폴리펩티드는 펩티드, 100개 이하의 아미노산, 또는 전장 길이 단백질이다. 표적 핵산에 대한 폴리펩티드의 친화력은 저 나노몰 내지 고 피코몰 범위 이내일 수 있다. 폴리펩티드는 천연적이거나 추론적 접근법 또는 스크리닝 접근법에 의해 디자인된, 징크 핑거(zinc finger)를 내포하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 징크 핑거의 예는 Zif 2g8, SpI, Gfi-1의 핑커 5, YYl의 핑커 3, CF2II의 핑거 4와 6, 및 TTK의 핑거 2를 포함한다(PNAS (2000) 97: 1495-1500; J Biol Chem (20010 276 (21): 29466-78; Nucl Acids Res (2001) 29 (24) :4920-9; Nucl Acid Res (2001) 29(11): 2427-36). 그 외 다른 폴리펩티드는, 시험관내 선별로 획득되는, 특정 핵산 서열에 결함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 앱타머의 예는 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF)(Nat Biotech (2002) 20:473-77)와 트롬빈(Nature(1992) 355: 564-6)을 포함한다. 아직 다른 폴리펩티드는 시험관내에서 DNA 이중나선에 결합하는 폴리펩티드이다; 이의 예는 이형핵 리보핵산 입자(heteronuclear ribonucleic particle, hnRNP) 단백질의 구성원, 예컨대, hnRNP K, L, El, A2/B1 및 I를 포함한다(Nucl Acids Res (2001)29(11): 2427-36).

핵산 결합 모이어티로서 폴리펩티드를 지니는 분절-폴리펩티드 단편들의 경우, 전체 분절-폴리펩티드 단편과 핵산 결합 모이어티 분자는 폴리펩티드 부분, 링 커와 핵산 결합 모이어티 폴리펩티드를 포함하는, 단일 컨스트럭트에 의해 엔코딩될 수 있다. 상기 컨스트럭트는 세포 내에서 발현되거나 세포 내로 미세주입(microinjection)될 수 있다. 이러한 컨스트럭트들은 또한 관심있는 핵산의 시험관내 검출에 사용될 수 있다.

핵산 표적.

본 발명의 방법은, 보완 복합체의 형성과 연관된 검출가능한 시그널을 생성시킴으로써, 단일-가닥 핵산 표적 또는 이중-가닥 핵산의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.

핵산 표적은 활성화된 분절-폴리펩티드 단편과 결합된 핵산 결합 모이어티의 결합을 위한 혼성화 부위를 포함하는 임의의 핵산일 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 DNA, RNA, 또는 핵산 유사체일 수 있다. 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 표적 핵산은 생체내 또는 시험관내에서 검출될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 시험관내에서 표적 핵산 및 색원체성 및/또는 형광체성 활성을 지닌 활성 단백질을 생성하기 위해 상호작용하는 활성화된 분절-폴리펩티드를 검출하는데 사용된다. 몇몇 구체예들에서, 폴리펩티드는 GFP, 변형된 GFP(예컨대, GFP-유사 형광 단백질), 또는 CFP, YFP, 및 RFP를 포함하는, 임의의 다른 천연 형광 단백질 또는 유전자적으로 조작된 형광 단백질을 엔코딩한다.

또 다른 구체예에서, 핵산 결합 모이어티는 표적 핵산 상의 2개의 인접 서열들에 결합하는데, 한 핵산 결합 모이어티는 한 표적 서열에 결합하고 제 2 핵산 결합 모이어티는 또 다른 표적 서열에 결합한다. 상기 구체예에서, 인접 서열들은, 이들에 결합된 핵산 결합 모이어티가 표적에 결합될 때, 활성 단백질의 조립을 가능하게 하면서, 상기 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들이 상호작용할 수 있게 충분히 서로에 대해 근접된다. 상기 구체예는 단일-가닥 및 이중-가닥 표적 핵산의 검출을 제공한다. 이중 가닥 표적의 검출의 경우, 단일-가닥 프로브는 이중-가닥 표적과 상호작용하여 삼중가닥을 형성한다.

진핵생물, 원핵생물 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에만 국한되지 아니하는, 샘플로부터의 임의의 핵산 표적은 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 핵산은 환자로부터 분리된 게놈 DNA의 샘플을 나타낸다. 상기 DNA는 임의의 세포 공급원 또는 체액으로부터 획득될 수 있다. 임상적 실시에 가용한 세포 공급원의 비제한적인 예는 혈액 세포, 구강 세포, 자궁경부(cervicovaginal) 세포, 소변으로부터의 상피 세포, 태아 세포, 또는 생검에 의해 획득되는 조직내에 존재하는 임의의 세포를 포함한다. 체액은 혈액, 소변, 뇌척수액, 정액 및 감염 또는 염증 부위의 조직 삼출액을 포함한다. 또 다른 구체예에서, DNA는 임의의 추가적인 정제 없이 샘플 내에서 직접적으로 검출된다. 또 다른 구체예에서, DNA는 당업계에 표준인 수많은 방법들 중 임의의 방법을 이용하여 세포 공급원 또는 체액으로부터 추출된다. DNA를 추출하는데 이용되는 특정 방법이 상기 공급원의 성격에 좌우될 것임은 이해될 것이다. 특정 구체예들에서, 본 발명에 사용하기 위하여 추출될 DNA의 양은 5 pg(4x10⁹ 염기쌍의 게놈 크기인 약 1 세포 당량에 상당함) 이상이다.

한 구체예에서, 표적 핵산은 보완 복합체의 성분들에 노출되기 전에 증폭될 수 있다. 핵산 표적을 증폭시키는 임의의 방법이 사용될 수 있는데, 다수의 동일한 혼성화 부위를 지니는 단일 가닥 핵산을 생성시키는 방법이 포함된다. 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), 핵산가닥 대체 증폭(strand displacement amplification, SDA), 전사 매개 증폭(transcription mediated amplification, TMA), Qβ-레플리카아제 증폭(Q-베타), 또는 순환 주기 증폭(rolling circle amplification, RCA).

몇몇 구체예에서, PCR이 핵산 표적을 증폭하기 위해 사용된다.

요망되는 핵산을 합성할 수 있는 임의의 중합효소가 사용될 수 있다. 바람직한 중합효소는, 이에만 국한되지 아니하나, 시쿼나아제(Sequenase), 벤트(Vent), 및 Taq 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 통상의 기술자는 중합효소-도입성 돌연변이를 최소화하기 위해 고 적합성(fidelity) 중합효소(예컨대, Clontech HF-2)를 사용한다.

또 다른 구체예에서, 다수의 동일한 혼성화 부위를 지니는 단일-가닥 DNA 표적을 생성시키기 위해 순환 주기 증폭(RCA)이 사용된다. 순환 주기 증폭(RCA)은 어떤 한 서열의 다수의 복제물을 생성시키기 위한 등온적(isothermal) 방법이다. 생체내 순환 주기 DNA 복제에서, DNA 중합효소는 원형 주형 상의 프라이머를 신장시킨다(Romberg, A. and Baker, T. A. DNA Replication, W. H. Freeman, New York, 1991). 산물은 주형의 상보적인 서열의 앞뒤로 나란히 연결된 복제물로 이루어진다. RCA는 DNA 증폭을 위하여 시험관내에서 사용하기 위해 개조된 방법이다(Fire, A. and Si-Qun Xu, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1995, 92:4641-4645; Lui, D., et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118:1587-1594; Lizardi, P. M., et al., Nature Genetics, 1998, 19:225-232; 쿨(Kool)에 의한 미국특허 제5,714,320호).

또 다른 구체예에서, 핵산 결합 모티프를 포함하는 분절-폴리펩티드 분자는 면역RCA(면역-순환 주기 증폭, immuno-rolling circle amplification)과 면역PCR에서 핵산의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 분절-폴리펩티드 분자의 핵산 결합 모티프 성분들은 PCR 산물의 존재하에 검출 단백질 분자의 재조립을 촉진하는데, 이는 시험관내에서 실시간 면역PCR 방법을 가능하게 한다. 또한, 또 다른 구체예에서, 상기 검출 분자의 핵산 결합 성분들은 분절-검출 분자와,그에 따라, 면역RCA(순환 주기 증폭) 방법에서 핵산 존재시, 시그널의 재조립을 용이하게 할 수 있으며, 그 결과 시험관내에서 고 시그널 증폭이 초래된다.

RCA 기술에서, 증폭 표적 주기(amplification target circle, ATC)에 상보적인 지역을 갖는 프라이머 서열은 ATC에 결합된다. 혼성화 후, 효소, dNTP 등은, 초기의 세그먼트를 대체하는 DNA 중합효소와 더불어, ATC 주형을 따라 프라이머의 신장을 가능하게 하는데, 상기 신장으로 본래 ATC 서열의 앞뒤로 나란히 연결된 반복 단위로 이루어진 단일 가닥 DNA 산물이 생성된다.

RCA 기술은 당업계에 널리 알려져 있는데, 선형 RCA(LRCA)를 포함한다. 이와 같은 임의의 RCA 기술이 본 발명에서 사용될 수 있다. RCA가 일어나는 동안의 핵산가닥 대체는 표준 대체 인자, 예컨대, 헬리카아제의 사용을 통해 촉진될 수 있다. 일반적으로, 표준 대체 인자의 존재하에 순환 주기 복제를 수행할 수 있는 임 의의 DNA 중합효소는, 심지어 상기 DNA 중합효소가 이와 같은 인자의 부재시에 순환 주기 복제를 수행하지 못한다 하더라도, 본 발명의 과정에서 사용되기에 적당하다. RCA에 사용될 수 있는 표준 대체 인자는 BMRFl 중합효소 보조 소단위체(Tsururni et al., J. Virology 67(12):7648-7653 (1993)), 아데노바이러스 DNA-결합 단백질(Zijderveld and van der Vliet, J. Virology 68(2):1158-1164 (1994)), 단순 포진 바이러스 단백질 ICP8(Boehmer and Lehman, J. Virology 67(2):711-715 (1993); Skaliter and Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22):10665-10669 (1994)), 단일-가닥 DNA 결합 단백질(SSB; Rigler and Romano, J. Biol. Chem. 270:8910-8919 (1995)), 및 송아지 흉선 헬리카제(Siegel et al., J Biol. Chem. 267:13629-13635 (1992))를 포함한다. 순환 주기 복제를 수행하는 중합효소의 활성은 다음 문헌에 소개된 것과 같은 순환 주기 복제 분석의 중합효소를 이용하여 측정될 수 있다: 파이어와 수의 논문(Fire Xu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4641-4645 (1995)) 및 리자디의 특허문헌(Lizardi, 미국 특허 제5,854,033호, 예를 들어, 상기 특허문헌의 실시예 1).

비핵산 분석대상물에 결합하는 결합 모티프.

몇몇 구체예들에서, 분절-폴리펩티드 분자는 비핵산 분석대상물에 결합하는 결합 모티프들을 포함할 수 있다. 이와 같은 모티프는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 다른 구체예들에서, 비핵산 분석대상물 결합 모티프는 생분자, 유기 분자 또는 무기 분자일 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 표적 분석대상물은 임의의 대사산물, 생분자, 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 이러한 분자들의 동정은 종래 기술 및 특허출원서에 의해 일반인 또는 통상의 기술자에게 알려져 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 본원에서 생산된 분절-폴리펩티드 분자 및/또는 분절-형광 단백질 분자는 생분자 상호작용의 시험관내 실시간 검출 분석 및 실시간 검출을 위해 사용될 수 있는데, 상기 분석에는, 예컨대, 바이러스 핵산 및/또는 게놈의 검출, 핵산 검출(RNA, DNA 등); 동형-핵산 상호작용(DNA-DNA; RNA-RNA)과 이형-핵산 상호작용(DNA-RNA 등)을 포함하는, 핵산 이중나선과 삼중나선 형성과 같은, 핵산 혼성화가 포함되나, 이에만 국한되는 것은 아니다. 대안적인 구체예들에서, 본 발명의 분절-폴리펩티드 분자는, 예를 들어, 생분자, 유기 분자 및 무기 분자와 같은, 비-핵산 분석대상물의 시험관내 실시간 검출 및 비핵산 상호작용의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 본 발명의 방법은 병원체성 및/또는 바이러스성 생분자, 유기 또는 무기 병원체성 및/또는 바이러스성 분자의 검출을 위해 사용될 수 있다.

이와 같은 구체예들에서, 본 발명은 실시간 단백질 보완 방법과 관련이 있다. 특히, 본 발명의 방법은 DNA와 RNA 표적을 포함하는, 표적 핵산 분자의 실시간 검출과 관련이 있다. 이와 같은 방법에서, 표적 핵산은 활성화된 분절-폴리펩티드에 결합된 핵산 결합 모이어티에 대한 이의 결합에 의해 검출되는데, 여기서 표적 핵산에 대한 결합 핵산 결합 모이어티는 활성화된 분절-폴리펩티드를 가까이 근접시키고 활성 단백질이 즉각적인 형성을 일으킨다.

한 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 결합된 핵산 결합 모이 어티는 표적 핵산 상의 2개의 인접 서열들에 결합한다. 이 구체예에서, 상기 인접 서열들은 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들의 결합과 각각이 결합된 핵산 모이어티들이 표적 핵산에 결합될 때 활성 단백질의 조립을 가능하게 할 정도로 충분히 서로에 대해 가깝게 위치한다. 이 구체예는 단일-가닥과 이중-가닥 표적 핵산의 검출을 제공한다. 이중 가닥 표적의 검출의 경우, 단일-가닥 프로브는 이중-가닥 표적과 상호작용하여 삼중가닥을 형성한다.

또 다른 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들에 결합된 핵산 결합 모이어티들은 핵산 또는 올리고뉴클레오티드이며, 삼중가닥을 형성시키는, 단일-가닥 표적 핵산 상의 동일한 서열에 결합한다. 이와 같은 구체예에서, 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은, 이들에 결합된 핵산 결합 모이어티들이 표적에 결합될 때, 보완 복합체의 조립을 가능하게 하면서, 상호작용하게 된다.

예를 들어, 본 발명은 실시간 단백질 보완 방법과 관련이 있다. 특히, 본 발명의 방법은 생분자, 유기 분자와 무기 분자뿐만 아니라, 이의 단편 또는 대사산물을 포함하는, 표적 분석대상물의 실시간 검출에 관한 것이다. 이와 같은 방법에서, 표적 분석대상물은 활성화된 분절-폴리펩티드들에 결합된 이의 분석대상물 결합 모티프들에 의해 검출되는데, 표적 분석대상물에 대한 상기 모티프들의 결합은 활성화된 분절-폴리펩티드들을 가까이 근접되게 하고 활성 단백질이 형성을 가져온다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 시험관내에서 관심있는 효적 핵산이 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 심지어 비-표적 분자가 존재하고 있더라도, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물이 표적 핵산과 표적 분석대상물의 특이적인 검출을 지향하고 있으므로, 상기한 본 발명들은 점 돌연변이를 분석하기 위해 디자인된 민감하며 신뢰할 수 있는 프로브-기반 혼성화 분석법, 또는 표적 분석대상물의 신뢰할 수 있는 검출법의 개발에 특히 적합하다. 본 발명의 방법, 키트와 조성물은 또한 개체(미생물), 바이러스, 진균 및 유전자에 기초한 관심있는 임상적 조건의 검출, 정량 또는 분석에 유용하다.

한 구체예에서, 본 발명은, 비-표적 서열의 존재시에도, 샘플 내의 표적 핵산을 분리하기 위한 방법을 제공한다. 대안적인 구체예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 분석대상물을 분리하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 중요한 양상은 핵산 혼성화에 대한 실시간 평가 및 핵산 상호작용의 분석을 위한 활성화된 분절-폴리펩티드의 사용이다. 이와 같은 구체예에서, 본 발명은 활성화된 분절-폴리펩티드 단백질 단편들에 컨주게이션되는 뉴클레오티드 결합 모이어티로서 역할하는 올리고뉴클레오티드들의 혼성화에 대한 실시간 즉각 검출 방법을 제공한다. 예를 들어, 국소 가열(참고문헌으로써 이의 전체 내용이 본원에서 인용된, 하마드-쉬페릴 등의 논문(Hamad-Schifferli et al., Nature, vol. 415, 10 January 2002)에 소개된 것과 동일함)은 결합된 올리고뉴클레오티들을 변성시키는데 사용될 수 있으며, 그에 따라 활성화된 분절-폴리펩티드 단편들은 분리되며 시그널 및/또는 형광은 꺼지게 된다. 본 발명의 활성화된 분절-폴리펩티드들은, 올리고뉴클레오티드들이 분리되자마자, 활성 단백질이 즉각적으로 해체(disassembly)되고 시그널이 개선된다는 점에서 독특하다. 분절-폴리펩티 드 단편들이 분절-형광 단편들인 구체예들에서, 형광은 즉각적으로 켄칭되거나 핵산 혼성화로 실시간으로 개선된다. 더욱이, 분절-폴리펩티드들은 또한 올리고뉴클레오티드들이 혼성화로 인하여 재결합되도록 촉진되면, 활성 단백질 시그널(예를 들어, 형광)이 즉각적으로 재구축된다는 점에서 독특하다.

이 구체예에서 본 발명의 분자의 용도는 통상의 기술자가 효율적으로 다수의 온-오프 순환이 요구되는 다양한 분석을 수행하고 상기 분석으로부터의 결과를 기록할 수 있게 하며 핵산 혼성화 사건의 실시간 광학 가시화를 가능하게 한다. 더 나아가, 본 발명의 방법은 혼성화를 방해하거나 촉진하고/하거나 핵산 혼성화 순환 사건에 개입하는 물질의 스크리닝을 가능하게 한다. 예를 들어, 본 발명의 활성화된 분절-폴리펩티드 단백질 분자 및/또는 활성화된 분절-형광 단백질 분자의 용도는 혼성화 또는 혼성화 순환 사건에 개입하는 물질의 급속한 실시간 스크리닝에 사용될 수 있다. 비제한적인 일예로서, 본 발명의 방법은 특이한 억제 핵산 서열, 예컨대, 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, mRNAi 등, 및/또는 이와 같은 억제 핵산의 활성을 촉진하거나 억제하는 물질을 급속하게 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 활성화된 분절-형광 단백질에 결합된 결합 모이어티들 간의 혼성화를 감소시키는 물질 또는 분자는 결과적으로 활성화된 단백질 시그널을 약화시키거나 감소시키는 반면, 결합 모이어티들 간의 혼성화를 촉진하는 물질은 결과적으로 활성화된 단백질 시그널의 증가를 초래한다.

또 다른 구체예에서, 분자는 핵산의 실시간 정량에 사용될 수 있다. 관련 구체예에서, 본 발명의 방법은 면역RCA 및 면역PCR 방법에 사용될 수 있다. 본 발 명의 또 다른 구체예는 시험관내에서 표적 핵산을 스크리닝하기 위한 실시간 단백질 보완의 사용을 제공한다. 예를 들어, 다를 비-표적 핵산들의 집단에서 관심있는 표적 핵산을 식별하는데 사용될 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명의 표적 핵산 또는 분절-폴리펩티드 분자는, 편리한 임의의 수단에 의해, 소정 유형의 고체 지지체에 부착된 형태로 사용될 수 있다. 이와 같은 지지체에 대한 부착은 본 발명의 방법을 사용하는 순환 주기 증폭에 의해 생산된 앞뒤 나란히 연결된 DNA 서열의 검출을 용이하게 하기 위해서 상기 프라이머 또는 ATC를 고체 지지체에 부착시키는 역할을 하는 일부 분자 종, 예컨대, 소정 형태의 중합체(생물학적 중합체 또는 그 외 다른 중합체)에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 이와 같은 고체-상태 기재(substrates)는 올리고뉴클레오티드들과 커플링될 수 있는 임의의 고체 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질에는 아크릴아미드, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 유리, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리프로필렌, 폴리메타아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 옥사이드, 유리, 폴리실리케이트, 폴리카보네이트, 테플론, 플루오카본, 나일론, 실리콘 고무, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리오르쏘에스터, 폴리프로필푸머레이트, 콜라겐, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans), 및 폴리아미노산과 같은 물질이 포함된다. 고체-상태 기재는 얇은 필름 또는 막, 비드, 병, 접시, 섬유, 부직포(woven fibers), 성형 중합체(shaped polymers), 입자 및 미세입자를 포함하는 임의의 유용한 형태를 지닐 수 있다. 고체-상태 기재에 관한 바람직한 형태는 유리 슬라이드 또는 마이크로티터접시(microtiter dish)(예를 들 어, 표준 96-웰 접시)이다. 추가적인 장치(arrangements)와 관련하여, 미국 특허 제5,854,033호에 소개된 것들을 참조하라.

고체-상태 기재에 대한 올리고뉴클레오티드의 고정화에 대한 방법은 잘 확립되어 있다. 어드레스(Adress) 프로브와 검출 프로브를 포함하는, 올리고뉴클레오티드들이 확립된 커플링 방법을 사용하여 기재에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 적당한 부착 방법들은 다음 문헌에 소개되어 있다: Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026 (1994). 고체-상태 기재에 올리고뉴클레오티드들을 부착시키기 위한 바람직한 방법은 다음 문헌에 소개되어 있다: Guo et al., Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994).

또 다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 비핵산 분석대상물의 정량을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예는 시험관내에서 표적 분석대상물을 스크리닝하기 위한 실시간 단백질 보완의 사용을 제공한다. 예를 들어, 기타 비-표적 분석대상물의 집단에서 관심있는 표적 분석대상물을 식별해내기 위해 사용된다. 이 구체예에서, 본 발명의 분절-폴리펩티드 분자에 컨주게이션된 분석대상물의 결합 모티프들은, 편리한 임의의 수단에 의해, 소정 형태의 고체 지지체에 부착된 형태로 사용될 수 있다. 이와 같은 지지체에 대한 부착은 본 발명의 방법을 사용한 순환 주기 증폭에 의해 생산되는 분석대상물 DNA의 검출을 용이하게 하기 위해서 상기 프라이머 또는 ATC를 고체 지지체에 부착시키는 역할을 하는 일부 분자 종, 예컨대, 소정 형태의 중합체(생물학적 또는 그 외 다른 중합체)에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 중요한 구체예는 시험관내에서 특정 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 분절-폴리펩티드 분자의 용도이다. 특히, 본 발명은 개체 내의 유전자 돌연변이, 다형성, 또는 변형의 실시간 검출을 가능하게 한다. 생물학적 샘플은 개체로부터 분리되며 DNA 및/또는 RNA는 추출된다. 본 발명의 분자는 분절 형광 단백질이 통상의 기술자가 검출하고자 하는 특정 돌연변이, 다형성 또는 변형에 특이적인 올리고뉴클레오티드에 결합되도록 디자인된다. 대안적으로, 한 풀의 분자들이 사용되어 다수의 돌연변이, 다형성, 또는 변형이 검출될 수 있다. 이 구체예에서, 분절 형광 단백질에 부착된 올리고뉴클레오티드는 서로에 대해 상보적이며, 그에 따라 기준(baseline)은 형광이다. 이후 개체 DNA 및/또는 RNA는 상기 분자(들)에 접촉된다. 개체가 특정 돌연변이 또는 다형성을 지니는 경우, 이것은 분절 형광 분자와 경쟁할 것이며 형광을 감소시킬 것이다. 바람직하게는, 개체의 DNA 및/또는 RNA는 형광 분자와 접촉되기 전에 증폭된다. 이것은 공지된 다형성의 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 분자는 형광 검출의 즉시성으로 인해 민감한 검출을 가능하게 한다.

한 구체예에서, 분자는 시험관내에서 병원체의 실시간 검출에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 분자는 병원체 및/또는 병원체 핵산의 존재의 결과로서 핵산 서열 내의 병원체 핵산 서열 및/또는 변형의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 대안적인 구체예들에서, 본 발명의 분자는 병원체 감염의 결과로서 비핵산 분석대상물의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 병원체는 바이러스 감염, 진균 감염, 박테리아 감염, 기생충 감염 및 기타 감염성 질병일 수 있다. 바이러스 는 단순포진 바이러스 타입-1, 단순포진 바이러스 타입-2, 사이토메갈로바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 수두(Varicella-zoster) 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 7, 인간 헤르페스 바이러스 8, 천연두(Vriola) 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 간염 D 바이러스, 간염 E 바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B. 홍역 바이러스, 폴리오마바이러스, 인유두종바이러스(Human Papilomavirus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus), 아데노바이러스, 코사키(Coxsackie) 바이러스, 뎅기 바이러스, 유행성이하선염(Mumps) 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병(Rabies) 바이러스, 로우스 육종 바이러스, 황열 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크(Marburg) 바이러스, 라사 열 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern Equine Encephalitis) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세이트 루이스 뇌염(St. Louis Encephalitis) 바이러스, 머레이 계곡 열(Murray Valley fever) 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열(Rift Valley fever) 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B. 로타바이러스 C, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 원숭이 면역 결핍 바이러스(Simian immunodeficiency virus), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입-1, 한타바이러스, 루벨라 바이러스, 원숭이 면역 결핍 바이러스, 인체 면역결핍 바이러스 타입-1, 및 인체 면역결핍 바이러스 타입-2를 포함하는 바이러스의 군에서 선택될 수 있다.

표적 핵산 또는 표적 분석대상물의 검출은 식품, 음료, 물, 약제학적 제품, 개인 의료 제품, 유제품, 환경적 샘플 내의 박테리아와 진핵생물의 검출에 유용할 수 있다. 바람직한 음료는 소다수, 병에 든 물, 과일 주스, 맥주, 와인 또는 알코올 제품을 포함한다. 개발된 분석법은 식품, 음료, 물, 약제학적 제품, 개인 의료 제품, 유제품, 환경적 샘플을 제조하거나 저장하기 위해 사용되는 원료 물질, 장비, 제품 또는 공정의 분석에 특히 유용할 것이다.

본 발명의 또 다른 관련 구체예에서, 활성화된 분절-형광 폴리펩티드들의 조립은 불연속 에피토프를 포함하는 재조립된 단백질을 형성하는데, 상기 단백질은 재조립된 단백질 상의 불연속 에피토프를 특이적으로 인지하나 어느 한 개별 폴리펩티드 상에 존재하는 부분적인 에피토프를 인지하지 아니하는 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 이와 같은 불연속 에피토프의 한 예는 HIV의 gpl20에서 발견된다. 이러한 항원들은 면역검출과 같은, 당업계에 공지된 방법에 의하여 연이은 검출을 위한 검출 단백질로 사용될 수 있다. 이러한 항원들 및 이와 같은 다른 유도체들은 널리 알려져 있는 기술에 기반하여 당업계이 통상이 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있으며, 항체 자체의 단백질 단편이 아니라 재조립된 단백질을 인지하는 항체들로 인해 스크리닝될 수 있다.

표적 핵산의 기원은 인간이 될 수 있다. 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 표적 핵산은 용액 중에서 유리되어 있거나 고체 지지체에 고착될 수 있다.

한 구체예에서, 표적 핵산 또는 표적 분석대상물은 유전자적으로 기원하는 질병에 특이적이거나 유전자적으로 기원하는 질병에 대한 소질에 특이적이다. 상기 질병은, 예를 들어, 베타-지중해빈혈(Thalassemia), 겸상세포빈혈(Sickle-cell anemia) 또는 인자-V 레이덴(Leiden), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF)와 같은 유전자 기반 질병, p53와 plO와 같은 암 관련 표적, 또는 유방암 감수성에 대한 BRC-I과 BRC-2일 수 있다. 아직 또 다른 구체예에서, 분리된 염색체 DNA는 친부 검사(paternity testing), 신원 확인(identity confirmation) 또는 범죄 조사와 관련하여 조사될 수 있다.

표적 핵산 또는 표적 분석대상물은 병원체 또는 미생물에 특이적일 수 있다. 대안적으로, 표적 핵산 또는 표적 분석대상물은 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 또는 효모일 수 있으며; 표적 핵산에 대한 보완 분자의 혼성화는 샘플 내에 상기 병원체 또는 미생물의 존재에 대한 지표가 된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 핵산 또는 표적 분석대상물의 존재 및/또는 양을 검출하는데 적당한 키트를 제공한다. 키트는 제 1 분자와 커플링된 하나 이상의 제 1 프로브와 제 2 분자에 커플링된 제 2 프로브를 포함하는데, 여기서 상기 프로브는 표적 핵산 내의 혼성화 서열에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로브는 바이얼 내에 존재한다. 키트는 또한 샘플 내의 표적 핵산 또는 표적 대상물의 존재 또는 양을 포획하고/하거나 검출하는데 적당한 시약(reagents)을 포함할 수 있다. 표적 핵산 및/또는 표적 분석대상물의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시약은 효소 활성 시약 또는 조립된 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 표지될 수 있다. 이와 같은 키트는 선택적으로 DNA 중합효소, DNA 중합효소 보조인자(cofactors), 및 데옥시리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트와 같은 RCA 반응을 실행하기 위하여 필요한 시약을 포함할 수 있다. 선택적으로, 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오티드 분자, DNA 또는 KNA 리가 아제, 제한효소(restriction endonucleases), 역전사효소, 말단 전이효소, 다양한 완충액과 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 바이얼과 같은 용기 내에 담겨진다. 키트는 또한 양성과 음성 대조 반응을 실행하기 위해 필요한 시약뿐만 아니라, 사용지침서를 포함할 수 있다. 주어진 반응에서 사용될 시약의 최적량은 현재의 개시사항의 이점을 갖는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 동시적으로 다수의 핵산 표적 또는 다수의 분석대상물에 대한 단백질 보완에 사용될 수 있다. 비제한적인 일예로서, 상이한 핵산 결합 모티프들에 결합된 상보적인 분절-폴리펩티드 단편들의 단백질 보완. 예를 들어, 한 표적 핵산의 존재는 한 쌍의 활성 분절-폴리펩티드 단편의 단백질 보완을 용이하게 할 것이며, 한편, 또 다른 표적의 존재는 또 다른 쌍의 활성화된 분절-폴리펩티드 단편의 단백질 보완을 용이하게 할 것인데, 이는 결과적으로 상이한 활성 단백질과 검출가능 시그널을 초래하게 된다. 이와 같은 구체예에서, 다수의 핵산 표적들은 동시적으로 검출될 수 있다. 대안적인 구체예에서, RNA와 DNA 같은, 표적 핵산의 동시 검출은 실시간 단백질 보완에 의해 모니터링될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 다수의 비핵산 분석대상물들은 특이적인 분석대상물 결합 모티프들을 포함하는 분절-폴리펩티드 단편의 사용으로 동시적으로 검출될 수 있다. 이와 같은 구체예는 특별히 유용한데, 예를 들어, 질병, 장애 또는 이상에 대한 진단에 관한 증상에 기여하는 하나 이상의 분석대상물의 존재 또는 수준을 평가하는데 있어서, 특히 유용하다.

관련 구체예에는, 상이한 형광 단백질들로부터의 분절-형광 단백질 단편들을 사용한 다수의 단백질 보완이 있다. 관련 구체예에서, 본 발명의 방법은 다양한 기타 추정되나 상이한 핵산 표적들에 따른 특이한 표적 핵산의 실시간 검출과 식별을 가능하게 한다(참고문헌으로써 이의 전체 내용이 본원에서 인용되는, 다음 문헌을 참조하라: Hu et al, Nature Biotechnology, 2003;21;539-545; Kerppola, 2006, 7;449-456, Hu, et al, Protein-Protein Interactions (Ed. P. Adams and E. Golemis), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2005).

정의

달리 명시하지 아니하는 한, 본원에서 사용된 하기 용어 및 어구는 하기 의미를 갖도록 의도된다:

용어 "리폴딩(refolding)"은 용매화 과정에서 생산된 분리된 단백질 분자들의 이들의 천연적인 3차원 형태로의 폴딩을 의미한다. 이러한 과정은 단백질의 아미노산 서열에 의해 영향을 받게 된다. 리폴딩이 단백질 내의 이황화 결합의 형성보다 앞서 일어날 때 이황화 결합이 올바른 위치에서 형성되며, 그에 따라 천연적인 형태의 활성 단백질의 형성이 초래된다는 것은 널리 알려져 있다.

본원에서 사용된 용어 "미리형성된(preformed)"은 이미 형성된 형태와 구조를 의미한다. 용어 "미리형성된 발색단"은 형광의 생성에 필요한 발색단의 성숙한 형태를 의미한다. 미리형성된 발색단은 활성 형태로 존재하고 활성화되기 위애 구조적인 변형을 필요치 아니한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 핵산 또는 컨스트럭트 내에 존재하는 임의의 하 나 이상이 핵산 세그먼트, 또는 핵산 분자, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 의미한다. "관심있는 유전자를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 이와 같은 폴리펩티드에 대한 코딩 지역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 프로모터 또는 전자 종결자와 같은 조절 엘리먼트를 엔코딩하거나, 폴리펩티드 또는 단백질의 특이적인 엘리먼트, 예컨대, 분비 신호 펩티드 또는 기능적 도메인을 엔코딩할 수 있다.

"뉴클레오티드"는 DNA와 RNA같은, 중합체성 핵산 내의 단량체 단위이며, 3가지 독특한 소부분 또는 모이어티로 구성된다: 당, 인산, 및 핵산염기(Blackburn, M., 1996). 이중 나선의 일부일 때, 뉴클레오티드들은 또한 "염기" 또는 "염기 쌍"으로도 지칭된다. 가장 일반적인 천연적으로 생성되는 핵산염기, 아데닌(A), 구아닌(G), 우라실(U), 시토신(C), 및 티민(T)은 한 핵산 가닥이 서열 특이적 방식으로 다른 가닥에 결합하는 수소-결합 기능성을 지닌다. "뉴클레오시드"는 인산이 결여된 뉴클레오티드를 의미한다. DNA와 RNA에서, 뉴클레오시드 단량체는 포스포디에스터 결합에 의해 연결되는데, 본원에서 사용된, 용어 "포스포디에스터 결합"은 결합된 카운터 이온, 예를 들어, IT', NW, Na', 및 이와 동종의 다른 것을 포함하는, 포스포디에스터 결합 또는 이의 인산 유사체를 포함하는 결합을 의미한다.

본원에서 사용된, 용어 "올리고뉴클레오티드"와 "프라이머"는 표준 핵산 과정에서 이와 관련된 관용적인 의미를 갖는데, 즉, 폴리뉴클레오티드 주형에 혼성화할 수 있으며 주형 가닥에 상보적인 프라이머 신장 산물의 합성을 위한 개시점으로 역할하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

"폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 이중 가닥과 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드 "DNA", 리보뉴클레오티드 "RNA" 및 이와 동종의 다른 것을 포함하는, 천연 뉴클레오티드 단량체 또는 이의 유사체의 선형 중합체를 의미한다. 달리 말해서, "올리고뉴클레오티드"는, 각각, 데옥시리보핵산(DNA)와 리보핵산(RNA)를 포함하는 구조적 단위체인, 데옥시뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 사슬이다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 일반적으로 소수 단량체 단위, 예를 들어, 8-40으로부터 수천 단량체 단위까지에 이른다. DNA 폴리뉴클레오티드가, 예컨대, "ATGCCTG"와 같은 연속된 문자로 표기될 때, 달리 명시한 바가 없는한, 상기 뉴클레오티드들은 좌에서 우로 5'->3' 순서로 존재하며 "A"는 데옥시아데노신, "C"는 데옥시시티딘, "G"는 데옥시구아노신, 및 "T"는 티미딘을 의미한다는 것은 이해될 것이다.

"왓슨/크릭 염기쌍 형성(base-pairing)"과 "왓슨/크릭 상보성"은 수소 결합을 통해 서로 결합되는 특정 쌍의 뉴클레오티드와 이의 유사체의 패턴을 의미하는데, 예를 들어, A는 T 및 U와 짝짓고, G는 C와 짝짓는다. 특이적인 염기-짝지음의 역할은 "혼성(hybidization)" 또는 "혼성화(hybridizing)"이다. 2 이상의 상보적인 핵산 또는 핵산 유사체의 가닥들이 염기쌍 형성을 겪게 될 때, 혼성체가 형성된다.

본원에서 사용된, 용어 "올리고뉴클레오티드"와 "프라이머"는 표준 핵산 과정에서 이와 관련된 관용적인 의미를 갖는데, 즉, 폴리뉴클레오티드 주형에 혼성화할 수 있으며 주형 가닥에 상보적인 프라이머 신장 산물의 합성을 위한 개시점으로 역할하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본원에 기재된 많은 올리고뉴클레오티드들은 안정한 혼성체가 이들 사이에 형성될 수 있도록 다른 올리고뉴클레오티드들 또는 핵산 들의 특정 부분에 상보적이도록 디자인된다. 이러한 혼성체의 안정성은 다음 문헌에 소개된 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있다: Lesnick and Freier, Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw et al, Biotechniques 8:674-678 (1990), 및 Rychlik et al., Nucleic Acids Res. 18:6409-6412 (1990).

"컨주게이트" 또는 "컨주게이션된"은 2이상의 모이어티들의 결합을 의미한다. 결합은 2 이상의 폴리펩티드들의 융합, 또는 공유결합성, 이온성, 또는 소수성 상호작용일 수 있는데, 그에 따라 분자의 모이어티들이 모이게 되며 근접하여 유지된다. 실체물의 부착은 링커, 화학적 변형, 펩티드 링커, 화학적 링커, 공유결합성 또는 비공유결합성 결합, 또는 단백질 융합 또는 당업계에 통상의 기술자에게 알려진 임의의 수단에 의해 동반될 것이다. 결합은 영구적이거나 가역적일 수있다. 몇몇 구체예들에서, 몇몇 링커들은 컨주게이트 내의 각각의 링커와 각각의 단백질의 바람직한 특성을 이용하기 위하여 포함될 수 있다. 컨주게이트의 용해도를 증가시키는 유연한 링커 및 링커는 단독으로 사용되거나 본원에 포함된 다른 링커들과 함께 사용되는 것이 고려된다. 펩티드 링커는 링커를 엔코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 컨주게이트 내의 하나 이상의 단백질들에 연결될 수 있다. 링커는 산 절단가능, 광절단가능 및 열 민감성 링커일 수 있다.

본원에서 호환적으로 사용된, 용어 "모이어티" 또는 "모티프"는 특별한 기능 을 수행할 수 있는, 분자; 핵산 또는 단백질 또는 그외의 다른 것을 의미한다. "핵산 결합 모이어티" 또는 "핵산 결합 모티프"는 특이적인 방식으로 핵산에 결합할 수 있는 분자를 의미한다.

"검출"은 검출 수준의 특성에 기초한 컨스트럭트에 대한 검출, 관찰, 또는 측정을 의미한다.

용어 "핵산염기-변형된"은 DNA와 RNA에서 발견되는 천연적으로 생성되는 핵산염기들인, A, G, C, T, U의 염기쌍 유도체를 의미한다.

용어 "프로모터"는 전사를 유도하는데 충분한 최소 뉴클레오티드 서열이다. 또한 프로모터-의존성 유전자 발현이 세포-유형 특이적으로, 또는 조직 특이적으로 조절되거나, 외래 시그널 또는 물질에 의해 유도되도록 하기에 충분한 그러한 프로모터 엘리먼트가 본 발명에 포함되며; 이와 같은 엘리먼트는 천연 유전자의 5' 또는 3' 지역 또는 인트론 내에 존재할 수 있다. 용어 "유도성 프로모터"는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시의 속도가 외부의 자극에 의해 조절될 수 있는 프로모터를 의미한다. 용어 "구조성 프로모터"는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시의 속도가 일정하며 비교적 외부의 자극에 독립적인 프로모터를 의미한다. "일과성(temporally modulated) 프로모터"는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시의 속도가 발달이 진행되는 동안의 특정 시간에 조절되는 프로모터이다. 이러한 모든 유형의 프로모터들이 본 발명에 포함된다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 단백질을 의미하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.

본원에서 사용된, 용어 "시험관내"는 개체 외부에 존재하는 임의의 용액 또는 임의의 세포를 포함하려는 의도이다. 일반적으로, 시험관내는, 용액 및/또는 세포가 정상적으로 발견되는 환경으로부터 분리되는, 시험관, 바이얼,또는 임의의 다른 용기 또는 홀더 내에서 일어나는 반응을 의미하는데, 된다.

본원의 비핵산 분석대상물이라는 문맥에서 사용된 용어 "분석대상물"은 핵산 또는 뉴클레오디드 또는 핵산 유사체가 아닌 임의의 화학적, 생물학적 또는 구조적 실체물을 의미하려는 의도이다. 이와 같은 분석대상물은, 이에만 국한되는 것은 아니나, 유기 분자, 무기 분자, 생분자, 대사생성물 등을 포함한다.

실시예

실시예 1

실험방법

분자 모델링. 일련의 비드 방법¹⁸을 이용하여 EGFP 및 이의 단편 단편에 대한 모델링을 수행하였다. 폴리펩티드의 각각의 아미노산은 C_α와 C_β 위치에 상응하는 2개의 비드들에 의해 대별된다. 이웃하는 비드들은 골격 기하와 유동성을 모방하도록 강제하였다. 아미노산들 간의 상호작용은 GO-유사 구조-기반 전위¹⁸에 의해 자극받게 된다. 이와 같은 모델에서, 2개의 아미노산들은 이들이 천연 단백질 상태에서의 접촉을 형성하는지 형성하지 아니하는지에 따라 인력 또는 척력을 할당받게 된다. 단백질 데이터베이스 뱅크(X-레이 구조; PDB 코드 Ic4f)로부터 천연 EGFP의 구조를 획득하였다. EGFP 단편들 내의 아미노산들에 대한 접촉 전위를 선 택하기 위해, 본 발명자들은 전장 길이 단백질의 천연 구조를 사용하였다. 이산 분자 동역학(discrete molecular dynamics, DMD) 접근법¹⁸으로 단백질 폴딩 열역학과 역학을 분석하였다.

폴리펩티드의 클로닝, 발현 및 정제. EGFP-1 유전자를 포함하는 플라스미드(Clontech)를 거대(A) 및 소(B) EGFP 단편을 코딩하는 DNA 서열의 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 거대 단편은 158개의 N-말단 아미노산에 더하여 C-말단 시스테인을 포함하였으며, 소 단편은 나머지 C-말단 81개 아미노산에 더하여 N-말단 시스테인을 포함하였다. PCR 산물을 TWIN-I 벡터(New England Biolabs)에 클로닝하여 Ssp DNAB 인테인의 C-말단 융합체를 생산하였으며(인테인 자가-분절 화학^21,22을 이용하여 요망되는 단백질 단편을 정제하기 위함), 대장균 BL21(DE3) pLys 컴피턴트 세포(competent cells)(Stratagene)에서 발현시켰다. 모든 컨스트럭트들의 구조를 시퀀싱으로 확증하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머들을 다음과 같다: C-말단 시스테인을 지닌 거대 EGFP 단편: 프라이머 ALPHA_dir: 5'-AGTTTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCG (서열번호 l); 프라이머 ALPHA-CYS_rev: 5'-ATCGCTCGAGTTAGCACTGCTTGTCGGCCATG (서열번호 2); 비오틴표지된 올리고 1: 비오틴-5'-CGACTGCGTTAGCATGTGTTG (서열번호 3). N-말단 시스테인을 지닌 소 EGFP 단편: 프라이머 BETA-CYS dir_5'-ATCGGATATCATGTGCAAGAACGGCATCAAGGTG (서열번호 4); 프라이머 BETA_rev: 5'- ATCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC (서열번호 5); 비오틴표지된 올리고 2: 5'- CAACACATGCTAACGCAGTCG-비오틴 (서열번호 6).

세포를 OD_60O = 0.6이 될 때까지 밤새 성장시켰으며 25℃에서 밤새 0.35 mM IPTG로 유도시켰다. 세포를 원심분리로 펠렛화하고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.5), 25% 수크로스, 1 mM EDTA, 10 mM DTT를 포함하는 완충액으로 세척하고, 동결시키고(-70℃에서 10분간), 3회 해동시켰다(37℃에서 5분간). 세포를 3 x 30 초 버스트(burst) 후, 세포를 얼음에 유지시키는, 각각 30초간의 인터벌(interval)이 뒤따르는 초음파처리로 분해시켰다(Sonifier cell disrupter Wl 85c, Branson Sonic Power). 그 결과 생성된 혼합물을 4℃에서 5분간 15000 rpm으로 원심분리하고, 펠렛을 상기한 동일한 완충액에 재현탁시키고 또 다시 추가의 3 x 30 초 파열로 초음파분해시켰다. 펠렛을 3회 세척하고 그 후 25 mM MES(pH 8.5), 8 M 우레아, 10 mM NaEDTA, 0.1 mM DTT를 포함하는 완충액 중에서 재현탁시키고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 용해된 단백질을 5분간 15000 rpm으로 원심분리시키고난 다음, 1:100의 희석비를 갖는 리폴딩 완충액(50 mM Tris(pH 8.5), 500 mM NaCl, 1mM DTT)을 적가하여 상청액을 리폴딩시켰다. 리폴딩된 단백질을 제조업자가 권장하는 대로 키틴 컬럼을 사용하여 정제하였다. 모들 단백질의 순도를 SDS-PAGE로 분석하였다(도 3A). 단백질 흡수 스펙트럼을 히타치(Hitachi) U-3010 분광광도계로 기록하였다.

단백질과 올리고뉴클레오티드의 커플링, 단백질 보완 및 형광 측정. 제일 먼저 EGFP 단백질 단편들을 G-25 마이크로스핀(microspin) 컬럼(Amersham Biosciences)을 사용하여 PBS-EDTA 완충액(pH 7.5)에서 겔-여과시켰다. 그 후, > 70% 비오틴표지화를 얻기 위해 이러한 용액을 10:1 부피비로 디메틸포름아미드 중 의 10 mM 비오틴-HPDP(Pierce)에 혼합하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 반응하지 않은 비오틴-HPDP를 겔 여과에 의해 비오틴표지된 단백질로부터 제거하였다. 그 다음에, 비오틴표지된 EGFP 단편과 스트렙트아비딘의 1:1 복합체를 PBS-EDTA 완충액 중에서 37℃에서 15분간 동일 몰당량(적정 실험에 의해 결정됨: 도 4A 참조)의 스트렙트아비딘과 함께 이러한 단편들을 인큐비이션함으로써 획득하였다. 최종적으로, 1:1:1의 세부분으로 이루어진 분자 구조물을 획득하기 위해 동일 몰당량의 상응하는 비오틴표지된 올리고뉴클레오티드를 각각의 2성분 복합체에 부가하였다. 그에 따라 획득된 세부분으로 이루어진 분자 구조물(도 4B 참조)을 PBS-EDTA 완충액 중에 1:1 몰비로 혼합하여 최종 농도 ~200 nM가 되게 하였다. 회복된, 분절 EGFP의 형광 반응을 히타치 F-2500 분광광도계로 모니터링하였다. 회복된 올리고뉴클레오티드-지지된 단백질 컨스트럭트들을 분리시키기 위해, 비오틴으로 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드(거대 EGFP 단편과의 커플링을 위해 사용된 비오틴표지된 올리고머와 동일한 서열을 지님)를 100배 과량으로 부가하였으며, 그 결과 생성된 형광 변화를 기록하였다.

결과

본 발명자들의 디자인에서(도 1A), 형광 단백질의 2개의 단편들은 상보적인 올리고뉴클레오티드들과 커플링된다. 한 폴리펩티드는 전장 길이 단백질 내에서 밝게 형광을 나타낼 수 있는 발색단을 포함한다. 그러나, 상기 발색단은 단백질 단편에서 형광을 나타내지 아니하는데, 이는 용매에 노출되고 켄칭되기 때문이며, 또한 다른 단편의 아미노산들과의 필요한 접촉이 결여되어 있을 수도 있기 때문이 다. 2개의 단백질 단편들이 핵산 상보적인 상호작용에 의해 서로에 대해 가까이 근접될 때, 제 2 폴리펩티드는 용액으로부터 발색단을 분리시키고 형광의 발달을 초래하는 소실된 모든 아미노산 접촉의 회복을 가능하게 하는 발색단에 대한 보호막으로써 역할한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)²의 2개의 단편들을 조작하였는데, 상기 단편들은 9개의 아미노산(153-161 EGFP 잔기)¹⁶의 유연한 루프에 의해 연결된 EGFP의 거대 단편과 소 단편에 해당한다. 거대, N-말단 EGFP 도메인은 천연 단백질에서 형광을 나타내나 변성된 단백질에서 형광을 나타내지 아니하는 발색단을 형성하는 3개의 아미노산을 포함하는 것으로 알려져 있다^2,17. 더욱이, 상기 트리펩티드는 분리된 거대 EGFP 단편에서 형광을 나타내지 아니한다^6,9.

EGFP 발색단 형성은 올바른 단백질 폴딩을 요하는 자가-촉매적 과정이다¹⁷. 본 발명자들은 N-말단 EGFP 단편(전체 EGFP의 ~2/3)은 단독으로 콤팩트한 폴딩된 구조를 나타낼 수 있을 정도로 충분히 거대하다고 가정하였다. 본 발명자들은 또한 비록 형광을 나타내지 아니할지라도, 상기 구조가, 발색단이 폴딩된 거대 EGFP 단편 내부에서 자발적으로 형성될, 완전한 EGPF의 상응하는 부분과 형태적으로 매우 근접해 있을 것으로 가정하였다.

본 발명자는 이산 분자 동역학(DMD) 시뮬레이션을 사용하여 EGFP와 이의 거 대 단편에 대한 분자 모델링 분석을 수행하였다¹⁸. DMD 시뮬레이션의 결과는 다음과 같다, 온도(T<0.6)에서 거대 EGFP 단편은 실제로 상당히 감소된 위치 에너지(potential energy)를 특징으로 하며 폴딩되며; 더 높은 온도(T>0.6)에서, 단백질은 높은 위치 에너지를 가지면서 폴딩되지 아니한 상태로 존재한다. 상기 폴리펩티드의 폴딩 열역학과 동역학은 2개의 상태, 단일-도메인 단백질들에 전형적인 전부-또는-전무 양상(all-or-none mode)을 따른다. 전이 온도 T_F~0.60 근처에서, 거대 EGFP 단편은 대략적으로 동일한 확률을 가지며 위치 에너지에서 거대한 변동(fluctuations)을 가지면서 폴딩된 상태와 폴딩되지 않은 상태 둘 모두를 나타낸다(도 2B). 폴딩 및 논폴딩 사건이 일어나는 동안, 거대 EGFP 단편의 중간체 상태는 관찰되지 아니하였다.

도 2C는 댕글링(dangling) 20-잔기-길이 C-말단 부분을 제외한, 콤팩트한 구조의 폴딩된 거대 EGFP 단편을 도시하고 있다. 더욱이, 전장 길이 EGFP와 이의 거대 단편 내부의 발색단-형성 아미노산들의 배열은 본질적으로 동일하며(도 2D, E), 따라서 발색단 형성을 가능하게 만든다. 여전히, 도 2C는 거대 EGFP 단편 내의 발색단-형성 아미노산들이 용매에 노출되어 있으며(전장 길이 EGFP의 경우에는 비노출되어 있음), 여기서 이러한 아미노산들은 단백질 내부에 깊숙히 묻혀있다는 것을 보여준다(도 2D). 게다가, 이러한 아미노산들은, 전장-길이 단백질에 존재하는, 더 작은 EGFP 단편의 다른 잔기와의 다수의 중요한 접촉들이 결여되어 있다¹⁹. 따라서, 발색단이 형성된다 할지라도, 불완전한 EGFP 내부에 존재할 때, 상기 발색단 은 강한 형광을 나타내는데 결함이 있을 수 있다.

소 EGFP 단편은, 서로 접촉하지 아니한, 2개의 β-헤어핀으로 이루어져 있는데, 그래서 이 폴리펩티드는 단독으로는 잘-규정된(well-defined) 콤팩트한 구조를 형성할 수 없다. 그러나, EGFP 폴딩에 대한 본 발명자들의 DMD 시뮬레이션은, 일단 소 EGFP 단편이 이의 거대 대응부(counterpart)에 결합하게 되면, 상기 단편은 합쳐진 콤팩트한 단백질 구조의 일부분이 되기 위한 올바른 위치를 발견하며, 거대 EGFP 단편 내의 댕글링 부분은 결과적으로 또한 폴딩된다는 것을 제시한다.

그 후 본 발명자들은 EGFP를 DMD 시뮬레이션에 사용된 거대 도메인과 소 도메인에 해당하는 이 단백질의 2개의 단편들을 클로닝하고 분리함으로써 유연한 루프 내부의 아미노산 158과 159 사이에서 분절시켰다. 최적의 기능성을 위해, 분절 EGFP-기반 광학 스위치는 DNA 혼성화-탈혼성화 사건에 빠르게 반응할 수 있어야 한다. 핵산 상보적 상호작용은 빠른 것으로 공지되어 있다(수분 이내)^12,13,20. 컨스트럭트내에서, 성숙한 프로-형광 EGFP 발색단의 새로운(de novo) 형성은 수시간을 요한다¹⁷. 분자 모델링 분석에 기초하여, 본 발명자들은 거대 EGFP 단편이 미리형성된 발색단과 함께 시험관내에서 분리될 수 있다고 추정하였다. 만일 이것이 그런 경우라면, 2개의 EGFP 단편들의 형광적으로 활성있는(fluorescently-active) 보완은 빠르게 진행되어야 하며 수시간 대신 수분이 소요되어야 한다. 모든 종래 보고에서, 시험관내 EGFP 재조립은, 재조립의 결과로만 형성된, 성숙한 발색단이 결여된 단백질과 함께 가장 그럴싸하게 수행되었다는 것을 주목하라^6,9. 따라서, 이 러한 연구에서 형광 발달은 매우 느렸다.

거대 및 소 EGFP 단편을 단백질 정제를 용이하게 하기 위해²² 자가-분절 Ssp DNAB 인테인²¹을 지닌 융합체로서 대장균에서 과발현시켰다. 이러한 폴리펩티드를 리폴딩 후 봉입체로부터 분리하였다(상세한 내용에 대해 실험방법을 참조하라). 형광 단백질을 지닌 융합체 내의 인테인은 이의 적절한 폴딩에 영향을 미치지 아니하였다는 것이 밝혀졌다²². 도 3A는 두 EGFP 단편들이 충분히 높은 순도로 획득되었음을 보여주었다: 리폴딩된 단백질 샘플은 >70%의 거대 EGFP 단편과 ~90%의 소 EGFP 단편을 포함하였다.

도 3B는 이러한 폴리펩티드의 흡수 스펙트럼을 보여준다. 통상의 기술자는 두 EGFP 단편들이 천연 EGFP에서 관찰되는 490 nm에서의 특징적인 피크가 결여되어 있음을 보여준다(도 3B 인세트). 그러나, 소 EGFP 단편과 다른 비형광/발색단이 없는 단백질(스트렙트아비딘)과 대조적으로, 거대 EGFP 단편은 300-400 nm 범위에서의 상당한 흡광도를 특색으로 하는데, 상기 흡광도는 변성된 EGFP17의 발색단에서 예상되며 또한 다른 광활성 분절된 EGFP 변이체 s23에서 관찰되었다. 거대 EGFP 단편 내의 발색단의 존재는 형광 스펙트럼으로 더 명백해진다(도 3C): 상기 단편은 360 nm에서 독특한 최대 여기 스페트럼 및 460 nm에서 최대 방출 스펙트럼을 갖는 약한 형광(온전한 EGFP의 피크 형광과 비교하여 ~ 100배 더 약함)을 나타낸다. 이러한 스펙트럼은 전장 길이 EGFP이 스펙트럼과 상당히 다르다(EGFP 방출 스펙트럼에 대해 도 4A를 참조하라: EGFP 여기 스펙트럼은 도 3B 인세트에 도시된 이의 흡수 스펙트럼과 유사하다). 그러나, 이들 스펙트럼은 합성 발색단의 형광 스펙트럼과, 부분적인 단백질분해에 의해 온전한 형광 단백질로부터 분리된 짧은, 발색단-포함 펩티드의 스펙트럼과 상응한다²⁴. 따라서, 이러한 데이터는 봉입체로부터 분리 및 리폴딩된 거대 EGFP 단편은 미리-형성된 발색단을 포함한다는 것을 제시한다.

DNA-기반 EGFP 보완의 경우, 단백질 단편을 비오틴-스트렙트아비딘 화학을 이용하여 상보적인 올리고뉴클레오티드에 커플링시켰다(도 1). 거대 및 소 EGFP 단편들을 설프히드릴-반응 시약인, 비오틴-HPDP를 이용한 비오틴표지화를 위해, 각각, C- 와 N-말단에 잉여의 시스테인 잔기들과 함께 발현시켰다. C- 및 N-말단에 비오틴표지된 폴리펩티드는 그 다음 스트렙트아비딘을 통해 비오틴표지된 올리고뉴클레오티드에 커플링될 수 있다; 이 고-친화력 비오틴-결합 단백질^{25 ,26}은 링커로서 역할한다. 본 발명자들은 EGFP의 A 단편 내의 말단 Cys가 비오틴표지화를 위한 주요 표적 부위가 될 것이며, 한편, 폴리펩티드(도 2C, 2E내의 DMD 구조에 의해 뒷받침됨) 내부의 어느 정도까지 묻힌, 내부 Cys₄₉와 Cys₇₁은 반응성이 훨씬 덜 할 것으로 추정하였다.

본 발명자들은 분자 디자인^27,28을 가능하기 때문에 비공유결합성 커플링을 선택하였는데, 상이한 EGFP-기반 광학 스위치가 준비될 때 유리할 수 있다. 만일 연이은 분해가 필요하다면, S-S 결합을 통한 단백질 및 비오틴-HPDP 사이에 형성된 링크는 용이하게 환원제로 분절될 수 있다는 것에 주목하라. 이 디자인 계획할 때, 본 발명자들은 이의 공간적 배열이 동시적으로 올리고뉴클레오티드들이 이중나선을 형성하는 것을 가능하게 하고 EGFP 단편들은 서로 가까이 근접하게 된다고 추정하였다. 실제로, 2개의 스트렙트아비딘 분자들이 나란히 위치하게 될 때, 이들의 중심은 ~60 Ų⁵만큼 이격된다. 비오틴-결합 부위가 각 스트렙트아비딘 소단위체²⁶의 중간 근처에 위치하게 되다고 가정하면, 통상의 기술자는 접촉하는 단백질 내의 이와 같은 2개의 부위들 사이의 가장 짧은 거리를 ~30 Å로 평가할 수 있다. 비오틴-HPDP 시약과 올리고뉴클레오티드 내의 비오틴 링커의 길이는 >25 Å이었으며, 그에 따라 조립체의 모든 상응하는 대응부가 결합하는데 충분하다.

비오틴표지된 EGFP 단편들은 스트렙트아비딘에 1:1의 비로 결합되며(도 4A), 그 후 5'- 또는 3'-말단에 비오틴을 지니는 상응하는 올리고뉴클레오티드들에 커플링된다(도 4B; 도식에 대해 도 1을 참조하라). 이러한 세부분으로 이루어진 분자 구조물이 동일 몰당량으로 결합될 때, 형광의 강한 증가가 EGFP와 유사한 여기/방출과 함께 검출되었다(도 4c). 대조적으로, 상보적인 올리고뉴클레오티드 없이 스트렙트아비딘-결합된 단백질 단편들을 혼합시킨 대조군 실험은 감지할 수 있을 정도의 임의의 형광을 나타내지 아니하였다. DNA-기반 EGFP 재조립의 동역학은 t1/2 ≤ 1 분으로 빨랐다(도 4A 인세트). 이것은 성숙한 발색단^2,17을 지니는 변성된 단백질로부터의 EGFP의 재생의 동역학에 가까우며^2,17, DNA 이중나선의 본질적으로 즉 각적인 형성과 매우 잘 부합한다²⁰. 재조립된 복합체의 형광 강도는 온전한 EGFP의 형광 강도에 근접한 최대 반응과 함께 실험시마다 달랐다.

온전한 EGFP의 형광 스펙트럼과 재조힙된 단백질의 스펙트럼 사이의 2가지 차이가 주목되어야 한다. 첫째, 재조립된 단백질의 여기/방출 최대파장은, EGFP의 488/507 nm와 비교하여, 490/524 nm로 적색-편이되었다. 스펙트럼 변화는 재조립된 단백질 내부의 발색단을 에워싼 아미노산의 다소 상이한 배열뿐만 아니라 복합체 내부의 스트렙트아비딘 및/또는 음으로 하전된 DNA의 존재로 설명될 수 있다. 두번째 차이는 Mg²⁺ 이온의 첨가시 분명해 진다. 천연 EGFP의 형광은 2 mM MgSO₄ 첨가 후, EGFP 형광에 대한 2가 양이온의 공지된 켄칭 효과에 따라서², 점차적으로 감소하며, 이후 3시간 이내에 이의 초기 수치의 약 70%에 도달한다. 대조적으로, 재조립된 복합체의 형광은 Mg²⁺ 이온의 첨가시 수분 이내에 약 30% 증가하였으며 본질적으로 변화되지 아니한체 유지되었다(도 4D). 이러한 효과는, DNA-단백질 복합체 내부의 EGFP의 재조립에 중요한 역할을 하는, 이중나선 DNA에 대한 Mg²⁺ 의 안정화 효과로 설명될 수 있다.

마지막으로, 본 발명자들은 재조립된 다성분 복합체를 분해시킴으로써 회복된 분절 EGFP의 형광이 꺼지는지 여부에 대한 가능성을 시험하였다. 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드들 중 하나를 형광 복합체에 과량으로 부가하였을 때, 형광에서의 필수적으로 즉각적인 감소가 검출되었다(도 4c). 명백하게, 태그되지 아니 한 올리고뉴클레오티드의 경쟁적인 혼성화는 이의 단백질-태그된 등가체를 대체하며, 그 결과로서, 보완된 단백질 복합체를 분절시킨다. 대안적으로, DNA 혼성화-탈혼성화 사건은 시스템 내에서 생성된 광학 시그널의 다수의 온-오프 순환이 가능하게 하는 국소 가열²⁰에 의해 원격조절될 수 있다. 본 발명자들은 이의 가능한 응용을 의미하고자 이러한 접근법을 SWITCH(Swift & Winked Illumination Triggerred & Controlled by Hybridization)로 명명하였다.

애쿼리아 빅토리아 ( Aequorea victoria ) 녹색-형광 단백질(접근번호 M62653):

애쿼리아 빅토리아 ( Aequorea victoria ) 녹색-형광 단백질 mRNA, 완전한 cds(접근번호 M62653):

참고문헌

상기 모든 참고문헌은 이의 전체 내용이 본원에서 인용된다.

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Claims (52)

1. 하기 단계를 포함하는 개체내의 질병 또는 장애를 검출하기 위한 방법:

   a. 개체로부터 생물학적 시험 샘플을 획득하는 단계;

   b. 상기 생물학적 샘플로부터 DNA 또는 RNA를 분리하는 단계;

   c. DNA 또는 RNA를 분절된(split) 형광 폴리펩티드 분자와 접촉시키는 단계로서, 상기 분절된 형광 폴리펩티드 단편은 핵산 결합 모티프에 컨주게이션되며, 하나 이상의 핵산 결합 모티프가 질병 또는 장애와 관련된 특정 핵산에 특이적임을 특징으로 하는 단계; 및

   d. 검출가능 단백질로부터의 시그널의 변화를 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 변화는 질병 또는 장애에 대한 지표가 됨을 특징으로 하는 단계.
2. 하기 단계를 포함하는 개체내의 질병 또는 장애를 검출하기 위한 방법:

   a. 개체로부터 생물학적 시험 샘플을 획득하는 단계;

   b. 상기 생물학적 샘플로부터 비핵산 분석대상물을 분리하는 단계;

   c. 비핵산 분석대상물을 분절된 형광 폴리펩티드 분자와 접촉시키는 단계로서, 상기 분절된 형광 폴리펩티드 단편은 비핵산 분석대상물을 위한 결합 모티프에 컨주게이션되며, 하나 이상의 상기 분석대상물 결합 모티프가 질병 또는 장애와 관련된 특정 핵산에 특이적임을 특징으로 하는 단계; 및

   d. 검출가능 단백질로부터의 시그널의 변화를 검출하는 단계로서, 상기 시그 널의 변화는 질병 또는 장애에 대한 지표가 됨을 특징으로 하는 단계.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 분절된 형광 폴리펩티드는 하기 성분을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법:

   a. 아미노산 1에서 대략 아미노산 158까지를 포함하는 EGFR 펩티드의 제 1 단편;

   b. 대략 아미노산 159에서 아미노산 239까지를 포함하는 EGFR 펩티드의 제 2 단편; 및

   c. 상기 제 1 EGFR 단편과 제 2 EGFR 단편 사이에 위치하는 절단(cleavage) 펩티드.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 질병이 병원체임을 특징으로 하는 검출 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스, 인플루엔자, 박테리아, 진균, 기생충 및 효모로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스임을 특징으로 하는 검출 방법.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 질병은 질병에 대한 유전적 소 인(genetic disposition)임을 특징으로 하는 검출 방법.
8. 분절된 형광 폴리펩티드를 포함하는 봉입체의 제조방법으로서, 상기 분절된 형광 폴리펩티드가 하기 성분을 포함함을 특징으로 하는 제조 방법:

   a. 아미노산 1에서 대략 아미노산 158까지를 포함하는 EGFR 펩티드의 제 1 단편;

   b. 대략 아미노산 159에서 아미노산 239까지를 포함하는 EGFR 펩티드의 제 2 단편; 및

   c. 상기 제 1 EGFR 단편과 제 2 EGFR 단편 사이에 위치하는 절단(cleavage) 펩티드.
9. 검출가능 단백질의 2개 이상의 폴리펩티드 단편들을 포함하는, 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자로서, 상기 단편들은 (a) 활성화된 형태로 존재하고, (b) 단독으로 활성화되지 아니하며, (c) 추가로 핵산 결합 모티프를 포함하고, (d) 표적 핵산 존재시, 급속하게 보완되어 실시간으로 활성 단백질을 재구성함을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
10. 제 7항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 이의 유사체를 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
11. 검출가능 단백질의 2개 이상의 폴리펩티드 단편들을 포함하는, 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자로서, 상기 단편들은 (a) 활성화된 형태로 존재하고, (b) 단독으로 활성화되지 아니하며, (c) 추가로 비핵산 분석대상물을 위한 결합 모티프를 포함하고, (d) 표적 분석대상물 분자 존재시, 급속하게 보완되어 실시간으로 활성 단백질을 재구성함을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
12. 제 9항에 있어서, 상기 표적 분석대상물 분자는 생분자(biomolecule), 유기 분자 또는 무기 분자임을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
13. 제 9항 또는 제 11항에 있어서, 상기 검출가능 단백질은 형광 단백질임을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
14. 제 9항 또는 제 11항에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), GFP-유사 형광 단백질(GFP-like); 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP); 노란색 형광 단백질(YFP); 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP); 파란색 형광 단백질(BFP); 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP); 청록색 형광 단백질(CFP); 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP); 및 적색 형광 단백질(dsRED)과 이의 변이체로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
15. 제 9항 또는 제 11항에 있어서, 상기 분자는 분절된 형광 단백질 분자이며, 한 폴리펩티드 단편은 형광 단백질의 성숙한 발색단을 포함하며, 상기 분자의 분절된 단편들은 (a) 결합하여 형광 단백질의 발색단으로 방호된 배럴(chromophore-shielding barrel) 내의 베타-가닥들의 완전한 보완을 포함하며; (b) 단독으로 형광을 나타내지 아니하고; (c) 추가로 핵산 결합 모티프를 포함하며; (d) 표적 핵산 또는 표적 분석대상물 분자 존재시, 급속하게 보완되어 실시간으로 형광 단백질과 형광 표현형을 재구성함을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
16. 제 9항에 있어서, 상기 형광 단백질이 EGFP임을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
17. 제 9항에 있어서, 상기 핵산 결합 모티프가 DNA, RNA, PNA, LNA DNA-결합 단백질 또는 펩티드; RNA-결합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
18. 제 9항에 있어서, 상기 한 단편 상의 핵산 결합 모티프가 다른 단편 상의 핵산 결합 단편과 동일한 유형의 모티프임을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백질 단편 분자.
19. 제 9항에 있어서, 상기 한 단편 상의 핵산 결합 모티프가 다른 단편 상의 핵산 결합 단편과 상이한 유형의 모티프임을 특징으로 하는 분절된 폴리펩티드 단백 질 단편 분자.
20. 핵산 혼성화의 변화에 대한 실시간 검출 방법으로써, 하기 단계를 포함하는 검출 방법:

    (a) 제 2항에 기재한 바와 같이 상기 분자의 기준 시그널(baseline signal)을 검출하는 단계로서, 상기 한 단편 상의 핵산 결합 모티프가 생물학적 샘플 내의 핵산과 함께 제 2 단편 상의 핵산 결합 모티프에 결합됨을 특징으로 하는 단계;

    (b) 상기 샘플 내의 상기 2개 단편들의 결합이 변형(alteration)될 수 있게 분석 조건을 변경(change)시키는 단계; 및

    (c) 상기 생물학적 샘플로부터의 형광 시그널의 변화를 즉각적으로 검출하는 단계로서, 시그널의 감소는 상기 분석 조건의 변경이 본래의 핵산 표적에 대한 개별 폴리펩티드 단편들의 친화력을 감소시켰음을 나타내는 것을 특징으로 하는 단계.
21. 제 20항에 있어서, 상기 한 단편 상의 핵산 결합 모티프가 제 2 단편 상의 핵산 결합 모티프와 동일한 유형의 모티프임을 특징으로 하는 검출 방법.
22. 제 20항에 있어서, 상기 한 단편 상의 핵산 결합 모티프가 제 2 단편 상의 핵산 결합 모티프와 상이한 유형의 모티프임을 특징으로 하는 검출 방법.
23. 하기 단계를 포함하는 분절된 폴리펩티드 단백질의 활성화된 단편들을 생산하기 위한 방법:

    a. 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편들을 엔코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 단계로서, 2개의 폴리펩티드 단편들은 표적 핵산 또는 표적 비핵산 분석대상물의 존재하에 결합하여 활성화된 상태의 검출가능 단백질을 형성하며, 상기 폴리펩티드 단편들은 야생형 활성 단백질과 비교할 때 활성화된 형태이며 형태적으로 올바른 형태로 존재함을 특징으로 하는 단계; 및

    b. 상기 폴리펩티드 단편들을 수확하여 형태적으로 올바르며 활성화된 상태로 2개의 개별 단백질 단편들을 획득하는 단계.
24. 제 21항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편들을 엔코딩하는 상기 핵산 서열은 하나의 핵산 서열로 엔코딩되며, 상기 핵산 서열은 제 1 폴리펩티드 단편과 다른 폴리펩티드 단편들 사이에 분절가능 부위(splittable site)를 엔코딩하며, 상기 제 1 폴리펩티드 단편과 다른 폴리펩티드 단편들은 분리(separation)될 수 있으며, 야생형 활성 단백질과 비교할 때, 활성화된 상태이며 형태적으로 올바른 형태로 존재함을 특징으로 하는 검출 방법.
25. 제 24항에 있어서, 상기 분절가능 부위는 효소 절단, 화학 절단, 광절단, 파장 절단, 열 절단, 산 절단으로 구성된 군에서 선택된 절단 수단에 의해 상기 다른 폴리펩티드 단편들로부터의 제 1 폴리펩티드 단편의 분리를 가능하게 함을 특징으 로 하는 검출 방법.
26. 제 23항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 검출 방법:

    a. 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 폴리펩티드 단편을 엔코딩하는 핵산 서열을 미생물 숙주 세포 내에서 발현시켜 봉입체를 형성시키는 단계로서, 상기 봉입체가 상기 폴리펩티드 단편들을 포함함을 특징으로 하는 단계; 및

    b. 숙주 세포를 분해하고, 봉입체를 수확하고 단계 (a)의 상기 봉입체 내에 포함된 폴리펩티들 단편들을 재용해(resolubilizing)시키고 리폴딩(refolding)시켜 상기 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 폴리펩티드 단편들을 이들의 활성화된 상태로 획득하는 단계.
27. 제 26항에 있어서, 추가로 상기 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 폴리펩티드 단편들을 효소적으로 또는 화학적으로 절단하여 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 폴리펩티드 단편들을 이들의 활성화된 상태로 획득하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
28. 제 26항에 있어서, 추가로 상기 숙주 세포의 가용성 분획으로부터 상기 폴리펩티드 단편들을 수확하여 제 1 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 폴리펩티드 단편들을 이들의 활성화된 상태로 획득하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
29. 제 23항에 있어서, 상기 검출가능 단백질이 효소임을 특징으로 하는 검출 방법.
30. 제 25항에 있어서, 상기 효소가 색원체 활성(chromogenic activity)을 지님을 특징으로 하는 검출 방법.
31. 제 23항에 있어서, 상기 검출가능 단백질이 형광 단백질임을 특징으로 하는 검출 방법.
32. 제 23항에 있어서, 형광 단백질의 제 1 폴리펩티드 단편이 형광을 위해 프라이밍된 미리형성된(preformed) 성숙한 발색단을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
33. 제 31항에 있어서, 상기 형광 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP), GFP-유사 형광 단백질(GFP-like); 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP); 노란색 형광 단백질(YFP); 강화된 노란색 형광 단백질(EYFP); 파란색 형광 단백질(BFP); 강화된 파란색 형광 단백질(EBFP); 청록색 형광 단백질(CFP); 강화된 청록색 형광 단백질(ECFP); 및 적색 형광 단백질(dsRED)과 이의 변이체로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
34. 제 31항에 있어서, 상기 형광 단백질이 EGFP 형광 단백질임을 특징으로 하는 검출 방법.
35. 제 34항에 있어서, 상기 EGFP 형광 단백질이 아미노산 1에서 대략 아미노산 158까지를 포함하는 EGFR 펩티드의 제 1 단편을 포함하며, EGFP 형광 단백질의 제 2 폴리펩티드 단편은 대략 아미노산 159에서부터 아미노산 239까지임을 특징으로 하는 검출 방법.
36. 제 23항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드 단편은 추가로 C-말단 시스테인을 포함하며 상기 제 2 폴리펩티드 단편은 추가로 N-말단 시스테인을 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
37. 제 23항에 있어서, 추가로 상기 제 1 및 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편들을 설프히드릴-반응 시약으로 비오틴표지화(biotinylation)시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 검출 방법.
38. 제 37항에 있어서, 상기 설프히드릴-반응 시약이 비오틴-HPDP임을 특징으로 하는 검출 방법.
39. 제 23항에 있어서, 상기 제 1 단편과 하나 이상의 또 다른 폴리펩티드 단편 들이 추가로 스트렙트아비딘-컨주게이션된 올리고뉴클레오티드에 컨주게이션됨을 특징으로 하는 검출 방법.
40. 제 39항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 DNA, RNA, PNA, LNA 및 이의 유사체를 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
41. 제 23항에 있어서, 상기 제 1 단편과 하나 이상의 폴리펩티드 단편들을 엔코딩하는 핵산이 추가로 핵산 결합 모이어티를 엔코딩함을 특징으로 하는 검출 방법.
42. 제 41항에 있어서, 상기 핵산 결합 모이어티가 핵산임을 특징으로 하는 검출 방법.
43. 제 42항에 있어서, 상기 핵산 결합 모이어티가 제 1 단편과 하나 이상의 다른 폴리펩티드 단편들에 컨주게이션됨을 특징으로 하는 검출 방법.
44. 제 42항에 있어서, 상기 핵산 결합 모이어티가 DNA-결합 단백질; DNA-결합 펩티드, RNA-결합 단백질, 및 RNA-결합 펩티드를 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 검출 방법.
45. a. 활성화된 제 1 분절 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 다른 분절된 폴리펩 티드 단편(여기서 각각의 분절된 폴리펩티드 단편은 비핵산 분석대상물에 대한 핵산 결합 도메인 또는 결합 모티프를 포함함); 및

    b. 보완과 시그널 검출을 위한 시약과 사용지침서를 포함하는, 키트.
46. a. 활성화된 제 1 분절 폴리펩티드 단편과 하나 이상의 다른 분절된 폴리펩티드 단편;

    b. 비핵산 분석대상물에 대한 사용자들 소유의 관심있는 핵산 결합 모티프 또는 결합 모티프의 부착을 위한 시약과 사용지침서; 및

    c. 보완과 시그널 검출을 위한 시약과 사용지침서를 포함하는, 키트
47. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 상기 활성화된 제 1 단편과 제 2 분절 폴리펩티드 단편들은 재구성되어 검출가능 단백질을 형성함을 특징으로 하는 키트.
48. 제 47항에 있어서, 상기 검출가능 단백질이 β-락타메이즈, DFHR, 루시퍼라제 및 형광 단백질을 포함하는 목록에서 선택됨을 특징으로 하는 키트.
49. 제 47항에 있어서, 상기 검출가능 단백질이 항원임을 특징으로 하는 키트.
50. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 추가로 상기 샘플의 표적 핵산의 증폭을 위한 시약(reagents)과 사용지침서를 포함함을 특징으로 하는 키트.
51. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변화가 시그널의 감소임을 특징으로 하는 키트.
52. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변화가 시그널의 증가임을 특징으로 하는 키트.

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